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修饰目的基因表达的组合物和方法

阅读：908发布：2020-05-18

专利汇可以提供修饰目的基因表达的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于在果实胚乳中表达目的基因的特定启动子。本发明还描述含有该启动子的DNA构建体，以及使用这些构建体产生植物、植物细胞或原生质体的方法。专一地在目的器官中表达转基因使得能够仅在果实中积累外源转录物，并且相对于组成型表达来说是有利的，因为它使得更容易实现一些策略，这些策略的目的在于获得具有更高的附加值的品种，如：对环境胁迫的适应性，对病原体、害虫和农业防御措施的耐受性，营养和治疗价值的增加以及植物体中表达系统的新的替代，以更低的成本产生更具有竞争力的品种。此外，本发明还描述了具有组成型表达的序列，当需要组成型表达时为表达系统的实现提供替代。本发明的目的在于增加与转基因转化相关的经济、社会和环境效益，以及基因工程的生物安全性。，下面是修饰目的基因表达的组合物和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.具有组织特异性活性的多核苷酸，其特征在于包含选自下列的序列：
a) 与SEQ ID NO1基本上相似的序列；
b) SEQ ID NO1中所述序列的互补序列；
c) SEQ ID NO1中所述序列的反向互补序列；
d) SEQ ID NO1中所述序列的反向序列。
2.嵌合基因，其特征在于包含：
a) 多核苷酸，其具有与SEQ ID NO1基本上相似的序列，可操作地连接到增强表达的序列或目的启动子；可操作地连接到
b) 目的多核苷酸序列。
3.根据权利要求2的嵌合基因，其特征在于所述目的多核苷酸序列可以是编码区或非编码区。
4.根据权利要求3的嵌合基因，其特征在于所述编码区是从内源或异源基因分离的。
5.根据权利要求2的嵌合基因，其特征在于所述目的多核苷酸序列可以是有义方向或反义方向的。
6.根据权利要求2的嵌合基因，其特征在于表达增强序列尤其选自SV40、HSV-1、AMV、HPV016。
7.重组载体，其特征在于含有根据权利要求2的嵌合基因。
8.重组载体，其特征在于包含：
a) 多核苷酸，其具有与SEQ ID NO1基本上相似的序列，可操作地连接到增强表达的序列或目的启动子；可操作地连接到
b) 目的多核苷酸序列；和
c) 终止序列。
9.根据权利要求8的重组载体，其特征在于所述目的多核苷酸序列可以是编码区或非编码区。
10.根据权利要求8的重组载体，其特征在于所述目的多核苷酸序列是从内源或异源基因分离的。
11.根据权利要求8的重组载体，其特征在于所述终止序列选自SV40终止信号、HSV TK腺苷酰化信号、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefasciens)胭脂碱合成酶基因(NOS)的终止信号、CaMV的基因19S和35S的终止信号、玉米乙醇脱氢酶的终止信号、甘露碱合成酶基因的终止信号、β-faseoline基因的终止信号、ssRUBISCO基因的终止信号、蔗糖合成酶基因的终止信号、攻击地三叶(Trifolium subterranean)的病毒(SCSV)的终止信号、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因的终止信号和其它类似的终止信号。
12.根据权利要求8的重组载体，其特征在于表达增强序列尤其选自SV40、HSV-1、AMV、HPV016。
13.生产转化的细胞的方法，所述转化的细胞的特征在于含有根据权利要求7-12任一项的重组载体。
14.生产植物或其部分、繁殖体或后代的方法，所述植物或其部分、繁殖体或后代的特征在于包含根据权利要求7-12任一项的重组载体。
15.在生物体中改变基因表达的方法，其特征在于将根据权利要求7-12任一项的重组载体或根据权利要求2-6任一项的嵌合基因稳定掺入到所述生物体的基因组中。
16.根据权利要求15的方法，其特征在于所述生物体是植物。
17.产生具有改变的基因表达的植物的方法，其特征在于包含下述步骤：
a) 用根据权利要求7-12任一项的重组载体，或根据权利要求2-6任一项的嵌合基因转化植物细胞、组织细胞、器官细胞或胚胎细胞；
b) 选择转化的细胞、细胞愈伤组织、胚胎或种子；
c) 从步骤(b)中选择的转化的细胞、细胞愈伤组织、胚胎或种子再生成熟植物；
d) 选择与非转化植物相比具有改变的基因表达的步骤(c)的成熟植物。

说明书全文

修饰目的基因表达的组合物和方法

[0001] 本申请是国际申请日为2013年04月09日、国际申请号为PCT/BR2013/000110、进入国家阶段的申请号为201380030230.6、发明名称为“修饰目的基因表达的组合物和方法”的PCT申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于在果实胚乳中表达目的基因的特定启动子。本发明进一步描述含有与异源和/或内源基因可操作连接的本发明启动子的DNA构建体。此外，本发明涉及这些构建体以表达载体，重组载体形式的使用和在植物，植物细胞或转基因原生质体中的使用。本发明进一步描述使用这种含有本发明启动子的构建体产生植物，植物细胞或转基因原生质体的方法。因此，仅在目的部分表达转基因使得能够仅在果实中积累外源转录物，这有利于实现一些策略，这些策略目的在于除了具有高营养价值和高治疗价值的植物之外，还在于增加附加值，产生更适应环境胁迫，病原体和害虫，农业防御措施的品种。除了这些优点，本发明还是植物体中表达系统的新的替代，并可用于产生新的品种和改良方案。本发明的目的在于增加与转基因转化相关的经济，社会，环境和生物安全性利益。

背景技术

[0003]在过去的三十年，农业得益于与重组DNA技术相关的生物技术，植物组织的培养和用于产生除了具有更高营养价值(Aluru, M., Xu, Y., Guo, R., Wang, Z., Li, S., White, W., Wang, K. & Rodermel, S. 2008 Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content. J. Exp. Bot., v. 59, n. 3, p. 3551–3562)和更高治疗价值(Marcondes, J. & Hansen, E. 2008 Transgenic lettuce seedlings carrying hepatitis B virus antigen HBsAg. Braz. J. Infect. Dis., v.12, n. 6, p. 469-
471)的植物之外，还有对除草剂有更强抗性的(Aragão, F.J.L., Vianna, G. R., Albino, M.M.C. & Rech, E.L. 2002 Transgenic Dry Bean Tolerant to the Herbicide Glufosinate Ammonium. Crop Science, v. 42, n. 4, p. 1298-1302)，对昆虫害虫 (insetos-praga) 有更强抗性的(Lilley C. J., Wang D., Atkinson H. J. & Urwin P. E. 2010 Effective delivery of a nematode-repellent peptide using.Plant Biotechnology Journal, pp. 1–11 doi: 10.1111/j.1467-
7652.2010.00542.x，a root-cap-specific promoter)和耐旱的 (tolerant do drought) (Quan R, Hu S, Zhang Z, Zhang H, Zhang Z, Huang R. Overexpression of an ERF transcription factor TSRF1 improves rice drought tolerance. Plant Biotechnol J. 2010 May 1;8(4):476-88)的植物的经典改良方法。综合起来，这些特性导致生产增加，经济收益，种群质量的提高和环境的保护。通过转基因技术，能够引入目的基因，而不管其种间屏障。

[0004] 尽管基因转化存在相关的经济，社会和环境利益，由于生物安全性问题，这种技术已成为在消费者和环保主义者一边的关注对象。

[0005] 来自于文献的数据根据各代转基因的出现指明了基因转化应用的进展。第一和第二代的转基因植物使用组成型启动子，如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S) (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985 Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812)，在根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的T-DNA中发现的基因启动子，例如欧乌头碱合成酶(nepaline sintase)基因启动子(Bevan, M. W., Barnes, W. M. & Chilton, M. D. 1983 Structure and transcription of the nopaline syntase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Research, v.11, n. 2, p. 369-385)和编码高度保守的并且在几乎所有生物体的生命过程中涉及的蛋白如泛素(Toki S., Takamatsu S., Nojiri C., Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A.H., Quail P.H. & Uchimiya H. 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants. Plant Physiol. Nov;100(3):1503-7)和肌动蛋白(An Y.Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S. & Meagher R.B.
1996 Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. Plant J. Jul;10(1):107-21)的基因的启动子。但是，第三代转基因植物的特征在于，尤其是使用组织特异性启动子如表皮细胞特异性启动子 (Hooker T.S., Millar A.A. & Kunst L. 2002. Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis. Plant Physiol. Aug;129(4):1568-80)，韧皮部(of phoem)特异性启动子 (Okumoto S., Koch W., Tegeder M., Fischer W.N., Biehl A., Leister D., Stierhof Y.D. & Frommer W.B. 2004. Root phloem-specific expression of the plasma membrane amino acid proton co-transporter AAP3. J Exp Bot. Oct;55(406):2155-68)，花粉(de pólen)特异性启动子(Wakeley PR, Rogers HJ, Rozycka M, Greenland AJ, Hussey PJ. A maize pectin methylesterase-like gene, ZmC5, specifically expressed in pollen. Plant Mol Biol. 1998 May;37(1):187-92)或胁迫诱导型启动子 (Himmelbach A., Liu L., Zierold U., Altschmied L., Maucher H., Beier F., Müller D., Hensel G., Heise A., Schützendübel A., Kumlehn J. & Schweizer P. 2010. Promoters of the barley germin-like GER4 gene cluster enable strong transgene expression in response to pathogen attack. Plant Cell. 2010. Mar; 22(3):937-
52. Epub Mar 19)，非生物胁迫诱导型启动子(Rai M., He C. & Wu R. 2009. Comparative functional analysis of three abiotic stress-inducible promoters in transgenic rice. Transgenic Res. Oct;18(5):787-99)和化学诱导型启动子(Tomsett, A. Tregova, A. Garoosi and M. Caddick, Ethanol-inducible gene expression: first step towards a new green revolution , Trends Plant Sci. 9 (2004), pp. 159–161)以促进精确转基因的表达并仅在需要时表达。

[0006] 获得并制造能够在时间和/或空间上限制基因表达的可用的启动子可以是平衡转基因的利益和其限制的一条途径。

[0007] 启动子是一套转录控制组件，位于酶聚合酶II的酶起始位点附近 (Potenza, C.; Aleman, L. & Sengupta-Gopalan, C. 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular Development Biological-Plant v. 40, p.1–22)，其含有被转录相关蛋白识别的特定序列。基于其表达模式，不同类别的启动子已在文献中被描述。其中组成型启动子在所有组织中以及在生物体发育的所有阶段都具有活性，例如CaMV35S (Odell, J.T., Nagy, F. & Chua, N-H. 1985. Identification of DNA sequences required for the activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, v. 313, p. 810-812)。另一方面，组织/器官特异性启动子仅促进其相关基因在其组织/器官靶标中如果实 (Atkinson R.G., Bolitho K.M., Wright M.A., Iturriagagoitia-Bueno T., Reid S.J. & Ross G.S. 1998 Apple ACC-oxidase and polygalacturonase: ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato. Plant Mol Biol. Oct; 38(3):449-60)、谷物种子(Paine J.A., Shipton C.A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy M.J., Vernon G., Wright S.Y., Hinchliffe E., Adams J.L., Silverstone A.L. & Drake R. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat Biotechnol. Apr;23(4):482-7)、根/小块茎(Visser R.G., Stolte A. & Jacobsen E. 1991. Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants. Plant Mol Biol. Oct;17(4):691-9)、花 (Annadana S., Beekwilder M.J., Kuipers G., Visser P.B., Outchkourov N., Pereira A., Udayakumar M., De Jong J. & Jongsma M.A. 2002. Cloning of the chrysanthemum UEP1 promoter and comparative expression in florets and leaves of Dendranthema grandiflora. Transgenic Res. Aug;11(4):437-45)、叶 (Nomura M., Katayama K., Nishimura A., Ishida Y., Ohta S., Komari T., Miyao-Tokutomi M., Tajima S. & Matsuoka M. 2000. The promoter of rbcS in a C3 plant (rice) directs organ-specific, light-dependent expression in a C4 plant (maize), but does not confer bundle sheath cell-specific expression. Plant Mol Biol. Sep;
44(1):99-106)中表达。还有响应性或诱导型启动子，其由确定的情况激活，对生物，非生物或化学胁迫做出响应。从给定生物体分离的启动子可以用于通过嵌合基因构建体调节另一种生物体的基因。

[0008] 对于植物来说，有无数组织特异性启动子被描述，如在种子(WO8903887)、小块茎(如专利申请US20030175783, Keil 等, 1989 EMBO J. 8: 1323:1330中所提及的)、叶(如专利申请US20030175783, Hudspeth 等, 1989 Plant Mol Biol 12:579-589中所提及的)、茎(如专利申请US20030175783, Keller 等, 1988 EMBO J. 7: 3625-3633中所提及的)、维管组织(如专利申请US20030175783, Peleman 等, 1989 Gene 84: 359-369 和 Schmülling 等 (1989) Plant Cell 1, 665-670中所提及的)，根(US20060143735和专利申请US20030175783, Keller 等, 1989 Genes Devel. 3:1639-1646中所提及的)、雄蕊(WO8910396, WO9213956)、裂区特异性启动子(WO9713865)、分生组织(Ito 等 (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878) 和果实(Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 和 US5753475，在后者文献中所提及的序列对于果皮具有特异性作用)中特异性表达的情况。

[0009] 在本发明中，我们提出从咖啡植物(咖啡属(Coffea ssp))中分离的启动子，对果实胚乳具有特异性。胚乳是籽粒的消耗部分，具有很大的经济利益，在胚乳中特异性表达目的蛋白的可能性可用于引入与营养品质，感官特性，收获期后阶段的优点相关的特性。目前，用于获得商业转基因的启动子通常是组成型的，其在植物的所有组织中以及在发育的所有阶段促进转基因的表达。这种特性在植物中需要能量耗损，因为蛋白以不必要的量并且在不必要的部位的产生会有代谢废物，并可导致生产力下降。此外，从市场的观点来看，整合重要经济作物的价值是合乎需要的，例如富含β-胡萝卜素的黄金水稻的例子(Beyer P. Golden Rice and 'Golden' crops for human nutrition. 2010. May 15. N Biotechnol. [Epub ahead of print]. http://www.sciencedirect.com/science _ob=ArticleURL&_udi=B8JG4-5033Y3B-2&_user=7430124&_coverDate=05%2F15%2F2010&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000012878&_ve r si o n= 1 &_ u rl V e rs io n =0 & _ us e ri d =7 4 30 1 24 & md 5 =a9c6d210db86be4e6946f0f1f69766c0)。另一个重要的方面是生物安全性试验变得更容易，因为基因的表达被限制在单个器官中。

[0010] 转基因越来越频繁地作为解决重要经济作物问题的手段被使用，是因为转基因能够以靶向的方式引入合乎需要的特性，而不考虑种间屏障。

[0011] 到目前为止，进入市场的大部分转基因植物使用组成型启动子，其产品在生物体的所有组织中被表达。另一个限制因素是技术依赖性，因为目前可获得的启动子的使用受到专利保护。本文提出的发明可以进一步被视为是现有启动子区的替代，主要在品种和改良方案中。

[0012] 现有的农业方案(agronomic scenario)受到天气变化所带来的影响的支配，这引起环境和农业上的严重不平衡，并且受到人口的增加的支配，由于需要空间增加农业生产，因此人口的增加是产生环境不平衡的一个因素。为了缓解这些影响，需要以可持续的方式处理自然资源如水和空间以及逆境如干旱，害虫和病原菌。因此，需要开发更适合这种情景的植物，而转基因(transgeny)是加速获得这些品种的一种工具。

[0013] 文献PI0209551-3提出一种发明，其涉及来自咖啡植物叶片的核苷酸序列，其可以在植物中被用作基因诱导型表达的启动子。特别地，所述发明涉及包含启动子和编码rbcS基因的核苷酸序列。与此不同，本文献中提出的发明涉及果实特异性启动子，还包括转基因过程的替代，特别是在植物体中。

[0014] 文献WO0151637和WO0302939涉及从草莓(Fragaria vesca –草莓)中分离的启动子，其在植物果实中选择性指导被置于其控制之下的DNA序列的表达。与本发明相比，可以观察到上述专利中所述的启动子的序列是从草莓中分离的。本文献中公开的方案的优点是，它可用于在不同植物体中产生品种和/或改良方案，包括那些属于咖啡属(Coffea ssp)的植物体，因为分离物是从相同的属中获得的。此外，所提出的启动子对于表达转基因的植物体的构建来说，提出了一种替代。

[0015] 专利KR100797644，接下来，涉及来自蜜柑(Citrus unshiu) - 一种起源于日本的柑橘类水果的果实特异性表达启动子。该启动子用于在果实中诱导后来成熟期(later maturation period)的表达，有效地在果实中表达外来基因并控制其表达，以便于有效产生转基因植物。使用我们的团队提出来的本发明的优点特别在于咖啡属的品种或者甚至在于用于改良该属的方案，因为这是存在于该属自身中的调控区域。它还提出了构建表达转基因的植物体的一种替代，如前所述的。

[0016] 文献WO2010093175提出了一种特异性表达。基因HR7的启动子，而文献WO2010012848涉及一种叫做FSP1的序列，位于基因Sn1的DNA的5'区域，二者都来自番茄(Solanum lycopersicum – 番茄)。根据该文献，与传统使用的，例如花椰菜花叶病毒 - CaMV 35S启动子相比，从转化的植物中引入的基因可以在花和果实的组织中特异性表达。虽然它是特异性启动子，并且虽然它可以用于在果实中表达，但它相对于本文要求保护的启动子而言具有缺点，它不能被用作咖啡属的天然启动子和/或改良该属的方案。

[0017] 接下来，文献CN1298021和WO2005026366中公开的发明涉及指导目的基因在胚乳中表达的序列。但是，相同的序列分别来源于水稻的蜡质基因和谷蛋白GluD-1的5'控制序列，因此对于咖啡属来说，具有与上述段落中所述的相同的缺陷。

[0018] 文献US2007169226中提出的发明涉及用于在时间和/或空间上调节基因表达的方法和反应物，特别是在植物种子中(ion plant seeds)和相关的雌性生殖组织中。但是，除了该序列对于咖啡属来说不是特异性的事实之外，该组合物包含新的启动子核苷酸序列，已知其控制被称为eep'的属的种子中的表达，而不是果实特异性的。

[0019] 与前述项目的文献类似，文献WO2008040061公开了分离的核酸序列，其包含相应于DNA序列的活性启动子区域的核苷酸序列。但是，所得到的核酸序列是来自于谷物，对于启动子在咖啡属以及在改良该属的方案中的使用，具有同样的缺点。

[0020] 更进一步，以类似的方式，文献US2009089897和US2010037347提供在植物中调节核苷酸序列表达的组合物和方法，其中该新的组合物是用于组织启动子的核苷酸序列，但是是从芦栗中分离的。

[0021] 文献WO2010118477，接下来，提供包含在植物中可操作的，从小麦(Triticum aestivum – 小麦)分离的启动子序列，及其变体的组合物，其能够选择性/特异性表达。在特定的基因中，特别是在胚乳中，因此有所不同并且对于咖啡属来说不具有本文所提出的序列的优点。

[0022] 专利US7071378和专利申请WO2005026366分别公开了玉米(Zea mays – 玉米)和大麦(Hordeum vulgare – 大麦)的分离的启动子核苷酸序列，其能够使与它们相连的编码序列表达，其对于胚乳区域是特异性的。

[0023] 面对上述问题，本发明涉及仅在果实中表达目的基因的胚乳特异性启动子序列。除了具有优点如仅在果实的胚乳中靶向表达以及可用于咖啡属的品种和该属的改良方案之外，本发明进一步为植物表达系统提供了一种新的替代。

发明内容

[0024]本发明涉及用于在果实胚乳中进行基因特异性表达的新的启动子。因此，仅在目的部分表达转基因使得能够仅在果实中积累外源转录物，这有利于实现一些策略，这些策略的目的除了具有高营养价值和高治疗价值的植物体之外，还包括增加附加值的策略，产生更适应环境胁迫，病原体和害虫，农业防御措施的品种。除了这些优点，本发明是植物体中表达系统的新的替代，可用于产生新的品种和改良方案。本发明的目的是增加与基因转化相关的经济，社会，环境和生物安全性利益。

[0025] 在第一个实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的反向序列；相应于SEQ ID NO1的探针和引物基本上类似的多核苷酸序列。

[0026] 在另一个方面，本发明提供嵌合基因，其包含单独的或与一种或多种已知多核苷酸组合的本发明的多核苷酸，以及包含这些嵌合基因的细胞和生物体。

[0027] 在相关的方面，本发明提供重组因子，其包含，从5’-3’方向，本发明的多核苷酸启动子序列，要被转录的多核苷酸，和基因终止序列。要被转录的多核苷酸可以包含编码目的多肽的多核苷酸的开放阅读框架，或者可以是目的多核苷酸的非编码区，或者非翻译区。开放阅读基元(open reading matrix)的方向可以是“有义的”或“反义的”。优选地，基因终止序列在宿主植物中是有功能的。更优选地，基因终止序列是目的基因的基因终止序列，它也可以是现有技术中描述的其它基因终止序列(参见Benjamin Lewin, Genes VIII, CHAPTER 9)如根癌农杆菌胭脂碱合酶终止子。重组载体可以进一步包括用于识别转化细胞的标记。

[0028] 在另一个方面，提供包含本发明的重组载体的转基因植物细胞，以及包含这些转基因细胞的生物体，如植物，和这些植物的果实，种子和其它产品，衍生物，或后代。本发明的转基因植物的繁殖体被包括在本发明中。

[0029] 在本发明的另一个方面，提供在生物体，如植物中改变基因表达的方法，包括在包含本发明的重组载体的生物体基因组中的稳定掺入。

[0030] 在本发明的另一个方面，提供产生具有改变的多肽表达的转化生物体如植物的方法。该方法包括在导致成熟植物再生和生长的条件下，用本发明的重组载体转化植物细胞以提供转基因细胞。

[0031] 在本发明的进一步的方面，提供用于鉴别负责所期望表型的功能的基因的方法。该方法包括：(a) 转化含有重组载体的植物细胞，该重组载体包含本发明的多核苷酸启动子序列，该启动子序列任选地与要被检测的多核苷酸相连；2) 在导致成熟植物再生和生长的条件下培养植物细胞；以及3)比较转基因植物的表型和非转化植物的或野生型的表型。

[0032] 本发明的上述方面和其它方面以及获得它们的方法是显而易见的，参考“发明详述”，本发明将会被更好地理解。附图说明

[0033]图1 – 显示胚乳特异性启动子的开发所涉及步骤的流程图；
图2 - 代表CaLTP1序列的特定片段的电泳级分。(+) 阳性对照，(R) 根DNA, (Fr) 果实DNA和(Fo) 叶DNA；
图3 - 代表LTP1在根，叶和果实中相对于泛素基因的表达概况的图；
图4 - 通过Northern 印迹对LTP1在果实中的优选表达的验证。变性凝胶1.5%，使用开花后120天的阿拉比卡咖啡(Coffea arabica)的根，叶和果实的样品； R = 根，Fo = 叶，Fr = 果实；
图5 - 通过5'race技术获得的片段的电泳级分 – 标志物为1Kb 梯状条带，1/1M - 文库DraI，2/2M – 文库Eco RV，3/3M – 文库PvuII以及4/4M – 文库 StuI。
图6 - 详细说明二元因子PBI121的重构的图；载体PBI121长度为12800 bp，并且它在Gen Bank的序列编号为AF485783；通过将CaMV 35S 启动子(835 bp)替换为CaLTP1启动子的451 bp的片段，获得目的构建体；
图7 - 二元因子PBI121的重构；载体PBI121长度为12800 bp，它在Gen Bank的序列编号为AF485783；通过将CaMV 35S启动子 (835 bp)替换为CaLTP1启动子的51 bp的片段，获得目的构建体；
图8 - 在用PBI启动子转化的烟草植物中GUS活性的定位。A行：未转化的烟草植物（阴性对照）；B、C、D和E行：用PBI的不同部分转化的植物。F行：实验的阳性对照（启动子35S和报告基因）。从左边起，检查的组织为：根和叶，生荚和未成熟种子，分离的成熟种子，花蕊、花瓣和雌蕊。

具体实施方式

[0034]本发明涉及用于仅在转基因植物体的果实中表达目的基因的胚乳特异性启动子。

[0035] 在下面的描述中，广泛使用多个术语。提供下述定义的目的是为了便于理解本发明。

[0036] “嵌合基因”是包含不同来源的启动子和编码区的基因。在本发明的情况中，嵌合基因包含与内源和/或外源基因的编码区相连的本发明的多核苷酸。

[0037] “共有序列”是一种人工序列，其中的每个位置上的碱基代表相比不同的等位基因，基因或生物体，现有的序列中最频繁出现的碱基。

[0038] “启动子”是编码区上游的DNA部分，其含有与RNA聚合酶II的连接位点以起始DNA的转录。

[0039] “表达”是内源或异源的结构基因的转录或翻译。

[0040] “GC盒”是启动子中的通用元件，可以增强启动子的活性。

[0041] “TATA盒”是启动子中的元件，位于转录起始位点上游大约30个碱基处。TATA盒通常与转录因子包括RNA聚合酶II相关。

[0042] 术语“基因”指遗传的物理和功能单元，表示为编码功能蛋白或RNA分子的DNA片段。

[0043] “内源基因”是属于该细胞或者生物体的基因。

[0044] “异源基因”是从供体生物体中分离并在转化的受体生物体中重组的基因。它是不属于该细胞或生物体的基因。

[0045] “报道基因”是编码单元，其产物易于检测，例如，基因CAT, GUS, GAL, LUC和GFP。报道基因的表达可用于检测与该报道基因相连的启动子的功能。

[0046] 本发明中使用的术语“繁殖体”指可用于繁殖(reproduction)或增殖(propagation)的植物的任何部分，其是有性的或无性的，包括幼苗。

[0047] “有义”指多核苷酸序列与启动子的5'-3'方向一致。

[0048] “反义”指多核苷酸的序列与启动子的5'-3'方向相反。

[0049] 如本文所使用的，对于特定值“x”，术语“x聚体（x-mero）”指包含被鉴定为SEQ ID NO1的多核苷酸的至少一个特定数目(“x”)的残基的序列。根据优选的实施方案，x的值优选为至少20，更优选为至少40，更优选为至少60，并且更优选为至少80。因此，本发明的多核苷酸包含被鉴定为SEQ ID NO1的20聚体、40聚体、60聚体、80聚体、1000聚体、120聚体、150聚体、180聚体、220聚体、250聚体、300聚体、400聚体、500聚体或600聚体的多核苷酸及其变体。

[0050] 本文使用的术语“一种或多种多核苷酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，且包括相应于RNA和DNA的分子，包括HnRNA和mRNA分子，均具有“正义”和“反义”链，并且包含cDNA，基因组DNA，和重组DNA，以及互补的或部分合成的多核苷酸。HnRNA分子含有内含子并以通常的一对一的模式对应于DNA分子。mRNA分子相应于其中内含子被切掉的DNA和HnRNA分子。多核苷酸可以由完整基因，或其任何部分组成。可操作的“反义”多核苷酸可以包含相应多核苷酸的片段，并且“多核苷酸”的定义包括所有这些可操作的反义片段。反义多核苷酸和涉及反义多核苷酸的技术是本领域熟知的(Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)。

[0051] 本发明中描述的多核苷酸优选是大约80%纯的，更优选至少大约90%纯，并且更优选至少大约99%纯。

[0052] 术语“寡核苷酸”指多核苷酸序列的相对短的片段，通常包含6-60个核苷酸。这些寡核苷酸可以被用作探针或引物，其中探针可用于杂交检测中，而引物可用于通过聚合酶链式反应进行的DNA扩增。

[0053] 本发明中使用的术语“探针”指多核苷酸或核酸，为RNA或DNA，由于限制酶的消化自然出现，其是纯化的或是人工合成的，其能够和含有与该探针互补的序列的核酸形成等位基因或特异性杂交。探针进一步可以是单链或双链的。探针的确切长度将依赖于许多因素，包括温度，探针来源和方法的使用。例如，依赖于靶序列的复杂度，寡核苷酸探针典型地含有15-25个或更多个核苷酸，虽然它可以含有较少的核苷酸。本文的探针被选择以便于互补，以区分特定核酸序列的链。这意味着探针可以是充分互补的，以能够在多种预定条件下与其各自的靶链“特异性杂交”或成为等位基因。因此，探针序列不需要精确反映靶标的互补序列。例如，非互补核苷酸片段可以与探针的5'或3'端连接，探针的其余部分与靶链互补。或者，非互补碱基或长序列可以被插入到探针内部，如果探针与靶核酸序列具有足够的互补性，能与其特异性形成等位基因的话。

[0054] 本文使用的术语“引物”指寡核苷酸，其是RNA或DNA，单链或双链，来自于生物系统，通过限制酶消化产生，或者合成产生，当其被置于适当的环境中时，在能够功能性地作为模板依赖性核酸合成的起始物。当提供合适的核酸模板，合适的核苷三磷酸，核酸前体，聚合酶，合适的辅因子和合适的条件如温度和pH时，可以通过聚合酶的作用添加核苷酸或通过类似的行为使引物在其3'末端延伸，产生产物的第一延伸。“引物”的长度可以不同，这取决于特定的条件和应用的需要。例如，在诊断应用中，寡核苷酸“引物”的长度典型地为15至25个或更多个核苷酸。引物应当与所期望的模板具有足够的互补性，以起始所期望产物的延伸的合成。这并不意味着引物的序列应当与所期望的模板准确互补。例如，非互补核苷酸序列可以与互补引物的5'末端相连。或者，非互补碱基可以被插入到引物的寡核苷酸序列内部，只要该引物与所期望模板链的序列具有足够的互补性，以功能性地提供用于产物延伸的合成的模板-引物复合物。

[0055] 术语“特异性杂交”指两个具有足够互补序列以使得在预定条件下能够发生这种杂交的单链核酸分子之间的结合，其在现有技术中被广泛地描述 (注：Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capítulo 1, 2003)。

[0056] 特别地，该术语指寡核苷酸与基本上互补的含有本发明的单链DNA或RNA分子的序列的杂交。在具有不同互补性的单链核酸分子之间进行特异性杂交所需要的合适的条件在现有技术中有充分的描述(注：Tecnologia de DNA recombinante. Unviersidade de São Paulo,o Capítulo 4, 2003)。用于计算核酸分子之间杂交的严谨条件的通用公式在下面给出(Sambrook 等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)：Tm = 81.5℃ + 16.6 Log [Na+] + 0.41 (%G+C) – 0.63 (%甲酰胺)-600/双链(探针)中bp。

[0057] 作为上述公式的一个说明，使用[Na+] = [0.368]以及50%甲酰胺，GC含量为42%，并且平均探针长度为200碱基，Tm将会是57℃。

[0058] 探针或引物被描述为是相应于被鉴定为SEQ ID NO1的本发明的多核苷酸或其变体，如果寡核苷酸或引物探针，或其互补序列被包含在指定的SEQ ID NO1的序列，或其变体中。

[0059] 术语“寡核苷酸”在本文中指本发明的“引物”和“探针”，并且被定义为包含两个或更多个，优选多于三个核糖-或脱氧核糖核苷酸的核酸分子，寡核苷酸的确切大小取决于各种因素和特定的应用以及寡核苷酸的用途。优选的寡核苷酸包含与SEQ ID NO 1互补的15-50对连续碱基。探针可以使用本领域熟知的程序容易地选择(Sambrook 等 “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)，其中考虑到DNA-DNA杂交的严谨性，重组和熔融温度，以及成环的可能性和其它因素，其是本领域已知的。

[0060] 本文使用的术语“互补序列”，“反向互补序列”和“反向序列”的定义通过下述实例进行说明。对于序列5’AGTGAAGT3’，互补序列是3’TCACTTCA5’，反向互补序列是3’ACTTCACT5’，而反向序列是5’TGAAGTGA3’。

[0061] 本文所使用的术语“变体”或“基本上相似的”包含与特定的鉴定的序列不同的氨基酸或核苷酸序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被删除，替换或添加。变体可以是等位基因变体，天然存在的变体，或非天然存在的变体。变体或基本上相似的序列指核酸的片段，其特征在于它们的核苷酸序列与本文所述的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)的相似性百分比，如通过本领域所使用的通用算法来确定。优选的核酸片段是那些与参考序列相比具有至少大约40%或45%的序列同一性，优选大约50%或55%的序列统一性，更优选大约60%或65%的序列同一性，更优选大约70%或75%的序列统一性，更优选大约80%或85%的序列同一性，更优选大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列。通过对要比较的两个序列进行比对，确定比对部分的相同残基的数目，用该数目除以被研究序列的残基的总数目并将结果乘以100，来确定同一性百分比。这种比对可以通过互联网上已有的软件进行，其中之一是BLASTIN，可以从国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)的网页上获得。

[0062] 术语“载体”指复制子，例如质粒，粘粒，杆粒，水青冈或病毒，其中其它基因序列或元件(即DNA或RNA)可以被连接以与载体一同复制。优选地，来源于病毒的载体选自噬菌体，痘苗病毒，逆转录病毒或牛乳头瘤病毒。“重组载体”是商业载体与嵌合基因，或者与目的内源和/或异源多核苷酸可操作连接并依次与终止序列可操作连接的本发明的多核苷酸组合形成的。这种载体可以从Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.)、Stratagene (La Jolla, Calif)、Invitrogen (Carlsbad, Calif.)、New England Biolabs (Beverly, Mass.)和Promega (Madison, Wis.)商购获得。本发明中使用的载体的几个实例是，但不限于载体pGEM-T、pCAMBIA 1391、gateway载体和pMON。

[0063] 表述“表达增强序列”指“增强子”，其可以离启动子很远(上游或下游)并且可以增强转录速度。这些增强子是非特异性且并增强其附近任何启动子的转录。基因在特定组织中的表达效率依赖于增强子，启动子和相邻序列的适当组合和整合。

[0064] 第一个发现的增强子是SV40 (存在于猿病毒40的基因组中)，其刺激真核基因的转录。在发现增强子SV40之后，在真核细胞的其它病毒基因组DNA中，数以百计的其它增强子被鉴别，例如HSV-1, AMV, HPV-16。( Lodish 等, Biologia celular e molecular. 4ª edição pág 368)表达“可操作地连接”指编码序列表达所必需的调控序列被置于DNA分子中相对编码序列而言的合适的位置，用于表达编码序列。同样的定义经常被用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子，辅助因子或增强子以及元件或终止序列)的排列。外源编码区的两侧通常与在转化细胞(可以是微生物，植物或动物)中调节外源编码区表达的调控区可操作连接。典型的与外源编码区可操作连接的调控区包括启动子，即可以引起外源编码区转录的核酸片段，其位于外源编码区的5'区域。在本发明的情况中，调控区指与SEQ ID NO
1基本上相似的区域。为了帮助增加确定的多核苷酸的转录，本发明的启动子序列可以与已描述过的其它调控序列，例如，尤其是，ATATT (在根中强表达的元件)，AACAAAC和GCCACCTCAT (与种子中的表达相关的元件)，CACGTG和CCTACC (两个序列都可以受到胁迫因素的刺激)连接。(Ai-Min Wu 等, Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGP1) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426—435)
“终止序列”是表示转录结束的DNA序列。下面是终止序列的实例，但不限于此，SV40终止信号，HSV TK腺苷酰化信号，根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(NOS)的终止信号、CaMV的基因19S和35S的终止信号、玉米乙醇脱氢酶的终止信号、甘露碱（manopine）合成酶基因的终止信号、β-faseoline基因的终止信号、ssRUBISCO基因的终止信号、蔗糖合成酶基因的终止信号、攻击地三叶(Trifolium subterranean)的病毒(SCSV)的终止信号、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因的终止信号，和其它类似的终止信号。本发明预见了可用于操纵植物表型的分离的多核苷酸的调控区，以及包含这些调控区的分离的多核苷酸。更特别地，本发明涉及根据SEQ ID NO1的启动子或调控序列，其负责LTP1(“脂类转运蛋白”)家族的代表（在本发明中被称为CaLTP1）的表达，CaLTP1负责在果实胚乳中的表达。

[0065] 可以通过在生物体，如植物的基因组中掺入额外的基因，或编码多肽的编码序列的拷贝，与本发明的启动子序列(SEQ ID NO1)可操作连接，来增加或减少特定目的多肽的数量。类似地，可以通过用这些基因的反义拷贝转化植物获得多肽数量的增加或减少。

[0066] 本发明的多核苷酸已经从咖啡植物，更特别地是阿拉比卡咖啡中被分离出来，但是它也可以可逆地通过使用传统的合成技术被合成。特别地，本发明的分离的多核苷酸包括被鉴定为SEQ ID NO1的序列；被鉴定为SEQ ID NO1的序列的反向互补序列；被鉴定为SEQ ID NO1的序列的反向互补序列。

[0067] 本发明的多核苷酸可以在基因组序列信息可被公众获得的植物的基因组DNA序列中被鉴定，或者从不同的多核苷酸文库中被分离，或者另外通过使用本领域熟知的技术(Sambrook 等 “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)被合成。多核苷酸可以例如，通过使用自动寡核苷酸合成仪(例如DNA OLIGO 1000M合成仪，Beckman)被合成以获得最多50个或更多核酸的多核苷酸片段。然后可以通过使用本领域熟知的标准DNA处理技术(Sambrook 等 “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)将多个这些多核苷酸片段连接起来。传统的多核苷酸合成技术包括合成具有例如80个核酸的单链多核苷酸片段，并将该片段与合成的85个核酸的互补片段杂交，以产生5个核苷酸的突出端。然后以类似方式合成嵌套片段(nest segment)，其在相反链上具有5个核苷酸的突出端。“粘性(sticky)”或黏性(cohesive)末端确保当两部分杂交时能够恰当地连接。以这种方式，本发明的多核苷酸可以完全在体外合成。

[0068] 如上面所观察到的，本发明的启动子序列可以用在重组和/或表达载体中以驱动目的多核苷酸的转录和/或表达。目的多核苷酸对于要被转化的生物体，例如植物来说可以是内源的或异源的。本发明的重组和/或表达载体然后可以被用于调节野生型植物中存在的多核苷酸，例如基因的转录和/或表达水平，或者可以被用于提供野生型植物中不存在的DNA序列的转录和/或表达，包括例如编码报道基因的基因，如GUS的转录和/或表达。

[0069] 在本发明的一些实施方案中，目的多核苷酸包含编码目的多核苷酸的开放阅读基元(open reading matrix)。开放阅读基元以有义方向被插入到载体中，用该基因构建体/重组载体进行转化通常会导致选定多肽的超表达。将会受本发明启动子调控的目的多肽，可以以有义，反义方向，或者以两种方向被插入到载体中。用包含调控反义方向或两种方向(有义和反义)的目的多核苷酸的表达的本发明启动子的重组载体和/或表达载体进行的转化通常会导致选定的多肽的表达减少。

[0070] 目的多核苷酸，作为编码序列，与本发明的多核苷酸启动子序列可操作连接，以使宿主细胞能够转录由与目的多核苷酸连接的启动子序列驱动的RNA的转录。多核苷酸启动子序列通常位于要被转录的多核苷酸的5'末端。组织特异性启动子，如负责被鉴定为SEQ ID NO1的LTP1(脂类转移蛋白)基因表达的咖啡启动子序列(阿拉比卡咖啡)，将会仅在被转化植物的胚乳中影响目的多核苷酸的转录。

[0071] 本发明重组载体或表达载体还可以含有在生物体，如植物的细胞中有效的选择标记，以能够检测含有所发明的重组载体的转化细胞。这些标记，众所周知，通常赋予对一种或多种毒素的抗性。这种标记的一个实例是nptII，其表达导致对卡那霉素或新霉素的抗性，卡那霉素或新霉素通常在中等浓度对植物细胞有毒性。因此，可以鉴定转化细胞在含有所涉及抗生素的培养基中生长的能力。其它可以用于构建含有本发明多核苷酸的重组载体和/或表达载体的标记可以是，但不限于：赋予对潮霉素抗生素抗性的hpt基因，manA基因和bar基因。

[0072] 使用大肠杆菌的manA (编码酶PMI - 磷酸甘露糖异构酶)的系统(Miles and Guest, 1984. Complete nucleotide sequence of the fumarase gene fumA, of E. coli. Nucleic Acids Res. 1984 April 25; 12(8): 3631–3642)，使用甘露糖作为选择试剂，是被提出作为前述的前两种(Joersbo 等, 1998 Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet, Physiologia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi:10.1034/j.1399-3054.1999.105117.x)的替代的一种新系统。不代谢甘露糖的植物物种在培养基中当提供甘露糖作为唯一碳源时受到严重的生长抑制。使用甘露糖的不良和抑制效果是由于甘露糖-6-磷酸，甘露糖被己糖激酶磷酸化的产物的积累造成的。PMI促进甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的互变，从而使得前者可以在糖酵解途径中被分解代谢(Ferguson e Street, 1958. Análise de sistemas gene marcador/ agente seletivo alternativos para seleção positiva de embriões somáticos transgênicos de mamoeiro, Rev. Bras. Fisiol. Veg., 2001, vol.13, no.3, p.365-372. ISSN 0103-3131.: Malca 等, 1967 Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes, Physiologia Plantarum Volume 111 Issue 3 Page 269 - March 2001 doi:
10.1034/j.1399- 3054.2001.1110301.x)。吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(其编码酶PAT – 草丁膦-N-乙酰转移酶)(Murakani 等, 1986 - The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Molecular and General Genetics., 205:
42-50, 1986.)，使用草胺磷铵(PPT)作为选择试剂，在植物OGMs的开发中，在除草剂-耐受基因类型(herbicide-tolerance gene)的系统中，它是基因工程最广泛使用的一种。PAT通过使PPT脱毒，展示PPT作为活性物质的除草剂失活。脱毒，由PPT中存在的自由氨基基团的乙酰化导致，使得PPT不能够竞争性抑制谷氨酰胺合成酶(GS)，从而使得能够通过将谷氨酸盐转化为谷氨酰胺，从而从植物细胞中除去毒性氨，这个过程由GS催化 (Lindsey, 1992 Molecular cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, constitutively expressed on resting leukocytes, Nature 360, 481 - 484 (03 December 1992); doi:10.1038/360481a0)。

[0073] 或者，转化细胞中嵌合基因的存在可以通过本领域中已知的其它技术来确定(Sambrook 等 “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)，如Southern和PCR。

[0074] 用于将重组载体或表达载体的组分可操作连接的技术是本领域熟知的，并包括使用含有一个或多个限制性内切酶位点的合成配体，例如Sambrook 等 (“Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)中所描述的。本发明的嵌合基因可以与具有至少一个复制系统，例如E.coli的载体相连，并且在每次操作之后，所获得的构建体可以被克隆并测序。

[0075] 本发明的重组载体和/或表达载体可以被用于转化多种生物体，包括植物，但不限于此。可以使用本发明的重组载体和/或表达载体转化的植物包括单子叶被子植物(例如禾草，玉米，谷物，燕麦，大麦)，双子叶被子植物(例如拟南芥，烟草，豆科植物，苜蓿，大麦，桉树，枫树...)，以及裸子植物(例如松树，白云杉，落叶松...)。植物转化方案已经是本领域熟知的(Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, Capitulo 3 e 7, 1998)。在另一个优选的实施方案中，本发明的重组载体和/或表达载体被用于转化双子叶植物。优选地，植物选自茜草科(Rubiaceae)家族，更优选是阿拉比卡咖啡(Coffea arabica)物种。其它可以用本发明的重组载体和/或表达载体以有用的方式转化的植物包括但不限于：腰果(Anacardium)、番荔枝(Anona)、落花生(Arachis)、菠萝蜜(Artocarpus)、芦笋(Asparagus)、颠茄(Atropa)、燕麦(Avena)、芸薹(Brassica)、番木瓜(Carica)、柑橘(Citrus)、西瓜(Citrullus)、辣椒(Capsicum)、红花(Carthamus)、可可(Cocos)、咖啡(Coffea)、黄瓜(Cucumis)、南瓜(Cucurbita)、胡萝卜(Daucus)、油棕(Elaeis)、草莓(Fragaria)、大豆(Glycine)、棉花(Gossypium)、向日葵(Helianthus)、Heterocallis、大麦(Hordeum)、莨菪(Hyoseyamus)、莴苣(Lactuca)、亚麻(Linum)、毒麦(Lolium)、羽扇豆(Lupinus)、番茄(Lycopersicon)、苹果(Malus)、木薯(Manihot)、Majorana、苜蓿(Medicago)、烟草(Nicotiana)、木犀榄(Olea)、稻(Oryza)、黍(Panieum)、狼尾草(Pannesetum)、西番莲(Passiflora)、鳄梨、(Persea)、菜豆(Phaseolus)、黄连木(Pistachia)、豌豆(Pisum)、梨(Pyrus)、李(Prunus)、番石榴(Psidium)、萝卜(Raphanus)、蓖麻(Ricinus)、黑麦(Secale)、千里光(Senecio)、欧白芥(Sinapis)、茄(Solanum)、高粱(Sorghum)、Theobromus、葫芦巴(Trigonella)、小麦(Triticum)、蚕豆(Vicia)、葡萄(Vitis)、豇豆(Vigna)和玉蜀黍(Zea)。

[0076] 本发明的转录终止信号和多聚腺苷酸化区域包括但不限于，尤其是，SV40终止信号、HSV TK腺苷酰化信号、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(NOS)的终止信号、CaMV的基因19S和35S的终止信号、玉米乙醇脱氢酶的终止信号、甘露碱合成酶基因的终止信号、β-faseoline基因的终止信号、ssRUBISCO基因的终止信号、蔗糖合成酶基因的终止信号、攻击地三叶(Trifolium subterranean)的病毒(SCSV)的终止信号、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因的终止信号。优选地，本发明中使用的终止子是LTP1(脂类转运蛋白)基因的终止子。

[0077] 本发明的重组和/或表达载体可以通过多种传统技术被引入到所期望宿主植物的基因组中。例如通过根癌农杆菌；电转化；原生质体融合；向生殖器官中注射，向未成熟的胚胎中注射；植物细胞原生质体的微注射；通过使用弹道轰击方法，如用DNA包覆颗粒进行轰击，等等来引入。技术的选择取决于要被转化的植物。例如，双子叶植物和一些单子叶植物和裸子植物可以通过农杆菌的Ti-质粒技术转化。重组和/或表达载体可以与合适的两侧为T-DNA的区域组合并被引入到传统的宿主载体根癌农杆菌中。当细胞被该细菌感染时，宿主根癌农杆菌的毒性功能会指引基因构建体和邻近的标记插入到植物细胞的DNA中。由根癌农杆菌介导的转化技术，包括去除武装(disarmament)和二元载体的使用，在科技文献中有详细描述(如专利申请US 20020152501, Horsch 等 Science 233:496-498, 1984；和Fraley 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803, 1983中所提及的)。本发明中优选使用的二元载体是pBI-121-型二元载体。

[0078] 微注射技术是本领域已知的并在科技和专利文献中有详细描述。通过使用聚乙二醇沉淀引入重组和/或表达载体在Paszkowski 等 Embo J. 3:2717-2722, 1984 (在专利申请US20020152501中提及) 中描述。电转化技术在From 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985 (在专利申请US20020152501中提及)中描述。弹道轰击转化技术在Klein 等 Nature 327:70-73, 1987 (在专利申请US20020152501中提及)中描述。本发明的重组和/或表达载体的引入可以是在组织，如叶组织，解离组织，原生质体，种子，胚胎，分生组织区域，子叶，下胚轴(hypocotyledons)及其它组织中进行。优选地，本发明使用通过根癌农杆菌介导的引入进行的转化，使用拟南芥作为模式植物 (Clough at al., "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of A. thaliana", Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43.)。但是其它转化方法也可以被用于插入本发明的重组和/或表达载体，如弹道轰击法，其包括使用被高速推进以携带DNA进入细胞的微弹的直接DNA转化的技术[Rech, E.L; Aragão, F.J.L. Biobalística. In: Manual de Transformação Genética de Plantas (Brasileiro, A.C.M. & Carneiro, V.T.C. eds.), EMBRAPA Serviço de Produção de Informações –SPI. 1998, 106pp]，以及通过花粉管。通过花粉管的转化方法由Zhou 等首次公开 (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., and Liu, G. Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol. 101:433-448, 1983)，包括将DNA溶液施用于授粉之后的苹果幼苗的上部。通过使用这种技术，外源DNA可以通过花粉管留下的通道到达子房并整合到已经受精但未分裂的合子细胞中。

[0079] 一旦细胞通过上述提及的任意技术被转化，其基因组被掺入了本发明的重组和/或表达载体的细胞可以通过标记，如潮霉素或卡那霉素抗性标记被选择。然后转化植物的细胞可以被培养以再生具有转化表型并且，最终具有所期望表型的完整植物。这种再生技术依赖于组织培养生长培养基中特定植物激素的处理，其应当与所期望的核苷酸序列一起被引入。从原生质体培养物再生植物在Evans 等 (Evans 等, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985，在专利申请US20020152501中提及)中描述。还可以通过植物愈伤组织，外植体或其部分实现再生。这种再生技术是本领域熟知的，如Leelavathi 等 [Leelavathi 等, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (G. hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep (2004) 22:465–470]所述。该论文描述了转化并再生棉花的方案，其中胚性愈伤组织农杆菌在脱水胁迫和抗生素选择下培养3-6个月，以再生不同的转基因胚胎，平均75个球状胚胎。根据玻片选择观察之后，这些胚胎在培养基中被培养和繁殖，然后在胚胎成熟培养基上发育成为有子叶的胚胎。以从共培养的愈伤组织的皮氏培养皿获得平均12株植物。这些植物中的大约83%是转基因的。获得的转化植物可以通过本领域已知的方法[Leelavathi 等, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (Gossipium hirsutum L.): Embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Rep, 2004, 22: 465–470 ]进行有性或无性繁殖，以得到转基因植物的连续代。

[0080] RNA在细胞中的产生可以通过启动子序列的选择，通过功能性拷贝数量的选择或通过被引入到宿主基因组的多核苷酸的整合位点来控制。生物体可以使用含有多于一个编码目的多肽的开放阅读基元的本发明的重组和/或表达载体进行转化。

[0081] 本发明的分离的多肽还可用于基因组作图，用于物理作图和用于基因的定位克隆。被鉴定为SEQ ID NO1的序列及其变体可被用于设计探针和寡核苷酸引物。通过使用本发明的多核苷酸设计的寡核苷酸探针可被用于在任何其细胞中具有足够相似DNA序列的生物体中检测LTP1基因的启动子的存在，通过使用本领域熟知的技术例如斑点杂交DNA杂交技术(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory ndmanual. 2 edition [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。

[0082] 通过使用本发明的多核苷酸设计的寡核苷酸可被用于扩增PCR。本发明的多核苷酸还可被用于标记或鉴定生物体或其繁殖材料。这种标记可以，例如通过将异源的，非功能性的，非破坏性的多核苷酸的标识(identifier)稳定引入生物体，并置于本发明的多核苷酸的控制之下来获得。

[0083] 本发明提出的启动子已通过下文引用的以下优选步骤获得。

[0084] 1 – 可能候选物样品的基因材料可以根据Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, e Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants, EMBO J 4: 2411-2418.)描述的方法，或能够获得完整基因材料的任何方法，例如使用有机溶剂的提取方法来完成。

[0085] 2 – 应当确认可能候选物的分离材料的完整性，例如通过变性凝胶技术，并且随后它可以作为模板通过PCR反应，或者甚至RT-PCR（如果模板是RNA的话），形成新的DNA分子。推荐用DNAse处理样品，例如通过本文中描述的方法。

[0086] 3 – 获得的基因材料可以被用于PCR反应中作为选定基因，例如LTP1基因的特异性引物，以评价其特异性。所述引物可以借助程序Primer (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S and Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)，或任何其它程序和/或为候选物提供特异性引物的方法进行设计。

[0087] 4 – PCR反应可以在用于该方法的特殊仪器，例如MJ Research model PTC-100热循环仪，或在该反应的理想条件下能够发挥其功能的任何其它热循环仪上进行，建议在94℃初始温育3分钟，然后是35个循环：在94℃变性30秒，在50℃使寡核苷酸杂交40秒并在72℃延伸1分钟。

[0088] 5 – 该步骤之后，应当进行附加时间的反应，其中推荐在72℃进行10分钟，以完成聚合。推荐每个反应在50 µL的终体积中应当含有1µL的1:10稀释的cDNA， 2.5 U的Taq DNA聚合酶和30 皮摩尔的初始寡核苷酸。

[0089] 6 – 可以通过，例如片段的电泳迁移确认扩增产物的同一性，其中推荐使用作为比较的阳性对照，其由含有被研究序列的载体，例如咖啡基因组计划(Projeto Genoma Café) (Coffee-Genome Project) (FV2-050) 的数据库载体组成。

[0090] 7 – 在对基因材料进行分级之后，样品应当进行Northen 印迹步骤，其中推荐将基因材料转移至适用于该方法的膜，例如尼龙膜上，在SSPE中与相应于所称的标记LTP，例如用磷的32同位素 - 32P标记的LTP的部分序列的探针杂交。

[0091] 8 – 启动子可以通过任何分离技术被分离，其中推荐的是使用5’race技术，并结合简化的“巢式”PCR技术，通过使用Genome Walker Universal Kit (Clontech)，根据制造商的说明进行。

[0092] 9 – 引入的片段可以被克隆和测序，通过意向用于此目的的方法来进行。推荐使用双脱氧核苷酸方法(Sanger, F., Nicklen,S. and Coulson,A.R. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5468.)。

[0093] 10 – 分离的推定启动子的表达概况的表征可以通过该序列，以及来自于它的但保留了所提出的启动子功能的截短形式的变体在二元载体中的表达来进行，其中建议使用pBI 121类型的二元载体并在位点Hind III和Bam HI进行克隆，根据分子生物学标准技术进行，例如Sambrook (SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 608p)中提出的技术。推荐使用阳性对照和阴性对照进行这些方法。

[0094] 11 – 可以在目的生物体中进行转化过程，其中建议使用烟草(bobacco - Nicotiana tabacum)，使用根癌农杆菌菌株，例如根癌农杆菌CV3101株(C58PMP90)作为载体，使用任何以此为目的的特定方案，例如Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., Rogers S.G. and Fraley R.T. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229–1231)提出的方案。转化外植体的效率可以通过再生繁殖体的组织中目的基因的瞬时或稳定表达来评价，其中推荐使用gus基因。

[0095] 12 – gus基因的表达分析可以在转化植物的叶、根、果实、种子和花(花瓣、雌蕊、雄蕊、花粉)中通过组化测定方案来进行，例如，根据Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. and Bevan M.W. 1987. GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants - EMBO J. 6: 3901–3907)描述的方案的修改。实施例

[0096] 本发明进一步在下述实施例中被定义，应当理解这些实施例，在说明本发明的一部分的同时，仅仅是作为举例说明而给出，并非是对目前权利要求的范围进行限制。

[0097] 当提及常见的分子生物学技术如细菌的转化和核酸的琼脂糖凝胶电泳时，使用常用术语对其进行描述。这些技术的实施细节，在本领域中众所周知，在Sambrook, 等 nd(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)中描述。当提及实验操作中使用的各种溶液时，使用他们的常用名称，如“琼脂糖”，“TBE”，“小量制备”等。这些溶液的组合物可以在参考书Sambrook, 等 (上述引用的)中找到。

[0098] 实施例 1 - 计算机(in silico)分析咖啡基因组数据库的“重叠群(contigs)”(VIEIRA, L. G. E. ; ANDRADE, A. C.; COLOMBO, C. A.; MORAES, A. H. A.; MEHTA, A.; OLIVEIRA, A. C.; LABATE, C. A.; MARINO, C. L.; MONTEIRO-VITORELLO, C. B. . Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource. Brazilian Journal of Plant Physiology, v. 18, p. 95-108, 2006)被分成2个相对的组：果实和非果实。这两个组通过费雪精确检验(Fisher exact test)进行比较，结果表明18个“重叠群”优选在果实中表达。随后对这些“重叠群”分析其是否存在专利。

[0099] 实施例 2 –实验验证被称为果实候选基因1的“重叠群” - CaLTP1被选择用于实验验证，因为它专一地在果实中表现出高度的特异性和高水平的表达，而且因为它的基因或启动子都没有受到专利保护。在进行了表征和验证测定之后，明确它是LTP (脂类转移蛋白)。使用RT-PCR (反转录酶-PCR); Northern 印迹; RT-qPCR技术通过时间和空间表达如所述对CaLTP1 (果实候选基因1)基因进行实验验证。

[0100] 实施例 3 - RT-PCR为了进行T-PCR测定，提取Embrapa Cerrados的试验田中种植的阿拉比卡咖啡品种IAPAR 59的根，叶和果实RNA样品。根据Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, and Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418)描述的方法提取RNA。然后在1.5%的变性凝胶中评价RNA的完整性。使用根，叶和果实DNA样品作为模板使用寡聚dT作为引物通过RT-PCR反应形成cDNA分子。得到的cDNAs被用于PCR反应中，使用LTP1-特异性引物，以评价其组织特异性。为此目的，借助Primer程序(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen, S e Skaletsky H. J. 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-
386)设计下述特异性寡核苷酸：
果实引物nº1: SEQ ID NO 2；
果实引物nº2: SEQ ID NO 3。

[0101] 在MJ Research model PTC-100热循环仪中进行反应，94℃ 初始温育3分钟，然后进行35个循环，每个循环在94℃ 变性30秒，在50℃ 使寡核苷酸杂交40秒并在72℃ 延伸1分钟。循环之后，在72℃进行10分钟附加时间的反应。每个反应在50 µL 的终体积中含有1µL的1:10稀释的cDNA，2.5 U的Taq DNA聚合酶和30 pmoles的初始寡核苷酸。扩增产物的同一性通过片段相比阳性对照的电泳迁移来证实，阳性对照由含有被研究序列的来自咖啡基因组计划(Projeto Genoma Café) (Coffee Genome Project) (FV2-050)数据库的载体组成(图2)。

[0102] 实施例 4 –RNA的提取提取Embrapa Cerrados的试验田中种植的阿拉比卡咖啡品种IAPAR 59的根，叶和果实总RNA样品，按照Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, and Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants, EMBO J 4: 2411-2418)所述方案进行。提取之后，在1.5%的变性凝胶中对RNA进行分级以分析其完整性。

[0103] 实施例5 - 用DNAse处理RNA用DNAse 酶进行处理，其反应包括10 µg的RNA，5 U的DNAse酶，2 µL的10X反应缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT)和DEPC水补满20 µL的总体积。反应在37℃进行10分钟，然后转移至冰上。反应后，处理样品以激活DNAse，也就是说，加入180 µL DEPC水和200 µL chlorofane (分别为24:24:1的苯酚，氯仿和异戊醇)。混合几次后，在
12.000 g将样品离心3分钟。上部的相(水相)被转移到新的试管中，加入乙醇(样品的2.5倍体积)和3M NaAc(样品的1/10体积)并在-20℃放置大约16 h。然后将样品在12.000 g离心
40分钟，去掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀，然后重悬于20 µL的DEPC水中。处理之后，将等分的RNAs置于1.5%琼脂糖凝胶中，分析其质量。

[0104] 实施例6 – cDNA的合成用300 ng根，叶或果实RNA(用DNAse处理)，2 μL的寡dT (50 µM)，1 μL的dNTP混合物(15 mM)和DEPC水补满13 μL，进行cDNA合成反应。反应被加热至65℃进行5分钟，然后被置于冰上3分钟。随后加入4 μL的第一链缓冲液(First-Strand Buffer) (5X)，1 μL的DDT (0.1 M)和1 μL的SuperScript III RT (200 U/μL)。反应在50℃温育1小时，然后在70℃温育15分钟，以激活反应。

[0105] 实施例7 - RT-qPCR根，叶和果实的总RNA样品用DNase 处理并被转化为cDNA。使用SYBR Green反应物，和下述特异性寡核苷酸准备PCR反应：
果实引物nº3: SEQ ID NO 4;
果实引物nº4: SEQ ID NO 5.
在7500 PCR Systems (Applied Biosystems)型的仪器上进行反应，根据Bustin, (Bustin SA in Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems; J Mol Endocrinol (2002) v.29 - p23-39)进行。使用泛素基因作为组成标准品(constitutive standard)进行比较分析(图3)。

[0106] 实施例 8 - Northern 印迹从成熟的咖啡植物阿拉比卡咖啡，Yellow-Catuaí品种提取叶和果实(未成熟阶段)的总RNA样品。在根的情况下，使用在germitest 纸上发芽后190天的植物根，转移至植物基质(蛭石 – Terral)，并在温室中进行培养。RNA提取方法由Jones (Jones JDG, Dunsmuir P, e Bedbrook J. 1985. High level expression of introduced chimeric genes in regenerated transformed plants. EMBO J 4: 2411-2418)描述。RNA在真空下在1.5%的变性凝胶中进行分级，在尼龙膜上在SSPE中与相应于所谓的用32P标记的LTP的部分序列的探针杂交。Northern 印迹的实验验证得到的结果证明基因的果实特异性表达(图4)。

[0107] 实施例 9 –启动子的分离利用5'race技术分离启动子，结合使用Genome Walker 通用试剂盒(Clontech)简化的“巢式”PCR技术，按照制造商的说明书进行，对于扩增使用下述引物：
第1个反应：
第1个正向反应引物：SEQ ID NO 6;
第1个反向反应引物：SEQ ID NO 7.
第2个反应：
第2个正向反应引物：SEQ ID NO 8;
第2个反向反应引物：SEQ ID NO 9.
得到的片段(图5)进行克隆并通过双脱氧核苷酸方法(Sanger,F., Nicklen,S. and Coulson,A.R. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5468)测序。

[0108] 实施例 10 –二元载体的获得为了表征分离的推定启动子的表达概况，制造4个含有CaLTP1启动子完整版本的二元载体，为1.2 Kb 的片段和451 bp, 785 bp和1,0 Kb的3个截短版本。为这些目的，按照分子生物学标准技术(SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular. Cloning: A Laboratory Manual 1. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989. 608p)在pBI 121类二元载体中在Hind III 和Bam HI 位点克隆片段。

[0109] 实施例 11 –用二元载体转化烟草按照前述事项制备的二元载体被用于转化烟草植物。用前述事项中所述的4个构建体，以及按照Horsch (Horsch R.B., Fry J.B., Hoffman N.L., Eicholts D., Rogers S.G. and Fraley R.T. 1985. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227: 1229–1231)的原始的阳性对照pBI 121独立地转化根癌农杆菌CV3101株 (C58PMP90)。在该步骤之后，将烟草的filiar部分(外植体)在含有二元载体的细菌悬液中浸渍5分钟。然后，该片被置于滤纸上以去除多余的细菌，并在共培养培养基中温育46小时(Trinca, S.; De Pace C.; Caccia, R.; Mugnozza, G.S.; Dodds, J.H. Jaynes, J. Transformation of potato (Solanum tuberosum L.) leaf disc using A. tumefaciens transfer DNA sequences coding for lytic peptides. Molecular methods for potato improvement. Lima: CIP, 1991. 85p)。共培养之后，外植体被置于选择培养基(加入50 mg. L-1卡那霉素和50 mg L-1头孢噻肟的共培养培养基)。通过再生的繁殖体的组织中gus基因的瞬时和稳定表达评价外植体的转化效率。

[0110] 实施例 12 – gus表达的分析154碱基对的启动子片段能够指挥烟草植物中报道基因gus的表达(图7)。在用451 bp启动子和阳性转化的植物的叶，根，果实，种子和花(花瓣，雌蕊，雄蕊，花粉)和阴性对照中，通过组化检测对gus的表达进行分析，按照Jefferson (Jefferson R.A., Kavangh T.A. and Bevan M.W. 1987. GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901–3907)所述的方案的修改版进行。借助外科手术刀手工制造切口，将样品浸在反应缓冲液中，反应缓冲液由
100 mM NaH2PO4 . H2O中的1 mM X-gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸环己基铵盐)，10 mM的EDTA，0.5 mM的铁氰化钾和0.5 mM的铁氰化钾，Triton X-100 0.1%组成。用NaOH调节溶液pH至7.0并在生长箱中过滤。真空过滤(5 mmHg)5分钟后，样品在37℃温育过夜。

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