技术领域
[0001] 本
发明属于
生物发酵技术领域，尤其涉及到一种制备菊粉酶的生产方法。
背景技术
[0002] 菊粉酶，学名(β-2，1-D一果聚糖酶)，又叫(β一果聚糖酶)，或叫[2，1-D一果聚糖
水解酶(EC 3.2.1)]。它是一种多糖水解酶，能够水解(β-2，1-D一果聚糖)的果糖苷键。
[0003] 目前菊粉酶的应用前景主要体现在三个方面：
[0004] 1)利用菊粉酶水解菊粉生产高果糖浆。由于高果糖浆价格低廉，味甜，爽口，渗透压高，保藏效果好，热值低，不易造成龋齿，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等发达国家被广泛用于食品和医药工业。该方法较以
淀粉为原料经过多种酶催化生产果糖的传统方法大为简化，且生产成本低，工艺简单，初产物即为高果糖浆。
[0005] 2)利用菊粉酶生产低聚果糖。低聚果糖是一种良好的双歧因子和
水溶性膳食
纤维，有防治便秘、抑制肠内腐败物质形成、提高
机体免疫
力、改善脂质代谢、降低胆固醇等作用，适于糖尿病人食用。
[0006] 3)利用菊粉酶生产酒精。将粗菊芋提取液先用菊粉酶水解成单糖，再通过发酵可生产
生物燃料酒精。
[0007] 虽然菊粉酶的
微生物在自然界中分布很广，
土壤、水和动物消化道中的多种微生物都能分泌，但真正具有高产菊粉酶的菌株却很少。
[0008] 目前在菊粉酶的研究和应用中遇到的主要困难如下：
[0009] 产酶菌株的菊粉酶产量低，导致应用成本高，制约了低聚果糖和高果糖浆在食品工业和
饲料工业中的应用。
发明内容
[0010] 为解决上述问题，本发明提供了一种制备菊粉酶的生产方法，该制备方法可以提高菊粉酶的产量，缩短发酵周期，降低生产成本。
[0011] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0012] 所述的一种制备菊粉酶的生产方法，该生产方法包括孢子悬液的制备、液体
种子的制备、黑曲霉发酵液的制备和菊粉酶制品的制备四个步骤，各步骤分述如下：
[0013] I、孢子悬液的制备
[0014] 将黑曲霉菌种接种到斜面培养基上并放于28℃的恒温箱中恒温培养3～4天生成孢子，取出孢子后加入浓度为0.85％的无菌生理盐水洗涤孢子制得孢子悬液；再用浓度为7
0.85％的无菌生理盐水稀释孢子悬液至每毫升液体中孢子数为10 个备用；
[0015] 所述斜面培养基构成为蛋白胨10g/L、菊粉40g/L和琼脂20g/L；
[0016] II、液体种子的制备
[0017] 将液体种子培养基加热到121℃并灭菌20min后冷却至28～30℃备用，按体积比3～6％的接种量将孢子悬液接入所述28～30℃的液体种子培养基中进行培养，在200～
300转/分的摇床上培养14～24h得到液体种子；
[0018] 所述液体种子培养基构成为
酵母粉10～20g/L、蛋白胨10～20g/L和菊粉30～50g/L；
[0019] III、黑曲霉发酵液的制备
[0020] 在
发酵罐中加入黑曲霉发酵基，黑曲霉发酵基加入量是发酵罐容积的70～75％，然后往发酵罐中通入121℃的
蒸汽对黑曲霉发酵基灭菌15min后冷却至28～30℃备用，在无菌状态下按体积比3～7％的接种量将液体种子接入黑曲霉发酵基中进行发酵，发酵的
温度控制在24～40℃，发酵的搅拌速度控制在150～200转/分，发酵的通
风量控制在0.3～2.0vvm；在所述发酵条件下的0～60h时间段内开启超声发射装置对黑曲霉发酵基和液体种子进行超声辐照培养，超声辐照培养进行完后继续无超声培养，超声辐照培养时间+无超声培养时间控制在70～100h得到黑曲霉发酵液；
[0021] 所述黑曲霉发酵基按重量百分比构成如下：
[0022] 玉米粉水溶液2～10％，豆饼粉2～10％，
磷酸氢二
钾1.5～5％，氯化
钙1～8％，
硫酸氨2-8％，其余为水；黑曲霉发酵基的pH值为5.5-7.0；
[0023] IV、菊粉酶制品的制备
[0024] 采用盐析法，或采用
喷雾干燥法，或采用普通干燥法，或采用絮凝-
超滤法将菊粉酶从黑曲霉发酵液中沉淀出来，经
压滤机过滤废液，
滤饼烘干，得到菊粉酶制品。
[0025] 所述的一种制备菊粉酶的生产方法，超声发射装置或是单频超声发射装置，或是两个单频超声发射装置的组合，或是双频超声发射装置，或是两个双频超声发射装置的组合，无论上述哪种超声发射装置，其超声总
频率控制在16kHz～10MHz，超声总功率控制在20～5000W。
[0026] 所述的一种制备菊粉酶的生产方法，超声发射装置的辐照方式或为连续式发射，或为间歇式发射。
[0027] 由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
[0028] 1.本发明采用
超声波对黑曲霉发酵过程进行辐照，利用
超声波来增强黑曲霉细胞膜的通透性，促使胞内酶尽可能多的释放，促进细胞生长，同时缩短微生物发酵产酶的时间，提高微生物产酶量，节约了生产成本和提高了产品的
质量，整个生产工艺稳定可靠。
[0029] 2.本发明具有发酵效率高，发酵时间短，生产方法简单、稳定，节约了生产成本和提高了菊粉酶的产量。
具体实施方式
[0031] 孢子悬液的制备：将黑曲霉菌种接种到斜面培养基上，斜面培养基的构成为(g/L)：蛋白胨10、菊粉40和琼脂20，斜面培养基的pH值为自然值。将接种的斜面培养基放于28℃的恒温箱中恒温培养3天生成孢子，取出孢子后加入浓度为0.85％的无菌生理盐水洗涤孢子制得孢子悬液。再用浓度为0.85％的无菌生理盐水稀释孢子悬液至每毫升液体中孢
7
子数为10 个备用。
[0032] 每毫升液体中孢子数为107个的检测方式可采用平板菌落计数法测得。
[0033] 液体种子的制备：液体种子培养基的构成为(g/L)：酵母粉15、蛋白胨15和菊粉40，液体种子培养基的pH值为自然值。将液体种子培养基加热到121℃并灭菌20min后冷却至30℃备用，按体积比3％的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中进行培养，在28℃和250转/分的摇床上培养18h得到液体种子。
[0034] 黑曲霉发酵液的制备：黑曲霉发酵基按重量百分比构成为：玉米粉水溶液2％，豆饼粉10％，
磷酸氢二钾1.5％，
氯化钙1％，硫酸氨2％，水83.5％。黑曲霉发酵基的pH值为6.5。在发酵罐中加入黑曲霉发酵基，黑曲霉发酵基加入量是发酵罐容积的70％，然后往发酵罐中通入121℃的蒸汽对黑曲霉发酵基灭菌15min后冷却至28℃备用，在无菌状态下按体积比4％的接种量将液体种子接入上述黑曲霉发酵基中进行发酵，发酵的
温度控制在28℃，发酵的搅拌速度控制在150转/分，发酵的
通风量控制在2.0vvm；在所述发酵条件下先进行2h的培养，2h后开启单频超声发射装置对黑曲霉发酵基和液体种子进行超声辐照培养，超声频率为16kHz，超声功率为20W，超声辐照方式为连续式发射，超声辐照培养时间为60h；超声辐照培养进行完后继续8h的无超声培养得到黑曲霉发酵液，测得黑曲霉发酵液中的酶活力达76.2U/mL，与未经超声处理的同类发酵液相比其酶活力提高了32.4％。
[0035] 菊粉酶制品的制备：采用盐析法将菊粉酶从黑曲霉发酵液中沉淀出来，经压滤机过滤废液，滤饼烘干，得到菊粉酶制品。
[0036] 实施例2：一种制备菊粉酶的生产方法
[0037] 孢子悬液的制备：将黑曲霉菌种接种到斜面培养基上，斜面培养基的构成为(g/L)：蛋白胨10、菊粉40和琼脂20，斜面培养基的pH值为自然值。将接种的斜面培养基放于28℃的恒温箱中恒温培养3天生成孢子，取出孢子后加入浓度为0.85％的无菌生理盐水洗涤孢子制得孢子悬液。再用浓度为0.85％的无菌生理盐水稀释孢子悬液至每毫升液体中孢
7
子数为10 个备用。
[0038] 每毫升液体中孢子数为107个的检测方式可采用平板菌落计数法测得。
[0039] 液体种子的制备：液体种子培养基的构成为(g/L)：酵母粉17、蛋白胨17和菊粉35，液体种子培养基的pH值为自然值。将液体种子培养基加热到121℃并灭菌20min后冷却至30℃备用，按体积比6％的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中进行培养，在28℃和250转/分的摇床上培养20h得到液体种子。
[0040] 黑曲霉发酵液的制备：黑曲霉发酵基按重量百分比构成为：玉米粉水溶液4％，豆饼粉6％，磷酸氢二钾3.5％，氯化钙4％，硫酸氨4％，水78.5％。黑曲霉发酵基的pH值为6.8。在发酵罐中加入黑曲霉发酵基，黑曲霉发酵基加入量是发酵罐容积的75％，然后往发酵罐中通入121℃的蒸汽对黑曲霉发酵基灭菌15min后冷却至28℃备用，在无菌状态下按体积比3％的接种量将液体种子接入上述黑曲霉发酵基中进行发酵，发酵的温度控制在
24℃，发酵的搅拌速度控制在160转/分，发酵的通风量控制在1.2vvm；在所述发酵条件下先进行12h的培养，12h后开启单频超声发射装置对黑曲霉发酵基和液体种子进行超声辐照培养，超声频率为42kHz，超声功率为500W，超声辐照方式为间歇式发射，间歇发射的时间为发射12秒→停发4秒→发射12秒→停发4秒→如此循环，超声辐照培养时间为20h；
超声辐照培养进行完后继续63h的无超声培养得到黑曲霉发酵液，测得黑曲霉发酵液中的酶活力达123.1U/mL，与未经超声处理的同类发酵液相比其酶活力提高了56.2％。
[0041] 菊粉酶制品的制备：采用盐析法将菊粉酶从黑曲霉发酵液中沉淀出来，经压滤机过滤废液，滤饼烘干，得到菊粉酶制品。
[0042] 实施例3：一种制备菊粉酶的生产方法
[0043] 孢子悬液的制备：将黑曲霉菌种接种到斜面培养基上，斜面培养基的构成为(g/L)：蛋白胨10、菊粉40和琼脂20，斜面培养基的pH值为自然值。将接种的斜面培养基放于28℃的恒温箱中恒温培养4天生成孢子，取出孢子后加入浓度为0.85％的无菌生理盐水洗涤孢子制得孢子悬液。再用浓度为0.85％的无菌生理盐水稀释孢子悬液至每毫升液体中孢
7
子数为10 个备用。
[0044] 每毫升液体中孢子数为107个的检测方式可采用平板菌落计数法测得。
[0045] 液体种子的制备：液体种子培养基的构成为(g/L)：酵母粉10、蛋白胨10和菊粉50，液体种子培养基的pH值为自然值。将液体种子培养基加热到121℃并灭菌20min后冷却至28℃备用，按体积比4.5％的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中进行培养，在28℃和200转/分的摇床上培养24h得到液体种子。
[0046] 黑曲霉发酵液的制备：黑曲霉发酵基按重量百分比构成为：玉米粉水溶液5％，豆饼粉5％，磷酸氢二钾3％，氯化钙5％，硫酸氨5％，水77％。黑曲霉发酵基的pH值为6.5。在发酵罐中加入黑曲霉发酵基，黑曲霉发酵基加入量是发酵罐容积的72％，然后往发酵罐中通入121℃的蒸汽对黑曲霉发酵基灭菌15min后冷却至28℃备用，在无菌状态下按体积比5％的接种量将液体种子接入上述黑曲霉发酵基中进行发酵，发酵的温度控制在30℃，发酵的搅拌速度控制在180转/分，发酵的通风量控制在1.0vvm；在所述发酵条件下先进行36h的培养，36h后开启双频超声发射装置对黑曲霉发酵基和液体种子进行超声辐照培养，双频超声发射装置的超声频率为40kHz+500kHz，超声总功率为1000W，超声辐照方式为连续式发射，超声辐照培养时间为60h；超声辐照培养进行完后继续4h的无超声培养得到黑曲霉发酵液，测得黑曲霉发酵液中的酶活力达132.6U/mL，与未经超声处理的同类发酵液相比其酶活力提高了76.4％。
[0047] 菊粉酶制品的制备：往发酵液中加入酶稳定剂，过滤大颗粒后用喷雾干燥法干燥，得到菊粉酶制品。
[0048] 实施例4：一种制备菊粉酶的生产方法
[0049] 孢子悬液的制备：将黑曲霉菌种接种到斜面培养基上，斜面培养基的构成为(g/L)：蛋白胨10、菊粉40和琼脂20，斜面培养基的pH值为自然值。将接种的斜面培养基放于28℃的恒温箱中恒温培养4天生成孢子，取出孢子后加入浓度为0.85％的无菌生理盐水洗涤孢子制得孢子悬液。再用浓度为0.85％的无菌生理盐水稀释孢子悬液至每毫升液体中孢
7
子数为10 个备用。
[0050] 每毫升液体中孢子数为107个的检测方式可采用平板菌落计数法测得。
[0051] 液体种子的制备：液体种子培养基的构成为(g/L)：酵母粉20、蛋白胨10和菊粉30，液体种子培养基的pH值为自然值。将液体种子培养基加热到121℃并灭菌20min后冷却至28℃备用，按体积比6％的接种量将孢子悬液接入上述冷却的液体种子培养基中进行培养，在29℃和300转/分的摇床上培养14h得到液体种子。
[0052] 黑曲霉发酵液的制备：黑曲霉发酵基按重量百分比构成为：玉米粉水溶液10％，豆饼粉2％，磷酸氢二钾5％，氯化钙8％，硫酸氨8％，水67％。黑曲霉发酵基的pH值为5.5。在发酵罐中加入黑曲霉发酵基，黑曲霉发酵基加入量是发酵罐容积的75％，然后往发酵罐
