一、技术领域
[0001] 本
发明属于生物技术细胞工程及
发酵工程技术领域。二、背景技术
[0002] 现如今，对
哺乳动物细胞的体外培养已经是很成熟的技术，但是大部分哺乳动物细胞必须依附于一定的表面才能生长，而当细胞的生长占据了全部表面后，细胞由于
接触抑制而不能继续生长，因此对于贴壁生长的细胞很难进行大规模培养。为了让这一类贴壁生长的细胞也可以像细菌一样高
密度生长，便产生了微载
体细胞悬浮培养技术：让细胞贴附于微小颗粒(微载体)上，随微载体一起悬浮，微载体可以提供相当大的表面积(微载体浓度越大，提供的表面积越大)供细胞贴附，从而使得细胞生长的密度成对数级增长。但是由于细胞的抗逆能
力远低于细菌，一般的
发酵罐不能适用于细胞的培养。在细菌发酵罐的
基础上，用于微载体细胞培养的生物反应器需要至少解决三个问题：
[0003] 第一、更温和的悬浮方法。用于悬浮细菌的搅拌桨同样也被用于搅拌微载体，但搅拌速度必须很低，过高的速度下，搅拌桨会划伤微载体表面上的细胞，甚至将细胞从贴壁状态撕扯下来。这就限制了微载体的使用浓度，因为低速搅拌不足以让它们全部悬浮，沉积下来的细胞过于拥挤也不能生长。
[0004] 第二、温和高效的气体交换途径。细菌发酵罐的气体是直接通入罐内液体底部的，而对于细胞，气泡浮出液面破裂时的表面
张力对细胞是致命的。因此用于细胞培养的生物反应器是将气体交换区与细胞生长区隔离开来，或采用液体表面通气的方式。 [0005] 第三、培养基的更新方法。细菌发酵过程几乎不需要补充养分，因为细菌是独立的生物体，它本身具有分解养分制造自己所需营养物质的能力，只要给它们足够的食物，它们就不会缺少营养；而动物细胞不一样，自然状态下，细胞所需营养成分都来自动物的消化器官，体外培养状态下，细胞的培养基成分是一定浓度的、细胞可以直接吸收的营养、维生素等，部分成分的消耗或代谢废物的增加都会影响细胞的正常生长，因此在高密度培养时，随时进行培养基更新是非常必要的。而要在保证微载体和细胞不流失的前提下连续抽出培养基是比较困难的！三、发明内容
[0006] 本发明灵感来源于
混合液体的方法，让微载体悬浮其实也就是让微载体与液体混合均匀。搅拌的方法应用最广，也最先被应用到生物反应器中；震摇的方法也很快被应用； 而实际上混合效果最好的方法是反复调换上下端，因为其中易沉淀的颗粒刚要沉淀到底部，底部又转成了上部，在重力作用下，颗粒又会反向向新的底部沉淀。无论调换上下端的速度快慢，永远不会有颗粒沉积，因为没有一个固定的底部可以让它们一直呆着。这种混合方法才是最温和最高效的，因此更适合应用于细胞培养的生物反应器中。 [0007] 本发明通过让生物反应器的整个罐体做180～360度往复转动(不可连续转动)反复调换上下端，让微载体在罐内做往复运动，不需要搅拌轻松实现悬浮。这样做要比仅仅让一个搅拌桨连续转动要困难得多，如果这样做仅仅是为了实现温和的悬浮就不一定划算了，而事实上，这样做也为解决其它问题提供了极大的方便：
[0008] 第一、提高控制
精度，减少控制盲区。上下端反复对调是最高效的混合方式，不仅对微载体悬浮有利，更对反应罐内液体的均一性有利，如让调节酸
碱度的液体迅速混匀，能降低局部
过酸或过碱对细胞的伤害，也能让检测探针检测到的数据真实、及时地反馈调节效果，从而提高控制精度。相反，如果不能及时混合均匀，就会出现局部缺养、过酸、过碱的情况，这种情况持续存在，整罐的细胞都不法生存，因此混合方式也是制约细胞培养罐做大和微载体浓度加大的主要因素。只有混合均一，检测数据才能反映罐内真实的情况，只有根据真实情况进行调整，才能保证调整的方向正确。
[0009] 第二、完美的气体交换方式。由于罐体是往复转动的，罐内的气体也可以两端反复游走，这样就不需要连续通气就可以实现普通罐连续通气的效果，而且由于没有液面，气泡表面破裂的机会非常少，气体除了慢慢溶于液体之外，别无它路。因此可以直接向罐内通气而不需要另外划分气体交换区。而气体在罐中游走能起到搅拌的作用，同时提高了混合效果。而不连续通气则可以大大降低高纯气体的浪费——连续通气则会让大部分气体来不及溶解冒出液面散入空气中。根据控制方式的需要或排除气泡融合时的泡面破裂的影响也可以选用分离的气体溶解腔。
[0010] 第三、无搅拌桨的障碍。搅拌桨的转动常会带来安全隐患，因为有了桨，反应器罐中布局需非常谨慎，罐体的运动使得桨被抛弃了，没有安全隐患，我们可以更随意地布置罐内的设施，比如在罐内设滤网。在罐内设滤网可以解决两个问题：
[0011] A.更新培养基。更新培养基的难点是先抽出罐内部分旧培养基而不带走长有细胞的微载体，通常我们都会在抽出培养基的过程中用滤网拦截微载体，而很快滤网就会被堆集的微载体堵住，再加上微载体上细胞的生长延伸到滤网上，堵塞会越来越严重使换液无法进行。本发明从五个方面解决滤网的堵塞问题：1.增大滤网面积，降低单位面积的液流量压力，在罐内增大滤网面积不需占用空间；2.由于没有了搅拌桨，可以将滤网放 在罐底(顶)作为罐内壁的一部分，这样沉积在滤网上的微载体可以在高效的混匀方式下重新回到液体中；3.两个滤网交替使用，这样空闲滤网上的
沉积物更容易被冲洗下来；4.两个滤网使用的时机配合罐体的转动由重力来控制，即：总是从上方的滤网来抽出液体，与重力沉降的方向相反，可以抑制微载体向上沉积于滤网上(见图2例)。5.配合往复循环：经第一个滤网抽出的液体除了被废弃的一部分外，另一部分回到第二个滤网，反向冲洗堵在上面的微载体；下一次从第二个滤网抽出液体，并冲洗第一个滤网，如此交替进行，形成往复式循环。这样可以及时对滤网进行反向冲洗，进一步降低堵塞的可能(见图3例)。 [0012] B.用滤网划分控制区。调节pH用的酸碱液都是细胞不能接触的极端溶液(极酸或极碱)，如果用滤网划出一
块区域让这些极端溶液在里面有一段缓冲后再与细胞接触，将大大减小对细胞的伤害(图2：7)。
[0013] 第四、循环通道的形成便于引进在线的检测设备及处理设备(图3：22)。循环通道可以像人的血管一样，连接各种新陈代谢及功能“器官”，可以根据需要添加更多的控制功能。这样更具
仿生学的意义。目前有一些检测设备，还不能直接用于生物反应器的在线适时应用，而需要从反应器中
采样。而循环通道则可以直接连接这些检测设备，用于适时监控，如紫外监测仪。用于细胞大规模培养过程的处理设备目前还没有，但是可以预见，一些
吸附类或交换类的去除代谢废物的处理系统将可以被接入循环通道中。对细胞生长所需营养与环境的深入研究将使更新培养基没有必要，而只需去除代谢废物、添加消耗营养即可完成所需的生物反应周期。为了说明此循环通道的价值，本发明
附图4设计了一个简单适用的反应器细胞代谢产物在线收集装置，可以在反应器开始产出时替代换液管道，同时承担收集产物和排出废液的功能。
[0014] 第五、无桨及循环控制有助于将反应器罐做得更小。混合的效率使反应器罐可以做得更大；可大可小反应器罐使细胞培养的每个阶段都有相同的选择，不必为细胞进入反应器罐前的大批量培养而担心，小罐细胞直接传大罐即可。四、附图说明
[0015] 图1为本发明罐体结构的一种设计方案，为罐体的往复转动及往复循环结构基础。标号注解如下：
[0018] 3-滤网
支架 6-气液及
电极入口开口处
[0019] 7-主罐体中部
[0020] 图2是一种由本发明实施的反应器运行控制方案。标号注解如下： [0021] 1-废液出口 10-死端/空气入口
[0023] 3-进出液预留口 12-二氧化
碳气入口
[0025] 5-滤网 14-碱液入口
[0026] 6-滤网支架 15-备用入口
[0027] 7-控制腔 16-液体选择阀
[0029] 9-气体选择阀 18-液体入口
[0030] 图3在图2基础上加入往复循环结构。1～18号同图2，其它标号注解如下： [0031] 19-重力
控制阀 21-
蠕动泵[0032] 20-重力控制阀 22-外置监测与处理设备
[0033] 图4反应器细胞代谢产物收集装置，标号注解如下：
[0034] 1-切向流滤 6-蠕动泵
[0036] 3-透过液出口 8-透过液出口
[0037] 4-蠕动泵 9-蠕动泵
[0038] 5-产物收集瓶 10-废弃液收集瓶
[0039] 五、具体实施方法
[0040] 1.本发明往复转动罐体的设计方案(图1)
[0041] 如图示意了一种形状、大小、比例、材质不限的容器，此为纵切图：上、下端开口(1)，通过相对比较结实的不锈
钢支撑筒(5)连接上下罐盖(2)和主罐体中部(7)，不采用一体式设计是为了便于更换和清洗支撑筒(5)与罐盖(2)之间的滤网(4)及滤网支架(3)。支撑筒(5)四周可开孔(6)以插入检测电极及作为气体和液体的入口。同时，支撑筒(5)支持整个罐体的重量，并与转动设备连接，支撑罐体做180～360度往复转动以调换罐体的上下端。在罐体转过的过程中，所有
水电气接口都通过
转轴中心或靠 近转轴中心与静止部分相连。主要有：电极数据线泵的控制线及电源线、加热及
致冷电源线、补液及废液管道、氧气与二氧化碳气管道等。因为这些管路与线路，所以罐体单方向转动不能超过360度。此外
离心力沉淀也是罐体不可连续转动的原因。
[0042] 2.本发明反应器运行控制方法(图2)
[0043] 如图所示，运行状态下，罐体及所有连接管道均充满液体(气体管道除外)，气体选择阀(9)选择空气入口(10)，而空气入口(10)夹死形成死端；液体入口(18)又被蠕动泵(17)
压实；罐体密封，只有废液出口(1)为开口，这时液体不会流出。下面分述反应器细胞培养过程中的常用控制在本发明中的操作：
[0044] 2.1更新罐内培养基：液体选择阀(16)选择培养基入口(13)，开启蠕动泵(17)，培养基泵入罐中，罐中液体则经滤网(5)流到重力控制阀(2)经废液出口(1)排出。如罐体转动使罐的上下端对调，重力控制阀(2)会自动堵住下方的通道，同时开放上端通道，保证了液体总是从上方流出。
[0045] 2.2罐中液体pH偏低：同2.1，液体选择阀(16)选择碱液入口，泵入碱液以提高pH。
[0046] 2.3罐中液体pH偏高：气体选择阀(9)选择二氧化碳气入口(12)，形成开口，废液出口(1)出液，吸入气体。气体入口不宜长时间开启，应及时返回死端(10)——夹死的空气入口，否则液体就可能全部排空！所以，当我们想排空反应器罐时，就需要打开空气入口。 [0047] 2.4罐中液体溶氧偏低：同2.3，气体选择阀(9)选择氧气入口(11)，通入氧气。 [0048] 2.5微载体细胞小罐传大罐：罐体停转后，使用预留进出液口(3)将大小两个罐用管道连接向小罐泵入培养基或通入压力空气，从而将小罐内的微载体和细胞导流到大罐。 [0049] 2.6采样：采样用进出液预留口(3)，进出液预留口(3)平时密封，采样时开启并将废液出口(1)关闭，泵入培养液则自动流出罐内细胞液。
[0050] 3.往复循环结构的液体流向控制(图3)
[0051] 图3比图2仅多了往复循环结构，蠕动泵(21)作为液体循环的动力，只需要定速工作即可，液流方向由两个重力控制阀(19，20)来控制，如图示，从而保证在罐体转过过程中液体始终从罐上方流出，罐下方流入。循环通道的形成便于将罐中的液体输送给相关检测及处理设备(22)，并将处理后的液体输回罐中。
[0052] 4.生物反应产物即时收集器(图4)
[0053] 本收集器具有较大的实用性，它不仅可以即时地将代谢产物从罐中分离出来，而且在生物反应周期结束的同时，基本可以完成浓缩工序，节省了工艺时间。设计原理就是将罐内液体经
切向流过滤后收集于瓶中，瓶中的收集液再经小孔径的切向流过滤进行浓缩，浓缩时排出的透过液可以输回罐中再利用。而目前采用收集产物方法是收集十几万到几十万的培养液后再一起浓缩，浓缩产生的十几万到几十万的培养液全部废弃，这是巨大的浪费。本设计通过用两个等速的蠕动泵(4，9)放在两个滤器的透过液端(3，8)来控制收集产物速度和产物被浓缩的速度相等，这样产物不断地被收集，而收集液的体积却不会变化，只是产物越来越浓。产物收集瓶(5)可以放进
冰箱内，以保持收集产物的生物学活性。浓缩机透过液出口(8)分出一支管路连接废液瓶(10)，当罐中营养不足补充新培养基时，废液会自动流出。单向阀(2)则可以防止含有产物的液体倒流入废液瓶(10)。
