一种植物细胞筛选器及筛选同步化植物细胞系的方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及细胞培养设备领域，特别是涉及一种植物细胞筛选器及筛选同步化植物细胞系的方法。
背景技术
[0002] 植物来源的天然产物是医药、食品、化工等领域的重要原材料。植物来源的天然产物的获取途径现在主要是依靠提取野生植物资源或人工种植资源。然而大部分野生植物资源由于过度采挖而面临资源枯竭的难题。人工种植资源虽然在一定程度上缓解了植物来源的天然产物产量不足问题，但是人工种植来源的产品常存在含量不稳定、重金属超标、农残超标等问题，同时人工种植易造成林地、耕地的占用，环境的破坏问题。采用植物细胞悬浮技术进行天然活性产物的工业化生产，是解决植物来源的天然产物资源短缺的重要途径之一。目前，利用植物细胞培养技术已取得了巨大的进步，并得到了实际的应用。利用植物细胞培养技术已成功生产的产品有紫杉醇、紫草宁、人参皂苷、长春花
碱与天然色素等。
[0003] 植物细胞培养技术体系主要包括细胞系的筛选、培养体系的建立、代谢调控研究、产物提取纯化等工作。其中植物细胞株的筛选是该技术体系的核心工作之一，能否获得性能优良的细胞系决定了其工业化生产的可行性。如上所述，虽然有部分成功工业化的产品，但相对于目前研究报道的的400多种植物细胞成功小试培养而言，显然成功产业化的比例相当低，造成这一结果的重要的原因之一是植物细胞系的不
稳定性性，它极大阻碍植物细胞培养的工业化
进程。因此，如何提高植物细胞系的稳定性对该技术体系的工业化至关重要。
[0004] 现有提高细胞系稳定性的主要方法包括选择优良的外植体材料法、单细胞克隆法、小细胞团法、原生质体培养法等。其中单细胞培养法对筛选稳定细胞系是最精确的方法，也是目前应用最广泛的的筛选方法。其优点在于单细胞克隆产生的细胞系均一性高，同质化、同步化程度高。该方法主要步骤包括平板的愈伤组织诱导若干代的继代增殖、摇瓶的若干代悬浮培养、通过看护培养或条件培养等手段获得单细胞、单细胞平板繁殖扩增、克隆系性能鉴定等。但该项技术还存在明显的
缺陷，如生长缓慢、培养周期长、操作繁琐、植板率低，容易污染等。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种植物细胞筛选器及筛选同步化植物细胞系的方法，解决植物细胞培养生长缓慢、培养周期长、操作繁琐、植板率低、容易污染的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] 一种植物细胞筛选器，配合通气装置使用，包括罐体、补料装置和废液收集装置，罐体内部设有
水平的筛网，筛网将罐体内腔分为相连通的第一腔体和第二腔体，第一腔体位于第二腔体上方，第一腔体呈圆柱状，第二腔体呈倒圆锥状，第一腔体上设有接种口、出气口和培养基
接口；补料装置和废液收集装置分别通过第一软管和第二软管连通第二腔体的底部，第一软管上设有第一
阀门，第二软管上设有第二阀门；第一腔体和第二腔体分别通过第三软管和第四软管连通通气装置，第三软管上设有第三阀门，第四软管上设有第四阀门。
[0008] 本发明还提供一种筛选同步化植物细胞系的方法，采用上述的植物细胞筛选器，包括如下步骤：
[0009] 步骤1：将植物细胞
种子通过接种口无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的植物细胞筛选器，同时将灭菌合格的细胞液体培养基通过培养基接口接入植物细胞筛选器，并控制
发酵液液面高于筛网，打开第四阀门且关闭第一阀门、第二阀门和第三阀门，通气装置将无菌空气输入植物细胞筛选器，同时无菌空气通过出气口排出，置于恒
温室恒温培养；
[0010] 步骤2：当培养至在筛网上层形成明显的数厘米厚的细胞团、同时发酵液呈现明显的分层现象时，关闭第四阀门，静置植物细胞筛选器，缓慢打开第二阀门，将下层稀的发酵废液排入废液收集装置中，待植物细胞筛选器内的发酵废液排空后关闭第二阀门；
[0011] 步骤3：打开第四阀门通入干燥的无菌空气，使细胞层湿度降低，直至肉眼观察上层细胞呈疏松干燥状，关闭第四阀门；
[0012] 步骤4：打开第一阀门，将补料装置中的
营养液缓慢加入植物细胞筛选器，加入到细胞团的下沿
位置，自然冷却
凝固；
[0013] 步骤5：打开第三阀门，定期通入无菌空气，使细胞继续生长18-22天，
收获上层的细胞即得到均一性、同步化程度高的细胞系。
[0014] 与
现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0015] 本发明提供的植物细胞筛选器操作简单、筛选周期短、无菌程度高，获得的细胞系具有均一性高、同步化程度高的特点，进而有利于缩短大生产的培养周期，有利于大生产次生代谢产物的调控，提高代谢产物丰度及稳定性，提高发酵强度，最终降低生产成本。
附图说明
[0016] 图1示出了本发明植物细胞筛选器的示意图。
具体实施方式
[0017] 为进一步说明各
实施例，本发明提供有附图。这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合
说明书的相关描述来解释实施例的运作原理。配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点。图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。
[0018] 实施例1：请参阅图1，本实施例提供一种植物细胞筛选器，配合通气装置使用，包括罐体1、补料装置7和废液收集装置8，罐体1内部设有水平的筛网2，筛网2将罐体1内腔分为相连通的第一腔体和第二腔体，第一腔体位于第二腔体上方，第一腔体上设有接种口3、出气口4和培养基接口5，第二腔体连通补料装置7和废液收集装置8，第一腔体和第二腔体皆设有进气口，进气口连接通气装置61。
[0019] 罐体1为采用柔性材质制造而成的罐体，柔性材料包括但不限于聚酰胺、聚乙烯、乙烯-
醋酸乙烯共聚物、
乙烯-乙烯醇共聚物等。
[0020] 研究中发现植物细胞悬浮培养时圆柱体构型
生物反应器底部容易沉积较多细胞，尤其植物细胞悬浮培养前期及后期细胞容易出现聚集效应，导致沉积现象严重，直接影响细胞的生长繁殖及
次级代谢产物合成，造成细胞单位基质收率和目标产物含量低的问题。因此，优选将罐体1底部设置为倒锥体，结合通气干扰，解决现有技术中植物细胞培养因细胞聚集成团而形成沉淀平面的问题，整个培养周期内细胞处于良好悬浮状态，利于细胞生长繁殖，提高单位基质细胞收率，降低生产成本。
[0021] 为了便于制造，进一步优选地将第一腔体设置为圆柱体，第二腔体设置为倒圆锥体，筛网2位于圆柱体和倒圆锥体的交界面。所述圆锥可以为正圆锥，也可以为斜圆锥。
[0022] 筛网2用于供细胞
吸附在其上，筛网2的孔径过大细胞不易吸附，孔径过小容易堵塞，因此，优选将筛网2孔径设置为3～5mm，进一步优选为孔径5mm，孔数为2～4个/mm2。筛网2的材质为聚乙烯、聚丙烯、聚
碳酸酯之一，优选采用聚碳酸酯以方便进行辐照灭菌。
[0023] 在具体的结构中，接种口3、出气口4和培养基接口5皆设置在第一腔体顶面，出气口4处设有出气阀门42，出气口4连接有软管，该软管经过一
蠕动泵。补料装置7和废液收集装置8分别通过第一软管和第二软管连通第二腔体的底部，第一软管上设有第一阀门71，第二软管上设有第二阀门81，第二软管上配置一
蠕动泵。第一软管与第二腔体的交接处高于第二软管与第二腔体的交接处。
[0024] 通气装置61为罐体1提供无菌空气，通气装置61通过第三软管连通第一腔体，通气装置61通过第四软管连通第二腔体，第三软管上设有第三阀门63，第四软管上设有第四阀门62。第三软管与第一腔体的交接处位于第一腔体上端，第四软管与第二腔体的交接处位于第二腔体底端。第四软管与第二腔体的交接处低于第二软管与第二腔体的交接处。
[0025] 本植物细胞筛选器具有以下优点：
[0026] 1)操作简单，将液体悬浮培养与固体看护培养集成在同一容器中进行。而现有技术需要通过多次摇瓶悬浮培养，多次的平板看护培养，操作步骤多且复杂，费时费
力。
[0027] 2)明显缩短筛选周期，正常只需经过两个单周期即可获得合格细胞系。现有技术如悬浮培养至少2个单周期，加上看护培养至少3个周期以上，总周期至少5个以上。
[0028] 3)无菌程度高，全密闭操作。现有技术需要经过多次在超净台中液体转种至固体，固体转种至固体培养，操作多，易污染。
[0029] 4)植板率高，容易获得同步化均一性细胞系。现有技术通过看护培养方法操作每一步培养对营养需求，培养条件的精细度有较高要求，而实际操作结果显示较难满足培养需求，往往植板率较低。
[0030] 实施例2：本实施例提供一种筛选同步化植物细胞系的方法，用于解释实施例1所述的植物细胞筛选器的使用原理，本方法包括如下步骤：
[0031] 步骤1：将植物细胞种子通过接种口3无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的植物细胞筛选器的罐体，同时将灭菌合格的细胞液体培养基通过培养基接口5接入罐体1，并控制发酵液液面高于筛网2，打开第四阀门62且第一阀门71、第二阀门81和第三阀门63，通气装置将无菌空气输入罐体1，同时无菌空气通过出气口4排出，置于恒温室恒温培养；
[0032] 步骤2：当培养至在筛网2上层形成明显的数厘米厚的细胞团、同时发酵液呈现明显的分层现象时，关闭第四阀门62，静置罐体1，缓慢打开第二阀门81，将下层稀的发酵废液排入废液收集装置8中，待罐体1内的发酵废液排空后关闭第二阀门81；
[0033] 步骤3：打开第四阀门62通入干燥的无菌空气，使细胞层湿度降低，直至肉眼观察上层细胞呈疏松干燥状，关闭第四阀门62；
[0034] 步骤4：打开第一阀门71，将补料装置7中的营养液缓慢加入罐体1，加入到细胞团的下沿位置，自然冷却凝固；
[0035] 步骤5：打开第三阀门63，定期通入无菌空气，使细胞继续生长18-22天，收获上层的细胞即得到均一性、同步化程度高的细胞系。
[0036] 步骤1中恒温培养的
温度在22-25℃之间，培养至
泡沫激增时，进行诱变处理。泡沫激增，此时细胞大部分处于快速对数增长期，为了进一步提高细胞系的同步化水平，可以采用
冰敷罐体降低温度等手段。步骤4中的营养液为含结冷胶的营养液，营养液温度在32℃-37℃之间。
[0037] 实施例3：本实施例提供一种采用实施例1所揭示的植物细胞筛选器筛选同步化人参细胞系的方法，包括以下步骤：
[0038] (1)将人参细胞愈伤组织无菌接种于灭菌合格的液体培养基中，置于22-25℃，80-120rpm旋转摇床中震荡培养15-25天，将合格的浓粥状人参液体种子通过接种口3无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的罐体1，同时经蠕动泵将灭菌合格的人参细胞液体培养基通过培养基接口5接入罐体1，注意控制发酵液液面略高于筛网2，打开无菌空气进气管路上的第四阀门62，关闭第一阀门71、第二阀门81和第三阀门63，无菌空气通过进气口输入罐体1，同时无菌空气通过出气口4排出罐体1。
[0039] (2)通过恒温室控制培养温度22-25℃培养，培养期间注意观察细胞浓度的变化，前10-15天发酵液细胞浓度较稀，均匀悬浮在罐体1中，整体发酵液齐平于筛网2，细胞少量附着在筛网2上；15-20天细胞浓度快速增加，发酵液泡沫激增，细胞随着泡沫增加开始漫过筛网2，大量细胞开始附着在筛网2上生长；泡沫激增，此时细胞大部分处于快速对数增长期，为了进一步提高细胞系的突变的概率，此时可以补加适量的物理、化学诱变剂，处理后正向突变的细胞自然适应培养环境而旺盛生长，并逐步在发酵液表面聚集。所述的理化因子，有一定效果的比如UVB光照、秋水仙素、高浓度茉莉酸甲酯。泡沫激增，此时细胞大部分处于快速对数增长期，为了进一步提高细胞系的同步化水平，可以采用冰敷罐体降低温度等手段。
[0040] (3)培养25天左右，在筛网2上层形成明显的数厘米厚的细胞团，同时发酵液呈现明显的分层现象，上层主要为新繁殖的细胞，下层为稀发酵细胞液。此时关闭第四阀门62，静置约30min，缓慢打开第二阀门81，将下层稀的发酵废液通过通过蠕动泵缓慢排空至废液收集装置8中，之后关闭第二阀门81。接着打开第四阀门62往第二腔体通入干燥的无菌空气，使细胞层湿度降低，直至肉眼观察上层细胞较疏松干燥状后关闭第四阀门62。
[0041] (4)打开第一阀门71，将补料装置7中约35℃左右的含结冷胶的营养液缓慢加入罐体1，加入到细胞团的下沿位置，自然冷却凝固。打开第三阀门63，定期通入无菌空气，使细胞继续生长20天左右，收获上层的细胞即得到均一性、同步化程度高的细胞系。
[0042] 实施例4：本实施例提供一种采用实施例1所揭示的植物细胞筛选器筛选同步化人参细胞系的方法，包括以下步骤：
[0043] (1)将甘草细胞愈伤组织无菌接种于灭菌合格的MS液体种子培养基中，MS液体种子培养基中添加2,4-D1-2mg/L、NAA0.5-1.0mg/L、IBA1-2mg/L，置于24-26℃，80-120rpm旋转摇床中震荡培养15-25天，将合格的浓粥状甘草液体种子通过接种口3无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的植物细胞筛选器的罐体内。同时经蠕动泵将灭菌合格的甘草细胞液体培养基通过培养基接口5接入罐体，注意控制发酵液液面略高于筛网2，打开无菌空气进气管路上的第四阀门62，关闭第一阀门71、第二阀门81和第三阀门63，无菌空气通过进气口输入罐体1，同时无菌空气通过出气口4排出罐体1。
[0044] (2)通过恒温室控制培养温度22-25℃培养，培养期间注意观察细胞浓度的变化，前10-15天发酵液细胞浓度较稀，均匀悬浮在罐体1中，整体发酵液齐平于筛网2，细胞少量附着在筛网2上；15-20天细胞浓度快速增加，发酵液泡沫激增，细胞随着泡沫增加开始漫过筛网2，大量细胞开始附着在筛网2上生长。泡沫激增，此时细胞大部分处于快速对数增长期，为了进一步提高细胞系的突变的概率，此时可以补加适量的物理、化学诱变剂，例如，添加高浓度甘露糖醇或高浓度茉莉酸甲酯，甘露糖醇浓度为1-5g/L，茉莉酸甲酯浓度为100-300mg/L，处理后正向突变的细胞自然适应培养环境而旺盛生长，并逐步在发酵液表面聚集。
[0045] (3)培养25天左右，在筛网2上层形成明显的数厘米厚的细胞团，同时发酵液呈现明显的分层现象，上层主要为新繁殖的细胞，下层为稀发酵细胞液。此时关闭第四阀门62，静置约30min，缓慢打开第二阀门81，将下层稀的发酵废液通过通过蠕动泵缓慢排空至废液收集装置8中，之后关闭第二阀门81。接着打开第四阀门62往第二腔体通入干燥的无菌空气，使细胞层湿度降低，直至肉眼观察上层细胞较疏松干燥状后关闭第四阀门62。
[0046] (4)打开第一阀门71，将补料装置7中约35℃左右的含结冷胶的营养液缓慢加入罐体1，加入到细胞团的下沿位置，自然冷却凝固。打开第三阀门63，定期通入无菌空气，使细胞继续生长20天左右，收获上层的细胞即得到均一性、同步化程度高的细胞系。
[0047] 尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附
权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。
