一个白及内参基因EF1α及其应用
阅读：514发布：2020-05-17
专利汇可以提供一个白及内参基因EF1α及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 属于白及基因工程技术领域，具体涉及一个白及内参基因EF1α及其应用 专利 申请事宜。该基因包括620bp 碱 基，如SEQ ID NO.1所示。该基因可作为内参基因用于分析评价相关功能基因、例如 蔗糖 合成酶 基因（SS）的表达情况。总体而言，本申请中首次对白及中的EF1α基因进行了克隆，并对其作为内参基因的功能做了初步研究，结果表明，其可以较好地作为内参基因加以应用，能够较为准确的为相关基因的 荧光 定量表达分析奠定应用 基础 ，具有较好地实用价值和科研应用价值。，下面是一个白及内参基因EF1α及其应用专利的具体信息内容。
1.一个白及内参基因EF1α，其特征在于，该基因包括620bp碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ACATCAACATTGTGGTCATTGGTCATGTCGACTCTGGGAAATCGACCACCACTGGTCATCTCATATACAAGCTTGGCGGTATTGATAAACGTGTGATCGAGAGGTTTGAGAAGGAAGCTGCTGAGATGAACAAAAGATCATTCAAGTACGCATGGGTGCTCGACAAGCTCAAAGCTGAGCGTGAGCGCGGTATTACCATTGATATCGCTCTGTGGAAATTCGAGACCACGAAATACTATTGCACTGTCATTGATGCCCCCGGACATCGCGATTTTATCAAGAACATGATCACCGGAACCTCTCAGGCAGATTGTGCCGTCCTTATTATTGATTCCACGACTGGAGGCTTTGAAGCTGGTATCTCCAAAGATGGCCAGACTCGTGAACATGCCCTCCTTGCTTTTACTCTCGGTGTTAAACAGATGATTTGTTGCTGCAACAAGATGGATGCAACTACACCCAAGTACTCAAAAGCAAGGTATGATGAGATTGTGAAGGAGGTTTCCTCCTACCTCAAGAAGGTTGGTTACAATCCTGATAAGATCCCATTTGTACCAATCTCCGGATTCGAAGGTGACAACATGATTGACAGATCAACCAACCTTGACTGGTACAAAGGC。
2.权利要求1所述白及内参基因EF1α的制备方法，其特征在于，采用PCR扩增获得，PCR扩增时，具体引物序列设计如下：
EF1aF，5'-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3'，
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG-3。
3.权利要求1所述白及内参基因EF1α在白及中的应用，其特征在于，作为内参基因应用。
4.如权利要求3所述白及内参基因EF1α在白及中的应用，其特征在于，EF1α作为内参基因用于功能基因蔗糖合成酶基因的分析。
5.利用权利要求1所述白及内参基因EF1α的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，检测分析时，引物序列设计如下：
QBJEF1aF: 5'-GCCGTCCTTATTATTGATTCCA-3'，
QBJEF1aR: 5'-GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA-3'。
一个白及内参基因EF1α及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 白及（Bletilla striata），又白芨，属兰科白及属（白及属共有6种，均产于东亚），多年生草本，高20～50厘米，叶4～5枚，基部互相套叠成茎状，中央抽出花葶，总状花序具数朵花，地下有粗厚的块茎，如鸡头状，富粘性，含白及胶质，即白及甘露聚糖，可供药用，有止血补肺、生肌止痛之效，同时也常作糊料应用。
[0003] 植物基因组研究中，就EF1α基因表达研究而言，一般认为其基因表达及调控非常保守，几乎存在于每个细胞内，仅次于肌动蛋白，在真核生物体内属于数量较多的一类蛋白。就其功能研究而言，一般认为EF1α是主要的翻译因子之一，主要用于调控蛋白质的翻译过程，是一种在蛋白质合成中起重要作用的延伸因子。另有研究认为，其还与细胞生长与增殖速度有关，除参与翻译控制、应激反应、细胞生长和运动性有关的信号传导外，还可与细胞结构结合，如细胞骨架和有丝分裂装置等，与细胞骨架的结合可以显著提高蛋白质的翻译。但总体而言，随物种不同、表达部位不同，其功能也有所不同。例如，有研究发现，eEF1A在香蕉果实采摘后的不同时期以及在香蕉不同器官中的表达都有差异，即其在细胞中的表达并不是恒定不变，在不同的生理状态下，不同的细胞类型中都有差异。
[0004] 总之，就EF1α基因研究而言，在多种植物中均可以克隆获得，如：蝴蝶兰、油桐、油棕、玉米、拟南芥、苹果、沙梨、碧桃、可可树、中果咖啡、亚麻芥、金丝小枣、甘蔗、棉花、玫瑰和水稻等等，但在白及中，尚未见到有关该基因的相关报道。发明内容
[0005] 鉴于EF1α基因功能的多样性和重要性，本申请对白及中EF1α基因及其功能进行了研究，从而为白及相关基因工程工作开展奠定基础。
[0006] 本申请所采取的技术方案详述如下。
[0007] 一个白及内参基因EF1α，包括620bp碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：ACATCAACATTGTGGTCATTGGTCATGTCGACTCTGGGAAATCGACCACCACTGGTCATCTCATATACAAGCTTGGCGGTATTGATAAACGTGTGATCGAGAGGTTTGAGAAGGAAGCTGCTGAGATGAACAAAAGATCATTCAAGTACGCATGGGTGCTCGACAAGCTCAAAGCTGAGCGTGAGCGCGGTATTACCATTGATATCGCTCTGTGGAAATTCGAGACCACGAAATACTATTGCACTGTCATTGATGCCCCCGGACATCGCGATTTTATCAAGAACATGATCACCGGAACCTCTCAGGCAGATTGTGCCGTCCTTATTATTGATTCCACGACTGGAGGCTTTGAAGCTGGTATCTCCAAAGATGGCCAGACTCGTGAACATGCCCTCCTTGCTTTTACTCTCGGTGTTAAACAGATGATTTGTTGCTGCAACAAGATGGATGCAACTACACCCAAGTACTCAAAAGCAAGGTATGATGAGATTGTGAAGGAGGTTTCCTCCTACCTCAAGAAGGTTGGTTACAATCCTGATAAGATCCCATTTGTACCAATCTCCGGATTCGAAGGTGACAACATGATTGACAGATCAACCAACCTTGACTGGTACAAAGGC。
[0008] 所述白及内参基因EF1α的制备方法，采用PCR扩增获得，PCR扩增时，具体引物序列设计如下：EF1aF，5'-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3'，
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG-3'。
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG-3'。
[0009] 所述白及内参基因EF1α在白及中的应用，作为内参基因应用，用于分析评价相关功能基因表达情况，所述功能基因例如为蔗糖合成酶基因（SS）； qRT-PCR分析蔗糖合成酶基因（SS）时，引物序列参考设计如下：QSSF755:5'- TTTGGGTTATCCTGACACTGGT-3'，
QSSR981: 5'-TCCTGAAGGGAACCCGAAG-3'。
QSSR981: 5'-TCCTGAAGGGAACCCGAAG-3'。
[0010] 利用所述白及内参基因EF1α的实时荧光定量PCR检测方法，检测分析时，引物序列设计如下：QBJEF1aF: 5'-GCCGTCCTTATTATTGATTCCA-3'，
QBJEF1aR: 5'-GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA-3'。
QBJEF1aR: 5'-GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA-3'。
[0011] 总体而言，本申请首次对白及中的EF1α基因进行了克隆，并对其作为内参基因的功能做了初步研究，结果表明，其可以较好地作为内参基因加以应用，能够较为准确的为相关基因的荧光定量表达分析奠定应用基础，具有较好地实用价值和科研应用价值。附图说明
[0012] 图1 为EF1a基因熔解曲线；图2为白及EF1a基因在不同发育阶段不同组织的实时荧光定量PCR的荧光阈值；
图3为白及EF1a基因在不同发育阶段不同组织的表达情况；
图4 为EF1a基因实时荧光定量PCR的标准曲线；
图5 为EF1a作为内参基因用于研究白及SS基因的时空表达特性（图注：MY:幼苗期叶，MG:幼苗期根，1Y：一年生叶，1G：1年生根，1K：一年生块茎，2Y：二年生叶，2G：二年生根，2K：
二年生块茎）；
图6 为TUB作为内参基因用于研究白及SS基因的时空表达特性（图注：MY:幼苗期叶，MG:幼苗期根，1Y：一年生叶，1G：1年生根，1K：一年生块茎，2Y：二年生叶，2G：二年生根，2K：
二年生块茎）。
图3为白及EF1a基因在不同发育阶段不同组织的表达情况；
图4 为EF1a基因实时荧光定量PCR的标准曲线；
图5 为EF1a作为内参基因用于研究白及SS基因的时空表达特性（图注：MY:幼苗期叶，MG:幼苗期根，1Y：一年生叶，1G：1年生根，1K：一年生块茎，2Y：二年生叶，2G：二年生根，2K：
二年生块茎）；
图6 为TUB作为内参基因用于研究白及SS基因的时空表达特性（图注：MY:幼苗期叶，MG:幼苗期根，1Y：一年生叶，1G：1年生根，1K：一年生块茎，2Y：二年生叶，2G：二年生根，2K：
二年生块茎）。
具体实施方式
[0014] 生物材料：白及，常见观赏花卉植物，相关材料取自郑州师范学院兰花工程技术中心智能日光温室内；
相关引物序列合成及测序工作由上海英俊生物技术公司提供完成；
实验试剂：
氨苄青霉素、IPTG、X-Gal、DH5α感受态细胞、pMD19-T载体、SYBR® Premix Ex TaqTM（qRT-PCR用）等，购自TaKaRA公司；
凝胶回收试剂盒、RNAprep多糖多酚植物总RNA提取试剂盒等，购自天根试剂公司；
实验设备：
荧光定量PCR仪 eppendorf realplex2，德国 Biometra公司产品；
微量紫外可见分光光度计（RNA浓度测定用），美国Quawell Q5000。
相关引物序列合成及测序工作由上海英俊生物技术公司提供完成；
实验试剂：
氨苄青霉素、IPTG、X-Gal、DH5α感受态细胞、pMD19-T载体、SYBR® Premix Ex TaqTM（qRT-PCR用）等，购自TaKaRA公司；
凝胶回收试剂盒、RNAprep多糖多酚植物总RNA提取试剂盒等，购自天根试剂公司；
实验设备：
荧光定量PCR仪 eppendorf realplex2，德国 Biometra公司产品；
微量紫外可见分光光度计（RNA浓度测定用），美国Quawell Q5000。
[0015] 实施例1本实施例主要对白及内参基因EF1α的克隆获得过程简要介绍说明如下。
[0016] （1）RNA的提取及cDNA的合成分别取白及幼苗期叶和根，一年生的根、块茎、叶，二年生的根、块茎、叶作为样品，随机取三个样品混匀，将样品在液氮中研磨；
参考试剂盒说明书，利用RNAprep多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取不同样品的总RNA，并利用琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取总RNA的完整性；同时，测定总RNA的A260/A280值和A260/A230值，以及测定所提取总RNA浓度。
参考试剂盒说明书，利用RNAprep多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取不同样品的总RNA，并利用琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取总RNA的完整性；同时，测定总RNA的A260/A280值和A260/A230值，以及测定所提取总RNA浓度。
[0017] 电泳检测结果分析表明：28S、18S、5S条带清晰，28S条带的亮度大约是18S的2倍；计算结果表明：OD260/280为1.8～2.1；检测结果表明：总RNA浓度在400-800 ng/µL之间。这些结果表明，所提取总RNA质量较好，提取的总RNA完整性较好，不同样品所提取结果较为稳定和一致，均可用于后续反转录cDNA制备用。
[0018] 进一步地，参考说明书，利用RevertAid TM First strand cDNA synthesis Kit合成制备第一链cDNA，直接应用，或者将所制备cDNA在-20℃条件下保存备用。
[0019] （2）PCR扩增基于已知的石斛、蝴蝶兰、花生、甘蔗、枸杞等同源DNA保守序列，采用primer5.0设计了
1对PCR克隆白及EF1α基因的简并引物序列如下：
EF1aF，5'-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3'，
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG-3'；
以步骤（1）中所制备cDNA为模板，20μL反应体系设计如下：
10×PCR buffer，2.0 µL；
dNTP(2.5 µmol/L)，1.6 µL；
MgCl2（25µmol/L)，1.5 µL；
EF1aF、EF1aR引物(10µmol/L)，各1.0µL；
Taq DNA聚合酶(5U/µL)，0.2 µL；
模板cDNA，1.0 µL；
ddH2O补足至20 µL；
反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30s，59℃复性30 s，72℃延伸40s，33个循环；最后72℃延伸8 min。
1对PCR克隆白及EF1α基因的简并引物序列如下：
EF1aF，5'-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3'，
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG-3'；
以步骤（1）中所制备cDNA为模板，20μL反应体系设计如下：
10×PCR buffer，2.0 µL；
dNTP(2.5 µmol/L)，1.6 µL；
MgCl2（25µmol/L)，1.5 µL；
EF1aF、EF1aR引物(10µmol/L)，各1.0µL；
Taq DNA聚合酶(5U/µL)，0.2 µL；
模板cDNA，1.0 µL；
ddH2O补足至20 µL；
反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30s，59℃复性30 s，72℃延伸40s，33个循环；最后72℃延伸8 min。
[0020] PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，凝胶回收。
[0021] （3）对PCR扩增所得EF1α基因进行鉴定分析取步骤（2）中回收的PCR扩增产物3.5 µL，按照现有技术，与pGEM-Teasy vector进行连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选后，挑选阳性单克隆进行扩增并进行菌液PCR鉴定，对鉴定正确菌株提取质粒进行测序分析，并进一步进行BLAST分析，以确保测序结果的准确性。
[0022] 最终测序结果分析表明， 本申请中扩增所得白及EF1α基因，包括620bp，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：ACATCAACATTGTGGTCATTGGTCATGTCGACTCTGGGAAATCGACCACCACTGGTCATCTCATATACAAGCTTGGCGGTATTGATAAACGTGTGATCGAGAGGTTTGAGAAGGAAGCTGCTGAGATGAACAAAAGATCATTCAAGTACGCATGGGTGCTCGACAAGCTCAAAGCTGAGCGTGAGCGCGGTATTACCATTGATATCGCTCTGTGGAAATTCGAGACCACGAAATACTATTGCACTGTCATTGATGCCCCCGGACATCGCGATTTTATCAAGAACATGATCACCGGAACCTCTCAGGCAGATTGTGCCGTCCTTATTATTGATTCCACGACTGGAGGCTTTGAAGCTGGTATCTCCAAAGATGGCCAGACTCGTGAACATGCCCTCCTTGCTTTTACTCTCGGTGTTAAACAGATGATTTGTTGCTGCAACAAGATGGATGCAACTACACCCAAGTACTCAAAAGCAAGGTATGATGAGATTGTGAAGGAGGTTTCCTCCTACCTCAAGAAGGTTGGTTACAATCCTGATAAGATCCCATTTGTACCAATCTCCGGATTCGAAGGTGACAACATGATTGACAGATCAACCAACCTTGACTGGTACAAAGGC。
[0023] 实施例2综合分析后，发明人初步认为白及的EF1α基因具有作为内参基因应用潜力，为检验此结论的正确性，需要对不同时期白及中EF1α基因的实时表达情况进行检测分析，相关实验过程简要介绍说明如下。
[0024] （1）q RT-PCR（Real-time quantitative PCR，荧光定量PCR）引物设计基于实施例1中的测序结果，设计q RT-PCR分析时引物序列如下：QBJEF1aF: 5'-GCCGTCCTTATTATTGATTCCA-3'，
QBJEF1aR: 5'-GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA-3'；
扩增产物长度为233bp；
（2）荧光定量PCR反应
以实施例1中所制备的不同组织样品的cDNA混匀品为标准品（样品为：白及幼苗期叶和根，一年生的根、块茎、叶，二年生的根、块茎、叶，混匀时，取等量8种组织的cDNA样品进行混匀操作），制备稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍及未稀释样品5个梯度，分别以5个梯度的cDNA为模板，以步骤（1）中所设计q RT-PCR 引物为引物，采用三步法 qRT-PCR检测，
20μL 反应体系包括：
10μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa）、
0.8μL的上下游基因特异性引物及各个样本的 cDNA 6.0μL，
并补 dH2O至20μL。
QBJEF1aR: 5'-GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA-3'；
扩增产物长度为233bp；
（2）荧光定量PCR反应
以实施例1中所制备的不同组织样品的cDNA混匀品为标准品（样品为：白及幼苗期叶和根，一年生的根、块茎、叶，二年生的根、块茎、叶，混匀时，取等量8种组织的cDNA样品进行混匀操作），制备稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍及未稀释样品5个梯度，分别以5个梯度的cDNA为模板，以步骤（1）中所设计q RT-PCR 引物为引物，采用三步法 qRT-PCR检测，
20μL 反应体系包括：
10μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa）、
0.8μL的上下游基因特异性引物及各个样本的 cDNA 6.0μL，
并补 dH2O至20μL。
[0025] 反应程序为：预变性95℃、30 s；95℃变性15 s；58.5退火15 s；72℃延伸30 s，40个循环。
[0026] 由实时荧光定量PCR仪自动生成标准曲线和熔解曲线，并计算扩增效率和相关系数。
[0027] 荧光定量PCR结果如图1所示，分析可以看出，熔解曲线为单峰，显示所设计扩增用引物特异性强；由实时荧光定量PCR的荧光阈值变化分析基因的表达情况，可以看出，8种组织的循环荧光阈值平均值为25.10-28.54（图2）；以凝胶电泳的形式显示EF1a基因的表达情况，凝胶电泳带亮度一致，确定EF1a片段序列表达具有稳定性（图3）。
[0028] 由标准曲线可见（图4），qRT-PCR的扩增效率为95%，相关系数为0.998，得到y=-3.381x+22.08的标准曲线，在8种组织中的循环阈值平均值为22.67-26.06，显示特异引物的qRT-PCR数据可靠有效，适用于白及营养生长期的不同组织的qRT-PCR的分析。
[0029] 实施例3基于实施例2的分析，以EF1a作为内参基因，发明人以蔗糖合成酶基因（SS）为例，对其在白及中的表达情况做了检测分析，相关实验过程简要介绍如下。
[0030] （1）引物设计荧光定量PCR检测蔗糖合成酶基因（SS）时，qRT-PCR引物设计如下：
QSSF755:5'- TTTGGGTTATCCTGACACTGGT-3'，
QSSR981: 5'-TCCTGAAGGGAACCCGAAG-3'；
（2）qRT-PCR检测
以白及不同发育阶段不同组织部位样品（幼苗期叶和根，一年生的根、块茎、叶，二年生的根、块茎、叶），参考实施例1操作，提取总RNA，并反转录为cDNA，以此为模板；
利用实施例2中引物QBJEF1aF、QBJEF1aR，以EF1a为内参基因，同时利用步骤（1）中引物QSSF755、QSSR981，进行荧光定量PCR；
20μL反应体系设计如下：
2×SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa），10μL；
特异性引物，0.8μL
cDNA，2.0μL；
ddH2O补至20μL；
反应程序：95℃预变性30s，95℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸30s，共41个循环。
QSSF755:5'- TTTGGGTTATCCTGACACTGGT-3'，
QSSR981: 5'-TCCTGAAGGGAACCCGAAG-3'；
（2）qRT-PCR检测
以白及不同发育阶段不同组织部位样品（幼苗期叶和根，一年生的根、块茎、叶，二年生的根、块茎、叶），参考实施例1操作，提取总RNA，并反转录为cDNA，以此为模板；
利用实施例2中引物QBJEF1aF、QBJEF1aR，以EF1a为内参基因，同时利用步骤（1）中引物QSSF755、QSSR981，进行荧光定量PCR；
20μL反应体系设计如下：
2×SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa），10μL；
特异性引物，0.8μL
cDNA，2.0μL；
ddH2O补至20μL；
反应程序：95℃预变性30s，95℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸30s，共41个循环。
[0031] PCR结果按照相对表达量Rel. Exp = 2-ΔΔCt计算，其中：ΔCt =Ct (SS) - Ct (EF1a)，ΔΔ Ct =(白及各个组织ΔCt) - (一年生根ΔCt)。
[0032] 以蒸馏水为阴性对照，目的基因SS和内参基因EF1a的退火温度均为58℃，每个样品3重复，SS实时荧光定量PCR设计长度为227bp。蔗糖合成酶基因（SS）的实时荧光定量PCR检测结果显示：
在白及幼苗期、一年生苗和二年生苗中都有表达，说明SS基因的表达没有组织特异性；
但是在幼苗期的叶、一年生的叶和二年生的叶中的表达量最高，根中的表达量较高，在块茎中的表达量最低；
另一方面，在白及叶子中的表达具有时间的特异性，二年生叶的表达量最高，其次为一年生叶，苗期叶的表达量最低；即：随着种植年限的增加，SS基因的表达量也呈增加趋势；相反，SS基因在块茎中的表达是随着白及种植年限的增加呈下降的趋势（图5），内参基因的CT值也是趋于稳定的；
综上可以得到结论如下：SS基因的表达没有组织特异性，而在白芨叶子和块茎中的表达具有时间的特异性。
在白及幼苗期、一年生苗和二年生苗中都有表达，说明SS基因的表达没有组织特异性；
但是在幼苗期的叶、一年生的叶和二年生的叶中的表达量最高，根中的表达量较高，在块茎中的表达量最低；
另一方面，在白及叶子中的表达具有时间的特异性，二年生叶的表达量最高，其次为一年生叶，苗期叶的表达量最低；即：随着种植年限的增加，SS基因的表达量也呈增加趋势；相反，SS基因在块茎中的表达是随着白及种植年限的增加呈下降的趋势（图5），内参基因的CT值也是趋于稳定的；
综上可以得到结论如下：SS基因的表达没有组织特异性，而在白芨叶子和块茎中的表达具有时间的特异性。
[0033] 实施例4为进一步考察EF1a在作为内参基因应用时结果的准确性，参考实施例3的操作，本申请以常用的TUB基因作为内参基因，对白及中的蔗糖合成酶基因（SS）的表达情况进行了分析，相关过程简要介绍如下。
[0034] 白及样品同实施例3，设计qRT-PCR反应时TUB基因引物序列如下：QTUBF: 5'- GGAGGGCAATGTGGCAA-3'，
QTUBR: 5'- TAAGCACAGCCCTCGGAAC-3'；
利用实施例2中引物QBJEF1aF、QBJEF1aR，以TUB基因为内参基因，同时利用实施例3中引物QSSF755、QSSR981，进行荧光定量PCR；
反应体系及反应程序参考实施例3；每个样品3重复，TUB长度为172bp。
以内参基因TUB进行的蔗糖合成酶基因（SS）的实时荧光定量PCR结果如图6所示，分析可以看出：SS基因在白及的各个组织内都有表达，说明SS基因的表达没有组织特异性，但是在幼苗期的叶、一年生的叶和二年生的叶中的表达量最高，在块茎中的表达量最低；同时，SS基因在白及叶中的表达具有时间的特异性，二年生叶的表达量最高，其次为一年生叶，苗期叶的表达量最低，随着种植年限的增加SS基因的表达量也呈增加趋势；另一方面，SS基因在块茎中的表达是随着白及种植年限的增加呈下降的趋势。
QTUBR: 5'- TAAGCACAGCCCTCGGAAC-3'；
利用实施例2中引物QBJEF1aF、QBJEF1aR，以TUB基因为内参基因，同时利用实施例3中引物QSSF755、QSSR981，进行荧光定量PCR；
反应体系及反应程序参考实施例3；每个样品3重复，TUB长度为172bp。
以内参基因TUB进行的蔗糖合成酶基因（SS）的实时荧光定量PCR结果如图6所示，分析可以看出：SS基因在白及的各个组织内都有表达，说明SS基因的表达没有组织特异性，但是在幼苗期的叶、一年生的叶和二年生的叶中的表达量最高，在块茎中的表达量最低；同时，SS基因在白及叶中的表达具有时间的特异性，二年生叶的表达量最高，其次为一年生叶，苗期叶的表达量最低，随着种植年限的增加SS基因的表达量也呈增加趋势；另一方面，SS基因在块茎中的表达是随着白及种植年限的增加呈下降的趋势。
[0035] 上述分析结果与与EF1a作为内参基因分析白及SS基因的时空表达特性结果一致，说明EF1a作为内参基因在分析相关目的基因时是可行的，结论也是较为准确的。
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