技术领域
[0001] 本
发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种脱细胞韧带或肌腱支架的制备方法。
背景技术
[0002] 韧带和肌腱损伤后修复后愈合能
力差是临床上常见的问题，这使得多种替代物应用于韧带和肌腱的修复重建。其中异体、异种韧带和肌腱移
植物材料支架有韧带和肌腱支架的固有特点，随着脱细胞技术及灭菌技术的发展，宿主对异体、异种韧带支架的免疫排斥和
疾病传染已大大降低，使得韧带和肌腱脱
细胞支架在临床应用成为可能。目前韧带和肌腱脱细胞韧带支架制备方法往往联合应用物理、化学和酶法行脱细胞，其中
去污剂的使用为脱细胞的重要步骤。文献上报道韧带或肌腱脱细胞的物理方法、酶法及常规
试剂应用差别不大，但对去污剂的选用方法报道不一，脱细胞结果也不一致。(参见文献1.Gratzer PF，Harrison RD，Woods T.Matrix alteration and not residualsodium sulfate cytotoxicity affects the cellular repopulation of a decellularizedmatrix.Tissue-Eng.2006；12(10)：2975-83.2.Whitlocka PW，Smitha TL，Poehlinga GG，Shilta JS，Dykeb MV.A naturally derived，cytocompatible，andarchitecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.Biomaterials 2007；28：4321-4329.3.Woods T，Gratzer PF.Effectiveness of threeextraction techniques in the development of a decellularized bone-anteriorcruciate ligament-bone graft.Biomaterials 2005；26：7339-7349.)韧带和肌腱是致密的结缔组织，
纤维束内外有内膜和外膜包绕使得细胞成分脱除困难，所以脱细胞周期长，脱细胞过程对细胞外基质破坏较大。各种脱细胞试剂进行脱细胞的同时，也干扰细胞外基质结构，因此减少脱细胞试剂的使用可以减轻对细胞外基质的影响，更有利于细胞粘附和生长。
[0003] 点阵激光是介于有创和无创
治疗之间的微创治疗技术，近年来常用于美容术。激光激透组织的同时可以减少周围组织的损伤[Jih MH，Kimyai-Asadi A.Fractional photothermolysis：a review and update.Semin Cutan Med Surg.2008Mar；27(1)：
63-71]。目前尚无报道点阵激光在制备韧带/肌腱脱细胞支架过程中的应用。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种制备韧带/肌腱脱细胞支架的方法。
[0005] 本
发明人在制备韧带/肌腱脱细胞支架过程中发现，完整的外膜/腱膜具有与外界屏障的作用，同样阻碍细胞成分的脱除。脱细胞过程中，但当外膜/腱膜完整时，残留的细胞成分主要堆积在外膜/腱膜下方，肌腱内部残留细胞成分少量，而外膜/腱膜不完整处，基质内细胞成分脱除彻底。
[0006] 将肌腱腱膜切开后进行脱细胞，发现使用低渗液脱细胞48h后，腱膜切开段细胞脱除彻底，而腱膜完整段细胞无明显脱除。
[0007] 可见切开肌腱腱膜有利于细胞脱除，可以明显减少脱细胞试剂的使用，从而减少对细胞外基质的干扰。但是肌腱腱膜具有维持胶原纤维结构作用，过度的切开肌腱腱膜脱细胞96h后见胶原结构明显松散。
[0008] 因此我们认为理想的韧带/肌腱的外膜/腱膜切开方法必须具备(1)、切开腱膜的深度合适，不能破坏胶原结构；(2)、腱膜切开均匀，比例合适，不能适当的切开肌腱腱膜有利于细胞脱除，不影响
生物力学。
[0009] 本发明提供了一种组织工程制备脱细胞韧带或肌腱支架的方法，该方法在脱细胞前，先用5％-20％击孔率，5-10mJ
能量的点阵激光，对韧带的外膜或肌腱的腱膜进行处理。
[0010] 本发明提供了一种组织工程制备脱细胞韧带或肌腱支架的方法，1)取动物韧带或肌腱；2)在脱细胞前，先用JC25C CO2型超脉冲点阵激光，5％-20％击孔率，5-10mJ能量，对韧带的外膜或肌腱的腱膜进行处理；3)常规脱细胞方法漂洗，用低渗液持续脱细胞4-7天，每隔24h换液一次。所有步骤均在摇床(150-200RPM)进行，均加5ml/L青霉素/
链霉素溶液(10000U/ml10000mg/ml)溶液
预防感染，完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。根据不同动物的韧带/肌腱结构致密程度，酌情使用或不使用去污剂；4)脱细胞完成后，低温干燥后常温干燥保存。
[0011] 韧带和肌腱的外膜/腱膜的厚度及细胞外基质结构致
密度取决于动物的种类、部位和大小等因素。因此，使用点阵激光的击孔率和激孔能量须根据取材的不同进行调节。
[0012] 用JC25C CO2型超脉冲点阵激光，选用5％-20％击孔率，5-10mJ能量，能激透韧带/肌腱的腱膜，并对腱膜下胶原影响小，
激光束直径约160μm。脱细胞前，用点阵激光对韧带/肌腱的外膜/腱膜进行处理，再使用低渗液持续脱细胞96-168h，发现能脱除髌韧带内部绝大部分细胞细胞核脱除较彻底，点阵激光击穿处少量组织
凝固，周围胶原结构正常，腱膜下含少量细胞核成分。点阵激光处理韧带或肌腱外膜后，生物力学无明显改变，细胞相容性好。
[0013] 现有文献报道脱细胞方法表明，脱细胞方法均使用去污剂Triton-X100、十二烷酸钠(SDS)、三
磷酸丁酯(TBP)等一种或几种联合应用。脱细胞周期1-2周不等，本脱细胞方法动物实验表明，脱细胞周期短，大大减少去污剂适用，甚至不用去污剂。
附图说明
[0014] 图1是脱细胞组标本组织HE切片图(100倍)
[0015] 其中A是苏木素
染色)，B是伊红染色。
[0016] 图2是对照组标本组织HE切片图
具体实施方式
[0017] 下面结合附图及
实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0018] 实施例：兔韧带脱细胞支架制备和评价
[0019] 1、取材：选用新西兰家兔(约3kg，第二军医大学动物实验中心提供，下同)，完整
切除髌韧带及其胫腓骨止点，清除韧带外滑膜组织，必须保证韧带外膜完整，无菌PBS液中4℃保存。
[0020] 2、点阵激光处理：将髌韧带表面PBS液用无菌纱布汲干，用JC25C CO2型超脉冲点阵激光(美国科医人公司)，选用10％击孔率，5mJ能量，处理髌韧带腱膜。
[0021] 3、髌韧带脱细胞处理，取正常兔髌韧带做比较。
[0022] (1)脱细胞步骤如下：
[0023] 10mM的低渗tris缓冲液+丝
氨酸蛋白酶
抑制剂(0.05％苯甲基磺酰氟化物
乙醇溶剂，35ml/L 50ml乙醇+25mgPMSF)，持续120h，每隔24h换液一次。所有步骤均在室温、摇床(150RPM)进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液(10000U/ml 10000mg/ml)溶液预防细菌繁殖，完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。
[0025] 取脱细胞后两组标本给予
石蜡包埋，切片(5μm)、HE染色观察。观察细胞核成分(苏木素染色)，胶原排列形态(伊红染色)，与正常肌腱作比较。点阵激光处理韧带膜后脱细胞96h后见细胞脱除彻底(图1)；髌韧带外膜未处理组见细胞无明显脱除(图2)[0026] (3)兔韧带脱细胞支架的生物力学检测
[0027] 取12条脱细胞韧带中间纵向12mm×1mm2部分，作为生物力学检测样本，取相同部位、相同大小的12条新鲜髌韧带作为比较。使用生物力学仪(Instron 5544，Needham，MA)检测生物力学性能，持续牵拉，测试样本中间断裂为准。其中2个脱细胞韧带在钳夹端断裂，不纳入比较。使用独立样本t-检验分析脱细胞对生物力学的影响。结果见
弹性模量、最大位移、最大
载荷均没有统计学差异(详见表1)，说明脱细胞前后髌韧带生物力学无明显改变。
[0028] 表1DCA法脱细胞对韧带生物力学的影响
[0029]
