技术领域
[0001] 本
发明涉及一种从香鳞毛蕨中分离纯化绵
马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB四种间苯三酚类化合物的方法，属于
植物活性成分分离纯化技术领域。
背景技术
[0002] 香鳞毛蕨[Dryopterisfragrans(L.)Schott.]是一种多年生蕨类植物，系鳞毛蕨科鳞毛蕨属，又名香叶鳞毛蕨，主要分布于我国东北、华北、华中，俄罗斯(远东地区)、朝鲜、日本及北美洲等一些国家。香鳞毛蕨具有较高的药用价值，民间常用其来
治疗多种
皮肤疾病（如
牛皮癣、皮疹、皮炎、痤疮等），用其洗头还可达到去屑，止痒的目的，被称为“皮肤病的克星”（沈志滨等，2002）。此外，香鳞毛蕨对
风湿性关节炎也有明显的治疗作用（常缨，2009）。近年来，多项药理研究结果表明，香鳞毛蕨具有消炎、
镇痛、抑制
真菌、抗
肿瘤、抗
氧化、治疗
银屑病等多种功效。
[0003] 目前，香鳞毛蕨中已有报道的活性成分包括间苯三酚类、黄
酮类、萜类、苯丙素类和挥发油类，其中间苯三酚类居多，主要包括绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB等（常缨，2009；Hisada S.etal,1974;Ito H.etal,1997）。已报道的香鳞毛蕨间苯三酚类化合物具有良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗炎活性（沈志滨等，2007；吴寿金等，1993），并且由于香鳞毛蕨中间苯三酚类化合物可来源于天然植物资源，安全性高、选择性高、活性强、毒
副作用小，成为当今社会研究的重点。
[0004] 绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB
单体均具有良好的药理活性。绵马素PB和香鳞毛蕨素均为鱼毒素类化合物，对非洲淋巴瘤病毒的早期
抗原有潜在抑制效果（Ito H.etal,1997）。此外，绵马素BB还具有广泛的抗肿瘤、抗炎等活性（Krivut BV.etal,1973）。近年来，香鳞毛蕨的抗菌活性得到证实，并且是鳞毛蕨属中抗菌活性最强的，对葡萄球菌以及真菌具有较好的抗菌活性，常被应用于牛皮癣、皮疹、皮炎和痤疮等的治疗（沈志滨，2006）。尽管从天然植物中获得的绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体活性突出，但是目前有关其生产过程的报道较少，已有的提取绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的方法主要是传统的技术手段，需要多次
硅胶柱层析。传统的提纯过程漫长且目标化合物损失较多，并且毒性较大的
有机溶剂使用量较多，不利于健康生产。 [0005] 综上所述，在利用
植物提取物分离纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的传统过程中，分离过程耗时较长，目标化合物损失较大，导致成本提高。因此，寻找一种简便经济高效且安全的分离纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的方法 就显得尤为必要。本发明旨在建立多种现代分离纯化技术手段相结合的方法，实现简单快速、经济安全且损失较少的提取纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体。 发明内容
[0006] 本发明目的在于提供一种以干燥的香鳞毛蕨为原料，采用匀浆诱导技术和酶
水解技术增加游离的活性成分含量，同时用
乙醇为溶剂，通过
超声波辅助提取、冷浸提取、
负压空化提取、
微波辅助提取得到提取物，将提取物采用
超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔
吸附树脂柱色谱富集技术、凝胶分离、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB四种单体，该方法分离纯化工艺简单易行，操作安全，产品得率高，纯度高，并且香鳞毛蕨资源丰富易得，适用于工业应用。本发明目的是通过以下方案来实现的：
[0007] 将干燥的香鳞毛蕨进行匀浆诱导，然后以80%乙醇作为溶剂进行提取，在所得提取物中加入40-50℃温水，通过超声波振荡、静止絮凝，将所得到的粘稠絮凝物经乙酸乙酯负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂柱色谱富集、凝胶分离和一次正相硅胶中压柱层析后分别得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB粗品，经过低温析晶和重结晶分别得到以上四种纯度均大于95%的化合物单体。
[0008] 上述绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的提取纯化方法，其特征在于，取干燥的香鳞毛蕨为原料进行匀浆诱导，匀浆诱导所用的溶剂为水，
温度30-50℃，体积为固体
质量的3-6倍，连续匀浆诱导3次，每次5-15min。然后用乙醇为溶剂，通过超声波辅助提取、冷浸提取、负压空化提取、微波辅助提取得到提取物，加入6-8倍体积的40-50℃的温水，于超声波振荡提取器中80-100KHz条件下振荡絮凝15-20min，静止10-20min，得到粘稠絮凝物，以-0.05MPa负压为动
力用乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，萃取所用的溶剂体积为提取物质量的0.05-0.1(L:g)，萃取次数为3-5次，所用溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷和正丁醇，浓缩萃取至干，将所得固形物用乙醇溶解，加入固形物2-5倍树脂，然后将拌样树脂加载到预置的树脂柱顶层，加入乙醇-水溶液梯度洗脱，具体包括用5-20BV体积分数10%-30%的乙醇溶液洗脱杂质，10-50BV体积分数50%-95%的乙醇溶液依次洗脱组份，收集洗脱液，每份100-150mL浓缩至干得到固形物。采用SephadexLH-20凝胶，将大孔吸附树脂富集浓缩的产物用2-8%甲醇溶解，配制成料液浓度为5-20mg/mL的样品液，经0.45μm滤
膜过滤后，按照100-150mg样品/mL凝胶，注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇2-5倍柱体积洗脱、然后用40%-70%甲醇3-7倍柱体积洗 杂质、最后用80%-90%甲醇4-7倍柱体积洗脱，收集洗脱液。预先称取质量为提取物质量10-20倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂包括乙酸乙酯和正己烷。将所得固形物用
有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1.2:1(w/w)的层析硅胶拌匀、减压旋干，装入预先装好的硅胶柱中，先后以1-30BV正己烷或石油醚、3-20BV正己烷或石油醚:乙酸乙酯或氯仿、丙酮=80:1-15:1洗脱，收集洗脱液，每份250-500mL，用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为正己烷:乙酸乙酯=100:1-10:1，紫外
波长为254nm和365nm，依此得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB溶液，低温析晶得到粗品，重结晶后得到纯品。
[0009] 上述的香鳞毛蕨中绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂为H1020、H103、D101、D3520、HPD-D、FL-3、AL-1、AB-8、HPD-826、HPD-600、NKA2或FL-1。
[0010] 上述的香鳞毛蕨中绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的提取纯化方法所用硅胶为300-400目。硅胶柱流动相包括（正己烷、石油醚）-（乙酸乙酯、氯仿、丙酮）的不同比例梯度。
[0011] 重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙腈、丙酮和甲醇中的两种，以100:1-10:1的比例混合，温度为-5-20℃。
[0012] 本发明的优点：
[0013] （1）本发明首次采用匀浆-酶诱导技术，诱导增加游离绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的含量，并诱导
粉碎样品，破坏细胞壁，缩短提取时间；
[0014] （2）本发明首次采用凝胶分离技术对绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB进行纯化，能有效除去样品中杂质，降低后期纯化难度，并减少有机溶剂实用，降低成本； [0015] （3）本发明采用负压空化混悬萃取的方法对提取样品进行萃取，一方面萃取效率高，另一方面以负压为动力，清洁环保，污染较小；
[0016] （4）本发明高效简单易行，周期短，可大规模投入生产。
具体实施方式
[0018] 以干燥的香鳞毛蕨为原料，称量1000g，加入6倍体积的40℃温水连续诱导3次，每次8min，将匀浆诱导好的液体用
柠檬酸调节pH为5.0；取0.3%的固形物重量的复合酶（纤 维素酶，果胶酶），溶于pH为5.0的缓冲溶液中，在50℃水浴上激活10min，然后与匀
浆液混匀，在40℃下酶解3h。诱导液分离后固形物采用微波提取的方法，用80%乙醇为溶剂进行提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将固体物质加入50℃温水1.5L，于超声波提取器中100KHz条件下振荡絮凝15min，静止10min，取粘稠絮凝物，以-0.05MPa负压为动力用等体积乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，将固形物用乙醇溶解，加入2.5倍AB-8树脂，使样品吸附，待溶剂挥干后上样，洗脱步骤为：水洗脱至无色，30%乙醇溶液8BV，50%乙醇溶液10BV、70%乙醇溶液18BV、80%乙醇溶液30BV和95%乙醇溶液20BV。洗脱完毕后收集含有目标成分的馏分，浓缩后分别进行凝胶分离。
[0019] 将树脂洗脱的50%、70%、80%以及95%部分分别浓缩，并将浓缩物用5%的甲醇溶解，配成15mg/mL的样品溶液，用Sephadex LH-20洗脱，，经0.45μm滤膜过滤后，按照100mg样品/mL凝胶，注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇3倍柱体积洗脱、然后用40%甲醇7倍柱体积洗杂质、最后用90%甲醇7倍柱体积洗脱，收集洗脱液并浓缩得到固体。
[0020] 将树脂50%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)进行洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马酚粗品，用石油醚:乙酸乙酯=5:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度96.2±0.2%的绵马酚26.72±0.52mg。
[0021] 将树脂70%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)开始洗脱，待棕色样品流出后开始收集组分并采用TLC进行监测，浓缩得到绵马素PB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=20:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.1±0.2%的绵马素PB 75.09±0.14mg。
[0022] 将树脂80%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)开始洗脱，先用10BV正己烷洗脱，然后采用10BV正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)，10BV正己烷:乙酸乙酯=30:1(v/v)进行洗脱，最后用正己烷:乙酸乙酯=15:1(v/v)开始洗脱，待棕黄色色带流出后，收集流分并用TLC监测，至收集液中不含目标成分的部分，将样品浓缩得到香鳞毛蕨素粗品，用正己烷:乙酸乙酯=30:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度97.7±0.4%的香鳞毛蕨素355.43±0.51mg。 [0023] 将树脂95%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后用正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)开始洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马素BB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=80:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.3±0.3%的绵马素BB 473.97±0.36mg。
[0024] 实施例2
[0025] 以干燥的香鳞毛蕨为原料，称量1000g，加入6倍体积的40℃温水连续诱导3次，每次10min，将匀浆诱导好的液体用柠檬酸调节pH为4.0；取0.5%的固形物重量的复合酶（
纤维素酶，果胶酶），溶于pH为4.0的缓冲溶液中，在55℃水浴上激活10min，然后与匀浆液混匀，在40℃下酶解4h。诱导液分离后固形物采用超声波提取方法，用80%乙醇为溶剂进行提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将固体物质，加入50℃温水2L，于超声波提取器中100KHz条件下振荡絮凝20min，静止15min，取粘稠絮凝物，以-0.05MPa负压为动力用等体积乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，将固形物用乙醇溶解，加入3倍AB-8树脂，使样品吸附，待溶剂挥干后上样，洗脱步骤为：水洗脱至无色，30%乙醇溶液10BV，50%乙醇溶液12BV、70%乙醇溶液20BV、80%乙醇溶液30BV和95%乙醇溶液22BV。洗脱完毕后收集含有目标成分的馏分，浓缩后分别进行凝胶分离。
[0026] 将树脂洗脱的50%、70%、80%以及95%部分分别浓缩，并将浓缩物用5%的甲醇溶解，配成12mg/mL的样品溶液，用Sephadex LH-20洗脱，经0.45μm滤膜过滤后，按照100mg样品/mL凝胶，注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇5倍柱体积洗脱、然后用40%甲醇6倍柱体积洗杂质、最后用90%甲醇6倍柱体积洗脱，收集洗脱液并浓缩得到固体。
[0027] 将树脂50%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)进行洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马素PB粗品，用石油醚:乙酸乙酯=5:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.1±0.2%的绵马酚28.81±0.47mg。
[0028] 将树脂70%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)开始洗脱，待棕色样品流出后开始收集组分并采用TLC进行 监测，浓缩得到绵马素PB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=20:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度96.4±0.3%的绵马素PB 79.14±0.37mg。
[0029] 将树脂80%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷：乙酸乙酯=50:1(v/v)开始洗脱，先用10BV正己烷洗脱，然后采用10BV正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)，10BV正己烷:乙酸乙酯=30:1(v/v)进行洗脱，最后用正己烷:乙酸乙酯=15:1(v/v)开始洗脱，待棕黄色色带流出后，收集流分并用TLC监测，至收集液中不含目标成分的部分，将样品浓缩得到香鳞毛蕨素粗品，用正己烷:乙酸乙酯=30:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.2±0.1%的香鳞毛蕨素345.42±0.72mg。 [0030] 将树脂95%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后用正己烷:乙酸乙酯=50:1(v/v)开始洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马素BB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=80:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.7±0.5%的绵马素BB 413.24±0.48mg。
附图说明
[0031] 图1为绵马酚分子结构式
[0032] 图2为绵马素PB分子结构式
[0033] 图3为香鳞毛蕨素分子结构式
[0034] 图4为绵马素BB分子结构式。
