【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ムタンを効率よく生産し得、工業的有利な酵素法によるムタンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ムタンはグルコースがα−１，３−結合でつながった水不溶性の高分子多糖で、自然界ではう蝕の原因菌として知られるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）やストレプトコッカス・
ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉ
ｎｕｓ）などが生産するグルカン（ムタンとデキストランの混合物）の形で存在する。

【０００３】ムタンは近年、歯垢形成抑制効果を有する口腔用組成物としての利用（特開平１０−１８２３８２
号公報）や、保湿剤としての利用（特願平１０−１５７
８８４号）が見出され、またその水不溶性の性質から担体等への応用も見込まれる極めてユニークな素材として着目されている高分子多糖である。

【０００４】従来、このムタンを得るためには、口腔レンサ球菌をショ糖存在下で培養しグルカンを得たのち、
デキストラナーゼでα−１，６−グルカンを分解除去する方法が用いられてきた（う蝕と歯周病 Ｖｏｌ．２、
１９８２、歯科評論社）。

【０００５】しかしながら、従来一般的に用いられていた発酵法では、生きた菌体を用いるために、生産量に最も影響を与えるショ糖濃度が菌の生育に対し制限条件となり、高濃度のショ糖を添加することができず、培地当たりの収量が低い上、あとからデキストラナーゼによりα−１，６−鎖を切断除去するための日数が必要であるため、生産性を高めるには自ずと限界があった。 また生成したグルカンから菌体を除くために、一度アルカリ処理を行うことでグルカンを可溶化する必要があるが、この際アルカリにより菌体成分、ことにヨード可溶性の菌体内グルカンが抽出され混入してしまうことが知られている上、ムタンに抱き込まれた菌の代謝産物を完全に除去することは容易なことではない。

【０００６】更にこのような製法では、工程が長く煩雑であるため、ロットごとの質のバラツキも大きくなってしまう欠点があった。

【０００７】このような点から、本発明者らは、従来の方法を更に効率的に行うために、上記のごとき口腔レンサ球菌の培養液にデキストラナーゼを添加し、グルカンの生産と、デキストラナーゼ処理を同時に行うことで効率的にムタンを製造する方法を開発した（特願平９−９
１６６７号）が、更に効率的な方法が望まれる。

【０００８】ところで、発酵法とは別に、菌体からムタン合成酵素（グルコシルトランスフェラーゼ−Ｉ；以下ＧＴＦ−Ｉと略す。なお、文献によれば、ＧＴＦＰ３と表記してある例もある。また酵素の発現遺伝子も菌種によりｇｔｆＩ、ｇｔｆＢと表記されている場合がある。
しかしながら、本明細書においては、ムタンを合成する機能を持つ全ての酵素をＧＴＦ−Ｉと定義する。 ）だけを分離精製し、ムタンの製造に利用することは理論的には可能であるが、現実には酵素の凝集や吸着及びプロテオリシス等により非常に困難である。

【０００９】本発明は上記事情に鑑みなされたもので、
従来の問題点であるα−１，６−グルカンの微量の混入と収量の低さを改善し、工業製品として供給性の高い純粋なムタンの製造方法を提供するものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討を行った結果、ムタンを製造する過程において、口腔レンサ球菌による発酵法ではなく、組換え体を利用することによる、
ＧＴＦ−Ｉのみを用いた酵素法によりムタンを製造することで、従来の問題点を解決できることを見出した。 ことに、組換え体からのＧＴＦ−Ｉの抽出は、オリジナルな菌株からの分離精製とは異なり、得られる酵素量が多いことはもちろん、凝集することもなく簡単に行うことができる点で非常に優れた方法であることを知見し、本発明をなすに至ったものである。

【００１１】以下、本発明につき更に詳しく説明する。

【００１２】本発明のムタンの製造方法は、ショ糖に組換え体由来のムタン合成酵素（ＧＦＴ−Ｉ）を添加する酵素法によるものである。

【００１３】本発明において、ＧＴＦ−Ｉとしては公知のものを使用することができ、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕ
ｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒ
ｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｄｏｗｎｅｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕ
ｓ）などに由来のＧＴＦ−Ｉが挙げられる。

【００１４】これら菌株からの遺伝子の取得は、ＰＣＲ
法などにより簡単に取得でき、例えば下記文献情報等により、その遺伝子情報を取得できる。 Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ５： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
Ｓｅｐｔ． １９８７ｐ４２６３−４２７０ Ｈ．
Ｋ． ＫＵＲＡＭＩＴＳＵら Ｓ． ｓｏｂｒｉｎｕｓ ６７１５： 特開平５−２３１８８号公報 Ｓ． ｄｏｗｎｅｉ Ｍｆｅ２８： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
Ｓｅｐｔ． １９８７ｐ４２７１−４２７８ ＲＯＹ
Ｒ． Ｂ． ＲＵＳＳＥＬら Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８： ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６
１， １９９８ ｐ３３１−３３６ Ｓ． ＨＡＭＡＤ
Ａら

【００１５】遺伝子を組み込むホストとしては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、
ストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓｍｉｌｌｅｒｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバクテリア、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリビロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍ
ａｌｔｏｓａ）などの酵母、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｒｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）等のカビ、そしてストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）などの放線菌を使用できる。 ホストとしては同属の菌であるストレプトコッカス・ミレリや基礎情報の充実したエシェリシア・コリが扱いやすい。

【００１６】ムタンの製造に使用するＧＴＦ−Ｉはこの組換え体を通常の方法で培養し菌体より抽出することで取得できる。 なお、この方法としては、菌株に応じ、下記方法を例示することができる。 Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＧＳ５： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
Ｓｅｐｔ． １９８７ｐ４２６３−４２７０ Ｈ．
Ｋ． ＫＵＲＡＭＩＴＳＵら Ｓ． ｓｏｂｒｉｎｕｓ ６７１５： 特開平５−２３１８８号公報 Ｓ． ｄｏｗｎｅｉ Ｍｆｅ２８： Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
Ｓｅｐｔ． １９８７ｐ４２７１−４２７８ ＲＯＹ
Ｒ． Ｂ． ＲＵＳＳＥＬら Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＭＴ８１４８： ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６
１， １９９８ ｐ３３１−３３６ Ｓ． ＨＡＭＡＤ
Ａら

【００１７】次に、ムタンの生産において、ＧＴＦ−Ｉ
の添加量に関しては、基本的には１Ｕ／ｍｌ以上のＧＴ
Ｆ−Ｉならばどれだけ添加してもよいが、好ましくは１
〜５０００Ｕ／ｍｌを添加するのがよく、更に好ましくは５〜１０００Ｕ／ｍｌのＧＴＦ−Ｉを添加するのがよい。 １Ｕ／ｍｌ未満の量では十分な効果が発揮されず、
また５０００Ｕ／ｍｌを超えて添加してもそれ以上の効果は見られない。

【００１８】なお、ここでいうＧＴＦ−Ｉ活性はショ糖分解活性で代替し、ショ糖を基質として反応を行った場合に１分間当たり１μｇのショ糖を分解する酵素量を１
単位とする。

【００１９】酵素反応液としては上記ＧＴＦ−Ｉが反応し得るものであればいずれの組成も使用可能であるが、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液が好ましい。

【００２０】ｐＨも上記ＧＴＦ−Ｉが反応し得る範囲であればいずれでもよいが、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ７．
５、更に好ましくはｐＨ５〜７が好適である。

【００２１】塩濃度は反応中に反応液のｐＨが好適範囲からはずれない程度の緩衝能を有すれば、いずれの濃度でも支障はないが、好ましくは５ｍＭ〜１Ｍ、更に好ましくは２５ｍＭ〜２５０ｍＭの範囲が好適である。

【００２２】温度も上記ＧＴＦ−Ｉが反応し得る温度であればいずれでもよいが、好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３０〜４０℃が好適である。

【００２３】また、添加するショ糖の量は１〜５０重量％濃度であれば可能であるが、１０〜３０重量％の濃度が好ましい。 なお、ショ糖が溶け残るほどの高濃度で用いても反応に支障はないが、対糖収率が上がらず、効率的ではない。

【００２４】以上のごとき条件で生産したムタンは、水不溶性であるが故、遠心分離により簡単に回収することができる。 目的によっては反応液にエタノール、メタノール、アセトンのような有機溶媒を添加することにより、更に低分子量のムタンも回収することができる。 得られた沈殿物は、水洗し、ムタン合成の結果遊離したフルクトース等の不純物を取り除き、凍結乾燥や真空乾燥等の適当な方法で乾燥粉末として保存することができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、これまで入手困難であったムタンを効率よく生産し得、工業的に有利である。

【００２６】

【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。

【００２７】［実施例１］ （１）組換え菌の取得 すでに報告されているストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）のＧＴ
Ｆ−Ｉ遺伝子配列（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ． １９８７ ｐ４２７１
−４２７８ ＲＯＹ Ｒ． Ｂ． ＲＵＳＳＥＬら）をもとに、上流と下流それぞれ３０塩基のプライマーを作成し、ＰＣＲ法により目的の遺伝子を取得した。 次に得られた遺伝子をベクター（ｐＵＣ１１８）に挿入し、大腸菌（ＪＭ１０９株）に形質転換することで、ＧＴＦ−
Ｉ遺伝子を保持した組換え大腸菌を得た。

【００２８】（２）組換え菌によるＧＴＦ−Ｉの調製 ３Ｌ容のジャーファメンターに２ＬのＢＨＩ培地（ＢＢ
Ｌ社製）を仕込み、オートクレーブで滅菌した。

【００２９】この培地に上記方法で取得した大腸菌組換え株を接種し、温度３２℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で１６時間培養した。

【００３０】培養後菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ×
２０分）により回収した後、菌体に対し、１００ｍｌの６Ｍウレア−ＥＤＴＡ溶液（６Ｍウレア、１０ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．１Ｍトリス塩酸）加え、室温で１時間放置した。 放置後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ×２０分）により上清を回収し酵素液とした。

【００３１】（３）ムタンの生成 次に、２０％のショ糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）５Ｌに対し７５００００Ｕ相当量の酵素液を加え、
３５℃で１６時間反応させた。 更に酵素反応の結果生成したムタンを遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収し、湿重量に対して１０倍量の蒸留水に懸濁したときの導電率が５０μｓ／ｃｍ（食塩換算）となるまで、蒸留水での洗浄を繰り返し、その後、凍結乾燥によりムタンを粉末を得た。 本方法で２０％ショ糖液１Ｌ当たり２５ｇのムタンを得ることができた。

【００３２】また上記条件で製造したムタンをＮＭＲを用い下記の条件で分析したところ、図１に示したように、α−１，６−結合は検出されなかった。 分析条件 サンプル濃度：１５％ 測定溶媒：１Ｎ−水酸化ナトリウム／２０％重水 測定磁場：６７．９ＭＨｚ 測定温度：２２℃

【００３３】なお、ここで用いたＧＴＦ−Ｉ力価は次のようにして測定する。 即ち、ショ糖１０％（Ｗ／Ｗ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を０．１ｍｌとり、これに酵素液を０．１ｍｌ加え、３５℃で１０分間インキュベートして反応させる。 反応後、ジニトロフタル酸溶液を０．４ｍｌ加え、反応を停止させ、ジニトロフタル酸法により遊離した還元糖量を測定する。

【００３４】対照には予め１００℃で１０分間加熱して失活させた酵素を上記と同様にして処理する。

【００３５】当該酵素の１単位とは上記条件下において１分間にショ糖１μｇを分解する酵素の量と定義する。

【００３６】［実施例２〜１７］実施例１の方法で製造した各菌株由来のＧＴＦ−Ｉを用いて、以下の条件でムタンを調製し、その収量を比較した。 結果を表１、２に示す。 なお、生成したムタンは実施例１の方法に従って洗浄及び乾燥を行った。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【表２】

【００３９】［比較例］比較例として、実際に発酵法でムタンを製造する場合の例を以下に示す。 培養条件使用菌株：Ｓ． ｓｏｂｒｉｎｕｓ ６７１５株 使用培地：ＴＴＹ培地 培養温度：３７℃ 培養環境：好気 Ｓｕｃ濃度：１０％ イノキュラムサイズ：１％ 培養日数：７日培地組成 ＴＴＹ培地 トリプチケース（ＢＢＬ） １５ｇ／Ｌ トリプトース（Ｄｉｆｃｏ） ４ｇ／Ｌ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ） ４ｇ／Ｌ Ｋ ₂ ＨＰＯ ₄ ２ｇ／Ｌ Ｎａ ₂ ＣＯ ₃ ２ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ２ｇ／Ｌ ＫＨ ₂ ＰＯ ₄ ５ｇ／Ｌ グルコース １０ｇ／Ｌ

【００４０】５Ｌの培養瓶を用い、１０％ショ糖を含む上記ＴＴＹ培地成分を３Ｌの脱イオン水中に溶解し、１
２１℃で２０分間のオートクレーブ処理を行った。 次いで、予めブレイン・ハート・インフュージョン培地（Ｂ
ＢＬ社製）で一晩前培養を行ったストレプトコッカス・
ソブリナス６７１５菌液を３０ｍｌ植菌し、３７℃で静置培養を行った。

【００４１】培養７日目に、得られた沈殿物（グルカンと菌体の混合物）を遠心分離により回収した。

【００４２】次に得られた沈殿物を１Ｎの水酸化ナトリウム溶液に溶解し室温で１時間放置した。 放置後遠心分離により除菌操作を行い、得られた上清は２Ｎの塩酸を用いて中和後、低温室に一晩放置しムタンを析出させた。 翌日析出したムタンを遠心分離で集め、脱イオン水で十分洗浄したのち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）に置換して、デキストラナーゼ処理を行い、α−
１，６−グルカンを切断除去した。

【００４３】デキストラナーゼ処理は上清中の還元糖がソモギーネルソン法で測定した場合にＯ． Ｄ６６０ｎｍ
の発色が０．１以下になるまで行った（３日ごとに緩衝液を交換し新たにデキストラナーゼを添加する方法で２
週間を要した）。

【００４４】Ｏ． Ｄの発色が０．１以下になったところで再度、アルカリ処理及び中和析出操作を行い、脱イオン水で洗浄したのち、凍結乾燥を行った。 この操作により、培地１Ｌ当たり約３．５ｇの白色粉末（ムタン）を得ることができた。

【００４５】上記条件で製造したムタンをＮＭＲを用い、実施例１の条件で分析したところ、α−１，６−結合は、７．２％検出された。 結果を表３に示す。

【００４６】

【表３】

【００４７】上記の結果より、一般的な発酵法で調製した場合はＮＭＲの検出限界以下までα−１，６−鎖を除去することは困難であり、かつ、得られるムタン収量は１Ｌ当たり３ｇ前後である。 従って、組換え酵素法を用いることで、純度のアップを図ることができると共に、
反応ｐＨを５．０〜７．０、反応温度を２５〜４５℃に設定することにより、およそ一桁の収量アップが見込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたムタンのＮＭＲチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 木川 博光 東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライオ ン株式会社内 (72)発明者 滝野 康子 東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライオ ン株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 CA02 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA26X AA49Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA60