関連出願情報 この出願は、2017年4月10日に出願された米国仮特許出願第62/483,655号の利益および優先権を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

政府の利権 本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたAI112029およびHL108808の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

本開示の主題は、例えば、一酸化窒素放出キトサンオリゴ糖などの一酸化窒素放出バイオポリマーを使用して粘液を改変することを含む、粘液を改変するための化合物、組成物、および方法を提供する。

生物学、生理学、および病態生理学における一酸化窒素(NO)の多面的な役割の発見(Marietta,M.A.,et al.,BioFactors,2,219−225(1990)を参照)により、一酸化窒素の放出を制御することができる一酸化窒素ドナーが探求されるようになった。Keefer,L.K.,Chemtech,28,30−35(1998)を参照されたい。これまで、研究者らは、NOが心血管系、胃腸系、泌尿生殖器系、呼吸器系、中枢および末梢神経系の様々な生物学的プロセスを調節していることを発見した。Ignarro,L.J.,Nitric Oxide:Biology and Pathobiology;Academic Press:San Diego,2000、およびIgnarro,L.J.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,84,9265−9269(1987)を参照されたい。さらに、血管拡張薬としてのNOの発見、ならびに抗生物質および殺腫瘍因子の両方としてのその同定により、NOは魅力的な医薬品候補となっている。例えば、Radomski,M.W.,et al.,Br.J.Pharmacol.,92,639−646(1987)、Albina,J.E.,and Reichner,J.S.;Canc.Metas.Rev.,17,19−53(1998)、Nablo,B.J.,et al.,J.Am.Chem.Soc.,123,9712−9713(2001)、Cobbs,C.S.,et al.,Cancer Res.,55,727−730(1995)、Jenkins,D.C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,92,4392−4396(1995)、およびThomsen,L.L.,et al.,Br.J.Cancer.,72,41−44(1995)を参照されたい。

いくつかの一酸化窒素ドナーが報告されており、最も顕著なものはN−ジアゼニウムジオレートである。一般に、N−ジアゼニウムジオレートNOドナーは、高圧でのアミンとNOとの反応によって合成される小分子であり、例えば、水溶液中で自然にNOを生成するために使用されている。Hrabie,J.A.and Keefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135−1154(2002)を参照されたい。

嚢胞性線維症(CF)は、アメリカ合衆国(米国)で約30,000人、世界中で70,000人に影響を与える、致死的な遺伝的疾患である(Hoiby,N.BMC Med.,9,32−39(2011)、Treggiari,M.M.,et al.,Pediatric Pulmonology,42,751−756(2007))。CF膜貫通伝導率制御タンパク質の欠損は、肺、肝臓、膵臓、胃腸管、および生殖系の粘液の蓄積を引き起こし、それらの正常な機能を阻害する(Ehre,C.,et al.,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,52,136−145(2014))。粘液がCF肺に蓄積して厚くなると、気道クリアランスが損なわれ、細菌の定着が促進される(Matsui,H.,et al.,P.N.A.S.,103,18131−18136(2006))。この厚くなった粘液層は、細菌を免疫細胞から保護し、バイオフィルム形成を促進する環境を生成する(Hassett,D.J.,et al.,Adv.Drug Delivery Rev.,54,1425−1443(2002))。慢性感染症には、持続的な炎症および肺機能の最終的な減少を伴う(Hassett,D.J.,et al.,Adv.Drug Delivery Rev.,54,1425−1443(2002))。結果として、慢性細菌感染症に関連する呼吸器合併症は、CF患者の主要な死因となっている(Lyczak,J.B.,et al.,Clinical Microbiology Reviews,15,194−222(2002))。

一酸化窒素ドナーの活性を探求する治療戦略は、当該技術分野で知られている一酸化窒素送達システムが無差別に一酸化窒素を放出または提供することから、一部問題がある。

本発明の態様は、本明細書に記載されるように、例えば、NO放出ポリグルコサミンなどの一酸化窒素(NO)放出バイオポリマーを使用して、粘液の1つ以上の特性を改変する方法を含む。

本発明の一態様は、粘液の改変をそれを必要とする対象において行う方法であって、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを対象に投与することを含み、NO放出バイオポリマーが粘膜付着性であり、粘液溶解性および抗菌性である量で対象に投与され、それによって対象の粘液を改変する、方法を対象とする。

本発明の別の態様は、粘液を改変する方法であって、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを粘液に接触させることを含み、NO放出バイオポリマーが粘膜付着性であり、粘液溶解性および抗菌性である量であり、それによって粘液を改変する、方法を対象とする。

本発明の追加の態様は、対象の粘液クリアランスを増加させる方法であって、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを対象に投与することを含む、方法を対象とする。

本発明の別の態様は、対象の粘液粘度および/または弾性を減少させる方法であって、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを対象に投与することを含む、方法を対象とする。

本発明のさらなる態様は、粘液粘度および/または弾性を減少させる方法であって、粘液を、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーに接触させることを含む、方法を対象とする。

本発明の別の態様は、粘液中の病原体を阻害または死滅させる方法であって、粘液を、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーに接触させることを含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態は、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを対象に投与して、対象の粘液中の病原体を阻害または死滅させることを含む。

本発明のさらなる態様は、粘液中の病原体を阻害または死滅させる方法であって、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを対象に投与することを含む、方法を対象とする。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、共有結合した酸化窒素放出部分、すなわちNOドナーを含む、NO放出バイオポリマー(例えば、ポリグルコサミン)を対象とする。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、任意選択的に、式Iの構造を有するポリグルコサミン骨格中に少なくとも1つの構造単位を含むポリグルコサミンを含む。任意選択的に、ポリグルコサミンの少なくとも1つの構造単位は、式IIの構造をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーは、抗菌薬として機能し、かつ/または、例えばヒト気管支上皮細胞培養物からのムチンおよび/もしくは嚢胞性線維症を有する患者から収集された臨床唾液試料などのムチンを分解する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、対象の疾患状態を治療する方法であって、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを投与することを含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、式Iの少なくとも1つの構造単位を含み、任意選択的に、式IIの少なくとも1つの構造単位をさらに含む、NO放出ポリグルコサミンが対象に投与される。さらなる実施形態では、NO放出バイオポリマーは、広範囲の抗生物質として機能し、かつ/または粘液および/もしくはCF唾液の粘弾性を減少させる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーと、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と、を含む、医薬組成物を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるNO放出ポリグルコサミンと、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と、を含む。NO放出ポリグルコサミンは、式Iの少なくとも1つの構造単位と、任意選択的に、式IIの少なくとも1つの構造単位と、を含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される主題は、例えば、式Iの少なくとも1つの構造単位と、任意選択的に、式IIの少なくとも1つの構造単位と、を含む、NO放出ポリグルコサミンなど、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーを調製する方法を対象とする。

一実施形態に関して記載される本発明の態様は、異なる実施形態に関して具体的に記載されていなくても、そこに組み込まれてもよいことに留意されたい。すなわち、すべての実施形態および/または任意の実施形態の特徴は、任意の方法および/または組み合わせで組み合わせることができる。出願人は、最初に出願された請求項のいずれをも変更し、かつ/またはそれに応じていずれの新規請求項も提出する権利も留保しており、これには、最初にそのように請求されていないが、いずれの他の請求項または複数の請求項にも従属し、かつ/またはそのいずれの特徴も組み込むように、最初に出願された請求項のいずれも補正することができる権利が含まれる。本発明のこれらおよび他の目的および/または態様は、以下に記載の明細書で詳細に説明される。本発明のさらなる特徴、利点、および詳細は、図面および以下の実施形態の詳細な説明を読むことによって当業者に理解されるが、そのような説明は本発明の例示に過ぎない。

修飾キトサンオリゴ糖による胃ブタムチン(GPM)の比濁滴定を示す。

キトサンオリゴ糖をムチン溶液に加えたときに形成される胃ブタムチン(GPM)−キトサン凝集体のゼータ電位測定値を示す(pH6.5の10mMのPB中に1mg/mL)。

0〜20mg/mLの範囲の濃度を有する、COS、COS−NO、COS−SPA、およびCOS−SPA−NOで、25℃で2時間処理された嚢胞性線維症を有するドナー由来のHBE培養洗浄液からのMUC5ACおよびMUC5Bムチンの代表的なウェスタンブロットである。

図4Aおよび図4B:修飾キトサンオリゴ糖で、室温で1時間処理された後のCF−HBE培養洗浄液からの(図4A)MUC5ACおよび(図4B)MUC5Bムチンの移動距離を図示する。等量のPBSで処理されたムチンの移動距離は、破線の水平線で示されている。すべての値は、3回以上のプールされた実験の平均±標準偏差として提示されている。アスタリスク(*)は、PBS(0mg/mL)による治療と比較した有意差(p<0.05)を示している。

0〜20mg/mLの濃度を有する、COS、COS−NO、COS−SPA、およびCOS−SPA−NOで、25℃で1時間処理されたCF唾液からのMUC5ACムチンの代表的なウェスタンブロットである。MUC5Bについても同様の傾向が観察された。

図6Aおよび図6B:室温で1時間修飾キトサンオリゴ糖で処理された後のCF唾液からの(図6A)MUC5ACおよび(図6B)MUC5Bムチンの相対移動距離を図示する。移動距離は、等量のPBSで処理されたCF唾液試料に対して正規化された。すべての値は、n=3以上のプールされた実験の平均±標準偏差として提示されている。

図7A〜図7T:PBS(図7A〜7D)または20mg/mLのCOS(図7E〜7H)、COS−NO(図7I〜7L)、COS−SPA(図7M〜7P)、またはCOS−SPA−NO(図7Q〜7T)で、25℃で1時間処理されたCF唾液の共焦点顕微鏡画像を示す。矢印は、COS(図7E)で処理すると凝集して塊を形成する未処理試料(図7A)のムチンの長い鎖を示す。

図8Aおよび図8B:25℃で1時間COS−NOで処理された後のCF唾液の(図8A)弾性係数および(図8B)粘性係数を示す。n=3の3連での測定値についての平均の平均±標準誤差として提示される値。アスタリスク(*)は、PBS(0mg/mL)による治療と比較した有意差(p<0.05)を示している。

図9A〜図9D:高圧のNOガスへの曝露によるN−ジアゼニウムジオレートの形成の前後の(図9A)COS、(図9B)COS−EA、(図9C)COS−TBuA、および(図9D)COS−SPAのUV Visスペクトルを図示する。

図10A〜図10D:修飾キトサンオリゴ糖のFT−IRスペクトルを図示する。 (図10A)COS、(図10B)COS−EA、(図10C)COS−TBuA、および(図10D)COS−SPAについてのCOS骨格へのアクリレート基の添加の成功をさらに特性評価するために、修飾キトサンオリゴ糖のスペクトルをFT−IRで得た。

キトサン骨格のヒドロキシル基がN−ジアゼニウムジオレートの形成後に保持されていることを例示する、COS−NOについてのFT−IRスペクトルを示す。

図12A〜図12D:リン酸塩緩衝液(pH6.5)およびリン酸緩衝生理食塩水(pH6.5、140mMのNaCl)中の(図12A)COS、(図12B)COS−EA、(図12C)COS−TBuA、および(図12D)COS−SPAの比濁滴定を示す。

これより、本発明の実施形態が示されている添付の図面を参照して、以下により完全に本発明を記載する。しかしながら、本明細書は、異なる形態で具現化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の対象の範囲を当業者に完全に伝達するために提供されている。例えば、一実施形態に関して例示される特徴を他の実施形態へと組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示される特徴をその実施形態から削除することができる。加えて、本明細書で示唆される実施形態に対する多数の変形および追加が、本開示に鑑みて当業者に明らかであり、これらは本発明から逸脱するものではない。

別途定義されない限り、本明細書で使用される用語(技術用語および科学用語を含む)はすべて、本発明が属する当該技術分野において当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書の発明の記載において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載するためだけにあり、本発明を限定することを意図していない。

本明細書で言及されるすべての公開物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「1つ(a)」、「1つ(an)」、または「その(the)」は、1つまたは1つ超を意味し得る。例えば、「1つの(a)」NO放出部分は、単一または多数を意味し得る。

また、本明細書で使用される場合、「および/または」は、関連する列挙された項目のうちの1つ以上のあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物(「または」)で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。

さらに、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、またはさらには±0.1%の変化を包含することが意図される。測定可能な値について本明細書で提供される範囲は、その中の任意の他の範囲および/または個々の値を含み得る。

本発明の組成物に適用される「から本質的になる」(および文法的変形)という用語は、追加の成分が組成を実質的に変えない限り、組成物が追加の成分を含むことができることを意味する。

本明細書で使用される場合、「増加する(increase)」、「増加する(increases)」、「増加された」、「増加すること」、「改善する」、「増強する」という用語、および同様の用語は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%、500%以上の指定されたパラメーターの上昇を示す。

本明細書で使用される場合、「減少させる(reduce)」、「減少させる(reduces)」、「減少された」、「減少」、「阻害する」という用語、および同様の用語は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、または100%の指定されたパラメーターの減少を指す。

特に明記されない限り、本明細書で使用される化学基または部分を記載するために使用される命名法は、名前を左から右に読むと、分子の残りの部分への付着点が名前の右側にあるという慣習に従う。例えば、「(C₁₋₃アルコキシ)C₁₋₃アルキル」基は、アルキル末端で分子の残りの部分に付着する。さらなる例には、付着点がエチル末端にあるメトキシエチル、および付着点がアミン末端にあるメチルアミノが含まれる。

特に明記されない限り、一価または二価の基が「−」で示される1つまたは2つの末端結合部分を含むその化学式で記載される場合、付着は左から右に読まれることが理解されるであろう。

特に明記されない限り、本明細書に図示される構造は、構造のすべてのエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的(または立体配座)形態、例えば、各不斉中心のRおよびS配置、(Z)および(E)二重結合異性体、ならびに(Z)および(E)立体配座異性体を含むことを意味する。したがって、本化合物の単一の立体化学異性体ならびにエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何学的(または立体配座)混合物は本発明の範囲内である。特に明記されない限り、本発明の化合物のすべての互変異性形態は本発明の範囲内である。

さらに、特に明記されない限り、本明細書に図示される構造は、1つ以上の同位体濃縮原子の存在のみが異なる化合物を含むことも意味する。例えば、重水素またはトリチウムによる水素の置換、または¹³C−もしくは¹⁴C−濃縮炭素による炭素の置換を除いて、本構造を有する化合物は本発明の範囲内である。そのような化合物は、例えば、生物学的アッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。

本明細書で使用される「粘膜付着」とは、対象のムチン、粘液、および/または粘膜表面への化合物の付着を指す。化合物に関して本明細書で使用される「粘膜付着性」とは、対象のムチン、粘液、および/または粘膜表面に付着することができる化合物を意味する。化合物は、例えば、共有結合、イオン結合、および/または水素結合(複数可)などの任意の種類の結合を使用して、ムチン、粘液、および/または粘膜表面に付着し得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物(すなわち、NO放出バイオポリマー)は粘膜付着性である。

いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、対照(例えば、NOドナーを含まないキトサンなどの非修飾バイオポリマーおよび/または非NO放出バイオポリマー)と比較して、改善された粘膜付着性を有する。いくつかの実施形態では、対照は、キトサン(例えば、1重量%の量の1%の酢酸溶液中に存在し、25℃で測定される場合、約200〜800センチポアズの粘度を有する中分子量キトサン)および/またはNOドナーを有しない修飾キトサン(例えば、NOドナーを含まない2−メチルアジリジン修飾キトサン)であり得る。化合物の粘膜付着の量または程度は、例えば、化合物を含むムチン溶液の濁度を測定することによって、任意選択的に補正吸光度を測定することによって、かつ/またはムチン溶液の濁度を測定することによって、当業者に知られている方法によって測定することができる。例えば、化合物の粘膜付着の量または程度は、本発明の化合物を含むムチン溶液で測定することができる。ムチン溶液は、不溶性成分を除去した状態で、4℃で18時間、滅菌リン酸緩衝液(PB)250mLに960mgの胃ブタムチンを合わせることによって(例えば、1,500×g、4℃、0.5時間での遠心分離によって)、任意選択的にpH6.5で調製され得る。ムチン溶液を、本発明の化合物を含む溶液と合わせて、合わせた溶液を形成することができる。本発明の化合物を含む溶液は、約0.1mg/mL〜約60mg/mLの濃度の化合物を含む滅菌PBであり得る。合わせた溶液は、236μLのムチン溶液を、本発明の化合物を含む34μLの溶液と合わせることによって調製され得る。合わせた溶液の吸光度は、540nmで読み取ることができる。いくつかの実施形態では、合わせた溶液を、任意選択的に穏やかに振盪(例えば、100rpm)しながら37℃で1時間インキュベートし、その後、540nmで吸光度を読み取ることができる。補正吸光度は、合わせた溶液の吸光度から化合物を含む(すなわち、ムチンを含まない)溶液の吸光度を引くことによって得ることができる。いくつかの実施形態では、対照溶液と比較して、本発明の化合物およびムチンを含む溶液の濁度の増加が、粘膜付着の改善を示す。対照溶液は、ムチンおよび低濃度の化合物を含む溶液であり得るか、または非修飾および/または非NO放出バイオポリマー(例えば、非NO放出キトサン)を含む溶液であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の化合物に対する粘膜付着の量または程度は、ムチン溶液に塩化ナトリウムを添加する際に、化合物を含むムチン溶液の濁度を減少させることによって測定することができる。塩化ナトリウムは、任意選択的にpH6.5の約140mMのNaClを達成する量の化合物を含むムチン溶液に添加され得る。第1の化合物を含むムチン溶液に塩化ナトリウムを加えると濁度が大きく減少することは、第2の化合物を含むムチン溶液に塩化ナトリウムを加えると濁度の減少が少ない第2の化合物と比較して、第1の化合物のムチンに対する粘膜付着性の程度が低いことを示し得る。

いくつかの実施形態では、化合物の粘膜付着の量または程度は、化合物を含むムチン溶液、任意選択的にpH6.5のムチン溶液のゼータ電位によって測定および/または定量化することができる。例えば、ゼータ電位を測定するためのムチン溶液は、上に記載されるとおりであり得るか、または不溶性成分が除去された状態で、4℃で18時間、滅菌PB10mLに10mgの胃ブタムチンを合わせることによって(例えば、1,500×g、4℃、0.5時間での遠心分離によって)調製され得る。本発明の化合物は、任意選択的に撹拌しながらムチン溶液に添加され得、ゼータ電位は、任意選択的に37℃で1時間インキュベートした後に測定され得る。本発明の化合物を含み、対照ムチン溶液(例えば、化合物を含まないムチン溶液)のゼータ電位と比較して増加したゼータ電位を有するムチン溶液は、化合物に対する粘膜付着の量または程度を示すことができる。いくつかの実施形態では、本発明の化合物を含むムチン溶液は、対照ムチン溶液(例えば、化合物を含まないムチン溶液)のゼータ電位と比較して、少なくとも1、2、または3mV増加されたゼータ電位を有する。

本発明の実施形態によると、粘液を改変する化合物、組成物、および/または方法が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の化合物、組成物、および/または方法は、粘液の1つ以上の物理的および/もしくは生物物理学的特性を改変し、かつ/または対象の粘液の粘液線毛クリアランスおよび/もしくは肺機能を増加(例えば、約10%以上)させ得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物、組成物、および/または方法は、粘液および/または対象中の病原体を減少(例えば、約10%以上)または除去し得る。したがって、いくつかの実施形態によると、本発明の化合物、組成物、および/または方法は、粘液の1つ以上の物理的および/または生物物理学的特性を改変し得、粘液および/または対象中の1つ以上の病原体を減少または死滅させ得る。粘液の改変ならびに/または粘液および/もしくは対象中の病原体の量は、本発明のNO放出バイオポリマーの対象への投与、および/または本発明のNO放出バイオポリマーの粘液との接触後の約24時間以内(例えば、約20、18、12、10、8、6、4、または2時間以内)に判定され得る。

本発明のいくつかの実施形態では、対象の粘液クリアランスおよび/または分解を増加させ、例えば、対象の粘液中の1つ以上の病原体などの対象中の1つ以上の病原体を減少させるための単剤療法を提供する。本明細書で使用される場合、「単剤療法」という用語は、例えば、細菌感染症および嚢胞性線維症などの2つ以上の状態を治療するために使用される単一の薬剤を指す。単剤療法は、治療期間中に対象に1回以上(例えば、1、2、3、4、5、6回以上)投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、単剤療法としてNO放出バイオポリマーを投与することを含み、単剤療法に応答して、対象の粘液クリアランスが増加し、対象の粘液中に存在する少なくとも1つの病原体が阻害または死滅され、対象の粘液劣化が増加し、かつ/または対象の粘液粘度および/もしくは弾性が減少する。

本発明の方法は、例えば、本発明のNO放出ポリグルコサミンなどの本発明のNO放出バイオポリマーを、対象に投与すること、および/または粘液に接触させることを含み得る。本明細書で使用される「バイオポリマー」とは、生きている微生物またはその誘導体によって産生され得るポリマーを指す。例示的なバイオポリマーには、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、および/または多糖類が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば理解するように、バイオポリマーは、合成により(例えば、実験室合成により)かつ/または自然界から得られ、かつ/または自然界に由来する(例えば、生きているか、または以前に生きていた微生物から)場合がある。したがって、バイオポリマーは、自然界に見られるポリマー(すなわち、天然バイオポリマー)と同じであり得るか、またはその誘導体であり得る。例えば、本発明のバイオポリマーは、生きている微生物から産生されるポリマーの誘導体であってもよく、自然界からバイオポリマーを得るか、または単離するために使用される合成方法によって引き起こされる誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、バイオポリマーは、例えば、本明細書に記載される方法に従ってNO放出ポリグルコサミンを形成するNOドナーで誘導体化され得る利用可能な窒素(例えば、その骨格中の、かつ/またはそこから垂下している利用可能な窒素)を有する。いくつかの実施形態では、バイオポリマーは、1つ以上の二級アミン(複数可)を含み、それらのうちの1つ以上は、例えば、強塩基およびガス状の一酸化窒素の存在下で二級アミンをNOドナーに変換するなどによって、誘導体化および/またはNOドナーに変換することができる。

さらに例示的なバイオポリマーには、キトサン、デンプン(アミロースおよび/またはアミロペクチンを含む)、ヘミセルロース、リグニン、セルロース、キチン、アルギン酸塩、デキストラン、プルラン、ポリヒドロキシアルカノエート、フィブリン、シクロデキストリン、タンパク質(例えば、大豆タンパク質)、他の多糖類(例えば、ペクチン)、および/またはポリ乳酸が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の方法で使用されるバイオポリマーは、例えば、約10,000ダルトン以下など、約20,000ダルトン以下の分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、バイオポリマーは、約20,000、19,000、18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000、または1,000ダルトンの分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、バイオポリマーは、約1,000ダルトン〜約20,000ダルトン、約1,000ダルトン〜約10,000ダルトン、または約1,000ダルトン〜約10,000ダルトンの分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、バイオポリマーは多分散であり得る。いくつかの実施形態では、バイオポリマーは水溶性であり得るか、または水溶性になるように官能化され得る。

本発明のNO放出バイオポリマーは、1つ以上のNOドナー(例えば、1、2、5、10、50、100、200個以上)を含むバイオポリマーである。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、NOドナーで官能化されたポリマー骨格のモノマー単位の少なくとも約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または100%を有する。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、NOドナーで官能化されたポリマー骨格のモノマー単位の少なくとも約1%〜約20%を有する。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、バイオポリマーの重量あたり約0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、または5%のNOを有する。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、本発明のNO放出ポリグルコサミンである。本発明のNO放出ポリグルコサミンは、本明細書においてNO放出キトサンオリゴ糖と互換的に呼ばれる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出ポリグルコサミンは、中分子量キトサンから調製され、かつ/またはこれを含む。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出ポリグルコサミンは、1%の酢酸溶液中に重量あたり1%の量で存在し、25℃で測定される場合、約200〜約800センチポアズの粘度を有する中分子量キトサンから調製され、かつ/またはこれを含む。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出ポリグルコサミンは、例えば、約5%〜約100%、約10%〜約50%、約75%〜約85%、約70%〜約95%、約95%〜約98%、約50%〜約80%、約90%〜約98%、または約80%〜約90%が脱アセチル化されているキトサンなどの脱アセチル化キトサンから調製され、かつ/またはこれを含む。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出ポリグルコサミンは、約50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、または100%が脱アセチル化されているキトサン(例えば、1%の酢酸溶液中に重量あたり1%の量で存在し、25℃で測定される場合、約200〜約800センチポアズの粘度を任意選択的に有する中分子量キトサン)から調製され、かつ/またはこれを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のポリグルコサミンは、式Iの少なくとも1つの構造単位と、

任意選択的に、式IIの少なくとも1つの構造単位と、を含み、

式中、 R₁、R₂、R₃およびR₄は、存在する場合、それぞれ独立して、水素、−(C=O)C₁₋₅アルキル、およびC₁₋₅アルキルからなる群から選択され、

が、それぞれの場合に、単結合または二重結合であり、 それが二重結合であるそれぞれの場合、二重結合−Oに結合したR₁、R₂、R₃、またはR₄は存在せず、R₁が存在しない場合、R₅は水素、ヒドロキシル、C₁₋₅アルキル、またはC₁₋₅アルコキシであり、R₃が存在しない場合、R₆は水素、ヒドロキシル、C₁₋₅アルキル、またはC₁₋₅アルコキシであり、 それが単結合であるそれぞれの場合、二重結合−Oに付着したR₁、R₂、R₃、またはR₄は存在し、R₁が存在する場合、R₅は水素であり、R₃が存在する場合、R₆は水素であり、 Wが−(Q−A)_p−B、−Q−A−B、または−C₁₋₂₀アルキル−A−Bであり、 Qが−(CR_cR_d)_v−であり、 式中、R_cおよびR_dが、それぞれの場合に独立して、水素またはC₁₋₅アルキルであり、vが2〜6の整数であり、 pが1〜100の整数であり、 Aが、

であり、式中、LがS、O、またはNであり、 Gが、それぞれの場合に独立して、水素であるか、またはLと一緒になって一酸化窒素ドナーを形成するか、または存在せず、 Xが水素、C₁₋₅アルキルであるか、またはNと一緒になって一酸化窒素ドナーを形成し、 Bが存在しないか、または水素、ヒドロキシル、C₁₋₅アルキル、もしくは−Y−Zからなる群から選択され、Yがスペーサーであり、Zがポリマー、末端、またはC₁₋₂₀アルキルであり、 Dが−NR_aR_bであり、R_aおよびR_bが独立して、水素、ホルミル、−(C=O)C₁₋₅アルキル、C₁₋₅アルキル、およびC₁₋₅アルキルエステルからなる群から選択されるか、 またはDが、

であり、 ポリグルコサミンが、少なくとも1つの一酸化窒素ドナーを含み、 GがLと一緒になって少なくとも1つの一酸化窒素ドナーを形成するか、またはXがNと一緒になって少なくとも1つの一酸化窒素ドナーを形成する。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は粘膜付着性である。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは粘膜付着性であり、キトサン(例えば、1%の酢酸溶液中に重量あたり1%の量で存在し、25℃で測定される場合、約200〜800センチポアズの粘度を有する中分子量キトサン)および/またはNOドナーを有しない修飾キトサン(例えば、NOドナーを含まない2−メチルアジリジン修飾キトサン)よりも粘膜付着性が高い。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは粘膜付着性であり、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、250%、300%以上、非NO放出バイオポリマー(例えば、キトサン(例えば、1%の酢酸溶液中に重量あたり1%の量で存在し、25℃で測定される場合、約200〜800センチポアズの粘度を有する中分子量キトサン))よりも粘膜付着性が高い。

本発明のNO放出バイオポリマーは、正に帯電し得、かつ/または全体的に正の電荷を有し得る。本発明のNO放出バイオポリマーとムチンとの間の静電相互作用は、対象のムチン、粘液、および/または粘膜表面へのNO放出バイオポリマーの粘膜付着を促進および/または支援し得る。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、対照化合物と比較して、より低い用量で対象に投与され得る。対照化合物は、例えば、粘膜付着性ではなく、任意選択的に本発明の粘膜付着性NO放出バイオポリマーと同じ量および/または速度のNOを送達することができるNO放出バイオポリマーなどの非粘膜付着性バイオポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、対照化合物は、NO放出小分子(例えば、500ダルトン未満の分子量を有し、少なくとも1つのNOドナーを含む有機および/または無機化合物)であり得る。本発明のNO放出バイオポリマーの用量は、任意選択的に同じかまたは同様の結果を達成するために、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%以上、対照化合物の用量未満であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは粘膜付着性であり、任意選択的に、同じ量および/もしくは速度のNOを本発明の粘膜付着性NO放出バイオポリマーとして送達し得る、粘膜付着性ではないNO放出バイオポリマーと比較して、かつ/またはNO放出小分子と比較して、より低い用量で対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の粘膜付着性NO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は、粘液の1つ以上の特性を改変する量で投与され得、この量は、粘液と同じかもしくは同様の改変を達成するために、粘膜付着性ではないNO放出バイオポリマーの量未満であり、任意選択的に、非粘膜付着性バイオポリマーは、粘膜付着性NO放出バイオポリマーと同じ量および/もしくは速度のNOを送達し、かつ/またはNO放出小分子の量未満である。

いくつかの実施形態では、本発明の粘膜付着性NO放出バイオポリマーは、治療上有効量および/または治療有効量で対象に投与され得、この量は、同じかまたは同様の治療結果を達成するために、任意選択的に、同じ量および/または速度のNOを粘膜付着性NO放出バイオポリマー、および/またはNO放出小分子として送達する、例えば、非粘膜付着性バイオポリマーなどの対照化合物の量未満である。治療上有効量および/または治療有効量の本発明のNO放出バイオポリマーは、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%以上、対照化合物の量未満であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーの投与は、例えば、治療有効量などの一酸化窒素の投与による全身効果をもたらさない。

いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、粘液溶解性である用量で投与される。化合物に関して本明細書で使用される「粘液溶解性」(例えば、本発明のNO放出バイオポリマー)は、化合物が粘液を分解させ、かつ/または粘液粘度および/もしくは弾性を減少させることができる用量で投与されることを意味する。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、粘液粘度および/または弾性を減少させ得る。粘液粘度および/または弾性は、NO放出バイオポリマーおよび/もしくは本発明の方法の非存在下での粘液粘度および/もしくは弾性と比較して、かつ/または本発明の方法前に、少なくとも約10%減少し得る。いくつかの実施形態では、粘液粘度および/または弾性は、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/もしくは方法の非存在下での粘液粘度および/もしくは弾性と比較して、かつ/または本発明の方法前に、約10%、15%、20%、25%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、または100%、または任意の2つの個々の値をその中に含む任意の範囲、減少する。例えば、いくつかの実施形態では、粘液粘度および/または弾性は、約65%〜約95%、約75%〜約95%、または約65%〜約90%の範囲の量だけ減少し得る。いくつかの実施形態では、粘度および/または弾性は、適切な対照(例えば、本明細書に記載される対照化合物)よりも統計的に大きい量だけ減少し得る。粘液粘度および/または弾性は、インビトロで判定され得る。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、N−アセチルシステインまたはドルナーゼアルファの投与などの従来の粘液溶解療法よりも大きい(例えば、少なくとも5%、10%、15%、または20%大きい)量で、粘液粘度および/または弾性を減少させ得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、N−アセチルシステインまたはドルナーゼアルファの投与などの従来の粘液溶解療法の投与時に粘液粘度および/または弾性の同じ減少を達成する時間量よりも、NO放出バイオポリマーの投与後により少ない時間で粘液粘度および/または弾性を減少させ得る。

粘液に関して本明細書で使用される「弾性」とは、外力(例えば、固体挙動)による形状の変形を経験した後に粘液が元の形状に戻る能力を指す。粘液に関して本明細書で使用される「粘度」は、力(例えば、せん断応力または引張応力)の適用時の変形(例えば、液体挙動)に対する粘液の抵抗性の尺度を指す。より高い粘液粘度は、粘液の変形が少ないことを意味する。粘液に関して本明細書で使用される「粘弾性」とは、変形を受けたときに粘性と弾性の両方の特性を示す粘液の特性を指す。

本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)および/または方法は、粘液および/または対象へのNO放出バイオポリマーの接触および/または投与後の約15、30、45、60、または90分で、または約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間以上で少なくとも約10%、粘液粘度および/もしくは弾性を減少させ得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、粘液および/または対象へのNO放出バイオポリマーの接触および/または投与後の約1、6、12、または24時間(複数可)で少なくとも約50%、75%、80%、または90%、粘液粘度および/または弾性を減少させ得る。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)および/または方法は、例えば、対象の気道、肺、気管支、および/または気管における粘液の蓄積など、対象における粘液の蓄積を減少させ得る。NO放出バイオポリマーおよび/または方法は、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法の非存在下の、かつ/または本発明の方法前の粘液の蓄積と比較して約10%、15%、20%、25%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、または100%、対象における粘液の蓄積を減少させ得る。いくつかの実施形態では、粘液の蓄積は、適切な対照(例えば、本明細書に記載される対照化合物)よりも統計的に多い量だけ減少し得る。粘液の蓄積は、インビトロで判定され得る。

本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)および/または方法は、例えば、任意選択的にゲル電気泳動を使用したムチン移動距離の測定によるなど、例えば、当業者に知られている方法を使用することなど、任意選択的に、インビトロで判定される、ムチンおよび/またはムチン多量体のサイズを(例えば、約10%以上)減少させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、任意選択的にゲル電気泳動を使用したムチン溶液および/またはムチン移動距離のゼータ電位の測定によるなど、例えば、当業者に知られている方法を使用することなど、任意選択的に、インビトロで判定される、ムチンおよび/またはムチン多量体に対する電荷を改変することができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、任意選択的にゲル電気泳動を使用した免疫組織化学的検出および/またはムチン移動距離の測定など、例えば、当業者に知られている方法を使用することなど、任意選択的に、インビトロで判定される、ムチンの三次元ネットワークを改変および/または破壊することができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、任意選択的にゲル電気泳動を使用した免疫組織化学的検出および/またはムチン移動距離の測定など、例えば、当業者に知られている方法を使用することなど、任意選択的に、インビトロで判定される、ムチンにおけるムチンのフラグメントの数および/または長さを(例えば、約10%以上)減少させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、任意選択的にゲル電気泳動を使用した免疫組織化学的検出および/またはムチン移動距離の測定など、例えば、当業者に知られている方法を使用することなど、任意選択的に、インビトロで判定される、ムチン中に存在するDNAを改変することができる。例えば、NO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、NO媒介DNA切断によって、粘液中に存在するDNAを切断し得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、免疫組織化学的検出および/またはゲル電気泳動など、例えば、当業者に知られている方法を使用することなど、任意選択的に、インビトロで判定される、ムチン中に存在する1つ以上のムチン(例えば、MUC5ACおよび/またはMUC5B)の濃度を(例えば、約10%以上)減少させることができる。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)および/または方法は、対象の粘液クリアランスを増加させることができる。粘液クリアランスは、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法の非存在下の、かつ/または本発明の方法の前の粘液クリアランスと比較して少なくとも約10%増加し得る。いくつかの実施形態では、粘液クリアランスは、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法の非存在下の、かつ/または本方法前の粘液クリアランスと比較して約10%、15%、20%、25%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%以上増加する。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、N−アセチルシステインまたはドルナーゼアルファの投与などの従来の粘液溶解療法よりも多い量(例えば、少なくとも5%、10%、15%、または20%以上)、対象の粘液クリアランスを増加させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、例えば、N−アセチルシステインまたはドルナーゼアルファの投与などの従来の粘液溶解療法の投与時に対象の粘度クリアランスの同じ増加を達成する時間量よりも、NO放出バイオポリマーの投与後により少ない時間で対象の粘液クリアランスを増加させることができる。

いくつかの実施形態によると、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は抗菌性であり、かつ/または本発明の方法は、抗菌性である用量で本発明のNO放出バイオポリマーを投与し得る。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、病原体(例えば、細菌)の成長を阻害し、かつ/または病原体を死滅させるのに有効な用量で対象に投与され、かつ/または粘液に接触される。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、病原体の成長を阻害し、かつ/または病原体を死滅させるのに有効な量で、一酸化窒素を対象および/または粘液に提供および/または送達する。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、一酸化窒素単独(例えば、ガス状NO)に対して病原体の成長を阻害し、かつ/または病原体を死滅させるのに有効な濃度以下(例えば、少なくとも5%、10%、15%、または20%以下)である量で、一酸化窒素を対象および/または粘液に提供および/または送達する。

本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)および/または方法は、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11以上)の病原体(複数可)の成長を阻害し、かつ/またはそれらを死滅させることができる。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは広域抗菌剤であり得る。本発明のNO放出バイオポリマーおよび/もしくは方法は、1つ以上の好気性および/もしくは嫌気性病原体(複数可)の成長を阻害し、かつ/またはそれを死滅させることができ、かつ/または好気性および/もしくは嫌気性条件下で、1つ以上の病原体(複数可)の成長を阻害し、かつ/またはそれらを死滅させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、1つ以上のグラム陰性細菌および/またはグラム陽性細菌の成長を阻害し、かつ/またはそれらを死滅させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、好気性および嫌気性条件下で、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の成長を阻害し、かつ/またはそれらを死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、病原体の目に見える成長を防止するのに有効な量以上の量で、本発明のNO放出バイオポリマーを対象および/または粘液に投与および/または接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、病原体を死滅させるのに有効な量以上の量で、本発明のNO放出バイオポリマーを対象および/または粘液に投与および/または接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「接触させる」、「接触させること」などの用語は、効果が生じ得るように非常に近接した2つ以上の物質を指す。例えば、実施形態では、対象の粘液は、粘液の改変、例えば、対象の粘液クリアランスの増加が生じ得るように、NO放出バイオポリマーに接触している場合がある。

病原体の例には、メチシリン耐性S.aureus(MRSA)およびメチシリン感受性S.aureus(MSSA)を含むStaphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa(例えば、ムコイドおよび非ムコイドPseudomonas aeruginosa)、Burkholderia cepacia、Achromobacter Xylosoxidans、Stenotrophomonas maltophillia、Klebsiella pneumoniae、Achromobacter xylosidans、Scedosporium apiospermum、ならびにMycobacterium avium、Mycobacterium abscessus、およびMycobacterium intracelullareを含むマイコバクテリウムを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「マイコバクテリウム」という用語は、150種を超える認識された種を有し、放線菌の属である細菌のファミリーを指す。マイコバクテリウムには、結核およびハンセン病などの疾患を引き起こすことが知られている病原体が含まれるが、これらに限定されない。マイコバクテリウムのさらなる非限定的な例は、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium gordonae、Mycobacterium kansasii、およびMycobacterium nonchromogenicum、およびMycobacterium ulceransである。いくつかの実施形態では、病原体はマイコバクテリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、非結核性マイコバクテリア膿瘍および非結核性マイコバクテリア・アビウムなどであるがこれらに限定されない非結核性マイコバクテリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、抗生物質耐性病原体および/またはスーパーバグである。本明細書で使用される場合、「スーパーバグ」という用語は、多剤耐性であり、2つ以上の抗菌剤(例えば、抗生物質)を使用して死滅させることができない病原体(例えば、細菌)を指す。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)および/または方法は、従来のCF抗生物質に耐性のある病原体などであるがこれに限定されない1つ以上の抗生物質に耐性のある1つ以上の病原体の成長を阻害し、かつ/またはそれらを死滅させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、ムコイドおよび/または非ムコイドPseudomonas aeruginosaの成長を阻害し、かつ/またはそれらを死滅させることができる。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、従来のCF抗生物質、ムコイドおよび/または非ムコイドPseudomonas aeruginosa、Burkholderia Cepacia複合種、メチシリン耐性Staphylococcus Aureus、非結核性マイコバクテリア膿瘍、非結核性マイコバクテリア・アビウム、Achromobacter xylosidans、および/またはScedosporium apiospermumに耐性のある病原体の成長を阻害し、かつ/またはそれを死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗菌性であり、粘液の粘度および/または弾性を減少させる量で、本発明のNO放出バイオポリマーを粘液および/または対象に接触および/または投与することを含む。NO放出バイオポリマーの量は、同じかまたは同様の抗菌活性および/または粘度の減少および/または粘液の弾性を達成するために、一酸化窒素単独(例えば、ガス状NO)の量よりも少ない量で、一酸化窒素を送達および/または投与し得る。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーの量は、粘液の同じかまたは同様の抗菌活性および/または粘度および/または弾性の減少を達成するために、対照化合物の量より少ない場合がある。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療上有効量のNO放出バイオポリマーを対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という用語は、対象において治療的に有用な応答を誘発する本発明のNO放出バイオポリマーの量を指す。当業者であれば、対象に何らかの利益が提供される限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。

本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、または「〜の治療」(およびそれらの文法的変形)は、対象に利益を与え、対象の状態の重症度が軽減されるか、少なくとも部分的に改善または向上されること、および/または少なくとも1つの臨床症状の軽減、緩和、または減少が達成され、かつ/または症状の進行が遅れていることを意味し得る、あらゆる種類の治療を指す。

いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は、治療有効量で投与され得る。本明細書で使用される「治療有効」量は、対象を(本明細書で定義されるように)治療するのに十分な量である。当業者であれば、対象に何らかの利益が提供される限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。

本発明は、獣医学的および医学的用途の両方に用途を見出す。本発明の方法で治療されるのに好適な対象には、哺乳動物対象が含まれるが、これに限定されない。本発明の哺乳動物には、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、げっ歯類(例えば、ラットおよびマウス)、ウサギ目、霊長類(例えば、猿人類およびヒト)、非ヒト霊長類(例えば、サル、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ)など、および子宮内の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従って治療される必要がある哺乳動物対象はいずれも好適である。両性別および発達の任意の段階(すなわち、新生児、幼児、少年、青年、成人)のヒト対象は、本発明に従って治療され得る。本発明のいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物であり、特定の実施形態では、対象はヒトである。ヒト対象には、胎児、新生児、幼児、若年、青年、成人、および老人ならびに妊娠した対象を含む、すべての年齢の男性と女性の両方が含まれる。本発明の特定の実施形態では、対象は、ヒト青年および/または成人である。

本発明の方法はまた、動物対象、特に、獣医学的目的ならびに/または薬物スクリーニングおよび薬物開発目的のために、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜、およびウマなどの哺乳動物対象で実施することもできる。

いくつかの実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要とする」か、または「それを必要とし」ており、例えば、対象は、感染および/または嚢胞性線維症に典型的に関連する所見を有し、それらを有する疑いがあり、かつ/または対象がそれらを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法「を必要とする」対象とは、疾患状態を経験しており、かつ/または疾患状態を経験すると予想される対象であり得、本発明の方法、化合物、および/または組成物は、疾患状態の治療的および/または予防的処置のために使用される。

本発明の方法は、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)を、対象の気道、肺、気管支、および/または気管に存在する粘液に送達および/または投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明のNO放出バイオポリマーを、対象に存在する粘液栓に送達および/または投与する。

本発明の方法は、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または一酸化窒素を、対象となる部位に直接送達(すなわち、局所送達)することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または一酸化窒素を対象に送達し、一酸化窒素の投与から全身効果をもたらさない。いくつかの実施形態は、対象の他の区域への全身曝露および/または毒性効果を提供することなく、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または一酸化窒素を対象に局所的に送達すること(例えば、対象の区域への標的送達)を含む。

本発明の方法は、一酸化窒素単独および/または対照化合物の治療用量よりも低い治療用量で一酸化窒素を投与することができる。したがって、本発明のNO放出バイオポリマーを投与することによって、治療上有効であり、一酸化窒素単独の、かつ/または対照化合物が同じかもしくは同様の治療効果を達成する用量よりも低い用量で、一酸化窒素を送達および/または投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、一酸化窒素単独の、かつ/または対照化合物が同じかもしくは同様の治療効果を達成する用量よりも少なくとも10%少ない治療効果を達成する用量で、一酸化窒素を投与および/または送達することができる。

本発明の方法は、本発明のNO放出バイオポリマーを、1日1回以上(例えば、1、2、3、4回以上)、毎日、1日おきに、3、4、5、または6日ごとに、または週に1回、対象および/または粘液に投与し得る。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、1、2、3、または4週間、1日に1、2、または3回、対象および/または粘液に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明のNO放出バイオポリマーを、治療期間中に1回以上、対象および/または粘液に投与する。本明細書で使用される「治療期間」は、本発明のNO放出バイオポリマーの最初の投与および/または用量から、本発明のNO放出バイオポリマーの最後の投与および/または用量までの期間を指す。治療期間は1日以上(複数可)または1週間以上(複数可)であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50以上の日(複数可)もしくは週(複数可)、またはその中の任意の範囲および/もしくは個々の値の治療期間にわたって、少なくとも1日1回、対象および/または粘液に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、50未満の日(複数可)もしくは週(複数可)、例えば、48、45、40、35、30、25、20、15、12、10、6、4、3、または2未満の日(複数可)もしくは週(複数可)、またはその中の任意の範囲および/もしくは個々の値の治療期間にわたって、少なくとも1日1回、対象および/または粘液に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象および/または粘液へのNO放出バイオポリマーの1回以上の投与および/または用量に続いて、粘液の1つ以上の物理的および/または生物物理学的特性の改変を達成することができ、かつ/または1つ以上の病原体を死滅させることができ、かつ/またはそれらの成長を阻害することができる。いくつかの実施形態では、単回投与および/または用量は、粘液の物理的および/または生物物理学的特性における1つ以上の改変を達成し、かつ/または1つ以上の病原体を死滅さることができ、かつ/またはそれらの成長を阻害することができる。いくつかの実施形態では、2回以上(例えば、2、3、4、5回以上)の投与および/または用量は、粘液の物理的および/または生物物理学的特性における1つ以上の改変を達成し、かつ/または1つ以上の病原体を死滅させることができ、かつ/またはそれらの成長を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、粘液の物理的および/または生物物理学的特性における1つ以上の改変を達成し、かつ/または治療期間の終わりに(例えば、NO放出バイオポリマーの最後の投与および/または用量の約24時間以内)、1つ以上の病原体を死滅させることができ、かつ/またはそれらの成長を阻害することができる。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は、粘液1mLあたり約0.1mg〜約100mgのNO放出バイオポリマーの濃度で粘液に接触される。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、粘液1mLあたり約0.1mg〜約100mgのNO放出バイオポリマーの濃度でNO放出バイオポリマーが存在するような薬用量で投与され得る。NO放出バイオポリマーは、粘液1mLあたり約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100mgのNO放出バイオポリマー、またはその中の任意の2つの個別の値を含む任意の範囲の濃度で粘液に接触され得、かつ/または対象に投与され得る。

いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、病原体を死滅させるのに有効な濃度で粘液に接触され得、かつ/または対象に投与され得る。本発明の方法は、病原体の数を1、2、または3ログ減少させる量で本発明のNO放出バイオポリマーを投与し得、かつ/または一酸化窒素を送達し得る。1ログの減少は、10倍(すなわち、10¹)または10%、数が減少することを表す。2ログの減少は、100倍(すなわち、10²)または99%、数が減少することを表す。3ログの減少は、1000倍(すなわち、10³)または99.9%、数が減少することを表す。病原体の数の減少は、NO放出バイオポリマーの1回以上(例えば、1、2、3、4、5回以上)の投与後の時点に(例えば、治療期間の終わりに)測定され得る。

いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、病原体が存在し、病原体の数を少なくとも1、2、または3ログ減少させる溶液1mLあたり約0.1mg〜約20または40mgのNO放出バイオポリマーの濃度で、粘液に接触され得、かつ/または対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、抗生物質が病原体の数を1、2、または3ログ減少させるのに必要な量より少ない量で、本発明のNO放出バイオポリマーを投与し得、かつ/または一酸化窒素を送達し得る。

NO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は、約1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、または7:1(NO放出バイオポリマー:ムチン)の重量比で対象に投与され得、かつ/または粘液に接触され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ムチンは粘液約6.5mg/mLの量で存在し得、NO放出バイオポリマーは粘液約10mg/mLの量で投与され得、そのためNO放出バイオポリマーは、約2:1〜約1:1の範囲の重量比で対象に投与される。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、約4:1〜約2:1、または約7:1〜約1:3の範囲の重量比で対象に投与される。

本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は、37℃での30mLの脱酸素化リン酸緩衝生理食塩水(pH6.5または7.4)中の1.0mgのNO放出バイオポリマーを用いて化学発光によりインビトロで測定される、NO放出バイオポリマー1mgあたり少なくとも約0.1μmolの一酸化窒素の量で一酸化窒素を放出し得、NO濃度がNO放出バイオポリマー1mgあたり10ppb未満のNOであるときに分析が終了される。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、37℃での30mLの脱酸素化リン酸緩衝生理食塩水(pH6.5または7.4)中の1.0mgのNO放出バイオポリマーを用いて化学発光によりインビトロで測定される、NO放出バイオポリマー1mgあたり約0.1μmol〜約1または2μmolの一酸化窒素の量で一酸化窒素を放出し得、NO濃度がNO放出バイオポリマー1mgあたり10ppb未満のNOであるときに分析が終了される。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、本明細書に記載される化学発光によりインビトロで測定される、NO放出バイオポリマー1mgあたり約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、もしくは2μmolの一酸化窒素、またはその中の任意の2つの個々の値を含む任意の範囲の量で一酸化窒素を放出し得る。

本発明のNO放出バイオポリマーは、本明細書に記載される化学発光によりインビトロで測定される場合、例えば、約15分〜約45分、約1時間〜約8時間、または4時間〜約6時間など、約15分〜約8時間の半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、本明細書に記載される化学発光によりインビトロで測定される、約15、30、45、もしくは60分、または約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、または8時間の半減期を有し得る。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、本明細書に記載される化学発光によりインビトロで測定される、例えば、少なくとも約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間など、本明細書に記載される化学発光によりインビトロで測定される、少なくとも約4時間、NO放出バイオポリマー1mgあたり10ppbを超えるNOの濃度で一酸化窒素を放出し得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、本明細書に記載される化学発光によりインビトロで測定される、約4時間〜約24時間、約10時間〜約22時間、約6時間〜約15時間、約12時間〜約20時間、または約19時間〜約20時間、NO放出バイオポリマー1mgあたり約10ppbを超えるNOの濃度で一酸化窒素を放出し得る。

本発明のNO放出バイオポリマーは、例えば、約10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、または0.5kDaなど、約10kDa以下の分子量を有し得る。

いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、抗菌特性を提供することができ、かつ/またはCF唾液の粘弾性を減少させることができ、そのような効果は、ムチンのサイズの減少および/または三次元ムチンネットワークの損傷を含み得るが、これらに限定されない。粘液溶解療法としてNOガスの吸入が以前に提案されているが、本明細書で開示される主題は、例えば、粘液栓への直接送達など、本発明のNO放出バイオポリマーからのNO放出の利点を確立する。いくつかの実施形態では、NO放出キトサンオリゴ糖足場の粘液接着特性は、NOの効力を増強し得る。例えば、CF粘液などの粘液へのNO放出を標的とする能力は、治療作用に必要なNO用量を減少させ得ると同時に、他のNO媒介プロセスに対する任意の潜在的な影響を軽減する可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるキトサンオリゴ糖は、抗菌剤および粘液溶解剤としてNO放出キトサンオリゴ糖の二重作用の可能性を有し得、例えば、呼吸器疾患および/または感染症の治療に使用され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法はCFを治療し得る。本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または方法は、ヒト気管支上皮細胞によって産生され、かつ/または例えば、嚢胞性線維症(CF)を有する患者から収集された試料などの臨床唾液試料中に存在するムチンを分解し得る。

本開示のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)は、水溶性であり、かつ/または調整可能であり得る。これらの特性は、例えば、嚢胞性線維症の治療において水溶性治療が有利である治療および/または疾患状態などにおいて、本開示のNO放出バイオポリマーの有用性に寄与し得る。いくつかの実施形態では、本発明のNO放出バイオポリマーは、米国特許出願公開第2015/0225488号に記載されているポリグルコサミンであり、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーは、バイオフィルムに容易に浸透し、これらを根絶することができる。「破壊すること」および「根絶すること」という用語は、本開示のNO放出バイオポリマーがバイオフィルムを除去する能力を指す。バイオフィルムは部分的に根絶されるかまたは破壊されることがあり、これは細胞がもはや互いにまたは表面に付着しないことを意味する。バイオフィルムは完全に根絶されることがあり、これはバイオフィルムがもはや実質的な程度まで、相互接続された、凝集したまたは連続的な細胞ネットワークではないことを意味する。

いくつかの実施形態では、例えば、対象のバイオフィルムなどのバイオフィルムを破壊、根絶、または予防する方法がある。本方法は、バイオフィルムを含むか、または表面もしくは区域の一部もしくは全部を形成するか、もしくは占有するバイオフィルムを受けやすい表面もしくは区域を、本発明のNO放出バイオポリマーに接触させることを含み得る。「バイオフィルム」という用語は、細胞が互いに、通常は表面上に付着する1つ以上の微生物の集合体を意味することを意図している。ほとんどの何らかの自由浮遊微生物はバイオフィルムを形成することができ、かつ/または表面に付着することができる。微生物は、ファンデルワールス力を介した弱い可逆的付着を通じて表面へまたは互いに付着することができる。微生物は、細胞接着または線毛などの構造を使用して、より永久的に固定することができる。

本明細書で使用される場合、本発明のNO放出バイオポリマーに関して「水溶性」という用語は、NO放出バイオポリマーが室温で約50、75、100、150、または200mg/mlを超える濃度で水に可溶性であることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される水溶性バイオポリマー(例えば、ポリグルコサミン)は、水1mLあたり50mgを超えるバイオポリマーが室温で溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される水溶性バイオポリマー(例えば、ポリグルコサミン)は、水1mLあたり75mgを超えるバイオポリマーが室温で溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される水溶性バイオポリマー(例えば、ポリグルコサミン)は、水1mLあたり100mgを超えるバイオポリマーが室温で溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される水溶性バイオポリマー(例えば、ポリグルコサミン)は、水1mLあたり150mgを超えるバイオポリマーが室温で溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される水溶性バイオポリマー(例えば、ポリグルコサミン)は、水1mLあたり200mgを超えるバイオポリマーが室温で溶解するように可溶性である。

「一酸化窒素ドナー」または「NOドナー」という用語は、一酸化窒素種の生物活性が、意図された作用部位で発現されるように、一酸化窒素種を供与、放出、および/または直接もしくは間接的に移動させ、かつ/またはインビボで一酸化窒素の内在性産生を刺激するおよび/またはインビボで一酸化窒素の内在性レベルを上昇させる種を指す。

「一酸化窒素の放出」または「一酸化窒素の供与」という用語は、一酸化窒素の3つの酸化還元形態(NO+、NO⁻、NO)のうちのいずれかを、供与、放出、および/または直接もしくは間接的に移動させる方法を指す。いくつかの場合では、一酸化窒素種の生物活性が、意図される作用部位で発現されるように、一酸化窒素の放出または供与が達成される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴ糖はポリグルコサミンである。ポリグルコサミンおよびそれらの誘導体は、キトサンおよびそれらの誘導体として知られている。特に有用なポリグルコサミンは、サイズが1000g/mol〜20,000g/molの範囲であり得るポリマーである。分子量が1000g/mol未満のより小さなポリグルコサミンおよび分子量が20,000g/molを超える、より大きいポリグルコサミンも考えられる。分子量が20,000g/molを超えるキトサンは、水溶性にするためにさらに官能化する必要があり得る。有用なポリグルコサミンの重要な特徴は、本明細書に記載される方法に従って誘導体化されてNO放出ポリグルコサミンを形成する炭水化物骨格上の、かつ/またはそこから垂下している利用可能な窒素である。有利には、本明細書に開示されるポリグルコサミンは水溶性である。

キトサンは、ランダムに分布されたβ−(1−4)−結合D−グルコサミン(脱アセチル化単位)およびN−アセチル−D−グルコサミン(アセチル化単位)から構成される線形多糖類である。それはポリグルコサミンである。キトサンは、エビ、ロブスター、カニなどの甲殻類の外骨格に見られる多糖類であるキチン、または真菌の供給源に由来する。それは以下の構造を有する。

キトサンは生分解性かつ生体適合性である。高分子量のキトサンは、溶解度が限定されており、酸性条件下でより可溶性である。約20,000g/molを超える分子量を有するキトサン多糖類は、生理学的条件下で限定された水溶解度を示す。さらに、高分子量のキトサンは、NOドナーの形成に必要な塩基性溶液への多糖類の溶解度が低い可能性が高いため、制限されたNO貯蔵(約0.2μmol/mg)が示される場合がある。Valmikinathan,C.M.;Mukhatyar,V.J.;Jain,A.;Karumbaiah,L.;Dasari,M.;Bellamkonda,R.V.Photocrosslinkable chitosan based hydrogels for neural tissue engineering.Soft Matter 2012,8,1964−1976;Zhang,J.L.;Xia,W.S.;Liu,P.;Cheng,Q.Y.;Tahirou,T.;Gu,W.X.;Li,B.Chitosan Modification and Pharmaceutical/Biomedical Applications.Mar.Drugs 2010,8,1962−1987;Wan,A.;Gao,Q.; Li,H.L.Effects of molecular weight and degree of acetylation on the release of nitric oxide from chitosan−nitric oxide adducts.J.Appl.Polym.Sci.2010,117,2183−2188。NO貯蔵が改善されたN−ジアゼニウムジオレート官能化キトサン誘導体を合成するために、過酸化水素中のキトサン多糖類の分解によって水溶性キトサンオリゴ糖を調製した。本明細書に記載されるキトサンオリゴ糖の利点は、1000〜20,000g/mol、特に約10,000g/mol以下、または約8000g/mol以下、または約5000g/mol以下、または約2,500g/mol以下の比較的低分子量であり、かつバイオフィルムに容易に浸透するそれらの能力である。Maghami,G.G.;Roberts,G.A.F.Evaluation of the viscometric constants for chitosan.Makromol.Chem.1988,189,195−200;Porporatto,C.;Bianco,I.D.;Riera,C.M.;Correa,S.G.,Chitosan induces different L−arginine metabolic pathways in resting and inflammatory macrophages.Biochem.Biophy.Res.Comm.2003,304,266−272。本明細書に記載されるキトサンオリゴ糖は、最大約8.7μmol/mgのより大きなNO貯蔵を有し、中性および塩基性条件下でも可溶性である。

キトサンの骨格上の一級アミノ基は、本明細書に開示されるNO放出オリゴ糖の調製のための化学的ハンドルである。以下のスキームに示されるように、二級アミノ基は一級アミノ基から調製される。

二級アミノ基を形成するのに有用な例示的な薬剤の1つは、アジリジン、例えば、2−メチルアジリジンである。チイランなどは、現在知られているか、または当該技術分野で知られるようになる可能性がある他の合成スキームに加えて使用することができる。

本明細書に記載されるように、ポリグルコサミンは、式Iの少なくとも1つの構造単位を含む。いくつかの実施形態では、R₁、R₂、R₃、およびR₄は、存在する場合、それぞれ独立して、水素およびC₁₋₅アルキルからなる群から選択される。R₁、R₂、R₃、およびR₄のうちの1つ以上がC₁₋₅アルキルである場合、それは、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロプリル、t−ブチル、n−ブチル、イソブチル、およびペンチルから選択され得る。いくつかの実施形態では、R₁、R₂、R₃、およびR₄は、存在する場合、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、R₁、R₂、R₃、およびR₄は、存在する場合、水素である。

いくつかの実施形態では、

は、すべての場合において単結合である。

いくつかの実施形態では、Wは−(Q−A)_P−Bであり、Qは、−(CR_CR_d)_v−であり、式中、R_cおよびR_dは、それぞれの場合に独立して、水素、またはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロプリル、t−ブチル、n−ブチル、イソブチル、およびペンチルなどのC₁₋₅アルキルである。いくつかの実施形態では、R_cおよびR_dは、それぞれの場合に独立して、水素、メチル、またはエチルである。いくつかの実施形態では、vは1または2である。

pの有用な値には、1〜100の任意の整数が含まれる。いくつかの実施形態では、pは1〜50の整数である。いくつかの実施形態では、pは1〜25の整数である。いくつかの実施形態では、pは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10などの1〜10の整数である。

いくつかの実施形態では、Wは−Q−A−Bである。いくつかの実施形態では、Wは−C₁₋₂₀アルキル−A−Bである。C₁₋₂₀アルキルは、1〜20個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素を指し得る。アルキルの代表的な例には、メチル、エチル、n−プロピル、イソ−プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、イソ−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、3−メチルヘキシル、2,2−ジメチルペンチル、2,3−ジメチルペンチル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニル、n−デシルなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、C₁₋₂₀アルキルは、−(CH₂CH₂)₁₋₁₀−、−(CH(CH₃)CH₂)₁₋₉、または−(CH₂CH(CH₃))₁₋₉−などの繰り返しアルキル単位を含み得る。

いくつかの実施形態では、LはNまたはSである。Gが生じるそれぞれの場合に独立して、水素または一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、Gは一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するGの少なくとも30%は一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するGの少なくとも50%は一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するGの少なくとも90%は一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するGの少なくとも95%は一酸化窒素ドナーである。

いくつかの実施形態では、Xは一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するXの少なくとも30%は一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するXの少なくとも50%は一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するXの少なくとも90%は一酸化窒素ドナーである。いくつかの実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するXの少なくとも95%は一酸化窒素ドナーである。

いくつかの実施形態では、Bは水素または−Y−Zであり、ここでYはスペーサーであり、Zはモノマーもしくはポリマー、または末端基である。いくつかの実施形態では、例えば、LがOまたはSである場合など、Bは存在しない。本明細書で使用される場合、末端基は、ポリマーまたはモノマーの末端の任意のエンドキャッピング基である。これらの基は当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、Bが末端基である場合、それは、水素、ヒドロキシル、またはC₁₋₅アルキルである。

いくつかの実施形態では、Bは、記載されるC₁₋₂₀アルキルである。いくつかの実施形態では、BはC₁₋₂₀アルキルである。

いくつかの実施形態では、Zは、当該技術分野で知られているモノマーまたはポリマー、特に活性医薬成分で使用されるものである。いくつかの実施形態では、Zは、記載されるC₁₋₂₀アルキルである。いくつかの実施形態では、Zは以下の構造のうちの1つを有する。

式中、jは、それぞれの場合に、1〜100の整数である。

いくつかの実施形態では、Yは、当該技術分野で知られているスペーサーまたはリンカー、特に活性医薬成分で使用されるものである。いくつかの実施形態では、Yは、C₁₋₆アルキルであるか、または以下の構造のうちの1つを有し、

式中、R_p、R_q、R_s、およびR_tは、それぞれの場合に独立して、水素またはヒドロキシルであり、kが1〜20の整数である。

本明細書に開示される戦略を使用して、ポリグルコサミン上に存在する任意の二級アミノ基を本明細書に記載されるように改変して、NO放出ポリグルコサミンを形成することができる。糖骨格部分に直接付着した二級アミノ基または骨格糖部分に垂下している二級アミノ基は、NO放出部分で官能化され得る。本明細書に合成経路で完全に開示されているように、一級アミンは二級アミンに改変される。この改変は、アジリジン、チイランなどによって促進され得る。

有用なNO放出部分は、当該技術分野で知られている任意のNO放出基を含む。NO放出基の残基が特に有用であり、すなわち、NOドナーは、ポリグルコサミン上のNに共有結合している。NOドナーは、それが結合しているポリグルコサミン上の原子と一緒になって、ジアゼニウムジオラート、例えばニトロソチオール基の一部としての−NO、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される部分を形成する。いくつかの実施形態では、NO放出部分はジアゼニウムジオレートである。これらの基は塩の形態で存在してもよい。

いくつかの実施形態では、NOドナーはN−ジアゼニウムジオラート(すなわち、1−アミノ−置換deazen−1−lum−1,2−ジオレート)であり、N−ジアゼニウムジオラートは、生物学的条件下でNOを自発的に生成するそれらの能力のためにNOドナーとして特に魅力的である。Hrabie,J.A.and Keefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135−1154(2002)、およびNapoli,C.and Lanarro,L.J.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,43,97−123(2003)を参照されたい。一級および二級アミン、ポリアミン、ならびに二級アミノ酸を包含する一連の求核残基を使用して、いくつかのN−ジアゼニウムジオラート化合物が合成されている。Hrabie,J.A.,and Keefer L.K.,Chem.Rev.,102,1135−1154(2002)を参照されたい。N−ジアゼニウムジオラートの形成において、1当量のアミンが高圧下で2当量の一酸化窒素と反応する。塩基(例えば、メトキシドのようなアルコキシド)は、アミン窒素からプロトンを除去してアニオン性の安定化した[N(O)NO]基を作成する。雰囲気条件下では安定であるが、N−ジアゼニウムジオラートは、水性媒体中で自発的に分解して、pH、温度、および/またはアミン部分の構造に依存する速度でNOを生成する。例えば、N−ジアゼニウムジオラート修飾プロリン(PROLI/NO)、2−(ジメチルアミノ)−エチルプトレアムルン(DMAEP/NO)、N,N−ジメチルヘキサンジアミン(DMHD/NO)、およびジエチレントリアミン(DETA/NO)が、pH7.4および37℃で2秒間〜20時間の範囲の多様なNO放出半減期を有する小分子NOドナーとして開発されている。Hrabie,J.A.,and Keefer,L.K.,Chem.Rev.,102,1135−1154(2002)、およびKeefer,L.K.,Annu,Rev.Pharmacol.Toxicol 43,585−607(2003)を参照されたい。

ポリグルコサミンの二級アミン官能基は、強塩基およびガス状の一酸化窒素の存在下で一酸化窒素ドナーに高収率で変換される。溶媒系は、ポリグルコサミンのNOとの帯電に影響を与える可能性がある。

「アミノ」および「アミン」という用語は、NR₃、NH₃、NHR₂、およびNH₂Rなどの含窒素基を指し、式中、Rは、本明細書の他の場所で説明されるとおりであり得る。したがって、本明細書で使用する「アミノ」は、一級アミン、二級アミン、または三級アミンを指すことができる。いくつかの実施形態では、アミノ基の1つのRはジアゼニウムジオラート(すなわち、NONO)であり得る。

「カチオン性アミン」および「四級アミン」という用語は、追加の(すなわち、第4の)基、例えば、窒素に結合した水素またはアルキル基を有するアミノ基を指す。したがって、カチオン性アミンおよび四級アミンは、正の電荷を保有している。

「アルキル」という用語は、1〜24個の炭素原子、例えば、1〜12個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を示す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチルなどが挙げられる。

「アルコキシ」という用語は、本明細書において、鎖長がそれに限定されない限り、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシなどを含むがこれらに限定されない、酸素原子に結合した上記に定義される直鎖または分岐鎖アルキルラジカルを意味するために使用される。いくつかの実施形態では、アルコキシ鎖は、長さが1〜5個の炭素原子または長さが1〜3個の炭素原子である。

荷電種を対象とする主題の場合、荷電種は対イオンを有する場合がある。対イオンは、親化合物上の電荷を安定させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、荷電種はその構造中に1を超える荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が荷電種の一部である場合、塩は複数の対イオンを有し得る。よって、荷電種は、1つ以上の荷電原子および/または1つ以上の対イオンを有し得る。無機対イオンの非限定的な例は、Na、K、Cs、Mg、Caなどである。

すべての実施形態では、置換基および/または変形物の組み合わせは、このような組み合わせがそれぞれの原子についての既知の原子価と一致する化合物を結果的に生じる場合にのみ許容可能である。

本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のNO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)を対象に投与することを含む、一酸化窒素を対象に送達する方法である。

いくつかの実施形態では、疾患状態を治療する方法であって、有効量の本発明のNO放出バイオポリマーを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。本明細書で使用される場合、「疾患状態」という用語は、生理学的プロセスを妨げるあらゆる異常な状態を指す。非限定的な疾患状態が本明細書に列挙されており、1つ超の疾患状態(すなわち、複数の疾患状態)が対象に同時に存在する場合がある。いくつかの実施形態では、複数の疾患状態の治療は、複数の疾患状態が同時に治療されるように、付随する様式で起こり得る。例えば、疾患状態には、がん、心血管疾患、微生物感染症、医療装置への血液の曝露によって引き起こされる血小板凝集および血小板粘着、異常な細胞増殖から結果として生じる病理学的状態、移植拒絶反応、自己免疫疾患、炎症、血管疾患、瘢痕組織、創傷収縮、再狭窄、疼痛、発熱、消化管障害、呼吸器障害、性機能障害、性感染症、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「微生物感染」という用語は、細菌、真菌、ウイルス、および/または酵母感染を指す。

本明細書で使用される場合、「呼吸器障害」という用語は、呼吸または呼吸器系に関連するあらゆる状態または疾患を指し、気道炎症、喘息、気腫、気管支炎、COPD、副鼻腔炎、鼻炎、咳、気管支痙攣、気流閉塞、運動誘発性気管支痙攣、増悪、気管支収縮、呼吸抑制、反応性気道機能不全症候群(RADS)、急性呼吸促迫症候群(ARDS)、刺激性喘息、職業性喘息、感覚過敏症、多剤感受性、および嚢胞性線維症を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、疾患状態は嚢胞性線維症である。いくつかの実施形態では、疾患状態は微生物感染症である。いくつかの実施形態では、疾患状態は嚢胞性線維症および微生物感染症である。

本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のNO放出バイオポリマーと薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤が提供される。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、生物学的にまたは別様に望ましくない材料を意味し、すなわち、この材料は、実質的に有害な生物学的作用を引き起こしたり、または有害な様式で、含まれる組成物の他の成分のいずれとも相互作用したりすることなく、本発明の組成物と共に個体に投与され得る。この材料は、当然ながら、当業者によく知られているように、対象における有効成分のいかなる分解も最小限にし、いかなる有害な副作用も最小限にするように選択されるであろう(例えば、Remington‘s Pharmaceutical Science;20 ed.2005を参照されたい)。本発明の組成物についての例となる薬学的に許容される担体には、滅菌発熱物質非含有水および滅菌発熱物質非含有生理塩類溶液水が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の組成物は、本発明のNO放出バイオポリマーおよび薬学的に許容される担体を含み得る。好適な組成物としては、製剤を意図される受容者の体液と等張にする抗酸化薬、緩衝剤、静菌薬、殺菌性抗生物質および溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。

本開示の方法において使用される組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、および/または分散剤などの調合剤を含み得る。あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱物質非含有水を用いた構成のために粉末形態であり得る。

組成物は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供され得、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結条件またはフリーズドライ(凍結乾燥)条件下で貯蔵され得る。

経口投与のために、組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ)、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来技術によって調製される錠剤もしくはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は当該技術分野で知られている方法によって被覆され得る。例えば、治療薬は、ヒドロクロロチアジドと組み合わせて、標的器官に到達するまで治療薬を保護する腸溶被覆または遅延放出被覆を有するpH安定化コアとして製剤することができる。

経口投与のための液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとることができ、または使用前に水もしくは他の好適なビヒクルを用いた構成のための乾燥製品として提示され得る。このような液体調製物は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素添加食用脂肪)、乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)、非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油)、および貯蔵剤(例えば、メチルもしくはプロピル−p−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸)などの薬学的に許容される添加剤を用いた従来技術によって調製され得る。調製物はまた、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を適宜含み得る。経口投与用調製物は、有効化合物を徐放を与えるように好適に製剤化され得る。頬側投与について、本組成物は従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態をとり得る。

本化合物はまた、移植または注射用の調製物として製剤化することもできる。したがって、例えば、本化合物は、好適なポリマー材料または疎水性材料(例えば、許容される油中のエマルションとして)またはイオン交換樹脂、または難溶性誘導体(例えば、難溶性塩として)と共に製剤化され得る。本化合物はまた、直腸用組成物(例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸)、クリームもしくはローション、または経皮パッチ中に製剤化され得る。

吸入によるエアロゾルとしての投与に好適な医薬製剤も提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーは、溶液および/またはエアゾールの形態で製剤化される。これらの製剤は、本明細書に記載されるNO放出バイオポリマーの溶液または懸濁液を含む。所望の製剤を小さなチャンバに入れて噴霧化することができる。噴霧化は、NO放出バイオポリマーを含む複数の液滴または固体粒子を形成するために、圧縮空気によって、または超音波エネルギーによって達成することができる。例えば、本開示のNO放出バイオポリマーは、嚢胞性線維症と関連する細菌感染症を治療するために吸入を介して投与され得る。嚢胞性線維症関連細菌感染症としては、stenotrophomonis、myobacterium avium intracellulaire and m.abcessus、burkhoderia cepacia、およびPseudomonas aeruginosa(P.aeruginosa)感染症が挙げられるが、これらに限定されない。

「有効量」という用語は、本明細書では、測定可能な生物学的応答を生じるのに十分な本発明のNO放出バイオポリマーおよび/または組成物の量を指すために使用される。本開示の主題の有効組成物中の有効成分の実際の薬用量レベルは、特定の対象および/または用途に対して所望の応答を達成するのに有効である量の有効化合物(複数可)を投与するように変えることができる。選択される薬用量レベルは、組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、治療されている状態の重症度、ならびに治療されている対象の健康状態および以前の病歴を含む、種々の因子に依存するであろう。いくつかの実施形態では、最小用量が投与され、用量は、用量制限毒性の非存在下で最小有効量まで漸増される。有効量の判定および調整、ならびにこのような調整をいつ、どのように行うかについての評価は、薬剤の技術分野において当業者に知られている。

本明細書に開示される組成物の投与のために、マウス薬用量をヒト薬用量に変換するための変換係数:kgあたりヒト用量=kgあたりマウス用量×12を使用して、マウス動物モデルに投与された用量に基づいてヒト薬用量を推定する従来の方法を実施することができる。(Freireich et al.,Cancer Chemother Rep.50,219−244(1966))。薬剤用量はまた、この方法が、体重よりもむしろ、特定の代謝機能および排泄機能との良好な相関関係を達成するため、体表面積1平方メートルあたりのミリグラムで与えることもできる。さらに、体表面積は、成人および年少者ならびに異なる動物種における薬剤の薬用量についての一般的な分母として使用することができる。(Freireich et al.,Cancer Chemother Rep.50,219−244(1966))。簡単に言えば、何らかの所与の種におけるmg/kg用量を等価のmg/sp m用量として表すために、用量に適切なkm係数を乗じる。成人においては、100mg/kgは、100mg/kg×37kg/sp m=3700mg/m²と等価である。

製剤および用量に関する追加のガイダンスについては、米国特許第5,326,902号、同第5,234,933号、PCT国際公開第WO93/25521号、Berkow et al.,The Merck Manual of Medical Information,Home ed.,Merck Research Laboratories:Whitehouse Station,N.J.(1997)、Goodman et al.,Goodman& Gilman‘s the Pharmacological Basis of Therapeutics,9th ed.McGraw−Hill Health Professions Division:New York(1996)、Ebadi,CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology,CRC Press,Boca Raton,Fla.(1998)、Katzunq,Basic &Clinical Pharmacology,8th ed.Lange Medical Books/McGraw−Hill Medical Pub.Division:New York(2001)、Remington et al.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,15th ed.Mack Pub.Co.:Easton,Pa.(1975)、およびSpeight et al.,Avery’s Drug Treatment:A Guide to the Properties,Choice,Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management,4th ed.Adis International:Auckland/Philadelphia(1997)、Dutch et al.,Toxicol.Leu.,100−101,255−263(1998)を参照されたい。

本開示の主題の組成物を対象に投与するための好適な方法としては、全身投与、非経口投与(血管内投与、筋肉内投与、動脈内投与を含む)、経口送達、頬側送達、皮下投与、吸入、気管内設置、外科的移植、経皮送達、局所注射、および高速注射/衝撃が挙げられるが、これらに限定されない。該当する場合、連続注入は標的部位での薬剤蓄積を増強することができる(例えば、米国特許第6,180,082号を参照されたい)。

本開示の主題の方法に従って使用される薬剤投与の特定の様式は、用いられる薬剤および/または担体、治療される状態の重症度、ならびに投与後の活性剤の代謝または除去についての機序を含むがこれらに限定されない種々の因子に依存する。

いくつかの実施形態では、1つ以上の追加の治療薬は、NO放出バイオポリマーとの組み合わせで使用することができる。このような追加の薬剤は、NO放出バイオポリマーを含む製剤の一部であり得るか、またはNO放出バイオポリマーを含む製剤の前、後、または同時に(並行して)別個の製剤として投与され得る。このような追加の治療薬は、特に、抗癌治療薬、抗菌薬、鎮痛薬、抗炎症薬、血管拡張薬、および免疫抑制薬、ならびに治療されている疾患または状態の軽減を増強し得る何らかの他の知られている治療薬を含む。「並行して」とは、複合効果を生み出すために同時にまたは十分に時間的に近いことを意味する(すなわち、並行してとは、同時であり得るか、または互いの前後の短時間内に発生する2つ以上の事象であり得る)。いくつかの実施形態では、2つ以上の化合物を「並行して」投与することは、一方の存在がもう一方の生物学的効果を変化させる時間において十分近くで2つの化合物が投与されることを意味する。2つの化合物は、同じかもしくは異なる製剤中で、または連続的に投与することができる。並行投与は、投与前に化合物を混合することによって、または例えば、同じ時点であるが異なる解剖学的部位でもしくは異なる投与経路を使用して、2つの異なる製剤中で化合物を投与することによって実施することができる。

NO放出バイオポリマーとの組み合わせにおいて使用される追加の治療薬の選択は、対象の疾患の種類、年齢、および全般的な健康状態、疾患進行の攻撃性、ならびに組み合わせを含む薬剤に耐容する対象の能力を含むがこれらに限定されない種々の因子によるであろう。

「抗腫瘍」剤または「化学療法剤」とも記載されている様々な化合物を、がんの治療に使用される本開示のNO放出バイオポリマーと組み合わせて使用することができる。そのような化学療法化合物には、アルキル化剤、DNAインターカレーター、タンパク質合成阻害剤、DNAまたはRNA合成の阻害剤、DNA塩基類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤、ならびにテロメラーゼ阻害剤またはテロメアDNA結合化合物が含まれるが、これらに限定されない。例えば、好適なアルキル化剤には、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩;ベンゾジゼパ、カルボコン、メテュデパ、およびウレデパなどのアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミンなどのエチレンイミンおよびメチルメラミン;クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、およびウラシルマスタードなどの窒素マスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソ尿素が含まれる。

がんの治療に使用される抗生物質には、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、硫酸ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、およびストレプトゾシンが含まれる。化学療法の代謝拮抗剤には、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル(5−FU)、フロクスウリジン、シタラビン、ペントスタチン、メトトレキサート、およびアザチオプリン、アシクロビル、アデニンβ−1−D−アラビノシド、アメトプテリン、アミノプテリン、2−アミノプリン、アフィジコリン、8−アザグアニン、アザセリン、6−アザウラシル、2’−アジド−2’−デオキシヌクレオシド、5−ブロモデオキシシチジン、シトシンβ−1−D−アラビノシド、ジアゾオキシノルロイシン、ジデオキシヌクレオシド、5−フルオロデオキシシチジン、5−フルオロデオキシウリジン、ならびにヒドロキシ尿素が含まれる。

化学療法のタンパク質合成阻害剤には、アブリン、アウリントリカルボン酸、クロラムフェニコール、コリシンE3、シクロヘキシミド、ジフテリア毒素、エデインA、エメチン、エリスロマイシン、エチオニン、フッ化物、5−フルオロトリプトファン、フシジン酸、グアニリルメチレンジホスホン酸塩およびグアニリルイミド二リン酸塩、カナマイシン、カスガマイシン、キロマイシン、およびO−メチルスレオニンが含まれる。追加のタンパク質合成阻害剤には、モデシン、ネオマイシン、ノルバリン、パクタマイシン、パロモマイシン、ピューロマイシン、リシン、志賀毒素、ショードマイシン、スパルソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チオストレプトン、およびトリメトプリムが含まれる。硫酸ジメチル、マイトマイシンC、窒素マスタードおよび硫黄マスタードなどのアルキル化剤;アクリジン色素、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アントラセン、ベンゾピレン、エチジウムブロマイド、プロピジウムジヨード撚り合わせなどのインターカレーション剤;ならびにジスタマイシンおよびネトロプシンなどの薬剤を含む、DNA合成阻害剤は、本開示のがん治療の一部として使用され得る。クメルマイシン、ナリジキシン酸、ノボビオシン、およびオキソリン酸などのトポイソメラーゼ阻害剤;コルセミド、コルヒチン、ビンブラスチン、およびビンクリスチンを含む細胞分裂阻害剤;ならびにアクチノマイシンD、α−アマニチンおよび他の真菌アマトキシン、コルジセピン(3’−デオキシアデノシン)、ジクロロリボフラノシルベンズイミダゾール、リファンピシン、ストレプトバリシン、およびストレプトリジジンを含むRNA合成阻害剤もまた、好適な癌治療を提供するためにNO放出バイオポリマーと組み合わせることができる。

したがって、本記載されるNO放出バイオポリマーと組み合わせて使用され得る本発明の化学療法剤には、アドリマイシン、5−フルオロウラシル(5FU)、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン−D、マイトマイシン、シスプラチン、過酸化水素、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、チロラムブシル、ビスルファン、ニトロ尿素、ダクチノマイシン、デュアノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ピルコマイシン、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチムン、ビンブラスチン、およびメトトレキサートなどが含まれる。

本明細書で使用される場合、「抗菌薬」という用語は、細菌、真菌、酵母、またはウイルスを死滅させるか、これらの成長を阻害するか、またはこれらの成長を防止する何らかの薬剤を指す。微生物感染症の治療または予防を支援するために本開示のNO放出バイオポリマーへと組み込むことができる好適な抗菌薬としては、バンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、およびアミカシンなどの抗生物質が含まれるが、これらに限定されない。他の抗菌薬には、2−p−スルファニリアニリノエタノール、4,4’−スルフィニルジアニリン、4−スルファニルアミドサリチル酸、アセジアスルホン、アセトスルホン、アミカシン、アモキシシリン、アンホテリシンB、アンピシリン、アパルシリン、アピシクリン、アプラマイシン、アルベカシン、アスポキシリン、アジダンフェニコール、アジスロマイシン、アズトレオナム、バシトラシン、バンベリマイシン(複数可)、ビアペネム、ブロジモプリム、ブチロシン、カプレオマイシン、カルベニシリン、カルボマイシン、カルモナム、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セフブペラゾン、セフクリジン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメット、セフィキシム、セフメノキシム、セフィニノク、セホジジム、セホニシド、セホペラゾン、セホラニド、セホタキシム、セホテタン、セホチアム、セフゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキサジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフトリアキソン、セフゾナム、セファレキシン、セファログリシン、セファロスポリンC、セフラジン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、リン酸クリンダマイシン、クロモサイクリン、コリスチン、シクラシリン、ダプソン、デメシサイクリン、ジアチモスルホン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、エノキサシン、エンビオマイシン、エピシリン、エリスロマイシン、フロモキセフ、ホルチミシン(複数可)、ゲンタミシン(複数可)、グルコスルホンソラスルホン、グラミシジンS、グラミシジン(複数可)、グレパフロキサシン、グアメシクリン、ヘタシリン、イミペネム、イセパミシン、ジョサマイシン、カナマイシン(複数可)、ロイコマイシン(複数可)、リンコマイシン、ロメフロキサシン、ルセンソマイシン、リムシクリン、メクロシクリン、メロペネム、メタサイクリン、ミクロノミシン、ミデカマイシン(複数可)、ミノサイクリン、モキサラクタム、ムピロシン、ナジフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ノルフロキサシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、p−スルファニリルベンジルアミン、パニペネム、パロモマイシン、パズフロキサシン、ペニシリンN、ピパシクリン、ピペミド酸、ポリミキシン、プリマイシン、キナシリン、リボスタマイシン、リファミド、リファンピン、リファマイシンSV、リファペンチン、リファキシミン、リストセチン、リチペネム、ロキタマイシン、ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、ロキシトロマイシン、サラゾスルファジミジン、サンサイクリン、シソマイシン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スクシスルホン、スルファクリソイジン、スルファロクス酸、スルファミドクリソイジン、スルファニル酸、スルホキソン、テイコプラニン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チアゾスルホン、チオストレプトン、チカルシリン、チゲモナム、トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、トロスペクトマイシン、トロバフロキサシン、ツベルアクチノマイシン、およびバンコマイシンなどの抗菌薬が含まれる。抗菌薬には、アムホテリシンB、アザセリン、カンジシジン(複数可)、クロルフェネシン、デルマスタチン(複数可)、フィリピン、フジクロミン、メパルチリン、ナイスタチン、オリゴマイシン(複数可)、ペリマイシンA、ツベルシジン、イミダゾール、トリアゾール、およびグリエソフルビンなどの抗真菌薬も含まれ得る。

いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーはポリマーフィルムに組み込まれ得る。このような組み込みは、NO放出バイオポリマーをポリマー表面に物理的に埋め込むことを通して、ポリマー表面へのNO放出バイオポリマーの静電的会合を介して、またはポリマー表面上の反応基へのNO放出バイオポリマーの共有結合によってなされ得る。あるいは、NO放出バイオポリマーは、液体ポリマー前駆体の溶液に混合することができ、ポリマーが硬化されたときにポリマーマトリックス中に捕捉され得る。重合性基を使用してNO放出バイオポリマーをさらに官能化することもでき、その際、NO放出バイオポリマーは重合過程中にポリマーへと共重合され得る。NO放出バイオポリマーを組み込むことができる好適なポリマーには、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、およびポリビニリデンなどのポリオレフィン、ならびにポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタンなどが含まれる。特に、ポリウレタンには医学的にセグメント化されたポリウレタンが含まれ得る。医学的にセグメント化されたポリウレタンはまた、ポリマーに追加の長さまたは重量を加える、アルキレン鎖などの1つ以上のエキスパンダー部分も含み得る。このようなポリウレタンも概して無毒性である。医学的にセグメント化されたポリウレタンの一例はTECOFLEX(登録商標)である。

NO放出バイオポリマーを含むポリマーフィルムを使用して、様々な物品、特に外科用器具、生体センサ、および医療用インプラントを被覆し、血小板粘着を防止し、細菌感染を防止し、または血管拡張剤として作用することができる。これらの物品は、脈管医療装置、泌尿器科医療装置、胆管医療装置、消化管医療装置、手術部位に配置するのに適した医療装置、および皮膚の創傷または開口部に配置するのに適した医療装置における使用に関するものであり得る。したがって、ポリマーを使用して、動脈ステント、誘導ワイヤ、カテーテル、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護用メッキ、股関節および関節置換物、リード線、バイオセンサ、プローブ、縫合糸、外科用ドレープ、創傷包帯、ならびに包帯を被覆することができる。

いくつかの実施形態では、被覆される装置は、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、チタン、アルミニウム、銅、金、銀、白金、およびこれらの組み合わせなどの金属表面を有することができる。いくつかの実施形態では、NO放出バイオポリマーを含むフィルムまたはポリマーを使用して、ガラスまたは繊維(例えば、布または紙)などの非金属表面を被覆することができる。

さらに、NO放出バイオポリマーを含むポリマーを使用して、装置自体を形成することができる。例えば、ポリマーは、血液もしくは組織のための貯蔵用バッグへと、または創傷被覆材として作り上げられ得る。

バイオフィルムを防止または破壊するためにNO放出バイオポリマーに接触させることができる表面には、医療装置、配管器具、コンデンサコイル、光学表面、ボート船体、および航空機からなる群から選択されるものが含まれる。他の非限定的な例としては、カウンタートップ、窓、電気器具、硬質の床、敷物、浴槽、シャワー、鏡、トイレ、ビデ、浴室備品、流し台、冷蔵庫、電子レンジ、小型キッチン家電、テーブル、椅子、キャビネット、引き出し、ソファ、ラブシート、ベンチ、ベッド、スツール、戸棚、チェスト、ドレッサー、飾り戸棚、時計、ビュッフェ、シェード、シャッター、娯楽センター、アームレール、ランプ、手すり、書庫、キャビネット、机、ドア、棚、カウチ、カート、ピアノ、彫像および他の芸術品、ラック、ファン、照明器具、ビリヤード台、卓球台、サッカー台、カード台、器具(例えば、手動式および/または携帯型器具、電気器具、空力器具など)、電話、ラジオ、テレビ、ステレオ機器、CDおよびDVDプレーヤ、アナログおよびデジタルサウンドデバイス、パームコンピュータ、ラップトップコンピュータ、デスクトップおよびタワーコンピュータ、コンピュータモニター、mp3プレーヤ、メモリストレージデバイス、カメラ、カムコーダ、車両表面(例えば、フロントガラス;タイヤ;金属、グラスファイバー、複合材料および/またはプラスチックの外面;布地および/またはビニール外面;布地、ビニール、および/または革の内装面;金属、プラスチック、木材および/または複合材料の内装面、ガラスの内装面など)、自転車、スノーモービル、オートバイ、オフロード車、庭手入れ用機器、農機、洗浄設備(例えば、パワーワッシャーなど)、塗装機器(例えば、電気および空圧式の塗装機器など)、医療用および/または歯科用機器、海洋機器(例えば、手漕ぎボート、動力付きボート、いかだ、セイルボード、カヌー、ロウボートなど)、玩具、筆記用具、腕時計、額入りの写真または絵画、本などが挙げられる。1種類以上の液体を表面から流れ出させ、表面に吸収させないように、かつ/または表面に染み込ませないようにすることが望ましい、いかなる表面も、基材であり得る。例えば、表面は環境条件に曝露されている表面であり得る。さらなる実施形態では、表面は、体組織または体液に接触する医療装置など、微生物付着のための場所となり得る表面であり得る。

血管または他の体腔を通る動きに適したカテーテルのような医療装置は、典型的には、低摩擦の外面を備えている。医療装置の表面が低摩擦表面ではない場合、装置を体腔内に挿入したり、体腔から取り外したりすることがより困難となり、体組織の損傷または炎症が起こる可能性がある。低摩擦表面は、例えば、患者の活動の結果として、特定の長期間の装置(例えば、長期間のカテーテル)と周囲の組織との間の移動の結果として生じ得る不快感および損傷を減少させるためにも有益である。医療装置は、様々な移植型および挿入型医療装置(本明細書では「内部医療装置」とも呼ばれる)を含む。このような医療装置の例としては、流体(例えば、薬物含有流体、膨張流体などの加圧流体、体液、造影剤、熱い媒体または冷たい媒体など)の送達または除去を包含する装置、ならびに心臓、動脈(例えば、冠状動脈、大腿動脈、大動脈、腸骨動脈、頸動脈および椎骨脳底動脈)および静脈などの心血管系の管腔、尿道(前立腺部尿道を含む)、膀胱、尿管、膣、子宮、精管およびファロピー管などの尿路性器系の管腔、鼻涙管、耳管、気管、気管支、鼻道および副鼻腔などの気道の管腔、食道、腸、十二指腸、小腸、大腸、直腸、胆管系および膵管系などの消化管の管腔、リンパ系の管腔、主要体腔(腹腔、胸腔、心膜腔)などを含む広範な範囲の体腔の中への、かつ/または体腔を通じての挿入のための装置が挙げられる。内部医療装置の非限定的な具体例としては、バルーンおよびそのための膨張チューブを含む脈管カテーテル(例えば、バルーンカテーテル)、加水分解カテーテル、誘導ワイヤ、プルバックシース、フィルタ(例えば、大静脈フィルタ)、左心室補助装置、全人工心臓、注射針、薬物送達管、排液管、胃腸管および結腸鏡管、内視鏡装置、気道管などの気管内装置、尿道カテーテルおよび尿管ステントなどの尿路用装置、ならびにカテーテルおよびワイヤ、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護用メッキ、関節置換物、リード線、バイオセンサ、プローブ、縫合糸、外科用ドレープ、創傷包帯、ならびに包帯などの神経区域のための装置が挙げられる。本発明による多くの装置は、中実および中空の両方の円筒形状を含む、円筒形状の1つ以上の部分を有する。

固体基材材料は、ポリマー材料などの有機材料(例えば、50重量%以上の有機種を含有する材料)、ならびに金属材料(例えば、金属および金属合金)および非金属材料(例えば、炭素、半導体、ガラスおよびセラミックを含み、とりわけ、種々の金属酸化物および非金属酸化物、種々の金属窒化物および非金属窒化物、種々の金属炭化物および非金属炭化物、種々の金属ホウ化物および非金属ホウ化物、種々の金属リン酸塩および非金属リン酸塩、ならびに種々の金属硫化物および非金属硫化物を含有し得る)などの無機材料(例えば、50重量%以上の無機種を含有する材料)を含むことができる。非金属無機材料の具体例は、以下のうちの1つ以上を含む材料であり得る:酸化アルミニウムおよび遷移金属酸化物(例えば、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、モリブデン、タングステン、レニウム、およびイリジウムの酸化物);ケイ素;窒化ケイ素、炭化ケイ素および酸化ケイ素を含有するものなどのケイ素系セラミック(時にガラスセラミックとも呼ぶ);リン酸カルシウムセラミックス(例えば、ヒドロキシアパタイト);炭素;窒化炭素などの炭素系のセラミック様材料。

さらに、NO放出バイオポリマーは、抗菌石鹸などであるがこれに限定されない洗剤に組み込まれ得る。例えば、バーソープに埋め込まれたポリグルコサミンからのNO放出は、水との接触および/または使用時のpHの低下によって誘起され得る。バーの外面が侵食または溶解されるにつれ、バー表面内の追加のポリグルコサミンは、その後のバーの使用のために露出されるようになる。NO放出バイオポリマーはまた、液体石鹸に懸濁することもできる。このような石鹸または洗剤は、個人衛生のために、または繊維のための抗菌処理を提供するために使用することができる。このような石鹸または洗剤を使用して、細菌、真菌、またはウイルスなどの微生物に曝露される可能性がある家庭用品の表面または病院もしくは他の医療環境におけるいずれかの表面を処理することもできる。

「生体適合性」という用語は、本明細書では、特定の量で患者に投与されたときに、毒性または望ましくない副作用を誘発しない有機溶媒を指す。

製剤はそれらのすべての薬学的に許容される塩形態を含む。このような塩の例としては、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基から誘導されるものが挙げられる。好適な酸塩の例としては、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモアート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアナート、トシラート、およびウンデカノアートが挙げられる。シュウ酸などの他の酸は、それ自体は薬学的に許容され得ないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に用いられ得る。

適切な塩基に由来する塩としては、限定されないが、アルカリ金属(例えば、ナトリウム、カリウム)、アルカリ土類金属(例えば、マグネシウムおよびカルシウム)、アンモニウムおよびN−(アルキル)₄⁺塩が挙げられる。

NO放出バイオポリマー(例えば、NO放出ポリグルコサミン)はまた、その中に任意の塩基性窒素含有基の四級化を有するものも含む。

本明細書における考察は、単純化のために、立体異性を参照せずに提供される。本明細書に記載されるバイオポリマーは、1つ以上の不斉中心を含む可能性があり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一の光学異性体、個々のジアステレオマー、ならびにジアステレオマー混合物として生じ得る。これらの化合物のすべてのこのような異性体は、本発明に明白に含まれる。

キトサンは、粘膜付着性を含む好ましい特性を保有している可能性がある(Grenha,A.,et al.,Journal of Drug Delivery Science and Technology,20,33−43(2010)、Dash,M.,et al.,Progress in Polymer Science,36,981−1014(2011))、biodegradability(Grenha,A.,et al.,Journal of Drug Delivery Science and Technology,20,33−43(2010)、Kean,T.,et al.,Adv.Drug Delivery Rev.,62,3−11(2010))、およびlow cytotoxicity(Grenha,A.,et al.,Journal of Drug Delivery Science and Technology,20,33−43(2010))。キトサンの正に帯電したアミンとムチンの負に帯電したシアル酸残基との間の静電相互作用(Grenha,A.,et al.,Journal of Drug Delivery Science and Technology,20,33−43(2010)、Menchicchi,B.,et al.,Biomacromolecules,15,3550−3558(2014)、Sogias,I.A.,et al.,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008))は、気道内のキトサンの保持を増強し、したがって作用時間を増加させると考えられている(Grenha,A.,et al.,Journal of Drug Delivery Science and Technology,20,33−43(2010)、Klinger−Strobel,M.,et al.,Expert Opinion on Drug Delivery,1−24(2015))。キトサンは、肺への抗生物質放出粒子の送達を促進し、それらの有効性を改善することが報告されている(Manca,M.−L.,et al.,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,62,220−231(2008)、Park,J.−H.,et al.,International Journal of Pharmaceutics,441,562−569(2013)、Jain,D.and Banerjee,R.,Journal of Biomedical Materials Research Part B:Applied Biomaterials,86,105−112(2008)、Osman,R.,et al.,International Journal of Pharmaceutics,449,44−58(2013)、Ungaro,F.,et al.,Journal of Controlled Release,157,149−159(2012))。しかしながら、粘膜付着は、粘液への薬物浸透に潜在的に影響を及ぼす可能性がある。Klinger−Strobelらは、ヒト頸膣部の粘液(Suk,J.S.,et al.,Nanomedicine,6,365−375(2011)、Tang,B.C.,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences,106,19268−19273(2009))、細菌バイオフィルム(Forier,K.,et al.,Nanomedicine,8,935−949(2013))、およびCF唾液(Suk,J.S.,et al.,Nanomedicine,6,365−375(2011)、Tang,B.C.,et al.,P.N.A.S.,106,19268−19273(2009)、Forier,K.,et al.,Nanomedicine,8,935−949(2013)、Suk,J.S.,et al.,Biomaterials,30,2591−2597(2009))上でのより良好な薬効を促進するために、キトサンをポリエチレングリコール(PEG)(Klinger−Strobel,M.,et al.,Expert Opinion on Drug Delivery,1−24(2015))で修飾する利点を記載した。

NOも強力な抗菌剤であるため(Reighard,K.P.and Schoenfisch,M.H.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,59,6506−6513(2015)、Reighard,K.P.,et al.,Biofouling,31,775−787(2015)、Lu,Y.,et al.,Biomaterials,35,1716−1724(2014)、Carpenter,A.W.and Schoenfisch,M.H.Chemical Society Reviews,41,3742−3752(2012)、Seabra,A.B.,et al.,Biotechnology Advances,33(6),1370−1379(2015)、Jones,M.L.,et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,88,401−407(2010)、Deppisch,C.,et al.,Infection,44(4),513−520(2016))、本明細書に記載されているキトサンオリゴ糖は、CFを治療するための抗菌剤および粘液溶解剤として、NO放出キトサンオリゴ糖の二重作用の可能性を有し得る。プランクトンおよびバイオフィルムベースの培養物におけるCF関連Pseudomonas aeruginosaに対するNO放出キトサンオリゴ糖の殺菌作用が報告されている(Reighard,K.P.,et al.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,59,6506−6513(2015)、Reighard,K.P.,et al.,Biofouling,31,775−787(2015))。一酸化窒素の広域スペクトル抗菌作用により、特定の実施形態では、本明細書に記載される主題は、多くの細菌が耐性を発達させた従来の抗生物質の代替物となる。

いくつかの実施形態では、本開示の一酸化窒素(NO)放出バイオポリマーは、抗生物質特性を有し、ムチンのサイズを縮小し、三次元ムチンネットワークを損傷させることによって、CF唾液の粘弾性も減少させる。他の実施形態では、本明細書に開示される主題は、粘液栓への直接送達のための粘膜付着性足場からのNO放出の利点を確立している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるキトサンオリゴ糖足場の粘液接着特性は、NOの効力を著しく増強することができる。実施形態では、本明細書に開示される主題は、治療作用に必要なNO用量を減少させ得ると同時に、他のNO媒介プロセスに対する任意の潜在的な影響を軽減することができる。

実施形態では、一酸化窒素(NO)放出キトサンオリゴ糖は、アクリレート官能基で修飾されている。実施形態では、足場の粘液接着性の性質は、ヒト気管支上皮細胞培養物、および嚢胞性線維症(CF)患者から収集された臨床唾液試料からのムチンを分解するNOの能力に影響を与える。アガロースゲル電気泳動実験は、特定の実施形態では、粘膜付着性のNO放出キトサンオリゴ糖は精製ムチンおよび唾液の両方を分解したが、対照足場(NO放出または粘膜付着性リガンドを有しない)はムチン構造に影響を与えなかったことを示している。粘膜付着性NO放出キトサンオリゴ糖の特定の実施形態で処理された唾液の顕微鏡観察により、ムチンおよびDNAネットワークの分解が確認された。実施形態では、粘膜付着性NO放出キトサンで処理すると、唾液の粘度および弾性が減少し、粘液溶解剤としてのNO放出足場の有用性が示された。

実施形態では、本開示の一酸化窒素(NO)放出ポリグルコサミンは、水溶性であり、調整可能であり得る。これらの特性は、例えば、嚢胞性線維症の治療において水溶性治療が有利である治療および/または疾患状態において、本開示のポリグルコサミンの有用性に寄与し得る。本開示の官能化NO放出ポリグルコサミンが保有し得る既知のNO放出粒子を超える他の利点には、以下が含まれる。1.キトサンオリゴ糖に二級アミン含有側鎖をグラフトすることによる、明確な合成経路および化学組成。2.NO貯蔵およびNO放出動態の調整可能性は利点である。アジリジン側鎖上の二級アミンの数を調整することによって、NO貯蔵を制御することができる。実施形態では、異なる疎水性/親水性の化合物による、得られた材料上のアミンの官能化により、NO放出動態を超える制御が可能になる。他の実施形態では、本開示の官能化ポリグルコサミンによって、より大きなNO貯蔵が得られた。3.粒子とは対照的に、本明細書に記載される官能化ポリグルコサミンは水溶性であり、水溶性が望まれる生物医学的用途を含む、より広範な範囲の用途を容易にする。以前に開示されたNO放出キトサン(US6,451,337)は水溶性ではない。他の実施形態では、本開示の水溶性官能化オリゴ糖は、バイオフィルムに浸透し、これらを根絶することができる。 本発明は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。

実施例1 この研究では、足場粘膜付着がNOの粘液溶解作用に及ぼす影響を理解するために、同等のNO放出特性を維持しながら粘膜付着特性を制御する官能基でキトサンオリゴ糖を修飾した。

実験的 物質および方法 中分子量キトサン(粘度200〜800センチポアズ)、2−メチルアジリジン、アクリル酸エチル、アクリル酸tert−ブチル、アクリル酸スルホプロピルカリウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ジチオトレイトール(DTT)、ウシ血清アルブミン(BSA)、およびII型胃ブタムチン(GPM)は、Sigma−Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)から購入した。一酸化窒素ガスは、Praxair(米国ノースカロライナ州サンフォード)から購入した。アルゴン(Ar)、NO較正(26.85ppm、N₂平衡)、および窒素(N₂)ガスは、Airgas National Welders(米国ノースカロライナ州ダラム)から購入した。ナトリウムメトキシドは、Acros Organics(ベルギー国ヘール)から購入した。

Tris−acetate−EDTA(TAE)緩衝液(10倍)は、Mediatech,Inc.(米国バージニア州マナッサス)から購入し、使用前に蒸留水で1:10に希釈した。クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液(20倍)は、Promega Corporation(米国ウィスコンシン州マディソン)から購入し、1:5に希釈して4倍のSSC緩衝液を得た。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、1倍)は、Life Technologies(米国カリフォルニア州カールズバッド)から購入した。粉ミルク(Drink’n Mix)は、Walmart(米国ノースカロライナ州ダラム)から購入した。中性緩衝ホルマリン(NBF、10体積%)は、Sigma Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)から購入した。リン酸緩衝液(10mM、pH6.5)およびリン酸緩衝生理食塩水(10mM、pH6.5)は、一般的な実験用塩および試薬を使用して社内で調製した。

抗MUC5B抗体(H−300)は、Santa Cruz Biotechnology(米国テキサス州ダラス)から購入した。抗MUC5AC抗体(45M1)は、Abcam(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)から購入した。二次抗体(IRDye 800CW Donkey anti−Mouse IgGおよびIRDye 680RD Donkey anti−Rabbit IgG)は、LI−COR Biosciences(米国ネブラスカ州リンカーン)から購入した。4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩化水素化物(DAPI)は、Life Technologies(米国カリフォルニア州カールズバッド)から購入した。

蒸留水は、Millipore Milli−Q UV Gradient A−10システム(米国マサチューセッツ州ベッドフォード)を使用して精製した。一般的な実験室の塩および溶媒のすべては、Fisher Scientific(米国ペンシルベニア州ピッツバーグ)から購入した。特に指定されない限り、すべての材料は、さらに精製することなく使用した。

粘液を含む培養洗浄液は、以前に記載されるように、CFを有する患者の初代ヒト気管支上皮(HBE)細胞培養物から収集された(Hill,D.B.and Button,B.,“Establishment of respiratory air−liquid interface cultures and their use in studying mucin production,secretion,and function.”Methods Mol.Biol.,Humana Press,Chpt.15,pp.245−258(2012))。簡単に言えば、過剰な外科組織(UNC−Chapel Hill Tissue Core Facility)から得られた初代細胞培養物を、気液界面培地(UNC Chapel Hill Tissue Core Facility)中の0.5mmの気孔径のMillicell細胞培養物インサート(米国マサチューセッツ州ベッドフォードMillipore)上で、培養物が繊毛、ならびに明確な繊毛周囲液(PCL)および粘液層を発達させるまで、最低6週間成長させた。2日間の粘液の蓄積後、培養面積1cm²あたり150μLのPBSを加えることによって、洗浄液を収集した。その後、これらの洗浄液を、分析のためにキトサンオリゴ糖で直ちに処理した。

自然吐出物によってCF患者から唾液試料を収集した。使用するまで試料を−20℃の滅菌容器に貯蔵した。

2−メチルアジリジン修飾キトサンオリゴ糖の合成 以前に記載されるように、ポリマーキトサンは、酸化的にキトサンオリゴ糖に分解された(Lu,Y.,et.al.,Biomaterials,35,1716−1724(2014))。中分子量キトサン(2.5g)を、15重量%の過酸化水素(50mL)に溶解し、85℃で1時間撹拌した。不溶性の非分解キトサンを濾過によって除去した。アセトンでの沈殿により、水溶性オリゴ糖を収集し、エタノールで十分に洗浄し、真空で乾燥させた。Ubbelohde粘度計を使用して、25℃で塩化ナトリウム(0.20M)および酢酸(0.10M)の溶液中のキトサンオリゴ糖の粘度を測定した。分子量は、古典的なMark−Houwink方程式(η=1.81×10⁻³M^0.93)を使用して、4.41±0.04kDと計算された(Maghami,G.G.and Roberts,G.A.,Die Makromolekulare Chemie,189,195−200(2000))。

次に、水溶性キトサンオリゴ糖を2−メチルアジリジンで修飾した(スキーム1)。キトサンオリゴ糖(0.50g)を撹拌水(10.00mL)に溶解した。次に、塩酸(12.1M、27.5μL)、水(250μL)、および2−メチルアジリジン(178μL、未修飾キトサンオリゴ糖の一級アミンに対するモル比が1:1)をこの溶液に加え、25℃で5日間かつ85℃で24時間撹拌し続けた。得られた2−メチルアジリジン修飾キトサンオリゴ糖(COS)をアセトンで沈殿させ、メタノールで洗浄して、過剰の2−メチルアジリジンを除去し、真空乾燥させた。

スキーム1は、2−メチルアジリジンによるキトサンオリゴ糖の修飾、およびその後のアクリレートによる官能化を図示する。

キトサンオリゴ糖のアクリレート修飾 COSの粘膜付着特性は、アミノ基へのアクリレートのマイケル付加によって変化した(スキーム1)。アクリル酸エチル(EA、2.08mL)およびアクリル酸tert−ブチル(TBuA、2.78mL)を、水(6.00mL)、メタノール(14.00mL)、水酸化アンモニウム(1.00mL)の溶液中のCOS(500mg)に加えた。SPAは水溶性であるため、スルホプロピルアクリレート(SPA)を加えるための反応溶媒からメタノールを除外した。より具体的には、水(20.00mL)および水酸化アンモニウム(1.00mL)の溶液中のCOS(500mg)にSPA(4.43g)を加えた。10倍モル過剰のアクリレート(対一級アミン)をすべての反応に使用して、アクリレートの添加を最大化した。室温で72時間撹拌した後、アクリレート修飾COSをアセトンで沈殿させ、遠心分離により収集し、メタノールで洗浄して過剰な試薬を除去した。SPA生成物をエタノールで十分に洗浄した。得られたEA−、TBuA−、およびSPA−修飾COS(それぞれ、COS−EA、COS−TBuA、およびCOS−SPA)を一晩真空乾燥し、室温で貯蔵した。¹H NMRスペクトルにおけるビニルプロトンの消失によって、生成物からの未反応アクリレートの除去を検証した。¹H NMR(Bruker 400MHz DRX分光計)によって、アクリレート修飾COSを特性評価して、置換度および生成物の純度を判定した。代表的な¹H NMRピークは以下のとおりであった。 COS:1H NMR(D₂O、400MHz):δ−0.8〜1.1(br、3H)、1.9(s、3H)、2.3〜2.9(br、4H)、3.3〜4.0(br、5H)、4.4(s、1H)。 COS−EA:1H NMR(D₂O、400MHz):δ−0.8〜1.1(br、6H)、1.9(s、3H)、2.3〜2.9(br、4H)、3.3〜4.0(br、5H)、4.1(s、2H)、4.4(s、1H)。 COS−TBuA:1H NMR(D₂O、400MHz):δ−0.8〜1.1(br、12H)、1.9(s、3H)、2.3〜2.9(br、4H)、3.3〜4.0(br、5H)、4.4(s、1H)。 COS−SPA:1H NMR(D₂O、400MHz):δ−0.8〜1.1(br、6H)、1.9(s、3H)、2.3〜2.9(br、4H)、3.3〜4.0(br、5H)、4.1(s、2H)、4.4(s、1H)。 脱アセチル化および置換度を判定するために使用される計算、およびFT−IR特性評価データは、実施例12および図10A〜Dに提供されている。

NO放出キトサンオリゴ糖の合成 NO貯蔵および放出を付与するために、N−ジアゼニウムジオレートNOドナーが、COSおよびアクリレート修飾COSの二級アミン上に形成された(Lu,Y.,et al.,Biomaterials,35,1716−1724(2014))。修飾キトサンオリゴ糖(15mg)を、撹拌棒を備えた1ドラムバイアル中の水(300μL)、メタノール(700μL)、および5.4Mナトリウムメトキシド(25μL)の溶液に溶解した。開いたバイアルを160mLのParr汎用ステンレス鋼圧力容器に入れ、激しく撹拌した。アルゴン(10秒、8bar)で3回パージし、続いて3回のより長いアルゴンパージ(10分、8bar)を行うことによって、反応容器から酸素を除去した。次に、容器を室温で72時間、水酸化カリウムで精製したNOガス(10bar)で充填した。その後、アルゴンパージ手順を繰り返して、未反応のNO.N−ジアゼニウムドレート修飾キトサンオリゴ糖(COS−NO、COS−EA−NO、COS−TBuA−NO、およびCOS−SPA−NO)を除去し、アセトンで沈殿させ、遠心分離により収集して黄色の粉末を生成し、真空乾燥し、さらに研究するまで−20℃で貯蔵した。

NO放出の化学発光検出 NO放出を定量化するために、Sievers 280i化学発光一酸化窒素アナライザー(米国コロラド州ボールダー)を使用した。分析前に、NOゼロフィルタ(0ppmのNO)および26.8ppmのNO標準ガス(N₂平衡)を通過した空気を用いて、機器を較正した。N−ジアゼニウムジオレート修飾キトサンオリゴ糖(1.0mg)を、30mLの脱酸素化PBS(pH6.5)に37℃で浸漬し、放出されたNOは、N₂ガスによって流量80mL/分で検出器に運ばれた。追加のN₂流量を200mL/分で試料フラスコに供給して、機器の収集率に合わせた。NO濃度がCOS−NO 1mgあたり10ppb未満のNOに低下すると、分析が終了された。さらに、Perkin Elmer Lambda 40 UV/Vis分光計を使用して、50mMの水酸化ナトリウム中のすべての化合物の0.1mg/mL溶液のUV−Visスペクトルを得た。この塩基性溶液は、中性pHですぐに始まる望ましくないN−ジアゼニウムジオレートNOドナーの分解を回避するために使用された。

ムチンの濁度滴定 胃ブタムチン(960mg)を、4℃で18時間250mLの滅菌リン酸緩衝液(PB)に溶解した。ムチン懸濁液を遠心分離(1,500×g、4℃、0.5時間)して、不溶性成分を除去した。得られたムチン溶液を、使用前に最大1週間4℃の滅菌容器に貯蔵した。96ウェルプレート中に236μLの精製ムチン溶液と34μLのキトサンオリゴ糖溶液(滅菌PB中に3.6〜54.5mg/mL)とを合わせることによって、ムチンおよびアクリレート修飾キトサンオリゴ糖の溶液を調製した。ムチンおよびキトサン溶液を、37℃で1時間、穏やかに振盪しながら(100rpm)インキュベートし、その後、Thermoscientific Multiskan EXプレートリーダーを使用して540nmで吸光度を読み取った。COS−ムチン吸光度からキトサンオリゴ糖(すなわち、ムチンなし)の吸光度を差し引いた後、補正吸光度が得られた。

ムチン−キトサンオリゴ糖凝集体のゼータ電位 胃ブタムチン(10.0mg)を、4℃で18時間10.00mLの滅菌PBに溶解した。ムチン懸濁液を遠心分離(1,500×g、4℃、0.5時間)して、不溶性成分を除去した。得られたムチン溶液を、使用前に最大1週間4℃の滅菌容器に貯蔵した。修飾キトサンオリゴ糖固体をムチン溶液に加え、溶解するまでボルテックスし、37℃で1時間インキュベートした。ゼータ電位測定で使用される電気化学セルの腐食を防止するために、このアッセイでは低濃度のムチンおよびキトサンオリゴ糖を使用した。10mWのHeNeレーザー(633nm)および173°の角度のNIBS検出器を備えたMalvern Zetasizer Nano−ZSを使用して、ムチン−キトサン凝集体のゼータ電位(すなわち、表面電荷)を判定した。

ゲル電気泳動 キトサンオリゴ糖(COSおよびCOS−SPA)およびNO放出キトサンオリゴ糖(COS−NOおよびCOS−SPA−NO)またはDTT(20μL)の濃縮ストックを、HBE粘液(40μL)に加え、穏やかに撹拌して、室温で2時間穏やかに揺らしながらインキュベートした。CF唾液にはタンパク質分解酵素が含まれているため、インキュベーション時間を1時間に短縮して、試料の酵素分解を減少させた。

アガロースムチンゲル電気泳動 処理後、以前に記載されるように電気泳動によって試料を分離した(Ramsey,K.A.,et al.,Journal of Visualized Experiments,112,e54153(2016))。簡単に言えば、試料(40μL)を、80Vで90分間の電気泳動ムチン分離のために、1重量%のSDSを含む1倍のTAE緩衝液中の0.8重量%のアガロースゲルに装填した。その後、ゲルを、10mMのDTTで20分間還元した。ムチンを、4倍のSSC緩衝液中の真空(45mbar、1.5時間)によって、孔径0.45μmのニトロセルロース膜(Optitran BA−S 85膜、米国ニュージャージー州ピスカタウェイGE Healthcare Life Sciences)に移した。粉ミルク(DPBS中に3重量%)との非特異的相互作用を1時間ブロックした後、MUC5ACおよびMUC5B(3%のミルク中に0.1μg/mL)に対して一晩(3℃)生じた希釈一次抗体への曝露によって、ムチンを検出した。膜をDPBSで3回洗浄し(10分)、二次抗体で蛍光標識した(3重量%の粉ミルク中に0.2μg/mL、1時間、25℃)。その後、ゲルを再びDPBSで洗浄し、次に、LI−COR Odyssey CLx赤外線画像システム(米国ネブラスカ州リンカーンLI−COR Biosciences)を使用して分析した。Image J(米国メリーランド州ベゼスタ国立衛生研究所)を使用して、移動距離を定量化した。CF唾液試料については、PBS処理試料に対して移動距離を標準化して、不均一性の程度を大きくした。

共焦点顕微鏡検査 アガロースゲルに装填する前に、COS、COS−NO、COS−SPA、またはCOS−SPA−NOに曝露されたCF唾液試料(5μL)をガラス顕微鏡スライドに慎重に塗って、ムチンおよびDNAネットワークの機械的破壊を防止した。試料をNBF(10体積%)で固定し、DPBSで洗浄し、室温で1時間BSA(DPBS中に3重量%)でブロックした。免疫組織化学的検出によって、ムチンネットワークを視覚化した。まず、一次抗体溶液への曝露により、MUC5ACおよびMUC5Bを同定した(マウス抗MUC5ACおよびウサギ抗MUC5Bについてそれぞれ、0.4および0.2μg/mL)。スライドをDPBSで3回(10分)洗浄してから、二次抗体(それぞれ、1μg/mLのAlexa 488および594抗ウサギおよびマウス)およびDAPI(5μg/mL)に25℃で1時間曝露し、定量的測定を容易にした。次に、スライドをDPBSで洗浄し(10分)、Fluorsave(Calbiochem)で取り付けた。20倍の対物レンズを使用して、Olympus FV 1000(オリンパス、ハミルトン、バミューダ)で、共焦点画像を得た。

平行板レオロジー レオロジー測定のために、単一の時点で収集された1人のCF患者からの自然に吐出された唾液を使用した。COS−NOの濃縮溶液(27.8μL)を、250μLのアリコートの唾液に加えて、0、5、10、および20mg/mLの最終COS−NO濃度を達成した。唾液試料を、室温で1時間ゆっくりと回転させた。間隙の厚さが50mmに設定された直径20mmの平行板を備えたBohlin Geminiレオメーター(英国ウースターシャーMalvern Instruments)上で、単一周波数(1Hz)で0.025〜50Paの応力範囲で振幅掃引実験により、処理された試料のレオロジー特性を測定した。試料の脱水を最小限に抑えるために、23℃でレオロジー測定を行った。以前に報告された線形レジームから、弾性率(G’)および粘性率(G’’)を判定した(Seagrave,J.,et al.,Respiratory Research 2012,13,98)。すべての値が、処理された唾液試料の最低3つの別々に評価されたアリコートの平均の平均±標準誤差(SEM)として報告された。

統計学的分析 特に明記されない限り、すべての値が、3つ以上のプールされた実験の平均±標準偏差として報告された。両側スチューデントのt検定を使用して、統計的有意性を判定した。

脱アセチル化および置換度の計算 脱アセチル化度の計算 Ishiiから採用された以下の方程式に従って、過酸化水素での分解後のキトサンオリゴ糖の脱アセチル化度の計算を判定した(Ishii,D.,et al.,Green Chemistry,16(4),1764−1767(2014))。

I_メチルは、アセチル化単位からのプロトン(2.3ppm)を示し、I_H2−H6(3.5〜4.4)は、アセチル化単位および脱アセチル化単位の両方に見られるプロトンである。分解後、キトサンオリゴ糖を75%脱アセチル化した。

COS−EAの一級アミンの修飾%の計算

I_OCH2CH3がアクリル酸エチル修飾を表す4.1ppmの一重項である場合、I_OCH(CHNH2)Oは、すべてのモノマーの骨格に見られるプロトン(s、4.4ppm)であり、DDは、脱アセチル化度(0.75)である。この計算は、Sashiwaから採用された(Sashiwa,H.,et al.,Carbohydrate Research,338(6),557−561(2003))。

COS−TBuAの一級アミンの修飾%の計算

I_OCC3H9がtert−ブチルアクリレートの修飾を示す1.3ppmのブロードピークである場合、I_OCH(CHNH2)Oは、すべてのモノマーの骨格に見られるプロトンであり、DDは、脱アセチル化度(0.75)である。この計算は、Sashiwaから採用された。

COS−SPAの一級アミンの修飾%の計算

I_{OCH2CH2CH2SO3}が4.4ppmのスルホプロピルアクリレート修飾を示す4.4ppmの一重項である場合、I_OCH(CHNH2)Oは、すべてのモノマーの骨格に見られるプロトンであり、DDは、脱アセチル化度(0.75)である。この計算は、Sashiwaから採用された。

UV−VIS分析 Perkin Elmer Lambda 40 UV/Vis分光計を使用して、修飾キトサンオリゴ糖溶液のスペクトル(0.1mg/mL、pH6.5のPBS)を得た。NOガスへの曝露により、253nmの吸光度最大値で示されるように、N−ジアゼニウムジオレートが形成された(Hrabie,J.A.and Keefer,L.K.,Chemical Reviews,102(4),1135−1154(2002))。

ニトロソアミン形成(Wang,P.G.,et al.,Chemical Reviews,102(4),1091−1134(2002))を示す350nmの吸光度ピークは検出されなかった。結果を図9A〜9Dに示す。

リン酸緩衝生理食塩水中のGPMおよびキトサンオリゴ糖の濁度 キトサンオリゴ糖の粘膜付着に対する静電気の影響を判定するために、リン酸緩衝液(pH6.5)およびリン酸緩衝生理食塩水(pH6.5)で濁度測定を比較した。リン酸緩衝液への140mMの塩化ナトリウム(NaCl)の添加を除いて、上に記載されるようにアッセイを行った。リン酸緩衝生理食塩水に塩化ナトリウムを加えると、オリゴ糖とムチンとの間の静電的相互作用が最小限に抑えられた。COS−SPAを除くすべての修飾キトサンオリゴ糖について、NaClの添加により、キトサンオリゴ糖のムチンを凝集させる能力が減少した。ムチンを凝集させるこの能力の減少を、濁度の減少によってモニターする。注目すべきことに、4.5mg/mLを超える濃度では、COSおよびCOS−TBuAについて、キトサン−ムチン複合体の脱凝集による濁度の減少が観察された。この高濃度での分解は、粘膜付着性ポリマーの特性である(Sogias,I.A.,et al.,Biomacromolecules,9(7),1837−1842(2008))。結果を図12A〜12Dに示す。

結果 NO放出粘膜付着性キトサンオリゴ糖 キトサンの粘膜付着の性質は、静電的および疎水性相互作用、ならびにキトサンとムチンとの間の水素結合に由来すると考えられる。これらの相互作用のうち、キトサン上の正に帯電した一級アミンとムチン上の負に帯電したシアル酸および硫酸エステル基との間の静電引力が支配的である(Sogias,I.A.,et al.,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008))。SogiasおよびMencchicchiは、キトサンの一級アミンをアセチル基でブロックする(すなわち、キトサンの脱アセチル化を減少させる)と、溶液中のムチンと結合して凝集するその能力が減少することを示した。(Sogias,I.A.,et al,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008)、Menchicchi,B.,et al.,Biomacromolecules,15,3550−3558(2014))。

キトサンの粘膜付着がどのようにNO送達および有効性に影響するかを判定するために、3つの構造的に異なるアクリレート修飾を使用して、2−メチルアジリジン修飾キトサンオリゴ糖(COS)の一級アミンを立体的にブロックした(スキーム1)。プロペノエートは穏やかな合成条件下でキトサンに共有結合するため、修飾経路としてアクリレートを選択した。特定のアクリレート修飾も、それらの商業的入手可能性に基づいて選択した。アクリル酸エチルおよびアクリル酸tert−ブチルを比較して、立体バルクをエチル基からtert−ブチル基に増加させると、COSの粘膜付着の性質が変化するかどうかを判定した。粘膜付着を減少させるために、負に帯電したアクリレート(スルホプロピルアクリレート)を用いて、粘液を静電的にはじき、さらに一級アミンを立体的に妨害した。

COS足場へのアクリレートのマイケル付加に対する反応条件は、修飾効率に影響を与えるために変化された。50℃に加熱すると、アクリル酸エチルとキトサン骨格との間に副反応が生じるため、すべての反応は室温で実施された。COS上の一級アミン(RNH₃⁺、pKa約10)は、塩基性溶液(pH12)で脱プロトン化され、それによってアクリレートビニル基のβ炭素に対する反応性が高まる。このように、TBuAによるCOSの修飾は、pH7(すなわち、中性条件)での11±1%からpH12での83±15%まで改善される。これらの反応条件により、3つすべてのアクリレートについて同様の修飾の改善(約80〜98%)がもたらされた(表1)。一元配置分散分析で判定されるように、3つのアクリレートに対する修飾効率の違いは有意ではなかった(F(2,10)=1.42、p=0.31)。

NO貯蔵および放出を付与するために、N−ジアゼニウムジオレートNOドナーは、高圧NOガスへの曝露により、修飾キトサンオリゴ糖の二級アミン部位に形成された(Lu,Y.,et al.,Biomaterials,35,1716−1724(2014))。一酸化窒素の貯蔵は、一定の溶媒比(水:メタノールが3:7)およびすべての足場の塩基濃度を維持することによって調整され、未修飾COSおよびアクリレート修飾足場の両方に対して同様のNOペイロード([NO]_合計〜0.4μmol/mg)および放出動態(t_1/2〜30分)(表1)がもたらされる。N−ジアゼニウムジオレートからのNO放出は、局所官能基から与えられる電荷安定化または疎水性によって変化する可能性があるが(Riccio,D.A.and Schoenfisch,M.H.Chemical Society Reviews,41,3731−3741(2012))、アクリレートの修飾は材料の疎水性を有意に変化させず、同等のNO放出動態を提供した。理論に束縛されるものではないが、本明細書に示される同様のNO放出半減期は、アクリレート修飾キトサンオリゴ糖のNO放出動態が、一般に外部官能基よりもキトサン骨格の疎水性により影響されることを示すと考えられる。

UV−Vis分光法を使用して、N−ジアゼニウムジオレートNOドナーの形成を特性評価した。すべての化合物について、UV−Visスペクトルは、NOガスの高圧への曝露後に253nmで最大吸光度を示し、N−ジアゼニウムジオレートNOドナー形成を確認した(Hrabie,J.A.and Keefer,L.K.Chemical Reviews,102,1135−1154(2002))。350nmの、またはこれ近くの吸光度ピークは観察されておらず、発癌性の可能性のあるニトロソアミンの形成がほとんどまたはまったくないことを示している(Wang,P.G.,et al.,Chemical Reviews,102,1091−1134(2002))。修飾キトサンオリゴ糖のそれぞれについての吸光度スペクトルを本明細書に提供する。

アクリレートおよび2−メチルアジリジン修飾キトサンオリゴ糖の粘膜付着 キトサンオリゴ糖足場の粘液接着特性を判定するために、アクリレート修飾COSによる胃ブタムチン(GPM)の濁度滴定を行った。低濃度の粘膜付着性ポリマーの存在下で、ムチンは光散乱自己組織化複合体を形成する(Sogias,I.A.,et al.,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008)、Rossi,S.,et al.,European Journal of Pharmaceutical Sciences,10,251−257(2000))。このように、ムチン溶液の濁度(補正吸光度によって測定される)は、粘膜付着性足場の追加により増加すると予想され、結果として吸光度測定値が増加する。より高い濃度では、粘膜付着性ポリマーがムチン−ポリマー複合体を分解することが示されている(Sogias,I.A.,et al.,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008))。あるいは、ムチン溶液の濁度(すなわち、吸光度)は、粘液不活性な足場の存在下で一定のままであるべきである。濁度を540nmでモニターして、溶液中の遊離キトサンオリゴ糖の吸光度を最小化しながら、GPM−キトサン複合体に対する感度を最大化した(λ_max=375nm)。

GPM溶液の濁度は、低濃度のCOS、COS−EA、およびCOS−TBuA足場(3mg/mL以下)で急速に(ほぼ4倍)増加し、溶液中のムチンとの有意な粘膜付着を示した(図1)。4.5mg/mL以上の濃度では、COSおよびCOS−TBuAについてキトサンムチン複合体の解離が観察された。GPM溶液にCOS−SPAを加えると、高濃度の溶液の濁度がわずかに増加した。正に帯電したキトサンと負に帯電したムチンとの間の静電相互作用が粘膜付着を促進するため(Menchicchi,B.,et al.,Biomacromolecule,15,3550−3558(2014)、Sogias,I.A,et al.,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008)、Khutoryanskiy,V.V.Macromolecular Bioscience,11,748−764(2011))、ムチンとCOS−SPAの負に帯電したスルホン酸基との間の対応する静電反発は、低濃度でのキトサン−ムチン凝集体の形成を回避した可能性が高い。高濃度(mLあたり3mgを超えるCOS−SPA)では、濁度のわずかな増加が観察され、キトサンオリゴ糖骨格とムチン粒子との間の引力(例えば、疎水性または水素結合)に起因した(Sogias,I.A.,et al.,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008))。

TBuAおよびEAの修飾は、COS足場上の粘液接着性一級アミンを立体的にブロックすると予想されたが、いかなる立体障害も、非修飾COS足場と比較して粘液接着性を有意に変更しなかった。理論に束縛されるものではないが、保持された粘膜付着特性は、正に帯電したアミンの不十分な立体ブロックまたは修飾基とムチンとの間の疎水性相互作用の結果であると考えられる。静電気による粘膜付着の程度を判定するために、PBS中で濁度アッセイを繰り返した。塩化ナトリウムを溶液に加えると、キトサンとムチンとの間の静電相互作用が最小限に抑えられる(Sogias,I.A.,et al.,Biomacromolecules,9,1837−1842(2008))。すべての修飾キトサンオリゴ糖について、塩化ナトリウムの添加により溶液の濁度が減少し、キトサンがムチン上の正に帯電したアミンと負に帯電した基との間の相互作用を防止するために修飾された後であっても、キトサンオリゴ糖とムチンとの間の静電引力が保持されることが示された。

キトサン−ムチン凝集体のゼータ電位測定は、比濁滴定の結果を裏付けた(図2)。pH6.5では、ブランクGPM溶液のゼータ電位は、−9.8±0.5mVであった。中性官能基(COS、COS−TBuA、およびCOS−EA)で修飾されたキトサンオリゴ糖を希釈ムチン溶液に加えると、ゼータ電位が増加した。GPM溶液を負に帯電したCOS−SPAで処理しても、試験された濃度で測定されたゼータ電位は変化せず、COS−SPAの粘膜付着性の減少がさらに示された。

キトサンオリゴ糖による処理後の精製粘液の電気泳動分離 ムチンのサイズ(すなわち、分子量)に対するNOの影響を判定するために、濃度が増加した対照キトサン足場(すなわち、非NO放出)およびNO放出キトサンオリゴ糖による処理後のアガロースゲル電気泳動によって、CF HBE培養物から収集された粘液を分離した。気道におけるゲル形成の原因となる主要なムチンであるMUC5BおよびMUC5ACの両方を使用して、NO放出キトサンオリゴ糖の粘液溶解作用を評価した。これらのムチンの濃度は、CFの肺の増悪中に増加することが知られている(Henke,M.O.,et al.,American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,175,816−821(2007))。強粘着性および弱粘着性のキトサンオリゴ糖(それぞれ、COSおよびCOS−SPA)を使用して、ムチン移動に対する足場の粘膜付着の影響を評価した。キトサンオリゴ糖への曝露後のムチン移動距離の任意の増加は、ムチン多量体のサイズおよび/または電荷の変化を反映しており、CF粘液の治療における有益な治療効果を示している。

ブランクPBSによる処理と比較して、ムチンの移動は、足場の粘液接着特性に関係なく、対照COSおよびCOS−SPA足場への曝露による影響を受けなかった(図3)。弱い粘膜付着性のNO放出COS−SPA(COS−SPA−NO)足場による処理は、同様にムチン移動に影響を与えなかった。しかしながら、粘膜付着性の強いCOS−NOで処理すると、10mg/mLで用量依存的にMUC5ACムチンおよびMUC5Bムチンの両方の移動距離が対照と比較して増加した(p≦0.05)(図4Aおよび4B)。ムチンの移動の増加は、対照足場単独での処理が移動に影響を与えなかったため、NOの薬理学的効果に起因する可能性がある。このように、ムチン多量体のサイズが小さくなると、より速い移動がもたらされる。理論に束縛されるものではないが、COS−SPA−NOによる処理はMUC5ACまたはMUC5Bの移動を変化させなかったため、足場の粘膜付着が効果的なNO送達に必要であると考えられる。また、負に帯電したCOS−SPAとの足場−ムチンの弱い会合は、局所的なNO放出を促進せず、それによって同等の治療活性のためにより大きな用量が必要になる。細菌およびNO放出シリカおよびデンドリマー高分子足場について同様の観察結果が報告されている(Carpenter,A.W.and Schoenfisch,M.H.Chemical Society Reviews,41,3742−3752(2012))。実際、デンドリマー(Lu,Y.,et al.,Biomacromolecules,14,3589−3598(2013)、Sun,B.,et al.,Biomacromolecules,13,3343−3354(2012)、Worley,B.V.,et al.,Molecular Pharmaceutics,12,1573−1583(2015))およびシリカ(Hetrick,E.M.,et al.,ACS Nano,2,235−246(2008)、Carpenter,A.W.,et al.,ACS Nano,5,7235−7244(2011)、Slomberg,D.L.,et al.,ACS Applied Materials&Interfaces,5,9322−9329(2013)、Carpenter,A.W.,et al.,Biomacromolecules,13,3334−3342(2012))の細菌(膜)との会合により、より標的を絞った局所的なNO送達の結果として、NO放出の抗菌作用が向上する。粘膜付着性のNO放出足場の設計は、標的の近接性を確保し、治療作用を高めるのに有利であろう。

キトサンオリゴ糖による処理後のCF唾液の電気泳動分離 COS−NOから放出されたNOはポリマームチンの移動を増加させるが、CF唾液の複雑さ(例えば、高濃度のDNA、細菌、炎症性タンパク質、および細胞)はNOの送達および効力に影響を与える可能性がある。CF唾液中のムチンに対するCOS、COS−NO、COS−SPA、およびCOS−SPA−NOの効果を、アガロースゲル電気泳動により評価した。HBE粘液と同様に、対照(非NO放出)キトサン足場またはCOS−SPA−NOによる処理は、ムチン移動に影響を与えなかった(図5)。対照的に、MUC5ACおよびMUC5Bムチンを濃度10mg/mL以上のCOS−NOで処理すると、ムチンの移動が増加し(図6Aおよび6B)、このNO放出足場に対するNOの粘液溶解活性がさらに支持された。注目すべきは、このアッセイで使用されるキトサンオリゴ糖の濃度は、濁度アッセイで使用される濃度よりも高いことである。ムチンの濃度はまた、濁度アッセイで使用されるムチン濃度(3.0mg/m)よりも唾液においてより高く(およそ6.5mg/mL)(Henderson,A.G.,et al.,Journal of Clinical Investigation,124,3047−3060(2014))、キトサンとムチンとの比率(mg/mg)が両方のアッセイで類似していることを示している。Klinger−Strobelは、粘液の浸透が改善されているため、粘液不活性な足場がCF気道における薬物送達により効果的であると提案している(Klinger−Strobel,M.,et al.,Expert Opinion on Drug Delivery,1−24(2015))。しかしながら、多くのそのような薬物の薬理学的標的は粘液層の奥にあり、COS−NOは蓄積された付着性粘液自体を標的にしている。実際、NO放出キトサンオリゴ糖の粘液溶解活性は、HBE粘液およびCF唾液の両方に対するCOS足場の粘液接着特性に依存しているようであり、弱い粘液接着性のCOS−SPA−NO足場は有益な治療効果を示さなかった。

CF唾液の蛍光顕微鏡検査 CF唾液中のムチンおよびDNAによって形成されたネットワークのNOを介した変化を視覚化するために、処理された試料を共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮像した。PBS処理試料(図7A〜7D)では、MUC5AC(赤)およびMUC5B(緑)のネットワークが絡み合っており、太いムチンフィラメント(図7A、白い矢印)およびウェブ様ムチンシートによって特徴付けられる三次元構造を形成している。強力なDAPI(青)染色によって検出されるように、無傷の好中球も三次元ムチンネットワーク内に埋め込まれた。唾液試料全体にわたる細胞外DNAレベル(図7F、7J、7N、および7R)は、COSまたはCOS−SPAキトサンオリゴ糖により処理すると増強され、その結果、好中球および炎症性細胞死が増強された(Dou,J.,et al.,Carbohydrate Polymers,75,119−124(2009))。COS−SPAおよびCOS−SPA−NOによる処理は、CF唾液構造に他の識別可能な影響を与えなかった。

正に帯電したキトサン変異体、COS、およびCOS−NOは、CF唾液中のムチンネットワークの外観を変化させた。ムチンシートの信号強度およびサイズ減少の両方から明らかなように、COS対照単独ではムチンのクラスター化が誘発され(図7E、白い矢印)、COSとムチンとの静電相互作用がCF唾液の複雑な粘弾性環境で持続していることが示された。より低い全体的なムチン信号および弛緩したムチンネットワークによって図示されるように、COS−NOを介した一酸化窒素放出は、ムチンネットワークをさらに分解した(図7K〜7L)。COS−NOで処理された試料(図7K〜7L)には、ムチンの長いフィラメントがなく、PBSで処理された試料には豊富であった(図7A、白い矢印)。これらの顕微鏡観察は、COS−NOによるムチンネットワークの激しい破壊を示唆している。NOを介したムチンの解きほぐしは、高いムチンの絡み合いが唾液弾性の上昇と相関するため、唾液の弾性を減少させる(Hassett,D.J.,et al.,Adv.Drug Delivery Rev.,54,1425−1443(2002))。

COS−SPA−NOによる処理は、唾液ネットワークを変更しなかった(図7Q〜7T)。理論に束縛されるものではないが、キトサンオリゴ糖骨格と負に帯電したムチンとの間の静電反発力は、最も密なムチンマトリックスへの効果的なキトサンオリゴ糖の浸透を妨げると考えられる。このように、COS−SPA−NOからのNO放出は、ムチンネットワークの変更には効果がない。

CF唾液のレオロジー 粘液溶解薬は、粘液の生物物理学的特性を減少させ、それによって粘液線毛クリアランスおよび肺機能を高めるように設計されている(Henderson,A.G.,et al.,Journal of Clinical Investigation,124,3047−3060(2014)、Anderson,W.H.,et al.,American journal of respiratory and critical care medicine,192,182−190(2015))。

本明細書で報告されるように、平行板レオロジーを使用して、弾性率(G’)および粘性率(G’’)の両方を測定し、COS−NOによる処理がCF唾液の生物物理学的特性にどのように影響を与えるかを評価した。COS−NOにより室温で1時間処理された後、CF唾液の粘度および弾性の用量依存的な減少が対照と比較して観察された(図8Aおよび8B)。試験された最低濃度(5mg/mL)で、COS−NOは、PBS処理ブランクと比較して、唾液の弾性および粘度がそれぞれ74.9±0.4および66.3±1.2%減少した。CF唾液を4倍の濃度のCOS−NO(20mg/mL)で処理すると、唾液の弾性および粘度がそれぞれ93.4±0.7および87.0±2.0%減少した。これらの結果は、COS−NOが短い(1時間)曝露期間でCF唾液の粘弾性特性を減少させるのに非常に効果的であることを示している。

本明細書に開示されているように、曝露および測定パラメーターが大きく異なるため(Lai,S.K.,et al.,Adv.Drug Delivery Rev,61,86−100(2009))、文献のレオロジーデータを比較することは困難であるが、ポリグルコサミンは、CFの治療に使用される従来の粘液溶解療法(例えば、N−アセチルシステイン、ドルナーゼアルファ)に匹敵する唾液の粘弾性における実質的かつ有益な変化を提供すると共に、特にマイコバクテリウムに対する抗菌活性を提供する。Seagraveは、従来の処理では、24時間のN−アセチルシステイン処理(30μM)により、HBE粘液の粘度および弾性を、対照と比較して1桁減少させたと報告した(Seagrave,J.,et al.,Respiratory Research,13,98(2012))。Shahは、ドルナーゼアルファにより10日間(2.5mg、1日2回)処理した後のCFを有する患者において吐出された唾液の粘度および弾性が減少する(それぞれ、59および68%)ことを観察した(Shah,P.L.,et al.,Thorax,51,119−125(1996))。以前に使用されたN−アセチルシステインおよびドルナーゼアルファと比較して、唾液のレオロジー特性を同様に変更するには、わずかにのみ高い濃度のCOS−NO(例示されるポリグルコサミン)が必要であったが、より長い曝露時間および/またはより大きなNOペイロードにより、同等の作用に必要な治療用量が減少する。以前の報告と比較してより短い治療曝露(24時間と比較して1時間)(Seagrave,J.,et al.,Respiratory Research,13,98(2012))または10回の毎日の治療(Shah,P.L.,et al.,Thorax,51,119−125(1996))が本明細書で示され、CF唾液の粘度および弾性における同様の減少が達成され、潜在的な粘液溶解剤としてのCOS−NOの有用性が示された。

CF唾液の弾性係数および粘性係数の減少は、NOを介したDNA切断によるDNAネットワークの変化に起因する可能性がある(Tamir,S.,et al.,Chemical Research in Toxicology,9,821−827(1996)、Burney,S.,et al.,Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,424,37−49(1999)、Duan,J.and Kasper,D.L.Glycobiology,21,401−409(2011))。電気泳動分離および共焦点顕微鏡検査の結果は、NOがムチンネットワークを積極的に変化させることを示している。NOは遺伝毒性がある可能性があるため(Felley−Bosco,E.Cancer and Metastasis Reviews,17,25−37(1998))、本明細書に開示される材料の細胞毒性および遺伝毒性は、前臨床試験または臨床試験の前に特性評価されるべきである。

実施例2 抗菌効果データ 多数の病原体に対するCOS−NOのインビトロ試験を表2および3に図示する。表2のMICおよびMBCに列挙されている値は、COS−NOの濃度である。

表3のMICおよびMBCに列挙されている値は、COS−NOによって経時的に放出されるNOの濃度であり、実験中に放出されるNOの合計である。当業者であれば理解するように、NOは動的であるため、NOの量は経時的に変化する。

Pseudomonas AeruginosaおよびStaphylococcus Aureusに対するCOS−NOの有効性は、2人のCF患者(AAおよびBB試料として標識される)由来の唾液の処理、および得られたコロニーの計数(CFUとして計数される)によって判定された。結果を表4に示す。

AA試料をCOS−NOに接触させ、Pseudomonas Aeruginosaのレベルを判定した。20mg/mLのNO放出キトサンの用量により、3つのAA試料のうちの2つ(AA6およびAA10)ですべての細菌が死滅した。もう1つ(AA4)では、NO放出により、細菌数を10⁵CFU減少させることができた。より高い濃度では、3つすべての試料でPseudomonas Aeruginosaが計数されなかった。

BB試料をCOS−NOに接触させ、Staphylococcus Aureusのレベルを判定した。Staphylococcus Aureusはすべて、20mg/mL以上の濃度で死滅された。

表5は、追加の病原体の抗菌データを示す。ニューデリーメタロ−β−ラクタマーゼ(NDM−1)およびKlebsiella Pneumoniae Carbapenemase(KPC)菌株分離株は、カルバペネム(CR)抗生物質に対する耐性を付与するbla NDM−1およびKPC遺伝子を保有する。各菌株は、様々な薬物クラスの36個もの代表的な抗生物質に対する多剤耐性を示している。

本発明の例示的な実施形態をこのように記載してきたが、上記の段落によって定義される本発明は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、その多くの明らかな変形が可能であるため、上記の記載に記載の特定の詳細に限定されないことが理解されるべきである。