【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イネのショ糖合成能力を増強することによって二酸化炭素の固定能力を増強し、ひいては生産性を向上させたイネの育成に利用される。

【０００２】

【従来の技術】ショ糖は植物の緑葉で光合成によって固定された二酸化炭素から複数の反応をへて合成される。
すなわち、大気から吸収された二酸化炭素は緑葉に局在する葉緑体で光合成によって固定され、一旦デンプンとして蓄積される。 その後、分解を経て細胞質に輸送され最終的に転流形態であるショ糖へと変換される。 このショ糖に変換するする過程で大きな役割をはたしているのがショ糖リン酸合成酵素(SPS)である( Physiologia Plan
tarum 77 (1989) 633-641)。 SPSはフルクトース6リン酸とUDPグルコースからショ糖リン酸を合成する反応を触媒する酵素である(Control of photosyntnthetic sucro
se syntesis, in:Hatch & Boadman (eds.)Biochemistry
of Plants, vol 10, (1987), Academic Press, New Yo
rk, pp.328-429)。

【０００３】従来、SPSは固定した炭酸同化産物の分配に関与すると考えられている。 従って、この酵素の活性を上昇させることが出来ればショ糖合成能力を強化することが出来、ひいては同化産物の流れをショ糖合成に向かわせることが出来る可能性があった。

【０００４】植物のある酵素の活性を増強させる方法の一つとしてとして、遺伝子組換え技術を用いる方法が挙げられる。 すなわち、目的とする酵素をコードするＤＮ
Ａ配列を植物細胞中で機能しうるプロモーターと接続した人工遺伝子を構築し、これを植物細胞に導入して安定に核ゲノムに組み込む。 このことによって植物体内で人工遺伝子を発現させ、酵素蛋白質の量を増強することによって酵素活性の増強を図る方法である。

【０００５】上記の方法によって、SPS活性の増強を図るためには、これをコードする遺伝子またはcDNAを単離し、これらを利用して形質転換植物を作出する必要がある。 これまで、SPSをコードしうる塩基配列がトウモロコシ、ホウレンソウ、テンサイ、イネから単離されている( Plant Cell 3 (1991) 1121-1130; Planta 190 (199
3) 498-510; Molecular & General Genetics 247 (199
5) 515-520; Plant Science 112 (1995) 207-217 )。 さらに、トマトにおいてトウモロコシから単離されたcDNA
を用いて、SPS活性を増強することによって糖の分配が変化することが報告されている( Plant Cell 3 (1991) 1
121-1130)。

【０００６】しかし、SPS遺伝子の増強に関しては以下のような問題点があった。 生体内での酵素反応は単一の反応が有機的に連鎖し、一連の代謝系として機能している。 そのため、酵素はその活性の発現レベルで様々な制御を受けている。 代謝経路の流れは、基本的にはその代謝系を構成する酵素の活性によって調節される。 酵素活性の調節は、酵素量による粗調節と、酵素分子に調節分子が直接作用し、触媒活性を変化させる微調節に大別される。 後者の調節はフィードバック制御や、タンパクのリン酸化等の化学修飾によって極めて迅速に行われている（代謝調節 (1992) 代謝、朝倉書店、東京、pp.30-6
9）。

【０００７】イネのSPSは酵素活性の発現レベルでリン酸化による制御を非常に強く受けていることが知られている。 すなわち、光による脱リン酸化によって活性化され、暗黒化でリン酸化されて活性を失う。 また、葉におけるSPSの活性は代謝経路全体の流れとして有機的に制御を受ける(Control of photosyntnthetic sucrose syn
tesis, in:Hatch & Boadman (eds.) Biochemistry of P
lants, vol 10, (1987), Academic Press, New York,p
p.328-429)。 従って、単にイネのSPSの酵素量を増加させただけでは酵素活性を増強させることは困難であり、
特に、全く相同なSPS酵素を増量させても同じ調節部位を有するため同じ制御を受けることから酵素活性を増強させることは困難とされる。

【０００８】このように、目的とする酵素の活性だけを選択的に上昇させることは一般的に困難であると考えらていた。 しかも、酵素活性を向上させれば対象となる植物の機能が向上させられるか否かを予測することは不可能である。 例えば、デンプン合成の鍵酵素と考えられる
ADPグルコースパイロフォスフリラーゼを遺伝子組換えによってコントロールしようとした場合に、通常の酵素をコードするcDNAを導入したポテトでは酵素活性は変化しなかった。 この酵素は、非常に強いアロステリック制御を受けることが知られており、この制御部位に変異を起こした突然変異酵素の遺伝子を導入した場合に酵素活性を増強することに成功している( Science 258 (1992)
287-292)。 この例が示すように、タンパク質レベルで強い制御を受ける酵素に関しては、単に酵素量を増加させるだけでは、酵素活性を増強することが困難である。

【０００９】また、SPSはショ糖の合成に強く影響し、
植物体全体の生理機能を左右する。 従って、遺伝子導入によってSPS活性を増強することは、本来その植物が持つ生理機能を損なう恐れがある。 事実、トマトでトウモロコシのSPSを増強して糖の分配を変化させた例においても、植物体の生育そのものは損なわれている( Plant Ce
ll 3 (1991) 1121-1130)。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はイネの
SPS遺伝子を多量に発現するように構築した人工遺伝子を用いたイネのショ糖合成能の増強方法と、これによって得られたショ糖合成能を強化したイネを提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らはショ糖合成能力を増強することによって植物の生長や生産性を向上させるためには、少なくともソース器官である葉において該遺伝子を増強する必要があると考えた。 かかる観点から、人工遺伝子を葉において組織特異的に発現させ、
葉においてのみSPS活性を増強させるために、本発明者らは、イネのSPSをコードするＤＮＡ配列をイネの葉で特異的に発現することができる集光性クロロフィルａ/
ｂ結合タンパク質遺伝子のプロモーターの下流に接続した人工遺伝子を構築し、該人工遺伝子をイネの核ゲノムに組み込んでイネを形質転換したところ、イネのショ糖合成能が増強方法されることを見いだし、本発明を完成したものである。

【００１２】即ち、本発明はイネのショ糖リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列を集光性クロロフィルａ/ｂ
複合体タンパク質遺伝子のプロモーターの下流に接続して得られる人工遺伝子をイネの核ゲノムに組み込むことによってイネのショ糖合成能力を増強する方法、該方法で作製されたイネ及び該イネを作製する方法を提供するものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】イネにおいてSPS活性の増強によってショ糖合成能を強化し、これをイネの生長や生産性に最も貢献させるためには、SPSをショ糖の供給源器官でのみ強化する必要がある。 ショ糖供給源として最も大きな役割を果たしているのが光合成によって二酸化炭素を同化している緑色組織、特に緑葉である。 イネの緑葉組織のみで発現する遺伝子として、集光性クロロフィルａ/ｂ結合タンパク質の遺伝子(Cab)のプロモーターが知られ( Plant & Cell Physiology 32 (1991) 385-393)、
本発明において該プロモーターが好適に用いられる。

【００１４】開始コドンから終止コドンを含むイネのSP
S遺伝子を大腸菌で増幅可能なベクターにクローニングし、さらに、SPS遺伝子の開始コドン上流にイネのCab遺伝子のプロモーターを含む領域を組み込むことによって人工遺伝子を構築することができる。

【００１５】人工遺伝子をイネに形質転換する方法として、公知の方法を用いることができる。 例えばエレクトロポレーション、遺伝子銃、PEG等の高分子化合物を利用してイネの組織細胞・カルスに再導入するか、もしくは、アグロバクテリウムを媒介としてイネの組織細胞・
カルスに再導入することができる。 これらの組織やカルス細胞からは、人工遺伝子を核ゲノムに組み込んだ形質転換イネを再生させることができる。

【００１６】

〔実施例１〕

(1)イネSPS遺伝子のクローニング イネ品種”日本晴”の緑葉より全DNAをCTAB法によって抽出した。 イネSPS遺伝子に相補的な配列から成る２種類のプライマー；SPSF(TCCCGGGTTTGATACGTGTGGTACGTG)
(配列番号１) SPS-R (GGTACCTGCTAAAAAGTCAACGGCGTC)
(配列番号２)を用いた。 ただし、SPS-RにはイネSPS遺伝子に相補的な配列の5'端に制限酵素KpnIサイトの配列を付加したものである。 PCRはGeneAmp PCR System 9600
(Perkin Elmer)を使用し、得られた全DNA100ng/20μlを鋳型として、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2 (TAKARA社)を用いて行った。 反応はキットのプロトコールに従って行った。 PCR反応液を0.8%アガロースゲルで分画し、増幅された約6kbの断片を回収した。 回収したDNA断片はTA clo
ning kit (Invitrogen社)を用いてpCRTMIIベクターにサブクローニングし、イネのSPS遺伝子を含むpOSSPSを得た。

【００１７】(2)イネCab遺伝子のプロモーター領域のクローニング 上記の全DNAを鋳型として、２種類のプライマー；CabPF
(TCTAGAGATTGGGATTAAGGTAATG) (配列番号３)Cab-PR(GAT
ATCGATGCAGTGAGCTGTGAGAG) (配列番号４) を用いて、Ca
b遺伝子のプロモーター領域を増幅した。 これらはイネのCab遺伝子に相補的な配列の5"端に制限酵素XbaI(Cab-
PF)およびEcoRV(Cab-PR)の認識サイトを付加してある。
PCRは、GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer) を使用し、20μl の系で行った。 PCRの条件は、94℃/10Sec
→60C/30sec→72℃/30secを１サイクルとし、これを35
サイクル行った。 PCR反応液を1.5%アガロースで分画し、約850bpのDNA断片を回収した。 回収したDNA断片を制限酵素XbaIとEcoRVで処理し、pBluescript KS II+ (S
tratagene)のXbaIとEcoRV サイトの間にクローニングした。 得られたイネのCab遺伝子のプロモーター領域を含むクローンをpOSCabPとした。

【００１８】(3)人工遺伝子の構築 人工遺伝子を構成するSPSをコードする配列として、上記イネのSPS遺伝子を含むクローンpOSSPSを用いた。 一方、SPS遺伝子をイネのソース器官でのみ高発現させるため、人工遺伝子を構成するプロモーターとしてイネの集光性クロロフィルa/b結合タンパク質(Cab)のプロモーターを用いた。 イネのCab遺伝子のプロモーターを含むD
NAとして、上記のpOSCabPを用いた。 イネSPS遺伝子をコードするpOSSPSを制限酵素SmaIとKpnIで切断し、SPS遺伝子を切り出した。 一方、pOSCabPをEcoRVとKpnIで切断し、切り出したSPS遺伝子を組み込んだ。 これによって、イネのSPS遺伝子とこれをソース器官でのみ発現させるプロモーターからなる人工遺伝子を含むプラスミド
pCab-SPSを得た。

【００１９】(4)形質転換イネの作出 構築した人工遺伝子含むプラスミドpCab-SPSのイネへの形質転換は、Tada らの方法(Theoretical & Applied Ge
netics 80 (1990) 475-480 )に従って実施した。 形質転換にはイネ品種”日本晴”を用い、その胚盤由来カルスより Fujimuraらの方法(Plant Tissu Culture Letter2
(1985) 74-75 )に従って確立した懸濁培溶細胞由来のプロトプラストにpCab-SPSをハイグロマイシン耐性遺伝子と共に導入した。 分裂増殖したコロニーからハイグロマイシンによって耐性カルスを選抜し、これらから形質転換イネを再生させた。

【００２０】(5)形質転換イネの選抜 再生した形質転換イネの中で、ハイグロマイシン耐性遺伝子と共に目的の遺伝子であるpCab-SPSが導入されている形質転換イネのスクリーニングを行った。 再生した形質転換イネから Edwards らの方法(Nucleic Acid Resar
ch 19 (1991)1349)に従ってDNAを抽出し、PCR によって
pCab-SPSの導入されている形質転換体の選抜を行った。
SPS遺伝子とCabプロモーターのキメラ部分を利用して、
野生型のイネのSPS遺伝子と導入したpCab-SPSの識別を行った。 すなわち、Cabプロモーターの上流に位置するp
Bluescript KS II+(Stratagene)のマルチクローニングサイト特異的なユニバーサルプライマー；M13-M4 (GTT
TTCCCAGTCACGAC)(配列番号5)とイネのSPS遺伝子に特異的なプライマー；P6 (TCGCCTCCAGGTAGCCATTG)(配列番号6)を組み合わせて用いた。 PCRは GeneAmp PCR System
9600 (Perkin Elmer)を使用し、20μl の系で行った。
PCRの条件は、94℃/10Sec→60C/30sec→72℃/30secを１
サイクルとし、これを30サイクル行った。 400個体の形質転換イネについて調べた結果、35個体で予想されるDN
A断片が増幅された。 さらに、pCab-SPSが完全な形で核ゲノムに組み込まれていることを確認するため、上記の選抜された35個体からCTAB法によって全DNAを抽出し、
サザンブロットによってpCab-SPSの組み込みパターンを解析した。 サザンブロットはECLキット(Amarsham)を用い、添付のプロトコールに従って行なった。 抽出した全
DNAを制限酵素KpnIとXbaIで処理し、0.8%アガロースで分画後、ナイロンメンブレン;Hybond N+(Amarsham)に転写した。 プローブとするDNA断片はpCab-SPSを鋳型として、イネSPS遺伝子の第11エクソンに対応する領域を配列番号7(GCTCTGAACAATGGACTGCTGGTAG)と配列番号8(CTTA
TTGGGGTCTTTGATGAAGAAG)のプライマーを用いて、PCRによって増幅した。 増幅したDNA断片は0.8%アガロースゲルで分画し、DNA回収キットQIAXII( QIAGEM GmbH, Germ
any)を用いて回収した。 回収したDNA断片はプロトコールに従って標識し、ハイブリダイゼーションに用いた。
サザン解析の結果、7kbにおよぶ人工遺伝子部分が完全な形で染色体に組込まれていることが確認された。

【００２１】(6)形質転換イネのSPS活性の測定 イネのSPS活性はHuberらの方法( Plant & Cell Physiolo
gy 30 (1989) 277-285)に従って測定した。 イネの葉を切断後、直ちに液体窒素で凍結させた。 凍結させた葉を秤量し、その0.5gを液体窒素中で磨砕した。 液体窒素を飛ばした後、抽出液(50mM MOPS(pH 7.5), 10mM MgCl2,1
mM EDTA, 2.5mM DTT, 0.1% Triton X-100)を2.5ml添加し、完全に磨砕した。 磨砕液をガーゼで濾過し、濾液を
2000回転で1分間遠心した。 上清をカラム平衡化液(50mM
MOPS(pH 7.5),10mM MgCl2, 1mMEDTA, 2.5mM DTT)で平衡化したPD-10カラム(Pharmachia Biotech)を用いて低分子を除去した。 濾過後、3.5mlのカラム平衡化液を添加して溶出した液を回収し、これを粗酵素液とした。 粗酵素液45mlを25℃で5分間プレインキュベートし、酵素反応液(10mM UDP-glucose, 10mM fructose-6-phosphat
e, 40mM glucose-6-phosphate, 15mM MgCl2, 2.5mM DT
T)を添加し、25℃で0または20分間反応させた。 反応終了後直ちに70mlの30%KOHを添加して反応を停止させた。
さらに、10分間煮沸後、氷令した。 反応液に0.15%のアントロン液(0.15%アントロンを13.8Mの濃硫酸に溶解したもの)を1ml添加し、40℃で20分間、反応させた。 反応後、620nmの吸光度を測定し、これを元にSPS活性を算出した。 人工遺伝子が完全な形で組み込まれていた組換え体イネについてSPS活性を測定した。 対照として遺伝子導入に用いた”日本晴”を用いた。 測定に供試したイネ植物体は同一条件下で栽培し、完全展開第1葉および完全展開第2葉から祖酵素液を抽出した。 活性測定の結果、形質転換体で対照の日本晴に比べて酵素活性が約8
倍に向上していた（表1）。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【発明の効果】本発明により、イネのSPS遺伝子をソース器官である葉においてのみに多量に発現するように再構築した人工遺伝子を用いることによるイネのショ糖合成能の増強方法が提供される。 イネのショ糖合成能力の向上はイネの二酸化炭素固定能力が増強され、ひいてはイネの生育向上、米の収量増加に寄与することが考えられる。 また、本発明と同様の手法を用いればイネ以外の他の植物でもショ糖合成能の改変が可能となることが予測される。

【００２４】

【配列表】

【００２５】配列番号:１ 配列の長さ:27 配列の形:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： TCCCGGGTTT GATACGTGTG GTACGTG 27

【００２６】配列番号:２ 配列の長さ:27 配列の形:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： GGTACCTGCT AAAAAGTCAA CGGCGTC 27

【００２７】配列番号:３ 配列の長さ:25 配列の形:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： TCTAGAGATT GGGATTAAGG TAATG 25

【００２８】配列番号:４ 配列の長さ:26 配列の形:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： GATATCGATG CAGTGAGCTG TGAGAG 26

【００２９】配列番号:５ 配列の長さ:17 配列の形:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： GTTTTCCCAG TCACGAC 17

【００３０】配列番号:６ 配列の長さ:20 配列の形:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： TCGCCTCCAG GTAGCCATTG 20

【００３１】配列番号:７ 配列の長さ:25 配列の形:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： GCTCTGAACA ATGGACTGCT GGTAG 25

【００３２】配列番号:８ 配列の長さ:25 配列の形:核酸 鎖の数 :1本鎖 トポロジ−:直鎖状 配列： CTTATTGGGG TCTTTGATGA AGAAG 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 島田 浩章 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 藤村 達人 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内