本発明は光ビームシェーパに関し、特に、光照射装置で使用するためのビームシェーパとその使用方法に関するが、これに限定されない。 例えば、光照射（及び走査）は、蛍光検出のシステム及び方法で使用される。

蛍光検出の使用例として、核酸検査（ＮＡＴ）があげられる。 これは、疾病の遺伝的素因を検出したり、ＲＮＡの発現レベルを測定したり、又は、感染症を引き起こすバクテリア及びウィルスなどの病原体を同定するための分子診断における中核的要素である。

多くの場合、特に病原体の同定においては、妥当な試料量に存在する標的ＤＮＡの量が極めて少なく、このことが直接検出を不可能にしている。 検出可能な量の標的物質を得るためには、増幅技術が必要である。 様々な増幅技術が提案されており、実際に日常的に使用されている。 最も広く使用されているものは、所謂ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいている。

増幅は、高温（通常はセ氏９０度よりも高い）での二本鎖ＤＮＡの変性、低温（およそ６５度）でのＤＮＡ試料へのプライマーの特異的結合、及び（およそ７０度での）プライマー位置から開始する元の配列の複製を含む。 この手順が繰り返され、各サイクルにおいて特異的配列を持つＤＮＡの量は倍増される（１００％の効率で進行する場合）。

増幅後、標的ＤＮＡの存在は、例えばキャピラリーでの電気泳動分離後、又は、増幅産物が流される表面上のスポットに適用される所謂キャプチャープローブへのハイブリダイゼーション後に、増幅された標識ＤＮＡの蛍光強度を測定することによって検出される。

蛍光検出のための標準的な技術は、走査型共焦点顕微鏡の使用である。 通常は、小さな（１μｍ未満）回折限界のスポットが、焦点面での蛍光を励起するために使用される。 システムの検出部では、この単一励起点から得られる光のみが検出される。

多数のスポット又は完全なラインの同時励起は、検出システムの共焦点性に大きな影響を及ぼすことなく、走査速度の増加を可能にすることがこれまでに提案されている。 画素化検出器は蛍光放射を検出するために使用することができる。 しかしながら、共焦点検出を可能にするスリットと組み合わせた単純なフォトダイオードの使用に基づく、より小型の検出器を使用することもまた提案されている。

共焦点ライン走査のための励起ビームを作り出すために、所謂非点収差を加える円柱レンズなどの光学素子を加えることによって、焦点スポットで走査を行うように光学装置を修正することが提案されている。 ビームの断面がｘｙ平面として定義される場合、ビーム中の各光線は座標（ｘ，ｙ）で特徴付けられる。 ｘ軸上、座標（ｘ，０）の光線が、ｙ軸上、座標（０，ｙ）の光線と異なる焦点を持つ場合、ビームは非点収差的である。

円柱レンズを使用すると、試料から反射され、集光レンズ（対物レンズ）によって集められる光は、最早平行ビームにはならない。 光は常に少なくとも１つの方向に発散する。 このことは、光がオートフォーカス又はトラッキングの目的で使用される際には、余分な労力を必要とし得る。

この発散は、広視野蛍光顕微鏡でも起こり得る。 そうした顕微鏡では、試料の広範囲を照射するために励起光の焦点がぼかされる。

本発明の目的はとりわけ、光ビーム内に発散を導入することなくビーム整形をもたらすことである。

本発明は独立請求項によって定義される。 従属請求項は有利な実施形態を定義する。

本発明によれば、光ビームシェーパが提供される。 この光ビームシェーパは、光ビームに非点収差を導入するために使用することができるが、直交偏光状態を有する光ビームへの非点収差を取り消すためにも使用することができる。

光ビームシェーパは、複屈折材料から形成される回折素子を有することができる。 これは例えば複数のゾーンを有してもよく、各ゾーンは、例えば４、５、又は５より多くのステップなど、複数のステップを画定する段階的厚さを有する。 この構成部品は、入射する平行光ビームに非点収差を導入するために使用することができる。

本発明によれば、光ビームシェーパを用いて試料を照射するための光学装置がさらに提供される。

従って本発明の光ビームシェーパは、ライン焦点又は広域焦点が得られるように、入射光の焦点をぼかすために使用することができる。 しかしながら、再度光ビームシェーパを通過する反射光は、再度（実質的に）平行にされる。

光学装置は、試料から反射される光を検出する第一検出器を有する。 この検出は、フォーカス及びトラッキングなどについて試料上の照射状態を調査する働きをしてもよい。 好ましくは、光学装置は、試料から反射され、第一検出器によって検出される光の分析に基づいて結像系を制御するための、例えばオートフォーカスシステムなどのコントローラをさらに有する。 従って、反射光は標準的なオートフォーカス及びトラッキングの方法のために使用することができる。 このことはスプリットビーム経路が使用される際に特に重要である。 スプリットビーム経路の構成では、光路の一部が、走査中に他の光路に対して移動している。 例えば光源とオートフォーカス検出器は固定されるが、一方対物レンズは試料を完全に調べるために走査される。 この結果、対物レンズと第一信号検出器との間の距離に変動が生じる。

これらの素子間の光が平行にされない場合、信号検出器上のビームの直径は対物レンズの位置に応じて変化する。 これは焦点位置に好ましくない変動をもたらす。 従って、スプリットビーム経路設計においては、可動部と固定部との間のビームが原則的に平行にされることを確実にすることが重要である。

従って、偏光調整装置の目的は、この装置を通る２度の通過後の偏光に直交変化をもたらすことである。 例えば、位相調整部材は四分の一波長板を有する。

試料を照射する光は、例えばライン幅が回折限界であるようなライン焦点を有するように設定することができる。

システムは好ましくは結像系を走査するための手段を有し、そしてコントローラはフォーカス及びトラッキングシステムを有する。

光源２４は、例えばレーザダイオード、若しくは発光ダイオード、又は任意の他の適切な光源を有してもよい。

本発明によれば、本発明にかかる光学系を組み込む検出装置が提供される。 この検出装置は、照射ビームによって生成される、及び試料から生じる放射を検出することができる第二検出器を有する。 とりわけこの検出光が、試料の情報を得るために使用される。 この検出装置は光学系のあらゆる利点を享受し、改良された試料検査と、比較的単純かつ安価な装置を提供する。

本発明によれば、光ビームを処理する方法、及びその処理方法を用いて試料を照射する方法もまた提供される。

照射方法は、試料を照射するステップが、偏光調整されたビームを試料全体にわたって走査するステップを有し、結像系を制御するステップが、走査するステップを制御するステップを有することを特徴とする、ステップを有してもよい。

本発明の実施例は添付の図面を参照して詳細に説明される。

図１は既知の蛍光スキャナを示す。

図２は本発明の光学系の動作を概略的に示す。

図３は本発明にかかる光ビームシェーパの一実施形態を示す。

図４は図３の光ビームシェーパに対するゾーン位置を示す。

図５は計算されたビームシェーパ構成の一実施例を示すための表である。

本発明は、例えば光ビームの偏光に応じて光ビームに位相パターンを加える位相板の形をとる、光ビームシェーパの使用に関する。 板は、等しい大きさであるが逆符号の位相パターンを２つの直交偏光状態に加える。 さらに、一実施形態では、光ビームシェーパは直線ゾーンを持つ回折素子であり、かつ複屈折材料から作られることが好ましい。

光ビームシェーパは、バイオセンシング手順の一部として、その後の検出のために試料中の蛍光を励起するために使用される検出装置の一部となり得る。

方法は、対物レンズを通る光放射によって蛍光色素分子を励起すること、及び、例えば反射モードにおいて同じレンズを通して発光を集めることによって、装置内の蛍光色素分子を検出することで知られている。 発光放射は、適切な波長帯を選択するためにフィルタ装置を通過させた後、センサ装置上に投影される。 目的の試料の上を走査することができるように、レンズは異なる駆動手段によって三方向に制御された方法で動かすことができる。 共焦点イメージング装置が通常は使用される。

図１は既知の蛍光スキャナの基本的構成部品を示す。 調査される試料は基板２０内の所定体積中に閉じ込められる。 レーザなどの光源２４によって生成される光は、試料中の蛍光を励起するために使用される。 光源から発する光はコリメータレンズＬ１によって平行にされる。 平行光ビームはその後、偏光ビームスプリッタ２１、四分の一波長板２２、バンドパスフィルタ２３、及びダイクロイックビームスプリッタ２５、すなわちレーザ光を励起レンズ２６へと向ける波長依存反射器、を通過した後、励起レンズ２６を用いて試料中で焦点を合わせられる。

レンズ２６は、好ましくは三次元全てにおいて、試料に対して動かすことができる。 この相対運動は任意に分離されてもよく、例えば、試料はｘ‐ｙ平面内で移動することができ、レンズはｚ方向に移動することができる。 あるいは、試料は固定されたままにすることができ、レンズは単独で三自由度（ｘ‐ｙ‐ｚ）を全て有する。 任意の他の構成もまた可能である。

誘導された蛍光（試料中に焦点を合わせられた励起光の結果として）は、この実施例では励起レンズ２６と同じ構成部品である集光レンズによって集められ、検出器２８の方へ向けられる。

反射された未吸収のレーザ光は全てビームスプリッタ２５によって再度反射されるが、一方蛍光輝度はビームスプリッタ２５を通過させられる。 第二バンドパスフィルタ２７がさらなるフィルタリングをもたらし、光はその後、検出器上に試料を結像する結像レンズＬ２によって、検出器２８上に焦点を合わせられる。

光電管増幅器、アバランシェ光子検出器、ＣＣＤ検出器、又はフォトダイオード検出器などの多くの様々な種類の検出器を使用することができる。

共焦点イメージングでは、励起体積は最小に、理想的には励起レンズ２６が作成可能な回折限界スポットに抑えられる。 通常の共焦点体積は、励起レンズ２６の強度（開口数、ＮＡ）に応じて、立方ミクロンのオーダーである。 この体積内で作られる蛍光は、集光レンズによって集められ、検出器上に結像される。 共焦点法では、焦点は検出経路内の一点と焦点を共有する。 この検出経路内の点には、通常、焦点以外の位置から入ってくるあらゆる光をフィルタ除去するために小さなピンホールが置かれる。

ピンホールを通過する光は検出器の方へ向けられる。 検出器の横方向のサイズが、結像レンズＬ２の焦点距離で除される集光レンズ２６の焦点距離で拡大縮小される焦点のサイズに一致しなければならないという条件で、検出器自体がピンホールの役目を果たすことが可能である。

この共焦点モードは、終点バイオ実験の結果として、表面固定化分析を行うのに最適である。 全試料を分析するためにその表面が走査される。

検出器の横寸法は、集光レンズ２６と結像レンズＬ２の視野を考慮して設計される。

制御装置２９は、同じ表面を走査する間、対物レンズの焦点を、被分析物と接触している分析装置の内部表面に正確に維持する。 対物レンズの焦点はまた、故意にオフセットさせることもできる。

本発明は特に図１のシステムへの修正に関わり、これは焦点を共有するスポットではなく、焦点を共有するラインの形で励起ビームをもたらすように構成される。 あるいは、本発明は光源を励起体積中へと焦点をぼかすために使用することができる。 本発明は偏光依存位相板を用いる。

概念は図２を参照して説明される。

図２ａは標準的な光路を示す。 明確にするため、光路は展開されている。 入射光３６は焦点レンズ４０によって試料４２上に焦点を合わせられ、反射光は同じ焦点レンズ４０によって集められる。 その結果反射光３８は完全に平行である。

図２ｂに示されるように、焦点の位置を修正するために、屈折素子４４が入射ビーム３６の中に置かれる。 ここで光がレンズ４０によって焦点を合わせられると、図示のように焦点は試料４２の前になる。 反射光はレンズ４０によって集められ、再度屈折素子４４を通過する。 最終的な出射ビーム３８は平行には走らない。

図２ｃは本発明の光学系を概略的に示す。 入射ビーム３６は直線偏光し、素子４８はビームに位相パターンを加える。 これは屈折素子４４と同じ効果を持つ。 光は四分の一波長板５０を通過する。 この場合もやはり、レンズ４０は試料４２の前で焦点を合わせる。 反射光はレンズ４０によって集められ、その後四分の一波長板５０を再度通過する。 従って偏光は、素子４８に再度衝突する時、９０度にわたって回転されていることになり、これが、入射ビームに加えられたものと符号は逆であるが等しい大きさを持つ位相パターンを加える。 この結果出射ビーム３８は再度平行になる。

好ましい実施形態では、位相板は、一軸配向に凍結された光重合性液晶ポリマーなどの複屈折材料から作られる回折素子である。

そのような材料の一実施例は、波長λ＝６６０ｎｍにおいて、正常屈折率（配向軸に垂直な偏光の場合）ｎ _ｏ ＝１．５３２３と、異常屈折率（配向軸に平行な偏光の場合）ｎ _ｅ ＝１．６６７９を持ち、平均屈折率ｎ＝１．６００１と複屈折性Δｎ＝０．１３５６を与える。

回折構造は多数のゾーンから成り、その各々はＮステップから成り、好ましくはＮ＝４又はＮ＝５である。 各ステップは、基準ステップｈ _０ ＝０として、高さｈ _ｊ （ｊ＝０，１，…，Ｎ−１）を持つ。 この構造は図４に断面で示される。 従って、構造はゾーンの繰り返しセットとして画定され、各ゾーンは同じステップ高分布を持つ。

図３では、回折ビームが入射ビームの偏光に応じて非点収差を生じる（図の面内、又は図の面に垂直）。 非点収差の量は、両偏光に対して大きさは等しいが逆の符号を持つ。

その結果、２つの偏光モードに対する各ステップの位相（波長λの場合）は次の通りである。

位相構造はビームを異なる回折次数に分割する。 その目的は、ｅモードに対する＋１次（−１次）の回折効率と、ｏモードに対する−１次（＋１次）の回折効率を最大化するためである。 その場合、等しい大きさであるが逆符号の位相パターンが、２つのモードに対するビームに可能な限り高い効率で加えられる。 Ｎステップの回折格子に対する最大効率は［ｓｉｎ（π／Ｎ）／（π／Ｎ）］ ^２であり、これはＮ＝４の場合は８／π ^２ ＝８１％に、Ｎ＝５の場合は２５（５−√５）／８π ^２ ＝８８％に単純化する。 最適条件は次の場合に見られる。

_ｏ,ｊとｍ

_ｅ,ｊは整数である。 Ｎ＝４の場合の両モードに対して約７９％、Ｎ＝５の場合の両モードに対して約８５％の回折効率を与える高さｈ

_ｊのセットを見つけることが可能である。 設計の一実施例は下記の表で与えられる。

この表は、ｏモードの場合の＋１次と、ｅモードの場合の−１次に対して与えられる屈折率の値に対して、Ｎ＝４ステップの回折格子の設計を与える。 括弧内の位相値は理想値を与える。

可能な応用例としては、光が対物レンズによって焦点を合わせられる際に、焦点がおよそ１００μｍの長さのラインに引き伸ばされるように、ビームに非点収差を加える位相パターンを提供することがある。

ゾーンとステップの位置と幅は、作成される必要な非点収差関数から得られる。 非点収差関数は次の通りである。

_ｐは位相素子によって作られる焦点距離である。 必要な収差関数はｘのみに依存するので、ゾーンはｙ方向に配向された直線縞である。 その結果、非点収差焦点ライン間の距離は次の通りである。

ａは瞳の半径であり、ＮＡは対物レンズ開口数、ｎは中に焦点を合わせる媒体の屈折率であり、焦点ラインの長さは次の通りである。

例えば、ＮＡ＝０．６０、ｎ＝１．３３、ａ＝１．７５ｍｍ、必要なＬ＝１００μｍとすると、その結果はｆ _ｐ ＝１１４ｍｍとなる（この分析では位相素子と対物レンズ間の距離は無視される。もしこれが考慮される場合は、わずかな差が生じる）。

ゾーンｋ−１とゾーンｋの間の境界はＷ＝ｋλで定義される。 その結果、瞳の縁におけるゾーンの幅は次の通りである。

図４は、瞳からの半径が増加するにつれてゾーン幅が減少することを示し、初期ゾーン幅はおよそ０．４ｍｍで、最終ゾーン幅はおよそ０．０４ｍｍである。 各ゾーン内にはサブゾーンステップがある。 図５では、サブゾーンステップもまた徐々に幅が減少することが見てとれる。 図５は、図５に示された第一ステップに対応して、第二ゾーン（サブゾーン５）がｘ＝０．３８７９３７で開始することを示す。 従って、図５におけるステップの位置はサブゾーン４，８，１２，１６，…などに対応する。

図５の表は１．７５ｍｍの最大直径に対する計算から得られる。 従って最終ゾーンは最大値１．７５ｍｍの範囲内に収まるように変更され、２０．５の予想位相には達しない。 表中の値ローは、０と１の間にのびる正規化された直径である。

位相板基板の基準面より上の各ステップの高さは上記表から得られる。

ライン焦点を提供するために、回折ステップは上記で説明した通りｙ方向のラインであり、図５で言及された"半径"が原則的に直線寸法である。 この場合、構造はゼロ対称であり、すなわちステップ値はｘの負と正の値に対して同じである。

第二の実施例では、上記と同じレンズ（ＮＡ＝０．６０、ｎ＝１．３３、ａ＝１．７５ｍｍ）が使用される際、直径１００μｍの円形スポットをもたらすように位相パターンを設計することができる。 この場合収差関数はｘとｙの両方に依存する。 最終結果は図３と図６に記載されたものと同様のステップパターンとなるが、設計は直線ではなく円形パターンを含む。 従って図５で言及された"半径"が真の半径となる。

ライン走査法では、焦点面内のラインの方向は高速走査方向に垂直に配置される。 これはレーザとビームシェーパの組立品を回転させることによって実現することができる。

フォーカス及びトラッキング装置は、オートフォーカスエラー信号を生成する標準的な象限検出器とすることができる。 好ましい方法は、例えば米国特許４０７９２４７号に記載の非点収差焦点法である。 この方法では、反射光が非点収差レンズ（例えば円柱レンズ）を通って、４つのセグメントを持つセグメント化検出器上に焦点を合わせられる。 システムは、試料が結像レンズの理想的な焦点内にある時に、光が４つの検出器全てに対して等しく当たるように調整される。 試料が理想焦点位置のいずれかの側に置かれる時、これは水平又は垂直な非点収差ラインをもたらす。 非点収差励起ビームが採用され、反射光が補正されない標準的なライン走査システムでは、反射ビーム中の固有非点収差が、検出される焦点エラー信号における大きなオフセットになる。 このことは、オートフォーカス目的で使用される光学系の完全な再設計を必要とする。 本発明で示されるように、反射ビーム中の非点収差を補正することによって、オートフォーカスシステムへの変更は全く必要ない。

上記の実施例では、レンズ２６は照射光と反射光の両方に対して、フォーカス及びトラッキングのために、実際には蛍光照射のために使用される。 しかしながら、例えば非正常方向の照射の場合、又は透過モードでの操作の場合、別々のレンズが使用されてもよい。

可能な偏光依存ビーム整形素子のただ１つの詳細な設計が与えられている。 ビーム整形素子は、ビームがレンズ２６を通過した後に所望の照射形状をもたらすように設計されることが明らかである。 従って、詳細な設計はシステム内の他の光学部品（レンズＬ１、レンズ２６、バンドパスフィルタ２３）、及びビーム整形素子を形成するために使用される材料の複屈折性に依存する。 当業者は、上記で説明された技術を用いて適切なビーム整形素子を設計することができ、従って単一の実施例は本発明の範囲を限定するものと取られるべきではない。

本発明は図２に示されたシステムに単一の追加構成部品として実装することができ、偏光ビームスプリッタ２１と四分の一波長板２２との間に挿入することができる。 しかしながら、本発明は図２に示された単一の実施例以外の他の光学的励起／検出装置に適用することができる。

本発明の構成部品のただ１つの用途のみが上記で記載されている。 しかしながら、この構成部品は他の用途を有してもよく、ここでは最初の光学的過程では光ビーム整形を実行するが、その後の光学的過程ではビーム整形の非点収差効果を取り消すことが望まれる。

本明細書に記載された実施形態の様々な改作が存在する。 従って、例えば、本発明は蛍光色素分子を用いて蛍光を発する試料に関して記載されている。 しかしながら、本発明は一般的に光学的信号を発する装置において一般的に使用されてもよい。 従って、照射ラインビームの一部を吸収する試料が測定され、残りのラインビーム光が集められ、その成分、又は、例えば標識物質などの成分検出を容易にする追加物質、のうちの１つ以上の存在、同定、及び／又は濃度に関して、試料の成分に関する手がかりを与えるようになっていてもよい。 同様に、試料によって引き起こされるラインビームの反射の効果が検出過程で使用されてもよい。 あるいは、ラインビームは、集めて検出することができる発光放射が生じるように、試料の成分又は追加物質のうちの１つ以上を励起するために励起源として機能してもよい。 本明細書で発光とは蛍光及び／又はリン光を含むことを意味する。

概して、本発明は試料の照射のためのラインの生成に関する。 照射ラインは前文で記載したように検出装置において役立つ。 本発明は、検出過程を高速化するためにライン走査又は共焦点ライン走査に特に関心を寄せている。 しかしながらある場合には、表面の領域を覆う走査は必要ないかもしれない。 本発明はその時にもまたその利点を提供する。

本発明は概して、試料が体積試験又は表面上で試験される必要があるような試料分析の分野で適用可能である。 従って本発明の応用例は、ライン励起を必要とする分析法であってもよい。 これらは気体、液体、及び／又は固体の試料に対する分析もまた含む。

従って本発明は、その成分を決定するためなど、試料の化学分析のために使用されてもよく、又は、化学的、若しくは生物化学的、若しくは生物学的過程の進展若しくは進行を調べるために使用されてもよい。 改良された走査速度は、単位時間当たりより多くのデータ点の収集を可能にし、改良された動的測定をもたらす。

生物分析の分野に限定されることなく、本発明の好ましい応用例は、例えば増幅後の核酸、タンパク質、又は他の生物化学的若しくは生物学的要素の検出に基づく分子診断の分野にある。 さらに好ましい応用分野は、臨床診断、ポイントオブケア診断、最新式生体分子診断研究、及び光バイオセンサ、特にＰＣＲ、ｑ‐ＰＣＲなどの増幅法と組み合わせたＤＮＡ検出に関するものを含む。 本発明はまた、例えば病理学目的で細胞及び／又は組織のイメージングのためのラインスキャナとしても使用することができる。 これはまた、タンパク質を検出するための免疫測定における検出でも使用することができる。

上述の実施形態は本発明を限定するのではなく例示するものであり、当業者は添付の請求項の範囲から逸脱することなく多くの別の実施形態を設計することができるだろう。 請求項においては、括弧の間におかれたいかなる参照符号も、請求項を限定するものと解釈されるものではない。 "有する"という語は、請求項にあげられたもの以外の他の要素又はステップの存在を除外しない。 要素に先行する"ａ"又は"ａｎ"という語は、その要素が複数存在することを除外しない。 いくつかの手段を列挙する装置の請求項では、これらの手段のいくつかが１つの同じハードウェアの項目によって具体化されてもよい。 互いに異なる従属請求項に特定の手段が列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを有利に使用することができないことを示すものではない。