技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物干细胞在抗衰老产品的应用，尤其涉及雪莲干细胞的分离培养方法及在制备抗衰老产品中的应用。
背景技术
[0002] 干细胞是一种尚未分化发育的
种子细胞，具有无限自我更新复制和分化潜能，这是干细胞用于美容产品的
基础。干细胞美容技术及其相关产品近两年受到美容界专家及业内人士的广泛关注。所有的干细胞，不论它们的来源(植物、动物或者人类)均含有特别的表观遗传因子以及丰富的营养物质，这些物质是维持干细胞的自我更新能
力。
[0003] 植物干细胞技术是以植物的伤口复原机制为基础，先令植物形成伤口从而诱导复原组织细胞的形成，复原组织包含了未分化的细胞即干细胞，将这些复原组织细胞收集起来并在培养液中培养，培养液中蕴含了果糖、微量元素以及植物荷尔蒙，继而放置于
生物反应系统进行大规模生产。
[0004] 雪莲是菊科毛凤菊属多肉植物，为菊科多年生草本植物。雪莲内含有丰富的细胞，尤其是干细胞。此外，由于其生在在海拔5000米的山中，那里空气稀薄同时要饱受最强的紫外线和
辐射的侵袭，因此其干细胞可以从根本上解决人类普遍存在的衰老问题。
[0005] 有相关报告和
专利称，将动植物干细胞活性成分添加到
化妆品中能起到一定的抗皱效果，然而，真正来源于动植物干细胞的活性物由于产率低导致原料价格非常昂贵，从而限制了它的使用。此外，现今市场上干细胞产品多来自于动物性胎盘素或动物性干细胞，它们与人
体细胞成分接近，从而可以用于抗衰老等功效。然后，动物源性干细胞的使用在许多国家存在争议，不仅存在安全隐患，同时具有诸多人道方面的限制。而植物干细胞苏日安大都具有全能性，具备干细胞的特点，然而其与人体的同源性较多，因此植物干细胞提取物具备的功能目前还不是十分清楚，阻碍了相应的应用。
发明内容
[0006] 目前苹果干细胞已被首次应用到化妆品中，而对于雪莲干细胞的研究目前并未报道，所以本发明首次从雪莲复原组织中提取分离较高生理活性的植物干细胞，并进行大规模生产；将其制成冻干粉，以一定的比例添加至抗衰老美容产品中。
[0007] 本发明目的通过以下技术方案来实现：
[0008] 一种雪莲干细胞的分离培养方法，其特征在于，取天山雪莲幼嫩
叶片，对其消毒后首先利用固体培养基分离天山雪莲干细胞，再利用液体培养基对其进行传代配养；所述固体培养基含有无机盐、维生素、
氨基酸、生长素、糖类和
活性炭；液体培养基含有无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和添加物。
[0009] 优选包括以下步骤：
[0010] (1)取雪莲幼嫩叶片，清洗、消毒；
[0011] (2)将消毒后的雪莲叶片接种至固体培养基上；所述固体培养基含有无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类、活性炭和琼脂；培养
温度为25-29℃，pH值为6.0-6.5，培养时间为20-25天，得到来源于形成层的雪莲干细胞；
[0012] (3)将来源于形成层的雪莲干细胞转移至液态培养基中培养，所述液体培养基含有无机盐、维生素、氨基酸、生长素、糖类和添加物。
[0013] 在步骤(2)所述接种之前，先将消毒后雪莲幼嫩叶片切成约0.5cm*0.5cm大小，接种时，使叶背面与培养基
接触，每瓶1片；
[0014] 步骤(2)所述无机盐为
硝酸钾、
硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸
铜、氯化
钙、碘化钾、氯化钴、
磷酸二氢钠或
硼酸中的一种以上；各物质的含量为：硝酸钾2450-2500mg/L，
硫酸镁122-124mg/L，硫酸锰11-13mg/L，硫酸锌2.0-3.0mg/L，硫酸铜0.03-0.05mg/L，
氯化钙112-114mg/L，碘化钾0.7-0.75mg/L，氯化钴0.024-0.026mg/L，磷酸二氢钠132-135mg/L，硼酸2.8-3.0mg/L；
[0015] 维生素为肌醇、硫胺类、烟酸、L-
抗坏血酸或
柠檬酸中的一种以上；各物质的含量为：肌醇210-230mg/L，硫胺类19-21mg/L，烟酸1.6-2.2mg/L，L-抗坏血酸52-55mg/L，柠檬酸75-85mg/L；
[0016] 氨基酸为L-天冬氨酸、L精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一种以上；各物质的含量为：L-天冬氨酸135-145mg/L，L精氨酸160-180mg/L，甘氨酸78-85mg/L，脯氨酸118-126mg/L；
[0017] 生长素为α-
萘乙酸，含量为1.8-3.0mg/L；
[0018] 糖类为
蔗糖或果糖，含量为10.0-12.0mg/L；
[0019] 活性炭的含量为450-550mg/L；
[0020] 琼脂的含量为3.6-3.8mg/L；
[0021] 步骤(3)所述无机盐为硝酸钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙、碘化钾、氯化钴、磷酸二氢钠或硼酸中的一种以上；
[0022] 各物质的含量为：硝酸钾992-996mg/L，硫酸镁180-184mg/L，硫酸锰22-26mg/L，硫酸锌10-12mg/L，硫酸铜0.3-0.5mg/L，氯化钙72-76mg/L，碘化钾0.3-0.6mg/L，氯化钴0.03-0.036mg/L，磷酸二氢钠126-131mg/L，硼酸2.0-2.5mg/L；
[0023] 维生素为肌醇、硫胺类、烟酸、L-抗坏血酸或柠檬酸中的一种以上；各物质含量为：肌醇194-220mg/L，硫胺类20-23mg/L，烟酸3-5mg/L，L-抗坏血酸57-62mg/L，柠檬酸75-83mg/L；
[0024] 氨基酸为L-天冬氨酸、L精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一种以上；各物质的含量为：L-天冬氨酸136-142mg/L，L精氨酸172-180mg/L，甘氨酸75.0-85.0mg/L，脯氨酸110.0-115.0mg/L；
[0025] 生长素为α-萘乙酸，含量为3.0-5.0mg/L；
[0026] 糖类为蔗糖或果糖，含量为32.0-34.0mg/L；
[0027] 添加物为麦饭石颗粒和硒
矿石颗粒，麦饭石颗粒60.0-80.0mg/L，硒矿石颗粒60.0-80.0mg/L。
[0028] 本发明还提供了一种利用所述的分离培养方法制备雪莲干细胞提取物的方法，包括以下步骤：
[0029] (1)将上述的分离培养方法获得的雪莲干细胞放大培养；
[0030] (2)过滤培养液，将截留的细胞系培养物取出，冷冻、
破碎后，过滤，将滤液浓缩即得雪莲干细胞提取物。
[0031] 所述放大培养是将在液体培养基中培养的干细胞移入
生物反应器内培养，培养液使用液态培养基(成分同分离培养方法步骤(3)中的液体培养基)，在25℃不间断搅拌，在培养至第10d时，向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉
酮酸酯和无菌磁化
水的
混合液；
[0032] 步骤(2)所述冷冻是放入-80℃超低温冷冻2h，取出解冻30min；再放入-80℃超低温冷冻，依次3-5次；最后一次解冻后利用
超声波破碎仪破碎细胞，
过滤器过滤，收集滤液，旋转式
真空蒸发器内浓缩，即为雪莲干细胞提取物。
[0033] 还包括将雪莲干细胞提取物与甘露醇和水混合后，除菌、冻干制得雪莲干细胞提取物冻干粉的步骤。所述水为50～60℃的超纯水，采用BCA法对所述雪莲干细胞提取物进行
蛋白质浓度测定，根据该蛋白浓度，加入水调节至蛋白终浓度为50.0±0.5μg/ml；所述甘露醇的
质量占雪莲干细胞提取物总质量的5％；所述冻干的温度为-20～-35℃，真空度为50～200Pa，冻干时间为48小时。
[0034] 本发明提供了一种雪莲干细胞提取物冻干粉包括雪莲干细胞提取物和甘露醇，其中甘露醇的质量占雪莲干细胞提取物总质量的5％。
[0035] 本发明还提供了所述的雪莲干细胞提取物的制备方法制得雪莲干细胞提取物或雪莲干细胞提取物冻干粉在抗衰老产品中的应用。
[0036] 优选，所述的方法制得雪莲干细胞提取物或雪莲干细胞提取物冻干粉制得的一种眼霜，包含雪莲干细胞冻干粉0.1-20ng、紧肤剂2.0-3.5g、去皱剂0.5-2.5g、
丙烯酸聚合物0.5-2.5g、乳化剂1.0-3.5g、棕榈酸异丙酯3.5-5.5g和合成
角鲨烷0.5-3.5g。
[0037] 本发明眼霜的制备工艺包括如下步骤：
[0038] 将丙烯酸聚合物用去离子水加热溶解、搅拌均匀，A组分于70～80℃溶解，A组分倒入丙烯酸聚合物中，搅拌均匀，降温至37～50℃后加入C组分和D组分，搅拌均匀，则制备得到本
实施例的雪莲干细胞冻干粉眼霜。A组分包括乳化剂、棕榈酸异丙酯和合成角鲨烷。C组分包括紧肤剂和去皱剂，D组分为用稳定剂溶解后的雪莲干细胞冻干粉。
[0039] 本发明相对于
现有技术所具有的优点及有益效果：
[0040] 人脂肪间充质干细胞提取物在提高了细胞内SOD酶的活性，从而减少因紫外线辐射诱导产生的
氧自由基对细胞的攻击和损害，降低细胞的死亡率，从而起到保护细胞的作用，达到抗光老化的功效。
附图说明
[0041] 图1为雪莲干细胞冻干粉对SOD酶活性的影响；
[0042] 图2为雪莲干细胞冻干粉对小鼠
血浆中SOD酶活性影响；
[0043] 图3为雪莲干细胞冻干粉对小鼠血浆中GPx活性影响；
[0044] 图4为雪莲干细胞冻干粉对小鼠血浆中MDA活性影响。
具体实施方式
[0045] 实施例1
[0046] (1)天山雪莲材料的准备
[0047] 本发明取天山雪莲幼嫩叶片，叶片用
自来水流水冲洗2h；用浓度70％酒精表面消毒10s，无菌水冲洗3次；用浓度0.1％升贡溶液分别消毒4、6、8、10min后，用无菌水冲洗3次，洗去植物表面的升贡残液，以构成不同的消毒处理；将消毒材料放入无菌培养皿中，用无菌
滤纸吸干水分备用。
[0048] (2)从材料中分离天山雪莲干细胞
[0049] 无菌条件下，将消毒后雪莲幼嫩叶片切成约0.5cm*0.5cm大小，接种在固体培养基上。接种时，使叶背面与培养基接触，每瓶1
块。培养温度为25℃，培养pH值6.0，培养时间为20天。
[0050] 固体培养基成分为硝酸钾2450mg/L；肌醇210mg/L；L-天冬氨酸135mg/L；α-萘乙酸1.8mg/L、蔗糖10.0mg/L、活性炭450mg/L，琼脂3.6mg/L，用0.1％NaOH或HCl调pH值至5.8，在温度121℃、压力98kPa的条件下，高压
蒸汽灭菌20min后置无菌室保存备用。
[0051] (3)传代培养
[0052] 待培养至20天时，将形成层细胞转移至优选的包含液态培养基的烧瓶中培养，并时刻在
显微镜下观察细胞的聚集状态和程度。
[0053] 液体培养基为：硝酸钾992mg/L、烟酸3.0mg/L、甘氨酸75mg/L、α-萘乙酸3.0mg/L、蔗糖32.0mg/L、麦饭石颗粒60.0mg/L和硒矿石颗粒60.0g/L，其余为水。用0.1％NaOH或HCl调pH值至5.8，在温度121℃、压力98kPa的条件下，高压蒸汽灭菌20min后置无菌室保存备用。
[0054] (4)生物反应器放大培养
[0055] 将在烧瓶中培养的干细胞移入20L的生物反应器内放大培养，培养液使用(3)中优选的液态培养基，在25℃不间断搅拌。在培养至第10d时，向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，以补充后期营养
加速干细胞生长。
[0056] (5)细胞收集及破碎
[0057] 将培养液用1um过滤器过滤，去掉培养液，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃超低温速冻2h，取出解冻30min；再放入-80℃超低温速冻，依次3次；最后一次解冻后利用
超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，旋转式真空
蒸发器内浓缩，即为雪莲干细胞提取物溶液。
[0058] (6)冻干粉制备
[0059] 采用BCA法对雪莲干细胞提取物溶液进行蛋白质浓度测定，根据该蛋白浓度，加入赋形剂甘露醇(甘露醇占雪莲干细胞提取物溶液总重量的5％)和50℃的超纯水混匀，并调节至蛋白终浓度为50.0+0.5μg/ml，过滤除菌，然后进行冻干处理，冻干温度为-20℃，真空度为50Pa，冻干时间为48小时，则制备得到所需的雪莲干细胞提取物冻干粉；冻干粉按照1ml量/支分装。
[0060] 实施例2
[0061] (1)天山雪莲材料的准备
[0062] 本发明取天山雪莲幼嫩叶片，叶片用自来水流水冲洗4h；用浓度75％酒精表面消毒15s，无菌水冲洗5次；用浓度0.1％升贡溶液分别消毒4、6、8、10min后，用无菌水冲洗5次，洗去植物表面的升贡残液，以构成不同的消毒处理；将消毒材料放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分备用。
[0063] (2)从材料中分离天山雪莲干细胞
[0064] 无菌条件下，将消毒后雪莲幼嫩叶片切成约0.5cm*0.5cm大小，接种在固体培养基上。接种时，使叶背面与培养基接触，每瓶1块。培养温度为29℃，培养pH在6.5，培养时间为30天左右。
[0065] 固体培养基为：氯化钴0.025mg/l、L-抗坏血酸54mg/l；脯氨酸120mg/l；生长素为α-萘乙酸2.5mg/l、糖类为蔗糖11.0mg/l、添加物为活性炭500mg/L，琼脂3.7mg/l。用0.1％NaOH或HCl调pH值至5.8，在温度121℃、压力108kPa的条件下，高压蒸汽灭菌25min后置无菌室保存备用。
[0066] (3)传代培养
[0067] 待培养至30天时，将形成层细胞转移至优选的包含液态培养基的烧瓶中培养，并时刻在显微镜下观察细胞的聚集状态和程度。
[0068] 液体培养基的成分为：磷酸二氢钠130mg/l；柠檬酸80mg/l；脯氨酸114.0mg/l；生长素为α-萘乙酸4.0mg/l、糖类为蔗糖33.0mg/l、添加物为麦饭石颗粒70.0mg/l和硒矿石颗粒70.0mg/l，其余为水。用0.1％NaOH或HCl调pH值至5.8，在温度121℃、压力
108kPa的条件下，高压蒸汽灭菌25min后置无菌室保存备用。
[0069] (4)生物反应器放大培养
[0070] 将在烧瓶中培养的干细胞移入20L的生物反应器内放大培养，培养液使用(3)中优选的液态培养基，在25℃不间断搅拌。在培养至第10d时，向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，以补充后期营养加速干细胞生长。
[0071] (5)细胞收集及破碎
[0072] 将培养液用1um过滤器过滤，去掉培养液，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃超低温速冻2h，取出解冻30min；再放入-80℃超低温速冻，依次5次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，旋转式真空蒸发器内浓缩，即为雪莲干细胞提取物溶液。
[0073] (6)冻干粉制备
[0074] 采用BCA法对雪莲干细胞提取物溶液进行蛋白质浓度测定，根据该蛋白浓度，加入赋形剂甘露醇(甘露醇占雪莲干细胞提取物溶液总重量的5％)和60℃的超纯水混匀，并调节至蛋白终浓度为49.5μg/ml，过滤除菌，然后进行冻干处理，冻干温度为-35℃，真空度为200Pa，冻干时间为48小时，则制备得到所需的雪莲干细胞提取物冻干粉；冻干粉按照1ml量/支分装。
[0075] 实施例3
[0076] (1)天山雪莲材料的准备
[0077] 本发明取天山雪莲幼嫩叶片，叶片用自来水流水冲洗3h；用浓度75％酒精表面消毒15s，无菌水冲洗4次；用浓度0.1％升贡溶液分别消毒4、6、8、10min后，用无菌水冲洗4次，洗去植物表面的升贡残液，以构成不同的消毒处理；将消毒材料放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分备用。
[0078] (2)从材料中分离天山雪莲干细胞
[0079] 无菌条件下，将消毒后雪莲幼嫩叶片切成约0.5cm*0.5cm大小，接种在固体培养基上。接种时，使叶背面与培养基接触，每瓶1块。培养温度为27℃，培养pH值在6.0，培养时间为15天。
[0080] 固体培养基成分为：碘化钾0.75mg/l、氯化钴0.026mg/l；烟酸2.2mg/l、甘氨酸85mg/l；生长素为α-萘乙酸3.0mg/l、糖类为果糖12.0mg/ml、添加物为活性炭500.0mg/l，琼脂3.8mg/l；用0.1％NaOH或HCl调pH值至5.8，在温度121℃、压力100kPa的条件下，高压蒸汽灭菌15min后置无菌室保存备用。
[0081] (3)传代培养
[0082] 待培养至15天时，将形成层细胞转移至优选的包含液态培养基的烧瓶中培养，并时刻在显微镜下观察细胞的聚集状态和程度。
[0083] 液体培养基的成分为：磷酸二氢钠131mg/l、硼酸2.5mg/l；L-抗坏血酸62.0mg/l、柠檬酸83.0mg/l；L-天冬氨酸142.0mg/l、L精氨酸180mg/l；生长素为α-萘乙酸5.0mg/l、糖类为蔗糖34.0mg/l、添加物为麦饭石颗粒80mg/l和硒矿石颗粒80mg/l，其余为水。用0.1％NaOH或HCl调pH值至5.8，在温度121℃、压力100kPa的条件下，高压蒸汽灭菌15min后置无菌室保存备用。
[0084] (4)生物反应器放大培养
[0085] 将在烧瓶中培养的干细胞移入20L的生物反应器内放大培养，培养液使用(3)中优选的液态培养基，在25℃不间断搅拌。在培养至第10d时，向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液，以补充后期营养加速干细胞生长。
[0086] (5)细胞收集及破碎
[0087] 将培养液用1um过滤器过滤，去掉培养液，将截留的细胞系培养物取出，放入-80℃超低温速冻2h，取出解冻30min；再放入-80℃超低温速冻，依次4次；最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞，过滤器过滤，收集滤液，旋转式真空蒸发器内浓缩，即为雪莲干细胞提取物溶液。
[0088] (6)冻干粉制备
[0089] 采用BCA法对雪莲干细胞提取物溶液进行蛋白质浓度测定，根据该蛋白浓度，加入赋形剂甘露醇(甘露醇占雪莲干细胞提取物溶液总重量的5％)和55℃的超纯水混匀，并调节至蛋白终浓度为50.0μg/ml，过滤除菌，然后进行冻干处理，冻干温度为-30℃，真空度为100Pa，冻干时间为48小时，则制备得到所需的雪莲干细胞提取物冻干粉；冻干粉按照1ml量/支分装。
[0090] 雪莲干细胞冻干粉眼霜
[0091] 本实施例将眼霜成分进行分组，如表1所示，制备得到3种配方的含有制备的雪莲干细胞冻干粉的眼霜。
[0092] 表1
[0093]
[0094]
[0095] 本实施例眼霜的制备工艺包括如下步骤：
[0096] 将B组分用部分去离子水加热溶解、搅拌均匀，A组分于70℃溶解，A组分倒入B组分中，搅拌均匀，降温至37℃后加入C组分和D组分，搅拌均匀，则制备得到本实施例的雪莲干细胞冻干粉眼霜。
[0097] 雪莲干细胞冻干粉体外抗光老化实验
[0098] 检测实施例1制得的雪莲干细胞冻干粉对紫外损伤人真皮
成纤维细胞的保护作用
[0099] 检测样品：实施例1制备的雪莲干细胞冻干粉。
[0100] 受试生物体：HDF细胞。
[0101] 具体步骤如下所示：
[0102] (1)当人真皮成纤维细胞生长至80％融合时，用UVA紫外线照射细胞，每天照射2小时，共照射4天，正常组用
锡纸包住细胞培养瓶。在显微镜下观察细胞的形态，发现细胞开始出现皱缩，个别细胞漂浮在培养基中；第五天，加入雪莲干细胞冻干粉继续培养(加入后蛋白终浓度分别为20μg/ml和10μg/ml)，维生素C20μg/ml作为阳性对照，继续培养48h，收集细胞；
[0103] (2)雪莲干细胞冻干粉对细胞内SOD酶活性的影响：胰酶消化后，细胞在1500g、4℃条件下离心10min。细胞沉淀悬浮在遇冷的缓冲液中(50mM的Tris–HCl、5mM EDTA和
1mM DTT)进行超声，裂解液在10000g、4℃条件下离心10min，上清利用SOD检测
试剂盒根据其说明方法进行分析。
[0104] (3)结果如下图1所示：人脂肪间充质干细胞提取物无论是20μg/ml，还是10μg/ml都在不同程度上提高了细胞内SOD酶的活性，从而减少因紫外线辐射诱导产生的氧自由基对细胞的攻击和损害，降低细胞的死亡率，从而起到保护细胞的作用，达到抗光老化的功效。
[0105] 图中，1为雪莲干细胞提取物冻干粉20μg/ml组；2为雪莲干细胞提取物冻干粉10μg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为正常组；其中：**P≦0.01，*P≦0.05[0106] 雪莲干细胞冻干粉对紫外线引起小鼠
皮肤光老化的保护作用
[0107] 1.检测样品：制备的雪莲干细胞冻干粉(蛋白含量为50.0±0.5μg/支)。
[0108] 2.试验方法：
[0109] 2.1动物饲养：4周龄SPF级雌性昆明小鼠(体重20±2g)，广东省医学实验中心提供，适应性饲养一周后，剔除小鼠背部毛，裸露皮肤
棉结约2cm2，进行试验。试验过程中正常给水和
饲料。
[0110] 2.2实验分组及药物处理：小鼠分为五组，每组5只，分别进行如下操作：
[0111] 第1组：用生理盐水溶解制备的雪莲干细胞冻干粉，制备得到制备的雪莲干细胞冻干粉浓度为20μg/ml的溶液；将其涂抹到小鼠上，涂抹量为lml/只，1次/天(照射前)，然后紫外照射；
[0112] 第2组：用生理盐水溶解制备的雪莲干细胞冻干粉，制备制备的雪莲干细胞冻干粉浓度为10μg/ml的溶液；；将其涂抹到小鼠上，涂抹量为lml/只，1次/天(照射前)，然后紫外照射；
[0113] 第3组：模型组，该组的小鼠不涂抹雪莲干细胞冻干粉，紫外照射；
[0114] 第4组：阳性对照组，用生理盐水溶解维生素C(VitC)制备得到维生素浓度为20μg/ml的溶液，将该溶液涂抹于小鼠上，涂抹量为lml/只，1次/天(照射前)，然后紫外照射；第5组：正常组，该组的小鼠什么也不涂抹，也不紫外照射。
[0115] 紫外线照射的具体操作：对小鼠
给药1h待冻干粉被吸收后进行紫外照射，第一周每天照射1h，第二周每天照射2h，第三周每天照射3h，从第4周开始每天照射4h，总共照射42天；紫外线的强度为：UVA：0.25mJ/cm2/s，UVB：0.02mJ/cm2/s；待照射完成后，将老鼠处死，进行各项指标的检测；对老鼠进行
放血，血清在2500g、4℃条件下离心4min，取上清进行各项指标的检测。
[0116] 3.检测项目：
[0117] 血浆中SOD酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)及丙二
醛(MDA)含量的测定：对小鼠进行放血，在2500g、4℃条件下离心4min，收集上清；
[0118] SOD的活性，GPx的活性以及MDA的含量利用南京建成
生物工程研究所提供的
诊断试剂盒根据供应商的
说明书进行测定分析。
[0119] 皮肤
组织切片HE
染色，观察皮肤结构的变化：取小鼠背部剔除毛的皮肤，10％的甲醛溶液固定，常规
石蜡切片，HE染色观察。
[0120] 4.检测结果：
[0121] 1)小鼠血浆中SOD酶活性的检测结果如下图2，由图可以看出，雪莲干细胞冻干粉保护的小鼠体内SOD酶活性虽然没有恢复到正常对照组水平，但是与模型组和阳性药VitC组比较，均具有大幅度的提高，说明雪莲干细胞冻干粉够更加有效清除或者协助动物体内抗氧化系统清除体内的氧自由基等有害物质，从而使抗氧化平衡系统保持稳定。
[0122] 图中，1为雪莲干细胞冻干粉20μg/ml组；2为雪莲干细胞冻干粉10μg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为正常组；其中：**P≦0.01，*P≦0.05
[0123] 2)小鼠血浆中GPx活性的检测结果如下图3，由图3可以看出，第1组小鼠和第2组小鼠的GPx活性都比模型组和阳性药VitC组要好，从而保护了小鼠皮肤。
[0124] 图3中，1为雪莲干细胞冻干粉20μg/ml组；2为雪莲干细胞冻干粉10μg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为正常组；其中：**P≦0.01，*P≦0.05
[0125] 3)小鼠血浆中MDA含量的检测结果如下图4，由图可以看出，人脂肪间充质干细胞提取物有效地降低了MDA的含量，保持了体内抗氧化平衡系统。
[0126] 图中，1为雪莲干细胞冻干粉20μg/ml组；2为雪莲干细胞冻干粉10μg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为正常组；其中：**P≦0.01，*P≦0.05
[0127] 4)5个实验组的小鼠皮肤组织的检测结果如下所示：
[0128] 第1组：皮肤结构完整且清晰，和正常皮肤组织没有明显的差别，未见
炎症细胞浸润等现象；
[0129] 第2组：真皮内的胶原纤维排列较为整齐，皮肤附件有少许的增生；
[0130] 第3组(模型组)：小鼠表皮厚度明显增加，真皮厚度急剧减少，胶原纤维异常增长且排列紊乱，皮肤附件呈现出皮肤初期老化的特征；
[0131] 第4组(阳性对照组)：表皮有一定的增生现象，皮肤深层胶原纤维排列较为松散；
[0132] 第5组(正常组)：皮肤正常，没有明显的裂痕和增生现象，没有初期老化的特征。
[0133] 由于维生素C是已知的具有良好防晒效果的药物，因此作为本实验的阳性药，而最终结果表明雪莲干细胞冻干粉的不同剂量组都有较好的抗衰老或修复作用，效果等同于阳性对照组。
[0134] 根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和
修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的
权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
