双管状结构
阅读：807发布：2020-05-18
专利汇可以提供双管状结构专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用包含微 流体 通道网络的微流 体细胞 培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法。在所述方法中，上皮细胞通过间充质细胞来源的细胞衬贴在所述微流体细胞培养系统中。所述细胞可以形成管状或管样结构，即管中管。所述方法得到适用于广泛的应用的改进的上皮模型，所述应用包括但不限于健康和患病的上皮细胞的高通量筛选和分析等。，下面是双管状结构专利的具体信息内容。
1.一种使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)将间充质细胞引入所述微流体通道网络，其中所述间充质细胞通过以下步骤引入所述微流体通道网络，
a1)使用水性介质；或
a2)使用凝胶前体并使所述凝胶前体在所述微流体通道网络中胶凝化从而占据所述微流体通道网络的至少一部分；
b)在步骤a1)的情况下，优选在步骤a2)的情况下，使所述间充质细胞增殖和/或分化，优选直至所述微流体通道网络的至少一部分被间充质细胞覆盖；
c)将上皮细胞引入包含所述间充质细胞的所述微流体通道网络；和
d)使所述上皮细胞增殖和/或分化，优选直至所述微流体通道网络的至少一部分被上皮细胞覆盖和/或直至所述间充质细胞的至少一部分被上皮细胞覆盖。
2.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将凝胶前体引入所述微流体通道网络并使所述凝胶前体在所述微流体通道网络中胶凝化从而占据所述微流体通道网络的至少一部分。
3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将凝胶图案化，优选通过使用毛细管压力屏障、通过UV图案化、或通过在胶凝化后将针缩回、或通过具有在胶凝化后除去的牺牲层来图案化。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤a)中引入的所述间充质细胞分散/悬浮在所述凝胶前体中。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤a)中，使用水性介质、优选在凝胶旁边，将所述间充质细胞引入所述微流体通道网络。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述间充质细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成间充质细胞的群/层/片。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述间充质细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成间充质细胞的管状结构。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞和/或所述上皮细胞在引入时解聚。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述上皮细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成上皮细胞的群/层/片。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述上皮细胞增殖和/或分化，直至在所述微流体通道网络中至少形成上皮细胞的管状结构。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，如果在步骤a)中在凝胶中引入所述间充质细胞，则所述上皮细胞增殖和/或分化，直至上皮细胞的至少一群/层/片覆盖所述凝胶的至少一部分，所述凝胶占据所述微流体通道网络的至少一部分。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中施加通过所述管状结构的内腔的生长培养基流，其中所述流可为单向或双向的。
13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在包含因子Wnt、头蛋白、egf/fgf和/或R-脊椎蛋白的至少之一的生长培养基的存在下培养所述细胞。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞的至少一部分位于所述微流体通道网络的壁和所述上皮细胞之间。
15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述上皮细胞在由所述间充质细胞形成的管状结构的内部形成管状结构。
16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，使所述上皮细胞形成具有顶侧和基底侧的细胞层，所述基底侧面向所述间充质细胞。
17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞的至少一部分与所述上皮细胞的至少一部分直接接触和/或其中间充质细胞片与上皮细胞片之间的距离为基膜的厚度或小于基膜的厚度。
18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞选自肌成纤维细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞和基质细胞，优选其中所述间充质细胞为哺乳动物细胞、优选人细胞。
19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述上皮细胞选自单层上皮细胞、单层鳞状上皮细胞、复层上皮细胞或柱状上皮细胞，优选其中所述上皮细胞为哺乳动物细胞、优选人细胞。
20.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述间充质细胞和/或所述上皮细胞为初级细胞。
21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过除去存在于包含所述上皮细胞的所述微流体通道网络中的水性介质使所述上皮细胞经受空气。
22.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微流体细胞培养系统包含培养室，在所述培养室中引入步骤a)中的所述间充质细胞和步骤c)中的所述上皮细胞。
23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微流体通道网络的特征在于存在构造成提供通向细胞的流路的第一部分和/或构造成提供离开所述细胞的流路的第二部分，优选往来于包含所述间充质细胞和所述上皮细胞的培养室。
24.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中如果存在凝胶，则所述凝胶设置在所述微流体通道网络中或设置在与所述微流体通道网络相邻的通道中，和其中所述凝胶与所述微流体通道网络直接接触。
25.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中与所述凝胶相邻地存在其它中空微流体通道，其与所述凝胶接触，但其中所述通道不与包含所述上皮细胞的所述微流体通道直接接触。
26.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤a)中引入不同类型的间充质细胞，和/或其中在步骤c)中在同一微流体通道中引入不同类型的上皮细胞。
27.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述凝胶为基底膜提取物、细胞外基质组分、胶原、胶原I、胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、D-赖氨酸、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或其组合。
28.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微流体细胞培养系统提供通向所述微流体通道网络中的细胞和/或通向所述凝胶和/或通向其他微流体通道网络的不间断光路。
29.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法还包括捕获在所述微流体培养系统中的细胞、凝胶和/或微流体通道网络的多个图像。
30.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中与任意的步骤a)-d)同时或在任意的步骤a)-d)之后使所述细胞与试验化合物接触。
31.根据前述权利要求任一项所述的方法所得到的微流体细胞培养系统中的细胞用于评估经上皮屏障的转运，毒性研究，与微生物组的共培养，食物吸收研究，炎症研究，提供用于对健康和患病状态下的上皮功能的机械研究的例如炎性肠病、囊性纤维病、COPD、哮喘、癌症等疾病模型的用途。
32.一种组合物或系统，其包含具有微流体通道网络的微流体细胞培养系统，所述微流体通道网络包含细胞内群和细胞外群，其中所述细胞内群至少部分地被所述细胞外群覆盖，其中所述内群的细胞为上皮细胞和所述外群的细胞为间充质细胞，优选其中所述细胞内群和所述细胞外群相互作用或直接接触。
33.使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)将上皮细胞和间充质细胞的混合物引入所述微流体通道网络，其中使用水性介质将细胞混合物引入所述微流体通道网络；
b)使所述间充质细胞和所述上皮细胞增殖和/或分化，优选直至所述微流体通道网络的至少一部分被细胞覆盖。
34.一种包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统，所述微流体通道网络包含间充质细胞和上皮细胞，优选其中所述间充质细胞和上皮细胞形成管状结构。
35.一种包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统，所述微流体通道网络包含可通过前述权利要求之一所述的培养和/或监测上皮细胞的方法得到的间充质细胞和上皮细胞。
双管状结构
背景技术
[0001] 上皮为形成内部和外部体表的衬里(lining)的特化和极化的组织。形成上皮的细胞紧密压紧并可形成一层或多层。上皮可为一层细胞厚(单层上皮)或两层以上细胞厚(复层上皮)。不同类型的上皮，单层和复层，都基于形状和功能来鉴别，包括鳞状上皮、立方上皮、柱状上皮和移行上皮。
[0002] 通常，称为基膜的结缔组织薄片将上皮与下层组织分隔。基膜为上皮提供结构支持并将其与相邻的结构连接。基膜充当支架，上皮可在其上生长并在受损后再生。上皮组织受神经支配但无血管，上皮必须通过从下层组织中的血管扩散的物质获取营养。基膜充当决定何种物质将能够进入上皮的选择性透过膜。
[0003] 上皮在发育过程中的分化与有序的形态发生事件序列紧密相关。一些实验研究已强调了这些发育过程依赖于相互的上皮-间充质相互作用。
[0004] 存在对上皮屏障组织的体外模型的开发的广泛关注，所述体外模型复制体内所观察到的组构(organization)和限制行为，并且例如将允许它们用于非侵入性、快速、经济和可再生的试验和/或筛选新的候选药物、化学品和食品的用途。然而，重要的信号在细胞于二维塑料基质上离体培养时丧失。多数情况下得到的组织并未展现它们体内等同组织的形态特征且缺少许多特化的分化细胞类型。
[0005] 解决这些局限性的努力导致了其中将细胞埋入细胞外基质中生长的3D细胞培养模型的发展。该方法增强了分化的功能的表达并改善了组织组构(Pampaloni等(2007).Nat Rev Mol Cell Biol 8:839-84)。
[0006] 特别地，在类器官培养领域已经取得了重大的最新进展。类器官是通常包含也可在人体内获得的大多数特化细胞的三维器官-芽(organ-bud)。事实上，在体外环境中模拟胚胎发育期间组织的培养和分化，使得干细胞分化成各种分化细胞。这种类器官的公知实例是小肠类器官(Shoichi Date和Toshiro Sato,Mini-Gut Organoids:Reconstitution of the Stem Cell Niche,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,2015,Vol.31:269-289)。生长因子和信号传导分子如Wnt通路激动剂(如Wnt3a、R-脊椎蛋白(R-spondin)、CHIR99021)、BMP/TGF通路抑制剂(如头蛋白(Noggin))、EGF和基底膜提取物(基质胶(matrigel)或类似物)的环境的混合物(cocktail)，保证初级肠隐窝(primary gut crypts)的培养、其干细胞生态位的维持和细胞向例如杯形细胞、肠细胞和肠内分泌细胞分化的潜能。这导致具有肠的次级形态学方面(secondary morphology aspects)的三维结构，包括隐窝和绒毛形成。已建立了类似的三维培养用于初级人食管、胃、结肠、肝和胰腺的培养。
[0007] 近期，由诱导多能干细胞生长脑类器官已取得了极大的进展。悬浮的球状体在连续振荡下的长期培养导致具有特化部分如前脑和后脑特征的所谓的迷你脑(minibrains)。甚至是最近，肾小球的培养已经实现了突破，其使用复杂的培养方案，从transwell系统上的诱导多能干细胞开始，再次产生存在于人肾的肾小球中的高度特化的细胞。
[0008] 这种类器官技术的缺点是缺乏对迷你器官的结构控制。特别是由于球状的形状造成缺乏独立的顶-底通道。已经尝试了将类器官方案应用于在transwell膜上建立扁平极化组织，以使得顶-底通道成为可能，但迄今为止的进展却高度受限，可能是由于细胞外基质环境对于类器官的生长是重要的，且将其引入并未产生密闭屏障。
[0009] 已通过在tranwell设备(setup)中的半透膜上单独地或与支持细胞(饲养层或间充质细胞如成纤维细胞)组合地培养不同来源的上皮细胞，开发了静态体外模型。不幸的是，这些模型显示低的跨上皮电阻(trans-epithelial electrical resistance,TEER)、典型不透性标记分子的高通透性、转运蛋白(如P-糖蛋白外排泵)的低的表达和功能性，以及短期的活力。这会限制它们作为模型的价值。
[0010] 饲养层通常用作多种类型的胚胎干细胞和成体干细胞的培养的支持体。例如，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)通常用于支持胚胎干细胞(ESC)的培养。另一干细胞类型、即造血干细胞(HSC)的维持可以通过与基质间充质干细胞的共培养来实现和推进。
[0011] 典型地，饲养细胞由有丝分裂不活跃的细胞片组成并充当替代的生态位细胞，其分泌在维持所期望的目标细胞类型中重要的必要生长因子和细胞因子。饲养细胞不仅通过向培养基释放生长因子、而且还通过提供细胞外基质支持体(这促进了期望的细胞-ECM相互作用)来支持其它细胞的生长。干细胞与其微环境的相互作用调节干细胞的自我更新机制和分化能力。但是如所提到的，在Transwell设备中，不幸的是，与饲养层组合，这些模型也显示低的跨上皮电阻(TEER)、典型不透性标记分子的高通透性、转运蛋白(如P-糖蛋白外排泵)的低的表达和功能性，以及短期的活力，这会限制作为模型的价值。
[0012] 另外，目前的方法和手段并不允许高通量研究，例如跨上皮组织的吸收、转运和/或分泌的分析。例如，已知的transwell板不适合测定跨上皮组织样品的吸收、转运和/或分泌，这是因为组织样品不会充分地粘附至transwell板的膜。
[0013] 因此，需要开发其中细胞的增殖和分化模拟体内情况的培养人上皮的更明确且预测性的模型。有鉴于此，将非常期望改进的体外上皮模型的产品、组合物、方法和用途，但还尚不可用。特别地，本领域对于可靠、有效且可再现的方法存在明确的需求，所述方法允许提供此类具有独立的底-顶通道的体外上皮屏障模型，并且例如可显示也存在于体内等同组织的较特化细胞。这些模型可用于例如高通量筛选，药物吸收、转运和毒性研究，疾病建模、与例如微生物培养物的相互作用和/或研究营养摄取用模型。因此，在提供满足任何前述需求的这类产品、组合物、方法和用途中可见本发明所基于的技术问题。所述技术问题通过权利要求和下文中表征的实施方案来解决。附图说明
[0014] 图1：用于培养上皮管的装置的实例(并非按比例绘制)：底视图。
[0015] 图2：用于培养上皮管的装置的实例(并非按比例绘制)：观察视窗特写。
[0016] 图3：用于培养上皮管的装置的实例(并非按比例绘制)：图2的垂直截面。
[0017] 图4和5：用于培养上皮管的方法中的步骤：将包括间充质细胞的ECM凝胶前体插入图2/3的凝胶道(gel lane)，固定在毛细管压力屏障上并使之胶凝化。ECM可为例如基质胶(生长因子减少或未减少的)、胶原I、胶原IV、纤维蛋白原、纤连蛋白、或其组合，以及合成ECM。
[0018] 图6和7：用于培养上皮管的方法中在图4/5中记述的步骤之后的步骤，其中上皮细胞引入第一灌注通道(perfusion channel)(和任选地生长培养基引入第二灌注通道)。
[0019] 图8和9：用于培养上皮管的方法中在图6/7中记述的步骤之后的步骤，其中图3的装置垂直放置以使上皮细胞沉降在凝胶表面上。在上皮细胞粘附时，引入流体(未示出)。
[0020] 图10和11：用于培养上皮管的方法中在图8/9中记述的步骤之后的步骤，其中使上皮细胞增殖并沿通道壁和凝胶表面衬贴从而形成小管。
[0021] 图12和13：用于培养上皮管的方法中在图10/11中记述的步骤之后的步骤，其中使间充质细胞与上皮细胞相互作用并使上皮分化；分化可导致规则的形态学图案：这里为隐窝结构。
[0022] 图14和15：用于培养上皮管的方法中的步骤：将ECM凝胶前体插入图2/3的凝胶道，固定在毛细管压力屏障上并使之胶凝化。
[0023] 图16和17：用于培养上皮管的方法中在图14/15中记述的步骤之后的步骤，其中间充质细胞引入第一灌注通道(和任选地生长培养基引入第二灌注通道)。
[0024] 图18和19：用于培养上皮管的方法中在图16/17中记述的步骤之后的步骤，其中图3的装置垂直放置以使间充质细胞沉降在凝胶表面上。在间充质细胞粘附时，引入流体(未示出)。
[0025] 图20和21：用于培养上皮管的方法中在图18/19中记述的步骤之后的步骤，其中使间充质细胞增殖并沿通道壁和凝胶表面衬贴。
[0026] 图22：用于培养上皮管的方法中在图20/21中记述的步骤之后的步骤，其中上皮细胞引入第一灌注通道(和任选地使用不同介质)。
[0027] 图23：用于培养上皮管的方法中在图22中记述的步骤之后的步骤，其中图3的装置垂直放置以使上皮细胞沉降在已沉降在凝胶表面的间充质细胞上。在间充质细胞粘附时，引入流体(未示出)。
[0028] 图24：用于培养上皮管的方法中在图23中记述的步骤之后的步骤，其中使上皮细胞增殖并沿通道壁和凝胶表面衬贴从而形成具有紧密连接的小管。
[0029] 图25和26：用于培养上皮管的方法中在图24中记述的步骤之后的步骤，其中使间充质细胞和上皮细胞相互作用并使上皮分化；分化可导致规则的形态学图案：这里为隐窝结构和穹顶(dome)。
[0030] 图27：图1的替代性实施方案，具有1个凝胶道和一个灌注道(perfusion lane)。
[0031] 图28：图1的替代性实施方案，具有2个从单一入口填充的凝胶道(可任选地为单独的入口)。
[0032] 图29：1.如图1所示的具有400微米宽的道的3-道 (MIMETAS)中的间充质细胞和上皮细胞连续接种后的相衬图像(Phase contrast images)。
发明内容
[0034] 定义
[0035] 本公开的一部分包含受版权保护的材料(例如，但不限于，图表、装置照片、或本申请的任何其他方面，对此版权保护在任何管辖权内是或可以是可得的)。版权所有者不反对对于由任意的专利文献或专利公开的影印复制，如其出现在专利局的专利文件或记录中那样，但其他情况下无论如何都保留所有版权。
[0036] 在整个说明书和权利要求中使用关于本发明的方法、组合物、用途、和其他方面的各种术语。除非另有指明，应赋予这类术语本发明所属领域的普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。虽然可在本发明的试验的实践中使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但本文描述优选的材料和方法。
[0037] “一个/种(a,an)”和“所述(the)”：除非内容清楚地另有指明，这些单数形式术语包括复数指示物。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括两个/种以上细胞的组合等。
[0038] “约(about,approximately)”：当指可测量值例如量、和持续时间等时，这些术语意为涵盖从特定值的±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、仍更优选±0.1％的变化，因为这类变化适用于进行所公开的方法。
[0039] “含有”：该术语解释为是包含性的和开放的，并且不是排除性的。具体地，所述术语和其变化意为包括具体特征、步骤或组分。这些术语不应解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。
[0040] “示例性”：该术语意为“作为实例、例子或说明”，并且不应解释为排除本文公开的其他配置。
具体实施方式
[0041] 预期本文所述的任何方法、用途或组合物可以相对于本文所述的任何其它方法、用途或组合物来实施。在本发明的方法、用途和/或组合物的背景下讨论的实施方案可以相对于本文所述的任何其他方法、用途或组合物来使用。因此，属于一种方法、用途或组合物的实施方案也可以应用于本发明的其他方法、用途和组合物。
[0043] 微流体细胞培养是越来越重要的技术。该技术在药物筛选、组织培养、毒性筛选和生物研究中得到应用。微流体细胞培养的主要优点在于其可向常规细胞培养添加诸如灌注流、提高的共培养和稳定的梯度等方面，并且可提供更高的品质数据、减少的试剂消耗和降低的成本。
[0044] 与微流体系统、装置、方法和制造相关的许多方面在包括专利文献如WO 2008/079320、WO 2013/151616、WO 2010/086179、WO2012/120101等的现有技术中讨论，或者可商购自例如Mimetas,Leiden,The Netherlands(如OrganoPlate；www.mimetas.com)。尽管不应从这些申请和文献中读取对本文所示的任何权利要求的特别限定，但这些文献提供了与具体实施方案相关的有用的背景材料。
[0045] 高品质的样品制备对于许多临床、研究和其他应用是重要的。培养、表征和可视化细胞已经在药物发现、疾病诊断和分析、以及各种其他治疗和实验工作的领域中越来越受到重视。非常重要的是，利用微流体细胞培养技术，可以获得接近于代表它们的体内特征的体外样品。这样的体外样品会潜在地有益于广泛的分子和细胞应用。
[0046] 本发明所基于的技术问题在于能够提供更接近于代表它们体内特征的体外上皮细胞培养物的细胞培养方法和系统的领域。这可包括极性(顶(apical)和基底侧(basolateral)蛋白如转运蛋白和通道蛋白(如OAT2/3、MATE1/2、NKCC1)的表达，结构相关蛋白(如刷状缘中的绒毛蛋白、肌动蛋白)、膜受体(如EGFR/ErbB)的表达和功能化，黏着连接，黏着斑，细胞形态和细胞层形成(形状和外观；尺寸；微绒毛、纤毛、汇合(confluency))和功能(屏障功能、细胞表面受体的表达、摄取和分泌)。
[0047] 最重要的是，这些模型优选显示在特定位置细胞向特化细胞的分化，同时优选在其他特定位置维持干细胞生态位。此类特化细胞的实例包括小肠中的肠细胞、杯形细胞、帕内特细胞，肾中的足细胞、各种特化的立方上皮，视网膜中的视网膜色素上皮、视杆细胞、视锥细胞、双极细胞、神经节细胞，肺中的I型鳞状肺泡细胞、II型大肺泡细胞。细胞在特定位置的分化不仅导致具有不同功能和行为的特化细胞，而且还在多数情况下改变组织的形状，为其提供其特征形态。实例为小肠中的隐窝-绒毛结构和粘蛋白产生，肺中的肺泡，肾中的肾小球、远端和近端小管以及亨利袢，视网膜中的色素层以及视杆和视锥层。我们将这些特征形状称为次级形态以便与初级形态相区分，所述初级形态例如transwell和表面粘附的细胞培养物中的扁平薄饼样细胞层，或者体内情况中或微流体系统中组织的管状结构。
[0048] 提供更好地对应于它们体内对应物的体外样品是重要的。
[0049] 在本领域中，已经提出了一些使用微流体细胞培养系统、微室或微流体的方法。大多数其他系统使用标准培养板并使用各种屏障嵌入物，试图培养更接近于代表它们体内特征的上皮细胞(如Transwell通透性支持物)。然而，目前可用的系统尚未满足关于提供与体内特征极为相似的体外上皮细胞样品以及关于易用性、高通量或自动化应用所必须的多个方面。
[0050] 本发明的发明人已出乎意料地发现，本领域中的问题可以通过提供使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法来解决。
[0051] 本发明的方法允许可以展示次级形态的微流体装置中的管形成并提供特化的、极化的和分化的细胞。这可取决于似乎类似于体内组织组构的图案(pattern)。简言之，这通过以下实现：上皮细胞和间充质细胞的衬贴，和在优选的实施方案中，与现有技术中的那些方法例如使用刚性结构的transwell系统相比，使用进一步适应次级形态的凝胶如细胞外基质凝胶。
[0052] 因此，根据本发明的第一方面，提供一种使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法，其中所述方法包括：
[0053] a)将间充质细胞引入微流体通道网络，其中间充质细胞通过以下步骤引入微流体通道网络，
[0054] a1)使用水性介质(aqueous medium)；或
[0055] a2)使用凝胶前体并使凝胶前体在所述微流体通道网络中胶凝化从而占据所述微流体通道网络的至少一部分；
[0056] b)在步骤a1)的情况下，优选在步骤a2)的情况下，使间充质细胞增殖和/或分化，优选直至微流体通道网络的至少一部分被间充质细胞覆盖；
[0057] c)将上皮细胞引入包含间充质细胞的微流体通道网络；和
[0058] d)使上皮细胞增殖和/或分化，优选直至微流体通道网络表面(壁)的至少一部分被上皮细胞覆盖和/或直至间充质细胞的至少一部分被上皮细胞覆盖。
[0059] 可选地，提供一种使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法，其中所述方法包括：
[0060] A1.1)将凝胶前体、优选细胞外基质凝胶前体引入微流体通道网络，例如引入微流体通道网络的一部分，如引入中空体积；
[0061] A1.2)使凝胶沉降或胶凝化；
[0062] A1.3)将间充质细胞引入未被ECM凝胶覆盖的微流体通道网络的另一部分；或[0063] A2)将细胞与凝胶前体混合并使凝胶前体在微流体通道网络中胶凝化从而占据微流体通道网络的至少一部分；
[0064] B)在步骤a1)的情况下，优选在步骤a2)的情况下，使间充质细胞增殖和/或分化，优选直至微流体通道网络的至少一部分被间充质细胞覆盖；
[0065] C)将上皮细胞引入包含间充质细胞的微流体通道网络；和
[0066] D)使上皮细胞增殖和/或分化，优选直至微流体通道网络表面的至少一部分被上皮细胞覆盖和/或直至间充质细胞的至少一部分被上皮细胞覆盖。
[0067] 尽管在说明书和权利要求书中将参考上述第一方法(以例如步骤a)-d))，但技术人员理解本文所述的任何方法、用途或组合物同样可以相对于替代性措辞(以例如步骤A)-D))来实施。
[0068] 在本发明的方法中，在微流体通道网络中，培养间充质来源的细胞从而形成第一细胞群，所述第一细胞群形成层或片。在使间充质细胞覆盖微流体网络和/或凝胶的表面的至少一部分后，将上皮细胞引入微流体通道网络，优选间充质细胞的层或片内(即，远离微流体通道的(人工)壁)。使上皮细胞(和间充质细胞)增殖和/或分化，优选至少直至达到汇合为止。
[0069] 利用本发明的方法，提供一层上皮细胞，其与一层间充质细胞直接接触，可能与由两种细胞类型分泌且与本领域所述的方法相比更类似于体内情况的中间基膜等同物直接接触。例如，间充质细胞和/或基膜可与上皮细胞直接接触，而不存在任何人工的、非天然的或来自外部引入的膜，例如transwell系统中使用的膜。与此同时，利用本发明的方法，上皮细胞与微流体细胞培养系统的微流体通道网络的人工(如塑料或玻璃)壁(表面)的接触减少。
[0070] 另外，与本领域中使用例如提供至少10μm的人造多孔膜的刚性结构的transwell系统的那些方法相反，通过使用细胞外基质凝胶，进一步适应细胞的次级形态。
[0071] 在不受理论的约束下，本发明人推测细胞的增殖和分化取决于上皮细胞和间充质细胞之间的双向通讯且该通讯通过本发明的方法、特别是由于缺少如应用于transwell系统中的这类刚性结构，和/或通过防止或减少上皮细胞与所采用的培养装置的刚性壁的接触和/或通过在中空微流体通道(即，在微流体通道网络中)建立使细胞的增殖和分化更类似于体内情况的(微)环境得以改进。
[0072] 不希望受任何特定理论的约束，我们假设间充质细胞的存在对上皮是有益的。信号传导分子如形态发生素的交换特别地导致这类分子如形态发生素的组合图案。这些分子在特定位置的特定组合可导致干细胞生态位的维持，同时形态发生素在另一特定位置的另一组合导致向特定亚型的分化。形态发生素通常理解为是支配形态发生的过程中的组织发育模式、以及各种特化细胞类型在组织内的位置的物质。更具体地，形态发生素可以为直接作用于细胞以根据其局部浓度而产生特定细胞反应的信号传导分子。
[0073] 不希望受任何特定理论的约束，我们假设信号传导分子、特别是形态发生素的特定组合，以或多或少的规则间隔发生。规则在此应在生物学背景下解释，即规则性，例如斑马的条纹、或豹皮上的斑块：不是精确的规则性，但为清晰的图案。
[0074] 在这类图案形成中至关重要的形态发生素包括，但不限于Wnt家族成员、刺猬蛋白家族成员、头蛋白、骨形态发生蛋白、上皮生长因子(EGF)、成纤维生长因子(FGF)和Dickkopf(DKK)蛋白。
[0075] 细胞外基质或基膜为此类规则图案形成中的重要元素，因为其可结合特定的形态发生因子，导致局部浓度，同时允许其他物质扩散。
[0076] 在本发明的范围内，微流体网络为由封闭通道网络的两个侧壁(表面)即底部基体和顶部基体所限定的中空体积。顶部基体和底部基体两个侧壁在与微流体通道网络接触时可称为壁。通道网络进一步与入口连接，该入口通常为顶部基体中的孔，用于从外部环境填充网络。此外，在用第一流体(通常为液体)填充网络时需要存在排出口，其允许存在于网络中的流体(通常为空气)排出。通道网络可包括一个微流体通道或彼此连接的多个微流体通道。微流体通道网络还可连接至其它入口或出口。
[0077] 在所述方法的第一步骤中，将间充质细胞引入微流体细胞培养系统的微流体通道网络。
[0078] 可用于本发明的间充质细胞可为间充质来源的任何类型的细胞。间充质细胞或者至少一种或多种间充质细胞包括来自不同身体区域的成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞和基质细胞，所述区域包括骨髓、前列腺、心脏、肺、肠、肾、血管和肌腱。优选地，间充质细胞为成纤维细胞或肌成纤维细胞。间充质细胞可为增殖状态或有丝分裂不活跃的。间充质细胞可为分化的间充质细胞或间充质前体细胞。间充质前体细胞意指间充质来源的多能细胞，例如能够分化成各种间充质来源谱系的细胞。为避免疑义，对于间充质细胞，我们意为间充质来源的细胞。
[0079] 间充质细胞可为新生儿或成人细胞。优选地，间充质细胞为哺乳动物细胞，更优选人间充质细胞。间充质细胞可为新鲜分离的细胞或多次传代的细胞。间充质细胞可为初级细胞或(永生化)细胞系。间充质细胞可从健康组织或包括肿瘤在内的病变组织分离。间充质细胞可包括多于一种类型的间充质细胞。间充质细胞还可通过干细胞技术如诱导干细胞技术获得。间充质细胞还可通过诱导上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)而从上皮衍生。
[0080] 在优选的实施方案中，间充质细胞选自肌成纤维细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞和基质细胞，优选其中间充质细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。
[0081] 可将细胞通过任何合适的手段引入微流体通道网络。例如，细胞可使用水性介质、典型地细胞培养基引入。细胞培养基必须能够递送生长和/或增殖必不可少的所有营养素和其它化合物，但它们优选可以不包含会对细胞的生长和/或增殖有害的化合物。
[0082] 细胞可分散在所述介质中并通过使该介质进入微流体通道网络来引入微流体通道。典型地，移液管可用于将细胞分配在入口中的介质中并使微流体通道网络通过毛细力填充。可选地，介质中的细胞可通过主动泵送引入微流体通道网络。技术人员将理解的是，一旦细胞引入微流体通道网络，应允许细胞沉降并开始分化和/或增殖。细胞的沉降可在一个表面上。优选地，所用的水性介质为适用于间充质细胞的增殖和/或分化的介质。此类介质的组成是本领域公知的且可以使用任何合适的生长培养基，如果需要则补充有额外的(生长)因子。在细胞沉降并任选地粘附至凝胶如细胞外基质凝胶(如果存在)和/或微流体通道网络的壁后，提供向间充质细胞提供营养素和氧的合适的生长培养基，使间充质细胞增殖和/或分化。生长培养基可以流的形式提供或不以流的形式提供。在流的情况下，生长培养基还可除去或稀释由细胞产生的代谢废物。
[0083] 可选地，间充质细胞可使用凝胶前体引入微流体通道网络。细胞可分散/悬浮于所述凝胶前体中并通过使凝胶前体进入微流体通道网络来引入微流体通道网络，并允许借助于图案化技术如毛细管压力屏障等填充所选的网络区域。随后，使凝胶前体在微流体通道的特定区域胶凝化(凝固)从而占据微流体通道网络的至少一部分。关于术语占据微流体通道网络的至少一部分，技术人员将理解的是，不需要凝胶在整个微流体通道网络中存在，但优选占据特定的领域或网络，以使所选的其他区域对于引入其它凝胶或生长培养基、例如对于灌注流仍旧是可进入的。还将理解的是，凝胶不应阻塞生长培养基通过微流体通道网络的通道。
[0084] 凝胶前体可提供至如上所述的通道。在提供凝胶后，使其在引入其它流体之前胶凝化。合适的(前体)凝胶在本领域是公知的。举例来说，凝胶前体可为水凝胶，且典型地为细胞外基质(ECM)凝胶。ECM可例如包含胶原、纤维蛋白原、纤连蛋白和/或基底膜提取物如基质胶或合成凝胶。举例来说，凝胶前体可利用移液管(典型地为重复式移液管如Eppendorf M4(Eppendorf AG,Germany,目录编号4982 000.012)与Eppendorf Combitips (Eppendorf AG,Germany,目录编号0030 089.405)的组合)引入入口。
[0085] 因此，凝胶可以包含基底膜提取物、人或动物组织或细胞培养物来源的细胞外基质、动物组织来源的细胞外基质、合成细胞外基质、水凝胶、胶原、软琼脂、蛋清和商购可得的产品如基质胶。
[0086] 包含基膜的基底膜为薄的细胞外基质，其在体内位于上皮细胞下方且包含如蛋白质和蛋白聚糖等细胞外基质。尽管上皮细胞层(多层或单层)作为屏障防止外源物质从外部环境侵入，但基底膜本身还起到物理屏障的作用。因此，上皮细胞，也包含上皮组织在内，与基底膜合作形成固体屏障并保护内部生命活动。
[0087] 它们由胶原IV、层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、和很多其他次要组分构成(Quaranta等人,Curr.Opin.Cell Biol.6,674-681,1994)。单独的这些组分以及完整的基底膜是生物活性的并且促进细胞粘附、迁移、和在很多情况下的生长和分化。基于基底膜的凝胶的实例称为基质胶(US4829000)。该材料在体外作为上皮细胞的基层(substratum)是非常生物活性的。
[0088] 用于本发明的方法的很多不同的合适的凝胶是商购可得的，并且包括但不限于包含以下的那些：基质胶rgf、BME1、BME1rgf、BME2、BME2rgf、BME3(所有基质胶变体)、胶原I、胶原IV、胶原I和IV的混合物、或胶原I和IV以及胶原II和III的混合物、puramatrix、水凝胶、Cell-TakTM、胶原I、胶原IV、 Matrix、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白、骨桥蛋白、聚-赖氨酸(PDL、PLL)、PDL/LM和PLO/LM、 或玻连蛋白。在一个优选实施方案中，基质组分以商购可得的 Matrix(Corning,NY 14831,USA)获得。
[0089] Matrx提取自Engelbreth-Holm-Swarm(“EHS”)小鼠肿瘤，即富含基底膜的肿瘤。主要基质组分为层粘连蛋白、胶原IV、巢蛋白、和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(“HSPG”)。基质还含有生长因子、基质金属蛋白酶(胶原酶)、和其他蛋白酶(纤溶酶原激活物)、以及一些至今未定义的细胞外基质组分。在室温下， Matrx胶凝化从而形成重组基底膜。
[0090] 优选地，凝胶(前体)为基底膜提取物、细胞外基质组分、胶原、胶原I、胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、D-赖氨酸、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或其组合。
[0091] 凝胶前体释放至微流体网络的入口并通过潜在地由重力辅助的毛细力运输至微流体网络中。再次举例来说，凝胶可以例如由基本上为跨越微流体通道网络的整个宽度的毛细管压力屏障的相位引导件停止并引起胶凝化。在凝胶形成后，提供向凝胶中的间充质细胞提供营养素和氧的合适的生长培养基，使间充质细胞增殖和/或分化。生长培养基可以流的形式提供或不以流的形式提供。在流的情况下，生长培养基还可除去或稀释由细胞产生的代谢废物。
[0092] 凝胶前体如ECM凝胶前体的图案化可以以多种方式进行，包括光刻图案化和利用毛细管压力技术的图案化。毛细管屏障的功能和图案化已经由申请人例如在WO2014038943中在先记述。毛细管压力屏障不应理解为壁或填充有凝胶前体的腔，但是由确保凝胶前体由于表面张力而不扩散开的要素组成。该概念称为弯月面阻塞(meniscus pinning)。同样地，将在微流体通道中实现由(ECM)凝胶前体组成的流体弯月面的稳定限制。
[0093] 所提供的毛细管压力屏障可以例如由从底部基体突出的材料的边缘或伸入底部基体的沟组成。边缘的侧壁与边缘的顶部具有角度，优选尽可能大。为了提供良好的屏障，该角度需要大于70°，典型地约90°。对脊的侧壁与底部基体的顶侧之间的角度同样适用。
[0094] 用于建立毛细管压力屏障的可选方式为在底部基体上施涂明显比周围材料更疏水的材料的线。后者因毛细力/表面张力而起到扩散停止的作用。结果，防止液体流过毛细管压力屏障并使得能够在微流体通道网络中形成稳定限制的弯月面。因此，在特定的实施方案中，所用的毛细管压力屏障特别地选自边缘、沟、孔或疏水材料线或其组合。在另一实施方案中，毛细管压力屏障可通过支柱以选定的间隔衬贴由凝胶占据的领域来建立。
[0095] (ECM)凝胶前体选择性图案化的可选方式包括使用牺牲层或可除去的结构，其在插入凝胶前体时存在于微流体通道网络中，并在凝胶胶凝化时除去。
[0097] 在间充质细胞引入微流体通道网络后，使用水性介质、优选生长培养基，或者通过使用凝胶(前体)，使间充质细胞在微流体通道网络中增殖和/或分化。间充质细胞的增殖持续一段时间，直至微流体通道网络的至少一部分被间充质细胞覆盖。在使细胞在微流体通道中培养时，它们典型地形成管状结构，所述管状结构可以用通过管状结构的腔(即，细胞的、面向远离通道壁的那一侧)的流灌注。
[0098] 换言之，一旦将间充质细胞引入微流体通道网络后，使间充质细胞生长、分化、扩增和分裂从而使细胞在微流体通道网络中形成细胞的片、层、群。
[0099] 在其中没有凝胶存在于微流体通道网络中的实施方案中，细胞可形成至少部分粘附至通道的(刚性)壁的细胞的片、层或群。
[0100] 在一些实施方案中，且将在下文详述，微流体通道网络的一部分包含凝胶，其中凝胶前体不具有间充质细胞，并且其中例如间充质细胞使用水性介质引入通道。在此类实施方案中，间充质细胞可在微流体通道网络中存在的凝胶上、以及在不由凝胶形成的通道的(刚性)壁(例如，微流体通道网络的塑料或玻璃壁，取决于制成壁的材料是何种类型)上形成细胞的群或片或层。
[0101] 在其中间充质细胞使用凝胶前体引入通道的实施方案中，使细胞在凝胶中生长、分裂、增殖和/或分化，和/或在凝胶外侧生长至微流体通道网络中。
[0102] 关于微流体通道网络的覆盖，这涵盖了间充质细胞仅存在于凝胶中、仅存在于通道中，以及存在于凝胶和通道中。在优选的实施方案中，间充质细胞覆盖细胞所引入的微流体通道的整个领域(并可因此形成管状结构)。这可称为100％汇合。汇合为常用作估计微流体装置中的贴壁细胞数的术语，是指被细胞覆盖的表面的占比。例如，50％汇合意指大致一半的表面被覆盖。当层称为汇合时，约100％的凝胶表面被细胞覆盖，且不再留有空间让细胞以单层生长。
[0103] 100％汇合、或覆盖微流体通道网络(在其中引入或监测细胞的领域)不是必要的，且更低的覆盖百分比，例如10、20、30、40、50、60、70、80或90％，可以适当地用于本发明。例如，间充质细胞可仅存在于凝胶中。在该后一种情况中，间充质细胞不必须地或优选地在通道壁上生长，但优选在(ECM)凝胶内侧以细胞簇生长。
[0104] 如本领域技术人员将理解的，在其中间充质细胞借助于凝胶前体引入微流体通道网络的实施方案中，没有必要在本发明方法的下一步骤中使间充质细胞在引入上皮细胞之前增殖和/或分化。还可在包含间充质细胞的凝胶胶凝化之后将上皮细胞引入通道中，并使间充质细胞和上皮细胞一起增殖和/或分化。
[0105] 然而，优选使间充质细胞在上皮细胞引入培养系统之前增殖和分化。时间的长度取决于各种因素，如引入的间充质细胞的类型、引入方法、引入的细胞数、用于增殖和/或分化细胞的生长培养基的组成、温度等等。例如，时间可以为至少20分钟，至少1小时，至少6小时，至少12小时，至少24小时，至少1、2、3、或4天。典型地，该时间不超过14天。本领域技术人员在确定适用于本发明的培养条件方面将没有问题。
[0106] 接下来，将上皮细胞引入其中存在间充质细胞的微流体通道网络。
[0107] 可用于本发明的上皮细胞可为具有上皮特征、或者能够分化成具有这些特征的细胞的任何类型的细胞。典型地，上皮细胞为外胚层或内胚层来源。当提及上皮细胞时，我们还意指具有向作为本发明的对象的上皮细胞分化的能力的祖细胞和干细胞。
[0108] 上皮细胞或者一种或多种上皮细胞可为单层上皮，例如单层鳞状上皮，如间皮或内皮。可选地，上皮细胞可为复层上皮，如表皮细胞或柱状上皮细胞。此类细胞可包括肾、结肠、小肠、肺、视网膜的上皮细胞。上皮细胞可为分化的上皮细胞或上皮祖细胞。上皮祖细胞意指具有上皮潜能的多能细胞，例如能够分化成上皮细胞的细胞。
[0109] 上皮细胞可为新生儿或成人细胞。优选地，上皮细胞为哺乳动物细胞，更优选人上皮细胞。上皮细胞可为新鲜分离的细胞或多次传代的细胞。上皮细胞可为初级细胞或(永生化)细胞系。上皮细胞可从健康组织或病变组织分离。上皮细胞可包括多于一种类型的上皮细胞。在一些实施方案中，以不同比例混合两种以上类型的上皮细胞并使其在间充质细胞上生长。
[0110] 优选地，上皮细胞选自单层上皮细胞、单层鳞状上皮细胞、复层上皮细胞或柱状上皮细胞，优选其中上皮细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。
[0111] 在优选的实施方案中，用于本发明方法的上皮细胞从体外培养的类器官获得，例如如US2012/0196312中所记述的。类器官中的细胞可以在引入微流体通道网络之前处理，从而提供例如单细胞或细胞的(例如2-50个细胞的、优选不超过20、10个细胞的)团块(clumps)。
[0112] 在一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞具有相同的来源，即来自同一类型的动物或来自同一动物。优选地，上皮细胞和间充质细胞来自同一身体部位。
[0113] 在一些实施方案中，上皮细胞和间充质细胞来自不同的来源，即来自不同类型的动物，或来自同一类型的动物的不同身体部位或同一动物的不同身体部位。在一些实施方案中，上皮细胞来自病变组织和间充质细胞来自健康组织。在一些实施方案中，间充质细胞来自病变组织和上皮细胞来自健康组织。在一些实施方案中，细胞来自肿瘤。
[0114] 还提供的是，在步骤a)中引入不同类型的间充质细胞和/或其中在步骤c)中在同一微流体通道中引入不同类型的上皮细胞。这允许研究更复杂的上皮系统，例如允许研究不同类型的上皮细胞之间、或来自健康和病变组织的上皮细胞之间的相互作用。
[0115] 上皮细胞可通过任何合适的手段引入微流体通道网络。优选地，细胞可使用水性介质引入。细胞可分散在所述介质中并通过使介质进入包含间充质细胞的微流体通道网络而引入微流体通道中。本领域技术人员将理解的是，一旦细胞引入微流体通道，应允许细胞沉降并开始增殖。优选地，所用的水性介质为适于上皮细胞、优选上皮和间充质细胞的增殖的介质。此类介质的组成在本领域中广泛公知且可以使用任何合适的生长培养基，如果需要则补充有额外的(生长)因子。在上皮细胞沉降并粘附后，提供向细胞提供营养素和氧的合适的生长培养基，使上皮细胞(和间充质细胞)增殖和/或分化。生长培养基可以流的形式提供或不以流的形式提供。在流的情况下，生长培养基还可除去或稀释由细胞产生的代谢废物。
[0116] 在上皮细胞引入包含间充质细胞的微流体通道网络之后，使细胞在微流体通道网络中增殖和/或分化。在使细胞在微流体通道中培养时，它们典型地形成管状结构，所述管状结构可以用通过管状结构的腔(即，细胞层的、面向远离通道壁的那一侧)的流灌注。
[0117] 管状结构意指细胞衬贴未被ECM凝胶覆盖的灌注流通道的大部分通道表面、以及ECM凝胶本身的面向其中引入有上皮细胞悬浮液的灌注流通道的表面。管状结构典型地沿着整个通道长度从一个入口向另一入口形成。此外，所述入口允许接近小管的内侧或内腔。在介质流的情况下，将流施加至上皮小管的腔侧(luminal side)。典型地，这与上皮的顶侧(apical side)是一致的。
[0118] 上皮细胞的增殖持续一段时间，直至由所引入的间充质细胞形成、并包括所引入的间充质细胞的生物材料的至少一部分，被由所引入的上皮细胞形成、并包括所引入的上皮细胞的生物材料覆盖。换言之，将间充质细胞和上皮细胞培养允许形成上皮细胞层的一段时间，所述上皮细胞层与间充质细胞、包括在间充质细胞和上皮细胞培养期间形成的任何基膜或基膜样结构紧密接触。例如，该时间可为至少20分钟，至少1小时，至少6小时，至少12小时，至少24小时，至少1、2、3或4天。典型地，所述时间为至少6小时，至少22小时，或至少
1、2、3或4天。通常该时间不超过14天。
1、2、3或4天。通常该时间不超过14天。
[0119] 关于间充质细胞的覆盖，在优选的实施方案中，上皮细胞覆盖由间充质细胞覆盖的整个领域。然而，100％覆盖在微流体通道网络(在其中引入或监测细胞的领域)中的间充质细胞不是必要的，并且更低的覆盖百分比，例如10、20、30、40、50、60、70、80或90％，可适当地用于本发明。然而，在本发明中，上皮细胞的至少一部分必须与间充质细胞和/或细胞培养期间形成的任何基膜和/或基膜样结构紧密接触。
[0120] 举例来说，如本文所详述的，间充质细胞可以仅存在于在微流体通道中存在的凝胶的表面上，和/或在间充质细胞借助凝胶前体引入通道中的那些实施方案中存在于凝胶的表面内和表面上。当在凝胶的表面上或在其附近有间充质细胞的领域的至少一部分被上皮细胞覆盖时，将上皮细胞理解为覆盖间充质细胞的至少一部分。
[0121] 下文详述地，且在高度优选的实施方案中，间充质细胞在微流体通道网络中形成管状结构，且在管状结构内允许上皮细胞增殖，从而在优选的实施方案中，在间充质细胞的所述管状结构内形成管状结构，其中间充质细胞至少部分地被上皮细胞覆盖。再者，在此类实施方案中，间充质细胞和/或在细胞培养期间形成的任何基膜和或基膜样结构与上皮细胞紧密接触。
[0122] 本发明发现，例如当与现有技术中的一些方法相比时，所述上皮细胞、和/或间充质细胞更近似于体内发现的上皮和/或间充质细胞。这可通过由体内情况所特有的特定基因表达的细胞、通过更近似于体内形态的形态、通过提高的上皮屏障功能、通过顶和基底侧膜的存在和作用、或甚至是通过绒毛、隐窝、纤毛组织、粘膜层的存在、和/或上皮细胞的片或层中不同地分化的细胞的存在来证明。上皮细胞层可在介质中和从介质中分泌和/或吸收不同类型的物质。最重要的是，细胞可分化成原始组织的各种谱系。
[0123] 在本发明的方法中，还可将凝胶前体引入微流体通道网络并使凝胶前体在微流体通道网络中胶凝化从而占据微流体通道网络的至少一部分。在一些实施方案中，如上所述，凝胶前体可包含间充质细胞，然而还预期将凝胶引入不包含间充质细胞的微流体通道网络。
[0124] 举例来说，凝胶前体可引入通道中并使其在间充质细胞例如借助于水性介质引入微流体通道网络之前胶凝化。
[0125] 在这些实施方案中，微流体通道网络的壁部分地由凝胶形成。再一次地，引入的凝胶前体可以包含或可以不包含间充质细胞。
[0126] 如果引入其中不存在间充质细胞的凝胶，间充质细胞可使用水性介质、优选提供营养素和氧的生长培养基引入通道中。经此介质，细胞可引入通道中，从而使它们靠着凝胶沉积并使间充质细胞例如在凝胶上形成细胞的片、群或层。
[0127] 如前所述，在使细胞在微流体通道中培养时，它们典型地、但不必然地形成管状结构，所述管状结构可以用通过管状结构的腔(即，细胞的、面向远离通道壁的那一侧)的流灌注。因此，在一些实施方案中，首先将凝胶提供至通道以便在胶凝化后可借助于介质如培养基将间充质细胞引入通道中，使细胞接触凝胶并在凝胶上形成细胞层(如片、或管状结构或导管(vessel))。接下来，可借助于介质如培养基将上皮细胞引入通道中，使上皮细胞接触间充质细胞并在间充质细胞上形成细胞层(如片、或管状结构或导管)，从而产生顶和基底侧。
[0128] 管状结构的意思是说，不期望间充质来源的细胞如在上皮的情况中的那样形成紧密层。然而上皮已知形成紧密连接，具有含刷状缘和纤毛的鹅卵石形状，间充质来源的细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞形成松散网络而无紧密连接。上皮表达上皮细胞标志物如E-钙黏素和绒毛蛋白，而间充质细胞表达间充质细胞标志物如α-SMA和波形蛋白。
[0129] 其中凝胶前体用于引入间充质细胞的实施方案和其中凝胶前体不用于引入间充质细胞的实施方案二者中，多种凝胶可彼此相邻地图案化。多种凝胶可通过注射凝胶前体、通过毛细管压力屏障停止前体的前进、并且引起前体在网络(通道)的不同部分依次地或同时胶凝化来图案化。第一细胞类型在第一凝胶前体中悬浮，然后第二细胞类型在第二凝胶前体中悬浮，导致所谓的分层共培养，其中细胞类型彼此相邻地培养。凝胶优选与一个或多个通道壁接触/靠着一个或多个通道壁沉积。
[0130] 凝胶定义为基本上稀释的交联系统，其一旦胶凝化便维持在适当的位置，但允许通过凝胶的间隙流。凝胶通常为通过流体在整个体积中膨胀的非流体胶体网络或聚合物网络。水凝胶(hydrogel,aqua gel)是溶胀剂为水的凝胶。在本发明的方法的范围内，凝胶材料可为优选不溶于水但含有水从而具有二维或三维支撑结构的含水凝胶。在本发明中，使用的凝胶允许物质在所述凝胶中或上的扩散。
[0131] 本发明中使用的凝胶不特别限制，只要层具有上述性质并且允许细胞层在凝胶上形成即可。通常使用的凝胶包括来自生物来源的凝胶，包括胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、基质胶和/或琼脂糖，以及基于多种支架的合成凝胶，例如PEG(聚乙二醇)、肽、PLLA(聚-L-丙交酯)、PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸(lactic-co-glycolic acid))。
[0132] 多种技术可用于图案化凝胶，即用凝胶填充微流体通道的部分，包括但不限于光固化凝胶的光刻图案化，使用例如柱、疏水补片或相位引导件的基于毛细力的图案化，和选择性沉积。
[0133] 优选地，凝胶优选通过使用毛细管压力屏障、通过UV图案化、或通过在胶凝化后将针缩回、或通过具有在胶凝化后除去的牺牲层来图案化。
[0134] 如上所述，在步骤a)中引入的间充质细胞可分散/悬浮在凝胶前体中，或者可优选地使用水性介质、和当凝胶(如其中没有分散间充质细胞的凝胶)存在时在凝胶旁边引入微流体通道网络。
[0135] 在本发明方法的优选实施方案中，在步骤b)中间充质细胞增殖，直至在微流体通道网络和/或凝胶中至少形成间充质细胞的群/层/片。在本发明的方法中培养的间充质细胞可形成细胞的片或层。此类片或层可为单层但也可由多于一层组成，且沿着片层(sheet)展现不同的厚度。所述片或层可为任何尺寸。
[0136] 优选地，在步骤b)中间充质细胞增殖，直至在微流体通道网络中至少形成间充质细胞的管状结构。在本发明的范围内，间充质细胞的管状结构为细胞形成的结构，所述细胞通过从微流体通道网络的入口向出口生长、从而衬贴通道和/或凝胶表面的大部分。本领域技术人员理解，该结构不需要为完全“圆形的”管，而实际上可以具有任何形式，例如由微流体通道网络的壁和/或凝胶的形式所决定的。然而，管状结构不一定必须遵循通道的形式，而是可以适应任何类型的不规则或规则形式，包括例如圆形的或更矩形的管。
[0137] 优选间充质细胞形成如本发明范围内所定义的管状结构，这是因为这允许上皮细胞引入所述管状结构内并以管状形式覆盖间充质细胞。发现此类“管中管”或双管组织的表型特征(如本文公开的那些)近似于体内组织。
[0138] 像对间充质细胞那样，同样地且优选地，在步骤d)中上皮细胞增殖，直至在微流体通道网络中至少形成上皮细胞的群/层/片。技术人员理解，上皮细胞可覆盖未被间充质细胞覆盖的微流体通道网络的一部分，如壁或表面，如果存在的话包括任何凝胶，但部分的间充质细胞还会被上皮细胞覆盖。本发明方法中培养的上皮细胞可形成细胞的片或层，取决于所用上皮细胞的类型，所述细胞的片或层可为单层或者由不同层形成(例如，当使用复层上皮组织的细胞时会发生)。层可沿着片层展现不同的厚度。片或层可为任何尺寸。
[0139] 优选地，在步骤d)中上皮细胞增殖，直至在微流体通道网络中至少形成上皮细胞的管状结构。在本发明的范围内，上皮细胞的管状结构为细胞形成的结构，所述细胞通过从微流体通道网络的入口向出口生长、从而衬贴被间充质细胞覆盖或未被间充质细胞覆盖的通道和/或凝胶表面的大部分。本领域技术人员理解，结构无需为完全“圆形的”管，而实际上可以具有任何形式，例如由微流体通道网络的壁和/或凝胶的形式、和/或由间充质细胞的形式所决定的。然而，管状结构不一定必须遵循通道的形式或者间充质细胞片的形式，而是可以适应任何类型的不规则或规则形式，包括例如圆形的或更矩形的管。
[0140] 如果在步骤a)中在凝胶中引入间充质细胞(即，使用凝胶前体引入)，优选在方法的步骤d)中，上皮细胞增殖，直至上皮细胞的至少一群/层/片覆盖凝胶的至少一部分，所述凝胶占据微流体通道网络的至少一部分。
[0141] 然而，在本发明的范围内，优选间充质细胞和上皮细胞均形成管状结构，其中上皮细胞层的特征在于紧密连接形成，间充质细胞层的特征在于细胞的松散网络。因此，提供本发明的方法，其中在步骤d)中上皮细胞在由间充质细胞形成的管状结构的内侧形成管状结构。还在本实施方案中，间充质细胞至少部分地被上皮细胞覆盖，或者换言之，上皮细胞被间充质细胞至少部分地衬贴。推测由于间充质细胞和上皮细胞的紧密接触，与例如采用transwell系统或包含其它类型的支持体、过滤器或膜的方法相比，优化了细胞之间例如通过分泌性因子或信号传导分子如wnt家族、刺猬蛋白家族(音猬因子、印度刺猬因子)、头蛋白、BMP、r脊椎蛋白、notch家族的成员和其它因子的通讯。
[0142] 在此情况下，可优选在中空微流体通道(即微流体通道网络中)样品中的生长培养基不流动或者流动，其中所述流动是单向或双向的。特别地，如果管状结构由间充质细胞或上皮细胞或优选二者获得，可优选施加通过管状结构的内腔的生长培养基流。
[0143] 举例来说，施加这样的流可进一步引发上皮细胞采用类似于体内情况的表型，例如也类似于在体内情况下液体流施加至上皮细胞时。
[0144] 另一实例，所述流可用于引入或除去介质中的物质，例如待试验对上皮功能或反应的影响的药物。
[0145] 技术人员理解，本发明的方法中使用的生长培养基的组成不特别限制。取决于例如所用细胞的环境，可期望生长培养基补充有特定的因子(信号传导分子、生长因子、信号通路的抑制剂和/或激活剂)，如Wnt、头蛋白、egf/fgf、notch配体和/或R脊椎蛋白及本文所述的其它因子。这些因子已知对于维持上皮的干细胞生态位是有益的，这反过来对于谱系细胞(pedigree cell)向目标上皮的亚系的增殖和分化是重要的。例如，对于小肠类器官的情况而言，发现将这些因子添加到悬浮于基质胶中的细胞，产生由干细胞、肠细胞、杯形细胞、帕内特细胞、肠内分泌细胞组成的完整的隐窝-绒毛结构。
[0146] 一种或多种因子可以在培养间充质细胞的阶段和/或在培养间充质细胞和上皮细胞二者的阶段提供。
[0147] 一种或多种因子可存在于整个细胞培养过程中或仅在有限的时间内存在(例如1-24小时，48小时，72小时，1、2、3、4、5、6、7或更多天)。
[0148] 一种或多种因子可从上皮细胞的顶侧或从上皮细胞的基底侧、或从两侧呈递至细胞。
[0149] 一种或多种因子可为本文所述的一种或多种信号通路的抑制剂或激活剂(例如，刺猬信号通路、Wnt信号通路、BMP信号通路)。还预期的是，首先细胞用特定的信号通路的抑制剂处理，随后用同一通路的激活剂处理，反之亦然。还预期的是，细胞在顶侧用激活剂处理、在基底侧用同一通路的抑制剂处理，反之亦然。一种或多种因子可同时使用。
[0150] 还预期应用一种或多种因子的浓度梯度，例如从顶侧至基底侧，或沿着中空通道从入口至出口。梯度可为线性或非线性的。因子的浓度可根据培养阶段而变化。
[0151] 因子可使用生长培养基或经由凝胶来供应，例如在培养之前分散在凝胶中或在培养期间提供至凝胶。
[0152] 对于因子，可以使用靶向一个、二个、三个或更多个信号通路的一种、两种、三种、四种或更多种的任意组合。
[0153] 非限制性但优选的因子、待靶向的信号通路、其抑制剂和激活剂(如因子)包括：
[0154] -骨形态发生蛋白(BMP)的激活剂和抑制剂。BMP构成一组关键的形态发生信号，协调整个身体的组织架构。
[0155] 合适的BMP信号传导抑制剂的实例包括但不限于参与BMP信号传导抑制的分子，所述BMP信号传导通过BMP(骨形态发生蛋白)与BMP受体的结合来介导，所述分子包括抑制剂如头蛋白(头蛋白，也称作NOG，是参与包括神经组织、肌肉和骨等多种身体组织的发育的蛋白质；例如浓度为10-500ng/ml)、脊索发生素和促滤泡素抑制素。具有此类性质的小分子BMP抑制剂的其它实例包括抑制能够激活转录因子SMADl、SMAD5或SMAD8的BMP2、BMP4、BMP6或BMP7的化合物，例如Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-A]嘧啶)(P.B.Yu等人(2007),Circulation,116:11 60；RB.Yu等人(2008),Nat.Chem.Biol.,4:33-41；J.Hao等人(2008),PLoS ONE(www.plozone.org),3(8):e2904)。另外，BMP I型受体激酶抑制剂的实例包括LDN-193189(即，4-(6-(4-(哌嗪-l-基)苯基)吡唑并[l,5-a]嘧啶3-基)喹诺酮；Yu PB等人，Nat Med,14:1363-9,2008)。LDN-193189可商购自例如Stemgent。
[0156] 合适的BMP信号传导激活剂的实例包括BMP(属于转化生长因子-β(TGFB)超家族；例如BMP1、BMP2、BMP4、BMP7等(例如，浓度为0.1ng/ml-250ng/ml介质)。
[0157] -Wnt信号传导的激活剂和抑制剂。Wnt信号通路为由通过细胞表面受体传递信号至细胞内的蛋白质组成的一组信号转导通路。已经表征了三个信号通路：经典Wnt通路、非经典平面细胞极化通路和非经典Wnt/钙离子通路。所有这三种通路都由Wnt蛋白配体与卷曲家族受体的结合来激活，将生物信号传给细胞内散乱的蛋白质。Wnt包括350-400个氨基酸长的分泌性脂质修饰的信号传导糖蛋白的多样的家族。出现在这些蛋白质上的脂质修饰的类型为以23-24个半胱氨酸残基的保守模式棕榈酰化半胱氨酸。
[0158] 合适的Wnt激活剂的实例包括但不限于，BML-284；2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)苄氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶或DKK1抑制剂；(1-(4-(萘-2-基)嘧啶-2-基)哌啶-4-基)甲胺，和R-脊椎蛋白家族的蛋白质，包括R-脊椎蛋白-1(如，浓度为0.01-5微克/ml介质)和无翅型MMTV整合位点家族的蛋白质，包括Wnt3a等(如，浓度为至少50、100、500、1000ng/ml，例如在50-1000ng/ml之间)。
[0159] Wnt信号传导抑制剂的实例包括XAV-939、PORCN抑制剂Wnt-C59(C59)、LGK-974、ICG-001、IWP-2、IWP-L6和许多其它抑制剂。
[0160] -合适的还有GSKβ抑制剂和/或激活剂。糖原合酶激酶-3(GSK-3)为脯氨酸引导的(proline-directed)丝氨酸-苏氨酸激酶，其起初被鉴定为糖原合酶的磷酸化剂和失活剂。两个异构体，α(GSK3A)和β，显示高度的氨基酸同源性。GSK3B参与能量代谢、神经元细胞发育和躯体图式形成。
[0161] GSKβ抑制剂的非限制性实例包括CHIR-99021(CT99021)、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、丙酮肟、和AZD2858、LiCl(如浓度为0.1mM-100mM)。CHIR 99021或CHIR98014可以例如以介质中至少约1μM至约20μM的浓度使用。
[0162] -另一实例为表皮生长因子或EGF，其为通过结合其受体EGFR来刺激细胞生长、增殖和分化的生长因子。人EGF为含有53个氨基酸残基的6045-Da的蛋白质。EGF可例如以5-200ng/nl、优选10-100ng/ml、例如50ng/ml的浓度的使用。
[0163] -Notch通路的激活剂和抑制剂。Notch信号通路为大多数多细胞生物体中存在的高度保守的细胞信号传导系统。哺乳动物具有四种不同的notch受体，称为NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。notch受体为单次跨膜受体蛋白。Notch信号传导促进神经发生过程中的增殖信号传导，且其活性被Numb抑制，从而促进神经分化。Notch信号传导通路对于细胞间通讯是重要的，其涉及控制胚胎和成人生命中多种细胞分化过程的基因调控机理。Notch通路调控剂的实例包括γ-分泌酶抑制剂如DAPT(例如浓度为0.1-50微摩尔)、和/或FLI-06、LY411575、二苯并氮杂卓(Dibenzazepine)、司马西特(Semagacestat)、L658等。
[0164] -另一实例，作为生长因子家族的成纤维生长因子或FGF，成员参与血管生成、创伤修复、胚胎发育和各种内分泌信号通路。FGF为肝素结合蛋白，并且已显示与细胞表面相关硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用对FGF信号转导是至关重要的。FGF是各种各样的细胞和组织的增殖和分化过程中的关键角色。
[0165] -此类因子的另一实例为转化生长因子β(TGF-β)，其为属于TGF-β超家族的多功能细胞因子，所述TGF-β超家族包括三种不同的亚型(isoforms)(TGF-β1-3)和许多其它信号传导蛋白。
[0166] -内皮素-1
[0167] -PDGF-B和PDGFA，血小板源生长因子亚基B和亚基A。该家族的成员为间充质来源的细胞的有丝分裂因子，且特征在于八个半胱氨酸的基序。
[0168] -包括刺猬蛋白的刺猬信号传导的激活剂和抑制剂。刺猬信号通路为将信息传递至正常发育所需细胞的信号通路。哺乳动物具有三种刺猬蛋白同系物，DHH、IHH和SHH，其中音猬(SHH)研究得最好。用于本发明的合适的蛋白因子包括Shh、Ihh和Hh，例如浓度为0.01-10mg/ml，优选0.1-1mg/ml，或更低。抑制剂包括LDE 225、萨瑞德吉(saridegib)、BMS
833923、LEQ 506、PF-04449913和TAK-441。
833923、LEQ 506、PF-04449913和TAK-441。
[0169] 这些因子是技术人员已知的，且其知晓如何在本发明的范围内使用这些因子。
[0170] 最近的研究表明，间充质来源的饲养层的使用(在此情况中为有丝分裂失活的3T3成纤维细胞)使得类器官能够在扁平transwell基板上生长，而不使用基质胶(X.Wang,Y.Yamamoto,L.H.Wilson,T.Zhang,B.E.Howitt,M.A.Farrow,F.Kern,G.Ning,Y.Hong,C.C.Khor等人,Nature,522(2015),pp.173–178)。在此，似乎也可以分化为小肠的基本亚型。然而，transwell的刚性基板不允许次级形态的自由产生，且本发明人明确，分化由于这一点以及缺乏流动状态而受到限制。
[0171] 利用本发明的方法可以在间充质饲养层的存在下培养上皮细胞，在优选的实施方案中，靠着凝胶如细胞外基质凝胶培养，由此除了生长具有明确的顶/基取向和具有灌注的可能性的管状结构以外，还提供形成次级形态的充分柔性。对于与凝胶接触的那些细胞，完全不存在(刚性)壁或过滤器(如织物过滤器)。
[0172] 如上所述，优选上皮片或管状结构被间充质细胞衬贴，其中间充质细胞位于微流体通道网络的壁和上皮细胞之间。换言之，还提供的是间充质细胞的至少一部分位于微流体通道网络壁和上皮细胞之间。
[0173] 还提供的是，在步骤d)中允许上皮细胞形成具有顶和基底侧的细胞层，所述基底侧面朝间充质细胞。对于顶-基极化重要的是存在ECM/基膜。另外，灌注流的使用产生很好极化的小管。
[0174] 极化细胞的顶膜为质膜的向内面向内腔的表面。极化细胞的基底侧膜为质膜的形成其基面和侧面的表面。在体内，其面朝间质(interstitium)，且远离内腔。本发明中，基底侧膜为面向、或紧密接触间充质细胞和/或凝胶如细胞外基质凝胶的膜。上皮细胞彼此形成紧密连接，产生紧密结合膜。各个质膜结构域具有独特的蛋白质组成，包括允许某些化合物沿着基底或顶端的方向跨膜转运的特定的转运蛋白。
[0175] 如上所述，间充质细胞的至少一部分与上皮细胞的至少一部分紧密(或直接)接触。在本发明的范围内，这表示上皮细胞与间充质细胞直接地或者经由在根据本发明的培养期间形成于细胞之间的基膜的存在来相互连接。典型地，间充质细胞片与上皮细胞片之间的距离为基膜的厚度或小于基膜的厚度(例如，优选小于100微米，更优选在10微米的范围内)。技术人员理解的是，在本发明的范围内，基膜为上皮细胞与间充质细胞之间的结构和功能界面，在上皮细胞的生长和控制机理中是重要的。基膜的厚度可以根据例如上皮的类型或位置、身体的状况而变化，并且可以具有例如30-300nm、如100nm的值(参见，如Dockery等人，Hum.Repr.Update(1998)4(5):486-495)、小于本领域中使用的膜和过滤器的值的厚度。
[0176] 还提供的是，所述方法还包括通过除去存在于包含上皮细胞的微流体通道网络中的水性介质使所述上皮细胞经受空气。经受空气可以在使间充质细胞和上皮细胞增殖、优选形成管状结构之后进行。当使用在体内条件下也会经受例如在肺、皮肤或肠中的空气的上皮细胞时，本实施方案是特别优选的。
[0177] 技术人员理解的是，上皮细胞可以经受各种各样的条件，不限于空气，但可包括经受其它气体、流体、药物和化合物、食品组分。甚至预期细胞经受例如胃肠道或阴道上皮的内腔中的细菌。
[0178] 还提供的是，微流体细胞培养系统包含培养室，在所述培养室中引入步骤a)中的所述间充质细胞和步骤c)中的所述上皮细胞。这样的室由此形成微流体通道网络。
[0179] 在优选的实施方案中，其中引入有细胞的微流体通道网络的特征在于，存在构造成提供通向细胞的流路的第一部分和/或构造成提供离开所述细胞的流路的第二部分，优选往来于包含间充质细胞和上皮细胞的培养室。这允许生长培养基通过通道并沿着存在于通道中、例如培养室中的细胞流动。
[0180] 关于凝胶，当存在凝胶时，凝胶可设置在微流体通道网络中或在与微流体通道网络相邻的通道中，和其中所述凝胶与所述微流体通道网络直接接触。在这两种情况中，凝胶由此覆盖或形成其中引入有细胞的微流体通道网络的壁的一部分。
[0181] 甚至可以为如下的情况：与凝胶相邻地存在其它微流体通道网络，其与凝胶接触，但其中所述通道不与包含上皮细胞的微流体通道直接接触。例如如果在与将要引入细胞的通道相邻的通道中存在凝胶，凝胶由此形成该通道的壁的一部分。在凝胶的另一侧，可以存在其它通道，并且可以例如用于提供含有营养素或化合物的凝胶，或者可以用于收集由细胞分泌的物质。
[0182] 可选地，凝胶可存在于灌注通道的两侧。本实施方案的优势在于最大凝胶表面暴露于小管。凝胶可从多个入口或一个共同入口引入。特别地，当与毛细管压力屏障如相位引导件一起工作时，在弯月面阻塞时凝胶前体的弯月面延伸至灌注通道中，使得截面中存在弧形弯月面。这可以有利于实现待形成的小管的更球形的截面。
[0183] 还提供的是，在本发明的方法中，微流体细胞培养系统提供通向微流体通道网络中的细胞和/或通向凝胶和/或通向其它微流体通道网络的不间断光路。这将允许不间断的测量、检测或观察在中空通道/微流体通道网络中培养的细胞。所述方法还可包括在培养期间或在利用本发明方法的培养细胞的使用中，捕获微流体培养系统中细胞、凝胶和/或微流体通道网络的多个图像。
[0184] 还提供的是，与步骤a)-d)任一步同时或在其之后，将细胞与试验化合物接触。试验化合物可为任何类型的化合物，例如药物、在食品或在血液中发现的物质。甚至预期试验化合物为细菌、真核细胞(包括例如血细胞)的病毒。此类化合物对上皮功能的影响可通过与不存在此类化合物的条件进行比较来确定。
[0185] 如技术人员所理解的，利用本发明的方法在微流体系统中得到的细胞可用于各种各样的环境(setting)。例如，用于评估跨上皮屏障的转运，毒性研究，与微生物组的共培养，食物吸收研究，炎症研究，提供用于对健康和患病状态下的上皮功能的机械研究的疾病模型例如炎性肠病、囊性纤维病、COPD、哮喘、癌症等。技术人员理解在此类实验环境的背景下如何使用根据本发明培养的细胞。使用根据本发明的微流体系统允许可靠的高通量测试。
[0186] 还提供组合物或系统，其包含具有微流体通道网络的微流体细胞培养系统，所述微流体通道网络包含细胞内群和细胞外群，其中所述细胞内群至少部分地被所述细胞外群覆盖，其中所述内群的细胞为上皮细胞和所述外群的细胞为间充质细胞，优选其中所述细胞内群和所述细胞外群相互作用或直接接触。换言之，还提供微流体细胞培养装置，其中包含间充质细胞层和上皮细胞层，彼此紧密接触且如本文所述。优选地，间充质细胞和上皮细胞为如本文所述的管状结构的形式。
[0187] 另外，还提供使用包含微流体通道网络的微流体细胞培养系统培养和/或监测上皮细胞的方法，所述方法包括：
[0188] a)将上皮细胞和间充质细胞的混合物引入所述微流体通道网络，其中使用水性介质将细胞混合物引入所述微流体通道网络；
[0189] b)允许间充质细胞和上皮细胞增殖，优选直至微流体通道网络的至少一部分被细胞覆盖。
[0190] 最后，提供一种微流体细胞培养系统，其包含间充质细胞和上皮细胞，优选其中所述间充质细胞和上皮细胞形成管状结构，或者提供一种微流体细胞培养系统，其包含可通过本发明的培养和/或监测上皮细胞的方法得到的间充质细胞和上皮细胞。
[0191] 技术人员将理解的是，此类含有间充质细和上皮细胞的微流体细胞培养系统提供重要的优势。利用此类系统，例如可以为消费者提供已经包含适当的细胞的准备就绪的系统(例如用于测试)，或者提供仅需要有限的进一步培养和处理的系统。这改进了当使用利用本发明方法培养的细胞时所得的实验数据的再现性和质量。将理解的是，微流体细胞培养系统可由此包含可以处在如本文所述的任何发育阶段的间充质细胞和上皮细胞。
[0192] 技术人员理解，关于有关该方法的各种实施方案和优选，可以参考整个说明书和权利要求书中在此记述的各种实施方案和优选，只要适用于本方法即可。
[0193] 现在已经一般性地描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不意图限制本发明。
[0194] 实施例
[0195] 实施例1
[0196] 材料和方法
[0197] 在肠道的发育模式化期间以及建立隐窝-绒毛轴会需要刺猬蛋白Wnt和BMP信号。在体内，肠上皮细胞相互作用并依赖于来自下方的间充质的信号。肠间充质细胞动态地促进上皮-间充质相互作用，调节上皮增殖和分化。
[0198] 为了在肠道的微流体模型中建立隐窝-绒毛轴，我们使用从如(Sato,T.等人，2011,Gastroenterol)所记述的人肠组织样品建立的肠类器官培养物。还可使用来自小鼠、犬科、猫科动物等的类器官。
[0199] 将类器官埋入接种于48或24孔板中的10-50微升(microl)的ECM(如，基质胶，优选基质胶、BME(Cultrex基底膜提取物、BME2))，并用250-750微升的基础培养基覆盖，所述基础培养基包括补充有青霉素/链霉素的高级Dulbecco改良Eagle培养基/F12、1x Glutamax、10mmol/L HEPES、1x N2、1x B27(全部来自Life Technologies)，50ng/ml鼠科EGF，1mmol/L N-乙酰半胱氨酸(Sigma)，100ng/ml鼠科头蛋白，1μg/ml人R-脊椎蛋白-1，1mM胃泌素，10mM烟酰胺，10μΜSB202190，500nM A83-01，50％Wnt3a条件培养基或200(300、400、500以上)ng/ml重组Wnt3a蛋白(R&D)。每2-3天更换全部培养基，每周以1:2(或1:3、1:4、1:5)传代类器官。
[0200] 为了模拟肠道发育，我们使用了间充质细胞，优选肠道来源的(例如，小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠成纤维细胞、人成纤维细胞、肠成纤维细、平滑肌细胞、肠肌成纤维细胞，优选人的)间充质细胞，并以ECM中1E6或5E6或10E6或15E6或20E6个细胞/ml的密度接种于凝胶(其可例如为胶原I、IV、Hystem c、基质胶)中的2-道或3-道，或者接种于由补充有pen/strep、1x NEAA、1xGlutamax的DMEM(或EMEM或RPMI培养基)中的10或15％的FCS组成的培养基与ECM的组合。ECM和培养基之比可为例如9:1或8:1或7:1或6:1或5:1或3:1或2:1或1:1。
[0201] 在另一实验中，靠着ECM引入间充质细胞，例如肠道来源的(肠成纤维细胞、肠肌成纤维细胞，优选人的)间充质细胞。在温育间充质细胞约0-72小时或更久后，将上皮肠类器官细胞引入与间充质细胞相邻的通道。
[0202] 下方间充质的图案化对于上皮细胞的图案化和隐窝形成会是重要的。在肠道发育期间，间充质细胞集中在隐窝周围区域(pericryptal regions)，这将为肠上皮中的隐窝形成提供诱因。辅助隐窝形成的、由间充质集中的细胞产生的主要因子之一为Wnt蛋白。
[0203] 发现可以通过提供趋化信号如TGFβ、内皮素1、PDGF-B、PDGFA和刺猬蛋白(Shh、Ihh、Hh)动员肠间充质细胞形成集中的细胞簇。肠间充质产生许多不同种类的Wnt蛋白。
[0204] 在一个实验中，方法为：间充质细胞可以接种至含有树脂的凝胶中，所述树脂浸泡有这些诱因的组合之一(例如Affi-凝胶珠(Bio Rad,153–7302)浸泡在hrSHH中(例如PBS中的0.1至1mg/mL；R&D Systems；1845-SH)，并在凝胶中接种间充质细胞来诱导细胞集中)。接下来，将肠类器官细胞(通过使用TrypLE达5min制备的细胞的单个细胞或2-5个细胞簇)引入ECM中的下一通道，或者靠着ECM引入。细胞可以以1E6或5E6或10E6或15E6或20E6个细胞/ml的密度接种。
[0205] 在中间道中含有一种类型的ECM的微流体培养装置的3道设计中，可在在珠上含有集中诱因(琼脂糖珠浸泡有化学引诱物/信号传导分子)的凝胶中引入间充质细胞。接着，将上皮细胞引入相邻通道之一。
[0206] 极化的上皮细胞依赖于细胞间接触并且当遭破坏时经历细胞凋亡。因此，在上皮细胞解离期间或之后提供Rock激酶抑制剂从而增加细胞的存活率会是重要的。优选地，可使用10μM Y27632Rock抑制剂。
[0207] 上皮细胞最初向顶和向底地保持在基础培养基中例如1或2或3或4天。然后将肠上皮细胞通道中的培养基的Wnt3a耗尽，但在远端通道培养基中补充额外的wnt3a蛋白。这在培养肠干细胞来源的上皮结构时会特别有利，这是因为Wnt蛋白将提供在管的一侧上维持隐窝样结构的信号，并且Wnt在其它通道中的降低的浓度将支持上皮屏障的分化。
[0208] 发现在装置中重现体内肠中发现的细胞微环境和例如Wnt信号的信号传导梯度对于功能性肠组织的装配是有利的。例如，至少100ng/ml以上浓度的Wnt3a重组蛋白优选用于建立该信号的梯度。为了扩大该处理的作用，应当用R-脊椎蛋白(如R-脊椎蛋白1)蛋白质以例如50ng/ml以上的浓度建立同样的梯度。Wnt3a条件培养基和R-脊椎蛋白1条件培养基也可用于建立这类梯度。R-脊椎蛋白条件培养基的浓度可优选10％以上。Wnt3a条件培养基的浓度可优选为50％以上且优选不小于30％。
[0209] GSKβ抑制剂小分子CHIR激活经典Wnt通路。在装置中肠上皮的初始扩增(expansion)阶段的过程中，例如当以3μM以上的浓度使用时，CHIR分子会替代Wnt3a或R-脊椎蛋白1蛋白质的使用。可能不期望CHIR分子建立Wnt信号传导梯度，这是因为该小分子与蛋白质相反，会在培养中迅速扩散。另一GSKβ抑制剂LiCl可以以例如1mM多至30mM的浓度代替CHIR来使用。
[0210] 在体内，Bmp信号分子(如BMP4)通过下方的间充质产生和释放。BMP信号传导为肠干细胞提供分化信号。因此重现BMP抑制剂(如头蛋白)的梯度来支持干细胞室(stem cell compartment)的活跃增殖(其被BMP抑制)并允许与体内发现的对应物类似的肠道的隔离和分化可以是有利的。
[0211] 包含头蛋白的培养基可在装置的一侧提供，例如在隐窝的“底部”供给。该信号的梯度可例如在上皮细胞达到汇合之后(或之前)建立。耗尽头蛋白的培养基可在工程化管的顶侧提供。当需要分化状态的特定表现如在顶侧产生粘蛋白时，该方法会特别有益于肠衬里的成熟。
[0212] EGF对于体内和体外维持肠干细胞和祖细胞也会是重要的。另外，当向顶补充时(例如补充有母乳)，可防止新生儿中正在发育的肠的细胞凋亡和坏死。因此，在整个培养期可以保持例如不小于10ng/ml且不超过100ng/ml、优选50ng/ml的浓度的EGF补充，从而支持上皮细胞的增殖并抑制这些细胞中的细胞凋亡。
[0213] Notch通路活性对于肠上皮的增殖状态是重要的，且当用例如γ-分泌酶抑制剂抑制时，可导致肠组织终末分化成例如杯形细胞。因此提供Notch通路抑制剂的短期脉冲从而增强杯形细胞成熟用于产生粘蛋白可以是有益的。γ-分泌酶抑制剂(如10μM DAPT)可优选在装置中的上皮细胞初始增殖后使用。
[0214] 在例如上皮细胞接种后3天之后或者在上皮细胞层达到汇合之后，γ-分泌酶抑制剂可加入顶侧培养基以诱导杯形细胞的生长停滞和成熟。培养基可耗尽γ-分泌酶抑制剂以防止干细胞生态位(隐窝)的损失，优选例如在γ-分泌酶抑制剂的存在下连续培养5天内(例如在12h或24或48h后等等)进行。该处理可改善通过成熟杯形细胞的黏膜层产生，同时从基侧(更接近于隐窝)用Notch抑制剂短处理和强Wnt激动剂处理可确保干细胞生态位将被保留。
[0215] 这种两种细胞的随后接种接着用关键通路的激动剂和抑制剂处理的时期，将确保成熟管状肠迷你器官的成功发育。
[0216] 实施例2-间充质细胞和上皮细胞的连续接种
[0217] 对于本实验，使用如图1所示的具有400微米宽的道的3-道(MIMETAS)。将以5000个细胞/实验的浓度接种在ECM凝胶(参见后述)中的肠肌成纤维细胞注射在凝胶道(103)中。其后，EMEM培养基(如下所述)中的CaCO-2细胞以20,000个细胞/实验的浓度注射在灌注道(102)中。接下来，将Caco-2细胞培养7天(在肌成纤维细胞的存在下)。在第三微流体通道(106)中，存在smGM培养基(平滑肌生长培养基；Lonza)。在第7天时，拍摄相衬图像，其结果示于图29A和29B。
[0218] 从这些图中可以看出，Caco-2细胞进入包含肌成纤维细胞的凝胶道，与肌成纤维细胞相互作用并在顶部形成层。另外，本试验示出，在Caco-2细胞与肌成纤维细胞相互作用的情况下形成次级形态和组构。箭头指向看起来类似于例如在结肠或小肠中发现的隐窝或绒毛形态的这类结构，并且与体内情况极为相似。
[0219] EMEM培养基：
[0220] EMEM(ATCC,Cat.No.30-2003)
[0221] Pen/Strep 1％(Sigma,Cat.No.P4333)
[0222] MEM非必需氨基酸溶液(100X)1％(Gibco,Cat.No.11140-050)
[0223] FBS HI 10％(Gibco,Cat.No.16140-071).
[0224] ECM凝胶：
[0225] 胶原I 5mg/mL(AMSbio Cultrex 3D胶原I鼠尾，5mg/mL，#3447-020-01)[0226] i.1M HEPES(Life Technologies 15630-122)
[0227] ii.37g/L NaHCO3(Sigma S5761-500G))
[0228] SmGM-2平滑肌生长培养基-2
[0229] SmGM-2完全培养基：
[0230] -SmBM基础培养基(Lonza,CC-3156)
[0231] -SmGMTM-2SingleQuotsTM补充剂和生长因子(hEGF、胰岛素、FGF-B、FBS和庆大霉素/两性霉素B)
[0232] 实施例3：间充质细胞/上皮细胞管
[0233] 对于本实验，使用具有400微米宽的道的2-道 (MIMETAS)。
[0234] 在将2-道 置于灌注摇床(7°倾斜角，8min振摇周期)上的情况下，以总计起始浓度为5000个细胞/μL培养细胞，即在上皮细胞生长培养基MV2(Promocel,Cat:C-
22022)中的vvHUVEC-RFP内皮细胞(Angiocrine,细胞传代4次)和在周细胞培养基(Pericyte Medium)(Sciencell)中的脑血管周细胞(Sciencell,细胞传代4次)的4:1混合物。
22022)中的vvHUVEC-RFP内皮细胞(Angiocrine,细胞传代4次)和在周细胞培养基(Pericyte Medium)(Sciencell)中的脑血管周细胞(Sciencell,细胞传代4次)的4:1混合物。
[0235] 在培养3天后，使用Actin-Green染色细胞。使用共聚焦显微镜(Leica,TCS SP5STED)得到形成的管的图像。使用(Schindelin,J.；Arganda-Carreras,I.&Frise,E.等人(2012),"Fiji:an open-source platform for biological-image analysis",Nature methods 9(7):676-682,PMID 22743772.)中的3D查看器Fiji插件建立3D投影。结果示于图31。可以看出，间充质细胞和上皮细胞能够形成包含上皮细胞和周细胞二者的管。
[0236] 现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在宽范围的等效参数、浓度和条件下进行相同的操作，无需过多的实验。
[0237] 虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是将理解其能够进一步修改。本申请旨在覆盖本发明的任何变化、使用或适应，所述变化、使用或适应一般地遵循本发明的原理，并且包括在本发明所属领域内的已知或惯常实践范围内的、以及可以适用于在所附权利要求的范围内的如上所述的基本特征的从本公开的偏离。
[0238] 本文引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要，公开的或相应的专利申请、专利或任何其他参考文献，都通过引用整体并入本文，包括引用的参考文献中呈现的所有数据、表格、附图和文本。另外，本文引用的参考文献中引用的参考文献的全部内容也通过引用全部并入。
[0239] 对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的参考不以任何方式承认在相关领域中公开、教导或建议本发明的任何方面、描述或实施方案。
[0240] 具体实施方案的前述描述将充分地揭示本发明的一般性质，使得其他人可通过应用本领域技术范围内的知识(包括本文引用的参考文献的内容)，在不脱离本发明的一般概念的情况下，容易地修改和/或适应这类特定实施方案的各种应用，无需过多的实验。因此，基于本文给出的教导和指导，这些适应和修改旨在落入所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。要理解的是，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员结合本领域普通技术人员的知识根据本文提供的教导和指导来解释。
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