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一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印 支架及其制备方法

阅读：6发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架及其制备方法。该仿生3D支架的制备方法包括：（1）具有仿生分级结构羟基磷灰石粉体的制备；（2）羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合浆料的制备；（3）仿生3D打印支架的制备。本发明利用3D打印技术，制备得到的机/无机复合三维打印支架的外部尺寸可控，生物相容性良好，并充分模拟了天然骨组织的成分和多级结构，赋予材料可控的力学强度；复合支架的微纳多级结构具有较高的成骨活性和骨诱导性，多级孔结构可以有效诱导组织和血管的长入，促进骨组织的再生修复。，下面是一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将(NH4)2PO4加入水中，混合均匀，得到(NH4)2PO4溶液；然后将所述(NH4)2PO4溶液的pH值调节为5.8-6.2，得到溶液a；将Ca(NO3)2·4H2O加入所述溶液a，搅拌均匀，得到溶液b；
然后将柠檬酸钠加入溶液b中，搅拌均匀，升温进行加热处理，离心取沉淀，离心洗涤，冷冻干燥，得到羟基磷灰石粉体；
(2)将明胶加入水中，混合均匀，得到明胶溶液；将步骤(1)所述羟基磷灰石粉体加入明胶溶液中，搅拌均匀，得到复合物溶液，然后往所述复合物溶液中加入海藻酸钠，搅拌均匀，超声去除气泡，得到打印浆料；
(3)将步骤(2)所述打印浆料装入打印所用料筒中，进行3D打印，得到胚体；将所述胚体浸泡在钙离子溶液中，取出，浸泡在京尼平溶液中，取出，浸泡在谷氨酸钠溶液，取出，最后浸泡在水中，得到所述仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架。
2.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述(NH4)2PO4溶液的浓度为1-40mM；所述Ca(NO3)2·4H2O与溶液a的摩尔体积比为1.5-60：1mmol/L；所述Ca(NO3)2·4H2O与柠檬酸钠的摩尔比为4-8：1。
3.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，所述加热处理的温度为180℃，加热处理的时间为2-12h。
4.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述明胶溶液的浓度为0.05-0.2g/mL；步骤(2)所述羟基磷灰石粉体与明胶的质量比为1:3-3:1；在步骤(2)所述打印浆料中，海藻酸钠的浓度为0.02-
0.08g/mL。
5.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述复合物溶液中，所述羟基磷灰石粉体的浓度为0.15-
0.30g/mL。
6.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述3D打印的挤出压力为0.5-5.0bar，所述牵引速度为5-
50mm/s。
7.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述胚体的外形为圆柱形；所述胚体的内部结构为分层的纺丝纤维层，丝的直径为0.2-0.8mm，同层的纺丝纤维丝之间的间距为0.2-1.2mm，层与层之间的纤维丝呈30-90°，形成内部具有连通的多边形三维网络孔结构。
8.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述钙离子溶液为钙盐与水混合均匀得到溶液，所述钙盐为氯化钙；所述钙离子溶液的浓度为0.2-0.6M，所述胚体浸泡在钙离子溶液中的时间为0.05-
1h；所述京尼平溶液的浓度为2-10mg/mL，所述胚体浸泡在京尼平溶液中的时间为1-5d；所述谷氨酸钠溶液的浓度为4-20mg/mL，所述胚体浸泡在谷氨酸钠溶液的时间为1-5d；所述胚体浸泡在水中的时间为1-5d。
9.根据权利要求1所述的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述胚体浸泡在谷氨酸钠溶液中时，每隔4-12h换一次谷氨酸钠溶液；所述胚体浸泡在水中时，每隔4-12h换一次水。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架。

说明书全文

一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印 支架

及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医用材料的技术领域，具体涉及一种仿生的基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着生活水平的提高和人口老龄化的加剧，人们对因创伤、骨肿瘤切除和骨组织病变等疾病造成的骨缺损修复的诉求急剧增加。自体骨移植被认为是治疗骨缺陷的金标准，但其来源有限、移植体难以塑形、植入部位易发生病变。异体骨较易获得，因容易引起疾病的传播、材料处理过程中失活及伦理争等也极大限制了它的临床使用。新型骨组织修复材料的开发为解决骨缺损修复带来了新的希望。

[0003] 天然骨是一种高度复杂且具有优异生物力学性能的血管化组织。骨是人体最坚硬的结缔组织，主要因为它的细胞外基质经过矿化赋予了其刚性和强度。骨组织主要由骨细胞和骨基质构成，其中骨基质又包括2/3的无机成分和1/3的有机成分。无机成分主要是以羟基磷灰石结晶为主，其作为骨中最主要的矿物，能够增加骨的刚度和强度。有机成分主要是以I型胶原纤维为主，可以增强骨组织的韧性。这种无机有机结合的特性既能够保持骨骼的灵活，又具有强大的承重能力。

[0004] 生物高分子材料如胶原、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、聚己内酯和聚乳酸等，具有良好的生物相容性、可控的降解性和力学强度、可塑性强，已广泛应用于生物医学材料领域。羟基磷灰石的化学组成与天然骨组织的矿物成分相似，且具有良好的生物相容性和促进骨再生的活性。目前羟基磷灰石粉体常用制备方法有化学沉积法、水热法和溶胶凝胶法等。生物功能小分子、天然高分子和表面活性剂等常用作HA晶体微结构仿生合成的调节基质。

[0005] 天然骨组织具有从纳米尺度到宏观层次的七级复杂构造，这赋予其强大的力学性能和生物功能。因此，具有微/纳米多级构造的新型生物材料模拟天然骨组织的组成、结构和性能，具有重要研究价值和临床应用前景。通过仿生合成技术，可获得具有多级微/纳结构、高比表面积和优异生物相容性的羟基磷灰石颗粒。这类HA微纳米颗粒，可用作蛋白质、基因和药物载体，支持细胞铺展和促进成骨分化。

[0006] 生物材料的拓扑结构可以增强蛋白吸附，促进细胞粘附、迁移、细胞增殖、成骨分化和骨整合。进一步研究表明，具有分级孔结构或分级构造的生物材料比具有单一尺度特征的生物材料能获得更优异的相关生物活性。例如，生物材料的多级孔结构有助于促进营养扩散、蛋白质吸附、细胞粘附、血管长入和成骨诱导；而生物材料的多级构造在刺激细胞表面生物应力、细胞形态，促进细胞迁移和细胞分化等方面则更具优势。

[0007] D.Mao,Q.Li,D.Li,Y.Tan,Q.Che,3D porous porous poly(epsilon-caprolactone)/58S bioactive glass-sodium alginate/gelatin hybrid scaffolds prepared by a modified melt molding method for bone tissue engineering,Materials&Design 160(2018)1-8.此研究以海藻酸钠和明胶为打印墨水通过加载生物玻璃促进骨组织的修复，但生物玻璃降解过程产生的碱性环境不利于干细胞的生长。因此开发出生物相容性更好，同时具有促成骨和骨诱导性能的有机无机复合的3D打印支架，将会具有重要应用前景。

发明内容

[0008] 为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种仿生的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架及其制备方法。

[0009] 针对现有骨修复材料设计性能上存在的缺点和不足之处，本发明提供了一种仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架及其制备方法。

[0010] 该3D支架由具有仿生结构的羟基磷灰石颗粒、明胶和海藻酸钠共混后制备得到打印浆料，打印后分别用钙离子和京尼平交联，得到成型的三维支架。仿生的羟基磷灰石颗粒具有高比表面积和多级结构，有效改善了浆料的流变性和打印稳定性，其微纳结构具有较高的成骨活性和骨诱导性；有机/无机复合支架仿生骨的成分和结构，赋予材料可控的力学强度，同时可以有效诱导组织和血管的长入，促进骨组织再生修复。

[0011] 本发明的目的还在于提供所述的一种仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法。

[0012] 本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

[0013] 本发明提供的一种仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备方法，包括以下步骤：

[0014] (1)将(NH4)2PO4加入水中，混合均匀，得到(NH4)2PO4溶液；然后将所述(NH4)2PO4溶液的pH值调节为5.8～6.2，得到溶液a；

[0015] (2)仿生的分级结构羟基磷灰石粉体的制备：将Ca(NO3)2·4H2O加入步骤(1)所述溶液a，搅拌均匀，充分溶解，得到溶液b；然后将柠檬酸钠加入溶液b中，搅拌均匀，充分溶解，得到混合物，将所述混合物转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，升温进行加热处理，离心取沉淀，离心洗涤，冷冻干燥，得到羟基磷灰石(HA)粉体；

[0016] (3)羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合浆料的制备：将明胶加入水中，混合均匀，得到明胶溶液；将步骤(2)所述羟基磷灰石粉体加入明胶溶液中，搅拌均匀，得到复合物溶液，然后往所述复合物溶液中加入海藻酸钠，搅拌均匀，超声去除气泡，得到打印浆料(羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合浆料)；

[0017] (4)仿生3D打印支架的制备：将步骤(3)所述打印浆料装入打印所用料筒中，计算机辅助设定支架材料的外部尺寸及内部结构，调试打印的挤出压力，及挤出后的牵引速度，进行3D打印，得到胚体；将所述胚体浸泡在钙离子溶液中，使羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合支架发生快速交联，取出，浸泡在京尼平溶液中进一步交联，取出，浸泡在谷氨酸钠溶液去除多余交联剂，取出，最后浸泡在去离子水中，得到所述仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架。

[0018] 优选地，步骤(1)中，将所述(NH4)2PO4溶液的pH值调节为6.0。

[0019] 进一步地，步骤(1)所述(NH4)2PO4溶液的浓度为1～40mM。

[0020] 优选地，步骤(1)所述(NH4)2PO4溶液的浓度为24mM。

[0021] 进一步地，步骤(2)所述Ca(NO3)2·4H2O与溶液a的摩尔体积比为1.5-60mmol/L；所述Ca(NO3)2·4H2O与柠檬酸钠的摩尔比为4～8：1；所述加热处理的温度为180℃，加热处理的时间为2～12h。

[0022] 优选地，步骤(2)所述加热处理的温度为180℃，加热处理的时间为3h。

[0023] 进一步地，步骤(3)所述明胶溶液的浓度为0.05-0.2g/mL；步骤(3)所述羟基磷灰石粉体与明胶的质量比为1:3-3:1。

[0024] 优选地，步骤(3)所述羟基磷灰石粉体与明胶的质量比为1:1.5-1.5:1。

[0025] 在步骤(3)所述打印浆料中，海藻酸钠的浓度为0.02-0.08g/mL。

[0026] 优选地，在步骤(3)所述打印浆料中，海藻酸钠的浓度为0.03g-0.06/mL。

[0027] 步骤(3)中，所述羟基磷灰石粉体质量：明胶和海藻酸钠两者总质量的比为10:1-2:1。

[0028] 优选地，步骤(3)所述羟基磷灰石、明胶和海藻酸盐的原料形态优选为颗粒。

[0029] 进一步地，步骤(3)中，所述明胶溶液优选为明胶的水溶液，且优选为去离子水、纯净水、蒸馏水或超纯水作为溶剂。

[0030] 优选地，步骤(3)所述搅拌的时间为0.5～24h，搅拌的温度为30～60℃，充分混合后超声1～4h，除去气泡。

[0031] 进一步地，在步骤(3)所述复合物溶液中，所述羟基磷灰石粉体的浓度为0.15-0.30g/mL。

[0032] 优选地，在步骤(3)所述复合物溶液中，所述羟基磷灰石粉体的浓度为0.2～0.25g/mL。

[0033] 进一步地，步骤(4)所述3D打印的挤出压力为0.5-5.0bar，所述牵引速度为5-50mm/s。

[0034] 优选地，步骤(4)所述3D打印的挤出压力为1.0～4.0bar。

[0035] 优选地，步骤(4)所述3D打印的牵引速度为5～20mm/s。

[0036] 进一步地，步骤(4)所述胚体的外形为圆柱形；所述胚体的内部结构为分层的的纺丝纤维层，丝的直径为0.2-0.8mm，同层的纺丝纤维丝之间的间距为0.2-1.2mm，层与层之间的纤维丝呈30-90°，形成内部具有连通的多边形三维网络孔结构。胚体的外部尺寸(直径和高度)可以根据实际需要进行设计。

[0037] 优选地，步骤(4)所述胚体的外形为圆柱形；所述胚体的内部结构为分层的纺丝纤维层，丝的直径为0.3-0.5mm；内部每层纺丝纤维层厚度为0.24-0.4mm；同层的纺丝纤维丝之间的间距为0.4-0.5mm；层与层之间的纤维丝呈90°。

[0038] 进一步地，步骤(4)所述钙离子溶液为钙盐与水混合均匀得到溶液，所述钙盐为氯化钙；所述钙离子溶液的浓度为0.2-0.6M，所述胚体浸泡在钙离子溶液中的时间为0.05-1h；浸泡过程中，海藻酸钠分子与钙离子快速交联。

[0039] 进一步地，步骤(4)所述京尼平溶液的浓度为2-10mg/mL，所述胚体浸泡在京尼平溶液中的时间为1-5d；

[0040] 优选地，步骤(4)所述胚体浸泡在京尼平溶液中的时间为2-4d。浸泡过程中，明胶和海藻酸钠分子上的基团被充分交联，形成三维交联网络。

[0041] 进一步地，步骤(4)所述谷氨酸钠溶液的浓度为4-20mg/mL，所述胚体浸泡在谷氨酸钠溶液的时间为1-5d。胚体浸泡在谷氨酸钠溶液时，能够去除胚体上多余的交联剂。

[0042] 优选地，步骤(4)所述胚体浸泡在谷氨酸钠溶液的时间为2-4d。

[0043] 进一步地，步骤(4)所述胚体浸泡在水中的时间为1-5d。胚体浸泡在水中，可去除胚体中网络的交联剂。

[0044] 优选地，步骤(4)所述胚体浸泡在水中的时间为2-4d。

[0045] 进一步地，步骤(4)中，所述胚体浸泡在谷氨酸钠溶液中时，每隔4～12h换一次谷氨酸钠溶液。

[0046] 优选地，步骤(4)中，当胚体浸泡在谷氨酸钠溶液中时，每隔12小时换一次谷氨酸钠溶液。

[0047] 进一步地，步骤(4)中，所述胚体浸泡在水中时，每隔4～12h换一次水。

[0048] 优选地，步骤(4)中，当胚体浸泡在水中时，每隔12小时换一次水。

[0049] 优选地，步骤(4)所述水为去离子水。

[0050] 本发明提供一种由上述的制备方法制得的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架，其外部形状为圆形，内部每层分层纺丝纤维层的厚度为0.15-0.65mm，同层的纺丝纤维之间的间距为0.2～1.2mm，层与层之间的纤维丝呈30～90°，形成内部具有连通的多边形三维网络孔结构。

[0051] 优选地，所述3D打印支架内部每层分层纺丝纤维层的厚度为0.32mm。

[0052] 本发明提供的支架打印制备方法的原理为：

[0053] 明胶的加入使得配置的复合物浆料具有温敏性，打印时控制料筒的温度为27～35℃，接收台的温度为0℃，环境温度为20℃左右，使得打印出的纤维丝在低温接收台上快速凝固并稳定。待打印完，将凝固的支架浸泡到钙离子溶液中，可以快速交联并固形，然后用京尼平溶液进一步交联支架中的氨基和羧基基团形成三维交联网络，得到最终的成型支架。

[0054] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

[0055] (1)本发明利用打印技术制备具有仿生多级结构的羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架，外部尺寸和内部孔结构可控，生物相容性良好，并充分模拟了天然骨组织的成分和多级结构，赋予材料可控的力学强度；

[0056] (2)本发明提供的制备方法中，特定分级结构羟基磷灰石粉体的加入，使得浆料的流变性和稳定性得到显著改善；打印得到的复合支架降解的过程中充分地暴露粉体的微结构，可以显著地增强成骨活性和骨诱导性；

[0057] (3)本发明提供的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架，其同时具有微孔、介孔和大孔等多级连通的孔结构可以有效地促进蛋白的吸附和营养的交换，诱导组织和血管的长入，促进骨组织再生修复。附图说明

[0058] 图1为实施例1中制备的分级结构的羟基磷灰石粉体的SEM图；

[0059] 图2为实施例2中制备的多级结构羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合浆料与明胶/海藻酸钠复合浆料的流变对比图；

[0060] 图3为实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的正面SEM图；

[0061] 图4为实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的元素分布图；

[0062] 图5为实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的截面SEM图；

[0063] 图6为实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架上的小鼠骨髓间充质干细胞的活死染色共聚焦显微镜图。

具体实施方式

[0064] 以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

[0065] 实施例1

[0066] 分级结构的羟基磷灰石粉体的制备：

[0067] 配置24mM的(NH4)2PO4溶液，将pH调到6.0得到溶液a。将40mmol的Ca(NO3)2·4H2O加入溶液a，充分溶解，搅拌均匀得到溶液b。然后将6mmol柠檬酸钠加入溶液b剧烈搅拌，搅拌均匀，得到混合液。将所述混合液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在180℃下反应3h。离心洗涤、冷冻干燥，得到分级结构的羟基磷灰石粉体(即HA颗粒)，在扫描电镜的观察下，其形貌如图1所示。该HA颗粒具有表面微纳分级结构和中空结构，比表面积高达
106.7m2/g。

[0068] 实施例2

[0069] 羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备，包括如下步骤：

[0070] (1)羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合浆料的制备：取5g的明胶颗粒，加入到50mL的去离子水中，充分磁力搅拌，搅拌均匀，得到浓度为的0.1g/mL的明胶溶液；然后加入
5g的实施例1中得到的HA颗粒，搅拌至HA颗粒均匀分散在明胶溶液中；将2.2g的海藻酸钠加入上述溶液，充分搅拌均匀，超声除气泡，即制备得到打印浆料；

[0071] (2)仿生3D打印支架的制备：将羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合浆料(即所述打印浆料)装入料筒中，针头直径为0.4mm，设计支架材料的外部尺寸为直径10mm，高为2mm的圆形，每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.5mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为2.5bar，溶液挤出后牵引速度为10mm/s，进行仿生羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D支架的打印，得到3D支架的胚体。

[0072] 实施例3

[0073] 羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备，包括如下步骤：

[0074] (1)羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合浆料的制备：取5g的明胶颗粒，加入到50mL的去离子水中，充分磁力搅拌，得到浓度为的0.1g/mL的明胶溶液；然后加入7.5g的实施例1中得到的HA颗粒，搅拌至HA颗粒均匀分散在明胶溶液中；将1.8g的海藻酸钠加入上述溶液，充分搅拌均匀，超声除气泡，即制备得到打印浆料；

[0075] (2)仿生3D打印支架的制备：将羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合浆料(即所述打印浆料)装入料筒中，针头直径为0.4mm，设计支架材料的外部尺寸为直径10mm，高为2mm的圆形，每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.5mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为3.5bar，溶液挤出后牵引速度为8mm/s，进行仿生羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D支架的打印，得到3D支架的胚体。

[0076] 实施例4

[0077] 羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的制备，包括如下步骤：

[0078] (1)羟基磷灰石粉体/明胶/海藻酸钠复合浆料的制备：取7.5g的明胶颗粒，加入到50mL的去离子水中，充分磁力搅拌，得到浓度为的0.15g/mL的明胶溶液；然后加入5g的实施例1中得到的HA颗粒，搅拌至HA颗粒均匀分散在明胶溶液中；将3g的海藻酸钠加入上述溶液，充分搅拌均匀，超声除气泡，即制备得到打印浆料；

[0079] (2)仿生3D打印支架的制备：将羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合浆料(即所述打印浆料)装入料筒中，针头直径为0.4mm，设计支架材料的外部尺寸为直径10mm，高为2mm的圆形，每层的打印高度为0.32mm，同层纤维丝的间距为0.5mm，层与层之间的纤维丝呈90°，挤出压力为2.0bar，溶液挤出后牵引速度为10mm/s，进行仿生羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D支架的打印，得到3D支架的胚体。

[0080] 实施例5

[0081] 将实施例2打印得到的胚体用0.45M的钙离子溶液浸泡0.25h，使羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合物中的海藻酸钠发生快速交联，得到浸泡后的交联支架。

[0082] 实施例6

[0083] 将实施例5所述浸泡后的交联支架，用5mg/mL的京尼平溶液浸泡3d进一步充分交联，得到稳定的支架。

[0084] 实施例7

[0085] 将实施例6所述稳定的支架用10mg/mL谷氨酸钠溶液浸泡3d，每隔12h换一次液，得到去除多余交联剂的支架。

[0086] 实施例8

[0087] 将实施例7所述去除多余交联剂的支架用去离子水浸泡3d，每隔12h换一次液，获得的支架材料冷冻干燥，得到所述仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架。

[0088] 实施例9

[0089] 将实施例2中步骤(1)得到的打印浆料，采用振荡温度扫描测量法研究浆料的变形特性；采用旋转测量法研究浆料的流动特性。实施例2中步骤(1)得到的打印浆料的流变图如图2所示。图2的A部分为打印浆料的储能模量和损耗模量折线图，图2的B部分为温度为30℃时，打印浆料的流动性分析折线图；图2中的Gel/ALG为不含HA颗粒的明胶/海藻酸钠浆料，Gel/ALG-HA为含HA颗粒的明胶/海藻酸钠浆料；

[0090] 其中，图2的A部分表明所述明胶/海藻酸钠浆料的凝胶温度26℃，当温度大于26℃时，其损耗模量远大于储能模量，材料主要发生粘性形变，呈液态；微纳分级结构HA颗粒的明胶/海藻酸钠复合浆料的凝胶温度28℃，当温度大于28℃时，储能模量和损耗模量相当，材料为半固态，即凝胶状；图2的B部分表明当剪切速率较高时，有无HA颗粒组的浆料粘度均较小，有助于浆料从打印机针头挤出；当剪切速率较低时，含HA颗粒复合浆料粘度较大，有利于浆料在接收板上成型，而不含HA颗粒的浆料粘度较小，不利于浆料在接收板上成型。

[0091] 实施例10

[0092] 将实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架在扫描电镜下观察；扫描电镜拍摄实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的正面，结果如图3所示；扫描电镜拍摄实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架的截面，结果如图5所示；扫描电镜能谱分析支架的元素分布和组成，如图4所示，表明实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架含有钙、磷、氮、氧和碳等三种主要原料的元素。

[0093] 实施例11

[0094] 将实施例8中得到的仿生的羟基磷灰石颗粒/明胶/海藻酸钠复合3D打印支架辐照灭菌，然后放置于孔板中，取小鼠骨髓间充质干细胞悬液种植在复合支架材料上使细胞充分粘附1h，加入完全培养基浸没支架，将孔板置于温度为37℃的恒温培养箱中，培养3d后吸走孔板中的完全培养基，加入细胞活死染色液，在37℃恒温培养箱中孵育0.5h，吸走活死染色液，用激光共聚焦显微镜观察小鼠骨髓间充质干细胞在3D支架材料上的生长情况，如图6所示。细胞在支架材料上增殖状态良好，立体的三维空间为成骨细胞提供充足的铺展生长空间。在体内植入环境下，支架会程序性降解，充分利用明胶的可降解性；暴露并释放内含的微纳结构的HA粉体，可以有效促进骨再生和骨诱导，有效发挥分级的微纳结构材料的促成骨特性，二者在骨组织再生过程中的级联生物学效应是本发明的突出优势。此外，大孔结构也有利于营养供给和血管的长入，从而协同促进骨组织的再生。

[0095] 以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

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