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一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺

阅读：725发布：2024-01-12

专利汇可以提供一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，属于含有来自植物的药物制剂技术领域。将白簕叶前处理置于超声波合成萃取仪中，加入乙醇后，乙醇的体积浓度为20-90%，确保液料比（乙醇体积：白簕叶质量）为40：1-120：1；启动超声，超声功率为400-1200W，控制提取温度为30-60℃，提取10-50min后，取出提取液并抽滤，蒸干得到的粉末在于超声条件下溶解，即为提取的白簕叶总多酚样。将发明应用于白簕茎干、叶片以及类似植物中多酚的分离纯化，具有纯化效率高、多酚活性高等优点。，下面是一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于：将白簕叶前处理置于超声波合成萃取仪中，加入乙醇后，乙醇的体积浓度为20-90%，确保液料比为40：1-120：1；启动超声，超声功率为400-1200W，控制提取温度为30-60℃，提取10-50min后，取出提取液并抽滤，蒸干得到的粉末在于超声条件下溶解，即为提取的白簕叶总多酚样。
2.如权利要求1所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于，所述的白簕叶前处理为：将干的白簕叶粉碎至成粉末状，以无明显茎叶特征为限。
3.如权利要求1或2所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于，所述的白簕叶置于超声波合成萃取仪中时，其粒径满足：可通过120目筛。
4.如权利要求1所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于：所述的超声过程中，保证超声探头处于待提取液液面以下。
5.如权利要求1所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于：所述的乙醇体积浓度为40-70%。
6.如权利要求1所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于：所述的液料比为60：1-100：1。
7.如权利要求1或6所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于：
所述的液料比为80：1-100：1。
8.如权利要求1所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于：所述的超声功率为500-1100W；所述的提取温度为40-50℃；所述的提取时间为20-50min。
9.如权利要求1所述的一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，其特征在于：所述的蒸干采用水浴旋转蒸干，水浴温度50-65℃。

说明书全文

一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺

技术领域

[0001] 本发明涉及一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，属于含有来自植物的药物制剂技术领域。

背景技术

[0002] 白簕(Acanthopanan trifoliatus(L.)Merr.)是一种五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)的攀援状灌木，咖啡酰奎宁酸类总多酚是白簕的有效成分群之一。白簕中含有较多具抗氧化活性和抗炎抗菌、抗过敏的物质，如黄酮类，已有研究表明，白簕中含有一定量的维生素C(VC)和黄酮类化合物，对亚硝酸盐有一定的清除作用和阻断亚硝胺合成的能力，且相关实验证明，白簕的抗氧化性较VC强，同时白簕中的萜类化合物具有一定的抗癌活性，可能将在未来成为可食用植物抗癌保健品的一员；王艳等的研究定量的测定了白簕总黄酮的抑菌作用，及其对不同菌类的抑制作用的差别。

[0003] 多酚类化合物是植物界中的一种含量丰富的次级代谢产物，广泛分布于水果、蔬菜、谷类等植物组织中，如茶多酚、苹果多酚、丹参多酚等，具有良好的抗氧化活性。研究发现，它具有一定的清除·OH自由基、·DPPH自由基、·O2-自由基的抗氧化能力，以及抗炎、抗癌、辐射损伤防护性、抑菌，和降血糖、降血脂等药理活性，在食品、医药等领域尚有较为广泛的应用前景。多酚类化合物咖啡酰奎宁酸类是一类由奎宁酸和不同数目的咖啡酸通过酯化反应缩合而成的酚酸类天然化合物，这类化合物广泛存在于植物之中，具有强烈的抗氧化和清除自由基、抗炎、抗微生物、抑制血管紧张素转换酶、肝细胞保护等作用。而前期研究表明五加属植物白簕叶中咖啡酰奎宁酸类多酚类化学成分群含量丰富，其含量达到4％以上。因此，优化白簕叶中咖啡酰奎宁酸类多酚类物提取方法，对后期开发相应医药及保健品奠定科学基础，具有良好的应用前景。

[0004] 基于此，做出本申请。

发明内容

[0005] 本申请旨在优化白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺。以白簕叶作为研究对象，咖啡酰奎宁酸类总多酚提取率为评价标准，以绿原酸为标准品，通过Folin-Ciocalteu比色法和紫外分光光度计联用测定白簕叶中咖啡酰奎宁酸类总多酚物质提取率，并最终提供一种纯度高、提取率好、多酚活性保持良好的白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺。

[0006] 为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

[0007] 一种白簕叶总多酚的超声细胞破碎提取工艺，将白簕叶前处理置于超声波合成萃取仪中，加入乙醇后，乙醇的体积浓度为20-90％，确保液料比(乙醇体积：白簕叶质量)为40：1-120：1；启动超声，超声功率为400-1200W，控制提取温度为30-60℃，提取10-50min后，取出提取液并抽滤，蒸干得到的粉末在于超声条件下溶解，即为提取的白簕叶总多酚样。

[0008] 进一步的，作为优选：

[0009] 所述的白簕叶前处理为：将干的白簕叶粉碎至成粉末状，以无明显茎叶特征为限。更优选的，所述的白簕叶前处理后可通过120目筛。

[0010] 所述的超声过程中，保证超声探头处于待提取液液面以下，避免实际超声处理效率有误对实验准确性的影响。所述的乙醇体积浓度为40-70％，更优选的，所述的乙醇体积浓度为70％。所述的液料比为60：1-100：1，更优选的，所述的液料比为80：1-100：1。所述的超声功率为500-1100W，更优选的，所述的超声功率为900-1100。所述的提取温度为40-50℃，更优选的，所述的提取温度为50℃。所述的提取时间为20-50min，更优选的，所述的提取时间为18-20min。所述的蒸干采用水浴旋转蒸干，水浴温度50-65℃。更优选的，所述的水浴温度为55℃。

[0011] 响应面法在给出的整个区域上找到目的研究因素与其响应值之间的一个明确的函数表达式，即回归方程，从而找到整个区域上目的研究因素的最佳组合与其响应值的最优值。因此，响应面法是一种试验次数少、周期短，所求得的回归方程精度高、并且能研究几种目的研究因素之间交互作用及其影响情况强弱的回归分析方法。本申请旨在利用响应面法，对白簕叶有效活性成分——咖啡酰奎宁酸类总多酚的超声细胞破碎提取工艺的进行获得并优化，建立紫外分光光度法、以绿原酸为指标物质(现阶段应用紫外分光法，测量植物多酚类提取物事常用的底物多为没食子酸或绿原酸，本申请拟以绿原酸为底物，采用福林酚比色法，用紫外分光法于760nm处测白簕叶总多酚提取率)测定白簕叶提取物中总多酚(主要是咖啡酰奎宁酸) 含量方法，并应用高效液相色谱法(HPLC法)，抗氧化活性(DPPH、ABTS自由基清除活性)分析法，将优化结果与同条件下的加热回流提取的咖啡酰奎宁酸类总多酚结果(浓度和抗氧化活性)进行对比验证。

[0012] 其中，准确把握对白簕叶总多酚提取影响较大的因素，并设计单因素研究试验，同时在实验中精确定量，尽量减少失误对结果造成影响，以及HPLC法测定多酚含量需要选择适宜的分离测定条件，需要进行液相色谱条件反复摸索，这都是本实验的重难点。

[0013] 本申请的关键在于准确将单因素法和响应面法综合应用，找到优化白簕叶总多酚提取工艺的最适条件并进行验证，同时准确应用紫外分光法、HPLC分析两种提取条件下白簕叶总多酚含量进行对比，最后准确应用DPPH、ABTS自由基清除活性测定法对两种提取条件下白簕叶总多酚抗氧化活性进行对比。

[0014] 通过Folin-Ciocalteu比色法和紫外分光光度计联用测定白簕叶中咖啡酰奎宁酸类总多酚物质提取率，选取乙醇浓度、超声功率、提取时间、提取温度、液料比的单因素实验结果作为基础，最终得到最优工艺：乙醇浓度为70％，提取温度为50℃，超声功率1037.46W，提取时间18.12min，液料比94.27：1。预计此条件下的总多酚得率为72.5868mg/g，实际操作条件为乙醇浓度70％，提取温度50℃，超声功率1037W，提取时间18min，液料比94.27：1，总多酚提取得率为71.9mg/g。与75℃，液料比94.27：1，加热回流120min 下，白簕叶总多酚得率为13.8mg/g，DPPH、ABTS抗氧化分析结果差别不显著，HPLC分析结果表明优化后的超声细胞破碎提取总多酚浓度明显高于加热回流提取的总多酚浓度，且超声细胞破碎提取工艺操作简便、绿色节能环保。附图说明

[0015] 图1为浓度因素实验结果；

[0016] 图2为温度因素实验结果；

[0017] 图3为功率因素实验结果；

[0018] 图4为时间因素实验结果；

[0019] 图5为液料比因素试验结果；

[0020] 图6为液料比和超声功率对白簕叶总多酚提取得率影响的响应面；

[0021] 图7为液料比和超声功率对白簕叶总多酚提取得率影响的等高线；

[0022] 图8为提取时间和超声功率对白簕叶总多酚提取得率影响的响应面；

[0023] 图9为提取时间液料比和超声功率对白簕叶总多酚提取得率影响的等高线；

[0024] 图10为液料比和提取时间对白簕叶总多酚提取得率影响的响应面；

[0025] 图11为液料比和提取时间对白簕叶总多酚提取得率影响的等高线；

[0026] 图12为DPPH抗氧化活性分析实验结果；

[0027] 图13为ABTS抗氧化活性分析试验结果；

[0028] 图14为1ug/mL混标液的色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0029] 图15为5ug/mL混标液的色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0030] 图16为10ug/mL混标液的色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0031] 图17为50ug/mL混标液的色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0032] 图18为250ug/mL混标液的色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0033] 图19为平行第一组超声细胞破碎提取色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为 4,5-DCQA)；

[0034] 图20为平行第二组超声细胞破碎提取色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为 4,5-DCQA)；

[0035] 图21为平行第三组超声细胞破碎提取色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为 4,5-DCQA)；

[0036] 图22为平行第一组加热回流提取色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0037] 图23为平行第二组加热回流提取色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0038] 图24为平行第三组加热回流提取色谱结果(1为5-CQA；2为4-CQA；3为3,5-DCQA；4为4,5-DCQA)；

[0039] 图25为浓度与5-CQA的线性曲线；

[0040] 图26为浓度与4-CQA的线性曲线；

[0041] 图27为浓度与3,5-DCQA的线性曲线；

[0042] 图28为浓度与4,5-DCQA的线性曲线。

具体实施方式

[0043] 以下结合具体案例进行本申请技术方案的诠释，并以加热回流法作为对比，进行技术方案效果的说明。

[0044] 1.实验材料

[0045] 1.1实验原料

[0046] 实验所采用的原料为白簕叶，采摘自江西省赣州会昌县，选取色泽嫩绿，新鲜完好的白簕叶，于不超过60℃的烘箱内烘干后，密封保存。

[0047] 1.2实验药品

[0048] 绿原酸标准品(经HPLC-DAD测定其纯度>99％，实验室自制)、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA标准品(纯度>99％，购于成都普菲德生物技术有限公司)；甲醇(分析纯)、无水乙醇(杭州高晶精细化工有限公司)；Folin-Ciocalteu试液(分析纯)(上海如吉生物科技发展有限公司)；碳酸钠(分析纯)、DPPH 试剂 (分析纯)、ABTS试剂(分析纯)、VC试剂、VE试剂(上海麦克林生化科技有限公司)；无水甲醇(液相纯)、无水甲酸(色谱纯)；水为蒸馏水。

[0049] 1.3实验仪器

[0050] LD-Y300A型高速万能粉碎机(上海顶帅电器有限公司)；XH-2008D型电脑智能低温超声波合成萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)；HWS28型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；循环水式多用真空泵(杭州大卫科教仪器有限公司)；旋转蒸发仪(海能仪器)；电热套(杭州惠创仪器设备有限公司)； KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-5500紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；高效液相色谱仪Kromasil C18(4.6*250mm柱，孔径5μm)、检测器(Waters，2998PDA Detecter)；移液器；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)等。

[0051] 2实验方法

[0052] 2.1白簕叶的前处理

[0053] 将密封储存的干白簕叶取出，使用高速粉碎机将其粉碎成粉末状，以无明显茎叶特征为限(过120目筛)。收集粉末，做好标记后密封储存。

[0054] 2.2单因素实验水平的设计

[0055] 查阅文献，确定对白簕叶总多酚的提取效率影响最大的因素分别为乙醇溶液浓度(乙醇体积分数，下同)、提取时间、提取温度、提取功率和料液比。除标注情况外，各单因素试验均称取1.000g白簕叶粉末。

[0056] 以液料比1：80(乙醇溶液体积与白簕叶粉末质量比，下同)、温度40℃、提取时间20min、超声功率 600W作为先决固定条件，选取不同乙醇体积分数(20％、30％、40％、50％、
60％、70％)进行单因素试验。

[0057] 以液料比1：80、乙醇浓度70％、提取时间20min、超声功率600W作为先决固定条件，选取不同提取温度(30℃、40℃、50℃、60℃)进行单因素试验。

[0058] 以液料比1：80、乙醇浓度70％、提取时间20min、提取温度50℃作为先决固定条件，选取不同超声功率(400W、600W、800W、1000W、1200W)进行单因素试验。

[0059] 以液料比1：80、乙醇浓度70％、超声功率800W、提取温度50℃作为先决固定条件，选取不同提取时间(10min、20min、30min、40min、50min)进行单因素试验。

[0060] 以提取时间20min、乙醇浓度70％、超声功率800W、提取温度50℃作为先决固定条件，选取不同液料比(40:1、60:1、80:1、100:1、120:1)进行单因素试验(其中，因液料比为40:1、60:1时，称取1.000g 白簕叶粉末时，待提取液体积分别为40mL、60mL，不能保证超声探头处于待提取液液面以下，对实验准确性影响较大，考虑称取2.000g白簕叶粉末，并分别加入80mL、120mL乙醇溶液，最后对测得的白簕叶总多酚得率除以2)。

[0061] 2.3超声细胞破碎提取过程

[0062] 使用分析天平称量1.000g白簕叶粉末，装入超声细胞破碎提取仪所配的三颈烧瓶中。按照单因素条件配置一定浓度的乙醇溶液，按照单因素条件所设置的一定料液比，缓慢倾入三颈烧瓶中，并加入洗净烘干的搅拌子。将三颈烧瓶装入超声细胞破碎提取仪中，确认超声探头处于待提取的液面之下；若超声探头处于待提取的液面上方，则考虑在保证料液比不变的条件下，倍增白簕叶粉末质量和所加入的乙醇溶液体积，以确保超声探头处于待提取液面以下。

[0063] 接入回流装置，并进行固定，打开回流装置，控制一定的水流速度。

[0064] 按照单因素实验设置超声细胞破碎提取的提取温度、超声功率和提取时间，并选择合适的搅拌子转速，进行超声细胞破碎提取。为降低实验的偶然性因素，重复进行三组平行试验。

[0065] 2.4绿原酸标准曲线的测绘

[0066] 准确量取25mg的绿原酸用甲醇溶解，将溶解后的绿原酸溶液转移至25mL容量瓶中，用甲醇定容至标准线，配成1mg/mL的绿原酸溶液。

[0067] 分别准确量取0.025mL、0.05mL、0.100mL、0.200mL、0.400mL、0.600mL，1mg/mL的绿原酸溶液，在量好后的绿原酸溶液中加入1.25mLFolin-Ciocalteu试剂和3.75mL的20％的碳酸钠溶液，转移至25mL的容量瓶中，加入蒸馏水定容至标准线。取配置好的溶液与空白组(试剂溶液)一起进行紫外分光吸光度的测定；绘制绿原酸标准曲线，观察是否满足线性关系，确定回归曲线方程以及R2。

[0068] 2.5Folin-Ciocalteu比色法测定总多酚方法的建立

[0069] 取出提取液，进行抽滤。用甲醇反复洗涤滤渣三次后，合并三次洗液与滤液，装入烧瓶中，并用甲醇润洗抽滤瓶后，将洗液装入烧瓶中。在55℃水浴下，进行旋转蒸发，直至蒸干。

[0070] 使用甲醇溶解剩余物质，借助超声清洗仪将其充分溶解，并用甲醇定容至100mL容量瓶中。

[0071] 将溶液混匀后，用移液枪取1mL溶液，加入3.75mL20％碳酸钠溶液和1.25mL的Folin-Ciocalteu试液，并用蒸馏水定容至25mL容量瓶标准线处，做好标记于30℃水浴下保存2小时。取3.75mL20％碳酸钠溶液和1.25mL的Folin-Ciocalteu试液，并用蒸馏水定容至25mL容量瓶标准线处，标记为空白対照液，于30℃水浴下保存2小时。

[0072] 预热紫外分光光度计15分钟，取出容量瓶，于760nm的吸光度下，以空白对照液作为对照，测其吸光度，记录并整理数据，代入绿原酸标准曲线中即可得到所提取的总多酚浓度。

[0073] 2.6响应面分析过程

[0074] 分析整理单因素实验数据，在单因素试验结果的基础上，选取对白簕叶总多酚提取率影响比较大，且难以仅从单因素试验结果分析得出最优条件的三个因素——即取超声功率、料液比、提取时间三个因素，设计三因素三水平Box—Behnkenn中心组合设计试验，并编码如表1；同时整理并设计响应面分析实验如表2，按之前步骤重复完成实验。

[0075] 表1响应面因素水平编码表

[0076]因素/水平 -1 0 1
A功率(W) 800 1000 1200
B时间(min) 10 20 30
C液料比 60 80 100

[0077] 表2响应面实验方案

[0078]

[0079]

[0080] 按照给定方案遵循之前步骤完成实验方案后，记录并整理数据，通过软件Design-Expert.8.05b(原版) 得出线性回归模型及其参数分析，响应面三维图谱，以及预计最优方案。

[0081] 按照预计最优方案，依照之前步骤测出最优提取方案提取的总多酚浓度。为降低实验的偶然性因素，重复进行三组平行试验。

[0082] 2.7加热回流提取过程

[0083] 使用分析天平称量1.000g白簕叶粉末，装入适量容量的单颈烧瓶中。按照响应面分析得出的最优提取条件配置一定浓度的乙醇溶液，设置的一定料液比，缓慢倾入三颈烧瓶中。将单颈烧瓶装入电热套中，考虑乙醇溶液的沸点后，设置加热温度为75℃，接入回流装置，并进行固定，打开回流装置，控制一定的水流速度。

[0084] 加热回流两小时后，关闭加热套和回流装置，取出提取液，按上述步骤测其总多酚提取率，并与最优工艺数据进行对比。

[0085] 2.8抗氧化活性测定过程

[0086] 准确称取DPPH试剂3.943mg，加无水甲醇溶解在100mL棕色容量瓶中，制成在517nm时吸光值为 0.78-0.82(最好)的标准品储备液。

[0087] 分别取超声细胞破碎提取液和加热回流提取液(定容至10mL)，用甲醇溶液稀释成一定梯度浓度的试液，取0.1mL试液，加入3mL DPPH，摇匀，置于阴暗处反应30min后，在517nm处进行吸光度测定，注为A1；分别取样品液0.1mL与3mL甲醇溶液，测定吸光值，注为A2；0.1mL甲醇溶液与DPPH试液混合，测定吸光值，注为A3。则不同浓度多酚对应清除率为：
(1-(A1-A2)/A3)*100％。以VC、VE作为阳性对照。

[0088] 准确称取ABTS试剂20.3mg，加入5mL蒸馏水溶解；称取过硫酸钾粉末3.51mg，加入5mL蒸馏水溶解。将两者混合均匀，置于室温，阴暗处反应12～16h，取1mL混合试液，加入
40mL甲醇，摇匀测定在 734nm处吸光值(最好为0.7左右)。

[0089] 分别取超声细胞破碎提取液和加热回流提取液(定容至10mL)，用甲醇溶液稀释成一定梯度浓度的试液，取0.1mL混合试液，加入4mL ABTS，摇匀，反应5min，在734nm处进行吸光度测定，注为A1；取样品液0.1mL与4mL蒸馏水，测定吸光值，注为A2；0.1mL蒸馏水与ABTS试液混合，测定吸光值，注为A3。则不同浓度多酚对应清除率为：(1-(A1-A2)/A3)*100％。以VC、VE作为阳性对照。

[0090] 对比超声细胞提取液和加热回流提取液的抗氧化活性大小(通过计算其清除率得出)，并分析原因。

[0091] 2.9HPLC色谱条件

[0092] 配置0.2％的甲酸溶液1L作为流动相，配置1mg/mL的5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA溶液后，密封储存于冰箱中。配置浓度分别为1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、50ug/mL、250ug/mL的5-CQA、4-CQA、 3,5-DCQA、4,5-DCQA混标溶液。

[0093] 分别取1mL加热回流提取液、1mL超声细胞破碎提取液、1mL5ug/mL混标溶液、1mL10ug/mL混标溶液、1mL50ug/mL混标溶液、1mL250ug/mL混标溶液分别标号，并按顺序放入HPLC进样盒，按照如表3 色谱条件进样进行梯度洗脱绘图(检测波长为UV320、203nm，液体流速为1mL/min，柱温为25℃±5℃，洗脱保留时间均为75min，进样体积均为10μL。检测器检测范围为210nm-400nm全扫描，但实验出峰通道为320nm以下)，并对此通道下所出峰进行积分计算。

[0094] 表3色谱条件

[0095]

[0096]

[0097] 绘图完成后，标记混标液中四种咖啡酰奎宁酸类总多酚物质峰，并绘制相应标准曲线，与超声细胞提取液和加热回流提取液相应洗脱时间出峰面积进行对比，分别计算超声细胞提取液和加热回流提取液的相应四种咖啡酰奎宁酸类总多酚含量，并进行对比。

[0098] 2.结果与分析

[0099] 2.1单因素实验分析各条件对白簕叶总多酚提取率的影响

[0100] 乙醇溶液浓度(体积分数)、超声细胞破碎提取时间、提取温度、提取功率和料液比是对白簕叶总多酚的提取得率影响较大的因素。

[0101] 于紫外光760nm下测定绿原酸标准线性方程为：C＝0.449*A-0.017mg/g，其中R2＝0.993，拟合情况较显著，故可使用此标准曲线进行白簕叶总多酚提取得率的计算。

[0102] 从表4和图1中可以清楚看到，固定其他因素不变时，在乙醇浓度为30％～70％时，白簕叶总多酚提取得率随乙醇溶液浓度升高而升高，最大达到 39.367mg/g，乙醇浓度超过70％时，白簕叶总多酚提取得率随乙醇溶液浓度升高而降低。从表5和图2中能够看出，在温度从30℃升至50℃时(其他条件固定)，白簕叶总多酚得率随温度升高逐渐上升，在50℃达到最高值22.167mg/g，当温度超过50℃继续升高时，白簕叶总多酚提取得率随温度升高急剧下降。表6和图3显示，在超声功率为400W-1000W时，白簕叶总多酚提取得率随超声功率增加而逐渐增加至65.767mg/g，超过1000W后，虽然白簕叶总多酚提取得率随超声功率的增加继续上升，但从图3曲线中能明显看出此时曲线趋于平缓，即此时白簕叶总多酚提取得率随超声功率的变化情况不再显著。由表7和图4可以看出，白簕叶总多酚提取得率随提取时间的增加而不断增加，在所选范围内，于提取时间＝50min时达到最大提取得率71.033mg/g，且由图4可看出此时曲线有趋于平缓的趋势。由表8和图5可得，在料液比为1:40-1:80时，白簕叶总多酚提取得率随料液比的升高而逐渐升高，最高达到58.100mg/g，随后随着料液比的增大，曲线趋于平缓(甚至降低)。

[0103] 表4浓度因素结果(提取温度40℃，超声功率600W，料液比1：80，提取时间20min)[0104]浓度 1(mg/g) 2(mg/g) 3(mg/g) 平均得率(mg/g)
30％ 0.198 0.23 0.217 21.5
40％ 0.255 0.187 0.22 22.06666667
50％ 0.309 0.278 0.257 28.13333333
60％ 0.306 0.389 0.363 35.26666667
70％ 0.414 0.382 0.385 39.36666667
80％ 0.272 0.229 0.282 26.1
90％ 0.197 0.226 0.272 23.16666667

[0105] 表5温度因素结果(乙醇浓度70％，提取功率600W，料液比1：80，提取时间20min)[0106]温度 1(mg/g) 2(mg/g) 3(mg/g) 平均得率(mg/g)
30℃ 0.117 0.114 0.126 11.9
40℃ 0.134 0.156 0.182 15.73333333
50℃ 0.212 0.201 0.252 22.16666667
60℃ 0.082 0.051 0.07 6.766666667

[0107] 表6功率因素结果(乙醇浓度70％，提取温度50℃，料液比1：80，提取时间20min)[0108]

[0109]

[0110] 表7时间因素结果(乙醇浓度70％，提取温度50℃，料液比1：80，超声功率800W)[0111]时间 1(mg/g) 2(mg/g) 3(mg/g) 平均得率(mg/g)
10min 0.606 0.647 0.614 62.23333333
20min 0.631 0.682 0.688 66.7
30min 0.702 0.724 0.617 68.1
40min 0.728 0.671 0.698 69.9
50min 0.705 0.707 0.719 71.03333333

[0112] 表8液料比因素结果(乙醇浓度70％，提取温度50℃，提取时间20min，超声功率800W)

[0113]液料比 1(mg/g) 2(mg/g) 3(mg/g) 平均得率(mg/g)
40 0.32 0.303 0.309 31.06666667
60 0.31 0.315 0.453 35.93333333
80 0.559 0.546 0.638 58.1
100 0.626 0.555 0.536 57.23333333
120 0.501 0.535 0.562 53.26666667

[0114] 2.2三因素三水平Box—Behnkenn中心组合响应面实验结果

[0115] 以白簕叶作为研究对象，咖啡酰奎宁酸类总多酚提取率为评价标准，选取乙醇浓度、超声功率、提取时间、提取温度、液料比的单因素实验结果作为基础，选取乙醇浓度70％，提取温度50℃作为先决最优条件，进一步通过三因素三水平Box—Behnkenn中心组合设计试验，进行响应面法分析最优超声功率、提取时间、液料比条件，建立白簕总多酚提取率的二次多项回归方程。实验结果见表9。模型拟合出白簕叶总多酚提取得率(Y)与乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)的回归方程为：

[0116] Y＝+0.67+0.027*A-(5.875E-003) *B+0.15*C+0.015*A*B+0.020*A*C-0.024*B*C-0.10*A2-0.053*B2-0.11*C2。

[0117] 响应面分析得到三维谱图如图6与图7、图8与图9、图10与图11通过快速上升法进行提取工艺优化，分析得出在乙醇浓度70％，提取温度50℃的先决条件下，白簕叶总多酚最优提取条件为超声功率1037.46W，提取时间18.12min，液料比为94.27:1，预测得率为72.5868mg/g。

[0118] 验证试验结果如表11，以提取条件乙醇浓度70％，提取温度50℃，超声功率1037W，提取时间18min，液料比为94.27:1，所得实际白簕叶总多酚提取得率为71.9mg/g，与预测得率相近，相对误差仅为0.946％，表明所得的优化结果具有一定的实际意义。

[0119] 表9响应面试验结果

[0120]

[0121] 表10回归模型参数分析

[0122] Sum of Mean F P
项目 Squares 自由度 Square Value Prob>F
模型 0.29 9 0.033 30.23 <0.0001 significant
A-功率 5.618E-003 1 5.618E-003 5.21 0.0564
B-时间 2.761E-004 1 2.761E-004 0.26 0.6284
C-液料比 0.17 1 0.17 156.77 <0.0001
AB 9.610E-004 1 9.610E-004 0.89 0.3766
AC 1.521E-003 1 1.521E-003 1.41 0.2737
BC 2.256E-003 1 2.256E-003 2.09 0.1913
A^2 0.042 1 0.042 39.34 0.0004
B^2 0.012 1 0.012 10.81 0.0133
C^2 0.049 1 0.049 45.22 0.0003
残差 7.549E-003 7 1.078E-003
失拟项 7.549E-003 3 2.516E-003
纯误差 0.000 4 0.000
总离差 0.30 16

[0123] 表11验证试验结果

[0124]验证最优条件白簕叶总多酚提取得率mg/g
1 68.7
2 73.3
3 73.7
平均 71.9

[0125] 2.3抗氧化活性测定实验结果

[0126] 实验所配DPPH溶液、ABTS溶液A3数据见表12。

[0127] 使用Origin作图如图12、13，可以看出同浓度条件下，超声细胞破碎提取的白簕叶总多酚抗氧化活性 (由DPPH、ABTS清除率体现)和加热回流提取的白簕叶总多酚抗氧化活性，相较于同浓度条件下的VC、 VE抗氧化活性明显偏低。

[0128] VC、VE在一定浓度范围内，抗氧化活性随浓度增大而增大，超出一定浓度范围后，其抗氧化活性随浓度变化不明显(此时清除率均已接近100％)。超声细胞破碎提取的白簕叶总多酚样品液和加热回流提取的白簕叶总多酚样品液，两者抗氧化活性随浓度变化趋势相同，且抗氧化活性相差不大。

[0129] 表12 DPPH溶液、ABTS溶液A3数据

[0130]

[0131] 表13超声细胞破碎提取DPPH抗氧化试验结果

[0132]

[0133] 表14加热回流提取DPPH抗氧化试验结果

[0134]

[0135] 表15为VC的DPPH抗氧化对照试验结果

[0136]

[0137] 表16为VE的DPPH抗氧化对照试验结果

[0138]

[0139] 表17超声细胞破碎提取ABTS抗氧化试验结果

[0140]

[0141] 表18加热回流提取ABTS抗氧化试验结果

[0142]

[0143] 表19 VC ABTS抗氧化对照试验结果

[0144]

[0145] 表20 VE DPPH抗氧化对照试验结果

[0146]

[0147]

[0148] 3.4高效液相色谱(HPLC)实验结果

[0149] 由图14、15、16、17可以看出，在适用范围内，随着混标液的浓度升高，混标液中四种物质峰峰型逐渐变得明显，根据色谱图中对应保留时间，确定混标液色谱图中5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA 对应峰面积。

[0150] 超声细胞破碎提取液和加热回流提取液的色谱图19-21、22-24中，可以看出显著峰较多且杂，可能是由于其中含有其他脂溶性成分进样后一同洗脱，对照混标液色谱图14、15、16、17中咖啡酰奎宁酸类多酚类物质5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA对应保留时间，根据图25-28中分别测绘的四种咖啡酰奎宁酸类多酚类物质5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA的标准曲线图，即可以计算出超声细胞破碎提取液和加热回流提取液中5-CQA、4-CQA、
3,5-DCQA、4,5-DCQA相对含量，如表32、33。

[0151] 表21为1ug/mL混标液色谱结果

[0152]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 11.223 23007 35.02 847
4-CQA 12.612 17182 26.15 565
3,5-DCQA 41.864 17177 26.14 524
4,5-DCQA 44.660 8335 12.69 265

[0153] 表22为5ug/mL混标液色谱结果

[0154]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 10.909 134362 29.34 6354
4-CQA 12.203 109150 23.84 4330
3,5-DCQA 41.648 129580 28.3 4154
4,5-DCQA 44.348 84782 18.52 3815

[0155] 表23为10ug/mL混标液色谱结果

[0156]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 10.885 246548 28.74 11245
4-CQA 12.142 198050 23.09 7910
3,5-DCQA 41.573 238807 27.84 7546
4,5-DCQA 44.241 174308 20.32 8413

[0157] 表24为50ug/mL混标液色谱结果

[0158]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 10.852 1674796 23.67 76914
4-CQA 12.1 1533884 21.68 60198
3,5-DCQA 41.471 1926121 27.22 58431
4,5-DCQA 44.153 1940186 27.42 84742

[0159] 表25为250ug/mL混标液色谱结果

[0160]名称保留时间面积％面积高度
5-CQA 10.823 9637389 23.66 451297
4-CQA 12.063 8318419 20.42 329355
3,5-DCQA 41.393 11172090 27.43 339945
4,5-DCQA 44.088 11601007 28.48 534419

[0161] 表26为平行第一组超声细胞破碎提取液的色谱结果

[0162]

[0163]

[0164] 表27为平行第二组超声细胞破碎提取液的色谱结果

[0165]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 10.858 405504 20.4 17146
4-CQA 12.11 29343 1.48 761
3,5-DCQA 41.008 995736 50.1 20903
4,5-DCQA 44.308 114449 5.76 4440

[0166] 表28为平行第三组超声细胞破碎提取液的色谱结果

[0167]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 10.926 359692 19.98 15680
4-CQA 16.491 33777 1.88 1043
3,5-DCQA 41.088 921345 51.17 19705
4,5-DCQA 44.351 106909 5.94 4121

[0168] 表29为平行第一组加热回流提取液的色谱结果

[0169]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 10.898 404213 20.81 16633
4-CQA 16.477 43443 2.24 1187
3,5-DCQA 41.029 906630 46.68 18391
4,5-DCQA 44.303 140548 7.24 4728

[0170] 表30为平行第二组加热回流提取液的色谱结果

[0171]名称保留时间面积％面积峰高
5-CQA 10.877 434090 19.98 17796
4-CQA 16.495 53309 2.45 1389
3,5-DCQA 41.056 972123 44.76 19488
4,5-DCQA 44.301 160011 7.37 5056

[0172] 表31为平行第三组加热回流提取液的色谱结果

[0173]名称保留时间面积％面积高度
5-CQA 10.905 383909 20.17 15522
4-CQA 16.449 44182 2.32 1192
3,5-DCQA 41.105 842863 44.28 16850
4,5-DCQA 44.002 16531 0.87 1514

[0174] 表32超声细胞破碎提取液中5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA含量[0175]名称平均峰面积浓度(ug/ml)
5-CQA 384044.6667 12.81451668
4-CQA 26187 3.343710898
3,5-DCQA 973407.3333 25.05781673
4,5-DCQA 115013 7.004947026

[0176] 表33加热回流提取液中5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA含量

[0177]

[0178]

[0179] 3.讨论

[0180] 3.1单因素实验结果讨论

[0181] 图1中白簕叶总多酚提取率在一定范围内随乙醇浓度增加而增加，超出此范围后白簕叶总多酚提取率反而随乙醇浓度升高反而下降，可能原因是在乙醇浓度超过70％后，白簕叶中其他脂溶性成分溶出较多，其脂溶性成分与白簕叶中多酚竞争性结合乙醇分子，使组织通透性降低，从而使得白簕叶总多酚提取得率随乙醇溶液浓度升高反而降低。

[0182] 由于温度在一定范围内升高时，待提取液中多酚小分子运动速度加快，更易进入乙醇溶液中被提取，故图2中，白簕叶总多酚提取率在一定范围内随温度升高而增加；当温度超出一定范围后，可能会破坏多酚类物质的结构(如氧化等)，导致所提取的白簕叶总多酚得率降低，超出相应温度范围后白簕叶总多酚提取率随提取温度升高反而下降。

[0183] 图3显示一定范围内白簕叶总多酚提取得率随超声功率增加而增加，超出范围后，曲线逐渐趋于平缓，即随超声功率的增加，白簕叶总多酚提取得率变化不明显。由于此实验初衷即节约能源，考虑选取超声功率＝1000W为中心点，设立800W，1000W，1200W三水平响应面实验，进一步综合分析超声功率对白簕叶总多酚提取得率的影响情况。

[0184] 同样，在一定范围内，白簕叶总多酚提取得率随提取时间增加而增加，而超出一定范围内，白簕叶总多酚提取率随提取时间变化情况有趋于平缓的趋势(图 4)，从节约能源角度考虑，选取提取时间＝20min为中心点，设立10min，20min， 30min三水平响应面实验，进一步综合分析提取时间对白簕叶总多酚提取得率的影响情况。

[0185] 图4证明其它因素一定时，增大料液比有助于白簕叶中多酚类物质的溶出，料液比增至一定值时，白簕叶中多酚类物质可能溶出饱和，表示可能此时白簕叶中多酚类物质已基本溶出完全。为进一步综合分析料液比对白簕叶总多酚提取得率的影响情况，选取液料比＝1：80为中心点，设立1:60，1:80，1:100三水平响应面实验。

[0186] 3.2响应面实验结果讨论

[0187] 响应面模型线性参数分析见表10，模型极显著(P<0.0001)，且失拟项不显著，表示此模型回归拟合程度较好，自变量与响应值之间线性关系显著，用于实验分析可信程度较高。其中C，A^2，B^2，C^2，对响应值的影响显著(P<0.05),因此白簕叶总多酚提取率对提取时间、超声功率、料液比并非单纯的线性关系。

[0188] 由图6和图7曲线变化程度可以看出，料液比对白簕叶总多酚提取率的影响大于超声功率；由图8和图9曲线变化程度可以看出，超声功率对白簕叶总多酚提取率的影响大于提取时间；由图10和图11曲线变化程度可以看出，料液比对白簕叶总多酚提取率的影响大于提取时间，综上所述，白簕叶总多酚提取率的影响大小为：料液比>超声功率>提取时间。

[0189] 3.3抗氧化活性测定实验结果讨论

[0190] 由图12和13可以看出，在低浓度和高浓度时，VC、VE与从白簕叶中提取的多酚类物质抗氧化活性相近(由DPPH、ABTS清除率反映)，但VC、VE在浓度较低时的一定范围内，抗氧化活性随浓度变化较明显，即在相对较低的同浓度溶液下，VC、VE抗氧化活性高于从白簕叶中提取出多酚类物质的抗氧化活性。

[0191] 而超声细胞破碎提取液与加热回流提取液相比，抗氧化活性相差不大，甚至加热回流提取液抗氧化活性ABTS清除率略高于超声细胞破碎提取液抗氧化活性。可能是因为，加热回流提取白簕叶中的多酚类物质时，加热回流的提取时间较长，温度较高，可能提取出较多脂溶性成分，且提取出的其他脂溶性成分也具有一定的抗氧化活性，使得其总抗氧化活性高于超声细胞破碎提取液的总抗氧化活性。

[0192] 3.4高效液相实验结果讨论

[0193] 由图19-21和图22-24可以看出，加热回流提取液色谱图较之超声细胞破碎提取液色谱图，出峰更多更杂，可能是加热回流提取白簕叶总多酚时，由于提取时间较长，且提取温度较高，其他脂溶性成分溶出更多，成分更复杂。此外，加热回流提取液色谱图与超声细胞破碎提取液色谱图相比，对应咖啡酰奎宁酸类多酚类物质5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA峰面积较小，证明所提取的咖啡酰奎宁酸类多酚类物质5-CQA、4-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA比超声细胞破碎所得总多酚类物质提取更少，证明优化后的超声细胞破碎提取工艺所提取出的咖啡酰奎宁酸类总多酚物质相较于加热回流提取的总多酚类物质多，此优化工艺实验有一定的成效。

[0194] 以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。

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