一种血源酶解肽在制备抑制动物肠道炎症药物中的应用
阅读：739发布：2024-02-11
专利汇可以提供一种血源酶解肽在制备抑制动物肠道炎症药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种血源酶解肽在制备抑 制动 物肠道 炎症 药物中的应用，具体是以猪血为原材料，经 研磨 、酶解、抽滤、离心、 超滤 等过程纯化后，获得具有抑制动物肠道炎症作用的 生物 活性肽。干燥后的活性肽为薄层、粉末、 颜色 较浅的粉末状。该生物活性肽通过对小鼠肠道炎症的抑制作用判断具有抑制肠道炎症的作用，可作为 饲料 、饲料添加剂、药物辅料等。本发明抑制肠道炎症的血源酶解肽是一种无毒性无 副作用 ，不会在动物体内残留，具有显著经济社会贡献。本发明将会推动活性肽生物产品在医药行业和饲料行业的快速发展。，下面是一种血源酶解肽在制备抑制动物肠道炎症药物中的应用专利的具体信息内容。
1.一种血源酶解肽在制备抑制动物肠道炎症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，特征在于：所述的血源酶解肽对于动物肠道炎症有显著的抑制作用。
3.根据权利要求1所述的应用，特征在于：所述的血源酶解肽应用于饲料添加剂、药物辅料。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述血源酶解肽的制备方法如下：
将猪血加入磷酸缓冲液体系中；
在磷酸缓冲液体系中，加入胰蛋白酶、胃蛋白酶进行双酶酶解；
酶解液离心，取上清液，抽滤，再过滤膜，除盐，
取滤液，冷冻干燥，浓缩至粉末状，即得生物活性肽。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液体系，pH为7.2-7.4，猪血的加入质量是缓冲液体积的9%。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的胰蛋白酶和胃蛋白酶，两者质量比为1:1，其总的加入质量是猪血质量的3%。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的酶解条件是：37℃，转速为150r/min，酶解时间为6小时。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抽滤是使用真空抽滤上清液，所得滤液再进行0.22um水系滤膜过滤，除去大分子。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：抽滤的截留分子量为3000Da以下。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的冷冻干燥为把酶解液放置于-86℃冰箱冷冻，后于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，制成粉剂于4℃冰箱保存。
一种血源酶解肽在制备抑制动物肠道炎症药物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 我国每年生产大量肉类食品，包括畜禽类、水产类食品，造成我国动物类食品不安全的主要因素是兽药的残留严重超标问题。在畜禽养殖过程中，不法分子无视国家法令在畜禽饲料中添加瘦肉精，而对人体造成危害；在畜禽养殖过程中，为预防或治疗疾病为使用抗生素如氯霉素、土霉素等，虽能有效地防腐及抗菌作用，但此药物在动物体内的残留，摄入人体后，有的在体内根本无法代谢掉，致癌，对人体造成严重危害。可是，现代养殖趋向于高密度、集约化养殖，导致养殖体更易于生病，进一步加剧药残问题。而用酶解肽——来自于血源的酶解肽作为抑制动物肠道炎症的药物，迄今尚未见文献报道。因此，研制抑制动物肠道炎症的生物活性肽及其应用具有十分重要的意义与价值。
[0003] 本发明通过合适的酶解纯化方法得到血源小肽或者蛋白混合物，再验证提取酶解物的存在活性与否去比所模拟合成的目标肽，并通过对小鼠动物肠道的炎症的抑制作用确认其具体活性。因此开发一种抑制动物肠道炎症的血源酶解肽具有重要的经济和社会效益。
发明内容
[0004] 本发明涉及一种血源酶解肽在制备抑制动物肠道炎症药物中的应用。运用猪血为原料，确定最佳的酶解时间和酶用量。建立C57BL/6小鼠的DSS急性肠道炎症模型，通过对小鼠的体重变化、粪便状态、肠道状态、肠道黏膜损伤情况、炎症因子等指标来测定其对肠道炎症的抑制作用。该血源蛋白酶解肽无毒性无副作用，在对动物肠道炎症的抑制方面有一定作用，具有广阔的应用前景。所述的血源酶解肽应用于饲料添加剂、药物辅料。
[0006] 一种抑制动物肠道炎症的血源酶解肽的制备，其具体制备步骤如下：1)将猪血添加到磷酸盐缓冲液（PBS），pH值为7.2-7.4，其中猪血的重量是缓冲液体积的9%；
2)加入胰蛋白酶和胃蛋白酶，按照1:1的比例加入到上述的猪血混合液中，其总加入质量是猪血质量的3%；
3)酶解条件是：37℃，转速为150r/min，酶解时间为6小时；
4)酶解液离心过滤，取上清液，上清液真空抽滤，所得滤液再进行0.22um水系膜过滤，两次过滤后的酶解上清液，用超滤离心管（孔径为3000Da）得3000Da以下的过滤液，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得血源酶解肽。
本发明的显著优点是：本发明所涉及一种抑制动物肠道炎症血源酶解肽的应用，显著特点归结如下：
1） 在医药和饲料方面，抗炎症血源酶解肽的筛选为新药合成的研发奠定基础，尤其是现今社会中越来越多的人对抗生素的使用越来越普遍，某些病原微生物对抗生素的耐药性也越来越高；过多的抗生素使用会对动物和人造成危害；
该活性肽具有显著地抑制肠道炎症的功能，且对动物无毒无副作用，不会在动物体内富集，其本身还可以参与新陈代谢，当摄取到人体后不会造成危害。
附图说明
2)加入胰蛋白酶和胃蛋白酶，按照1:1的比例加入到上述的猪血混合液中，其总加入质量是猪血质量的3%；
3)酶解条件是：37℃，转速为150r/min，酶解时间为6小时；
4)酶解液离心过滤，取上清液，上清液真空抽滤，所得滤液再进行0.22um水系膜过滤，两次过滤后的酶解上清液，用超滤离心管（孔径为3000Da）得3000Da以下的过滤液，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得血源酶解肽。
本发明的显著优点是：本发明所涉及一种抑制动物肠道炎症血源酶解肽的应用，显著特点归结如下：
1） 在医药和饲料方面，抗炎症血源酶解肽的筛选为新药合成的研发奠定基础，尤其是现今社会中越来越多的人对抗生素的使用越来越普遍，某些病原微生物对抗生素的耐药性也越来越高；过多的抗生素使用会对动物和人造成危害；
该活性肽具有显著地抑制肠道炎症的功能，且对动物无毒无副作用，不会在动物体内富集，其本身还可以参与新陈代谢，当摄取到人体后不会造成危害。
附图说明
[0007] 图1是PBS、血源酶解产物、血源粉末和诺氟沙星小鼠体重变化比较。
[0008] 图2是PBS、血源酶解产物、血源粉末和诺氟沙星小鼠便血情况比较。
[0009] 图3 PBS、血源酶解产物、血源粉末和诺氟沙星肠道形态比较。
[0010] 图4是PBS、血源酶解产物、血源粉末和诺氟沙星肠长度比较。
[0011] 图5 PBS、血源酶解产物、血源粉末和诺氟沙星肠道组织评分比较。
[0012] 图6是PBS、血源酶解产物、血源粉末和诺氟沙星肠黏膜病理形态比较。
[0013] 图7是PBS、血源酶解产物、血源粉末和诺氟沙星Q-PCR检测炎症因子比较。
具体实施方式
[0014]下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0015] 实施例1称取猪血5.0g，胰蛋白酶0.15mg，胃蛋白酶0.15mg，配磷酸缓冲溶液40mL于锥形瓶中，在摇床里进行酶解.摇床温度设定为37度，搅拌转速为150r/min,酶解时间6小时。酶解液离心取滤液，离心机的转速设定为5000 rpm/min，常温离心时间为10min。去沉淀，取上清，重复离心两次；将所得滤液真空抽滤，所得滤液进行0.22um水系膜过滤，两次过滤后的酶解上清液，用超滤离心管（孔径为3000Da）于2500 rpm/min离心过滤得3000Da以下的过滤液，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得血源酶解肽粉末。利用DSS建立C57BL/6小鼠的急性肠道炎症模型：利用浓度为2.5%的DSS建模，将配好的DSS溶液装在饮水瓶中，供给4组小鼠自由饮用，每天对每只小鼠的状态、体重、便血情况进行观察，以确保建模成功建立。在5天结束后，撤去DSS溶液，更换装有自来水的饮用水。将小鼠分为4组分别为阴性对照组、血源粉末组、血源酶解肽组、阳性对照组，与实验开始第一天，即饮用DSS第一天，阴性对照组、血源粉末组、酶解产物组、阳性对照组剂量分别按0、500 C/mg˙kg-1、500 C/mg˙kg-1、8 C/mg˙kg-1，每组在同一时间定量用配制好各组不同剂量的溶液喂食，在撤去DSS溶液换为正常饮用水后每天对每只小鼠进行称重，并计算每组小鼠的平均体重变化。结果如图1所示，初期血源酶解产物组体重下降幅度低于阳性组，在恢复期，血源酶解肽组小鼠也是最快恢复到初始体重，可见血源酶解肽对肠道炎症具有抑制和治疗的功效。
[0016] 实施例2称取猪血5.0g，胰蛋白酶0.15mg，胃蛋白酶0.15mg，配磷酸缓冲溶液40mL于锥形瓶中，在摇床里进行酶解.摇床温度设定为37度，搅拌转速为150r/min,酶解时间6小时。酶解液离心取滤液，离心机的转速设定为5000 rpm/min，常温离心时间为10min。去沉淀，取上清，重复离心两次；将所得滤液真空抽滤，所得滤液进行0.22um水系膜过滤，两次过滤后的酶解上清液，用超滤离心管（孔径为3000Da）于2500 rpm/min离心过滤得3000Da以下的过滤液，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得血源酶解肽粉末。利用DSS建立C57BL/6小鼠的急性肠道炎症模型：利用浓度为2.5%的DSS建模，将配好的DSS溶液装在饮水瓶中，供给4组小鼠自由饮用，每天对每只小鼠的状态、体重、便血情况进行观察，以确保建模成功建立。在5天结束后，撤去DSS溶液，更换装有自来水的饮用水。将小鼠分为4组分别为阴性对照组、血源粉末组、酶解产物组、阳性对照组，与实验开始第一天，即饮用DSS第一天，阴性对照组、血源粉末组、酶解产物组、阳性对照组剂量分别按0、500 C/mg˙kg-1、500 C/mg˙kg-1、8 C/mg˙kg-1，每组在同一时间定量用配制好各组不同剂量的溶液喂食，在撤去DSS溶液换为正常饮用水后，对小鼠进行粪便隐血的半定量检查。具体操作方法如下：
1）将测试卡背面朝上，打开印有“Development Window”的封盖；
2）取每只待测小鼠的新鲜粪便，迅速均匀涂抹在测试区域；
3）向粪便样品上第一滴显色剂A，待试剂完全渗透以后，再滴加一滴显色剂B；
4）加入显色剂B后，于2min后判读完毕。
1）将测试卡背面朝上，打开印有“Development Window”的封盖；
2）取每只待测小鼠的新鲜粪便，迅速均匀涂抹在测试区域；
3）向粪便样品上第一滴显色剂A，待试剂完全渗透以后，再滴加一滴显色剂B；
4）加入显色剂B后，于2min后判读完毕。
[0017] 5）检验结果的判定：（a）加入显色剂B后,立即产生蓝紫色，报告为（4+）；
（b）加入显色剂B后,10s内产生蓝紫色，报告为（3+）；
（c）加入显色剂B后,1min内产生蓝紫色，报告为（2+）；
（d）加入显色剂B后,1～2min内产生紫红色，报告为（1+）；
（e）加入显色剂B后,判读时间内无任何蓝紫色或紫红色的颜色反应，，报告为（-）。
（b）加入显色剂B后,10s内产生蓝紫色，报告为（3+）；
（c）加入显色剂B后,1min内产生蓝紫色，报告为（2+）；
（d）加入显色剂B后,1～2min内产生紫红色，报告为（1+）；
（e）加入显色剂B后,判读时间内无任何蓝紫色或紫红色的颜色反应，，报告为（-）。
[0018] 依据以上方法，每天同一时间对每只小鼠进行粪便隐血检测，对比，观察。结果如图2所示，四组小鼠都有不同程度的便血情况，证明小鼠体重下降是有肠道炎症引起的。血源酶解肽和诺氟沙星也有一定程度的便血情况，但明显比血源粉末和PBS溶液状况轻，酶解产物组为浅紫色，诺氟沙星组相对颜色稍深，可见血源酶解产物对肠道炎症的治疗效果优于诺氟沙星。
[0019] 实施例3称取猪血5.0g，胰蛋白酶0.15mg，胃蛋白酶0.15mg，配磷酸缓冲溶液40mL于锥形瓶中，在摇床里进行酶解.摇床温度设定为37度，搅拌转速为150r/min,酶解时间6小时。酶解液离心取滤液，离心机的转速设定为5000 rpm/min，常温离心时间为10min。去沉淀，取上清，重复离心两次；将所得滤液真空抽滤，所得滤液进行0.22um水系膜过滤，两次过滤后的酶解上清液，用超滤离心管（孔径为3000Da）于2500 rpm/min离心过滤得3000Da以下的过滤液，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得血源酶解肽粉末。利用DSS建立C57BL/6小鼠的急性肠道炎症模型：利用浓度为2.5%的DSS建模，将配好的DSS溶液装在饮水瓶中，供给4组小鼠自由饮用，每天对每只小鼠的状态、体重、便血情况进行观察，以确保建模成功建立。在5天结束后，撤去DSS溶液，更换装有自来水的饮用水。将小鼠分为4组分别为阴性对照组、血源粉末组、酶解产物组、阳性对照组，与实验开始第一天，即饮用DSS第一天，阴性对照组、血源粉末组、酶解产物组、阳性对照组剂量分别按0、500 C/mg˙kg-1、500 C/mg˙kg-1、8 C/mg˙kg-1，每组在同一时间定量用配制好各组不同剂量的溶液喂食，在撤去DSS溶液换为正常饮用水后，从每组中各随机取3支，乙醚麻醉后断颈处死，解剖取其肠道，进行观察。
[0020] 结果如图3，四组肠道在长度上有很大的差别，PBS组小鼠肠道出现非常明显的萎缩现象，长度短细，内部无粪便积累，意味着无法正常进食，且仅能看到凝固的血液粘附在肠道内壁；血源粉末组萎缩情况比PBS组稍好一些，其余情况相差不大，同样无粪便残留；而诺氟沙星组和血源酶解肽组均在肠道内发现残留粪便，粪便混油少量红色血液，但无凝固现象，情况远远优于其他两组。血源酶解肽组的肠道长度比诺氟沙星组的稍长一些，且均没有出现太明显的萎缩现象。
[0021] 图4展示了每组小鼠肠道的平均长度，血源酶解组的肠道长度明显比其他3组的长，可见，血源酶解肽产物能很好的抑制肠道炎症，阻止或缓解小鼠肠道萎缩，稳定小鼠的病情，治疗效果比诺氟沙星好一些。
[0022] 实施例4称取猪血5.0g，胰蛋白酶0.15mg，胃蛋白酶0.15mg，配磷酸缓冲溶液40mL于锥形瓶中，在摇床里进行酶解.摇床温度设定为37度，搅拌转速为150r/min,酶解时间6小时。酶解液离心取滤液，离心机的转速设定为5000 rpm/min，常温离心时间为10min。去沉淀，取上清，重复离心两次；将所得滤液真空抽滤，所得滤液进行0.22um水系膜过滤，两次过滤后的酶解上清液，用超滤离心管（孔径为3000Da）于2500 rpm/min离心过滤得3000Da以下的过滤液，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得血源酶解肽粉末。利用DSS建立C57BL/6小鼠的急性肠道炎症模型：利用浓度为2.5%的DSS建模，将配好的DSS溶液装在饮水瓶中，供给4组小鼠自由饮用，每天对每只小鼠的状态、体重、便血情况进行观察，以确保建模成功建立。在5天结束后，撤去DSS溶液，更换装有自来水的饮用水。将小鼠分为4组分别为阴性对照组、血源粉末组、酶解产物组、阳性对照组，与实验开始第一天，即饮用DSS第一天，阴性对照组、血源粉末组、酶解产物组、阳性对照组剂量分别按0、500 C/mg˙kg-1、500 C/mg˙kg-1、8 C/mg˙kg-1，每组在同一时间定量用配制好各组不同剂量的溶液喂食，在撤去DSS溶液换为正常饮用水后，从每组中各随机取3支，乙醚麻醉后断颈处死，解剖取其肠道，进行肠道组织病理学实验。
[0023] 正常小鼠结肠粘膜结构正常，不应该出现萎缩。变性、坏死、炎性细胞浸润、溃疡等现象。而如图5，PBS组具有典型的溃疡性结肠炎的病理变化，其肠道黏膜层基本上全部消失，杯状细胞已完全不可见，溃疡现象非常严重；血源粉末组在近尾端残存少量杯状细胞，但排列比较疏松混乱，远尾端黏膜层已遭到破坏，说明该组小鼠受到较大程度的损伤；诺氟沙星组同样有少量杯状细胞存留，但细胞排列相对紧密整齐，这是该组小鼠肠道能保留一部分机能，阻止病情恶化；血源酶解组小鼠肠黏膜状况相对最好，近尾端和远尾端均未出现太大面积的溃疡，只有局部小面积被炎症浸润，杯状细胞得以保留，还能执行一定的生理机能。可见血源酶解组对肠道炎症的治疗效果较好。图6所示，为残留杯状细胞为基础转化为病理学评分，分数越高，表明残留杯状细胞数量越多，肠黏膜遭到破坏程度越小。可见血源酶解产物对肠道黏膜具有显著保护作用。
[0024] 实施例4称取猪血5.0g，胰蛋白酶0.15mg，胃蛋白酶0.15mg，配磷酸缓冲溶液40mL于锥形瓶中，在摇床里进行酶解.摇床温度设定为37度，搅拌转速为150rpm/min,酶解时间6小时。酶解液离心取滤液，离心机的转速设定为5000 rpm/min，常温离心时间为10min。去沉淀，取上清，重复离心两次；将所得滤液真空抽滤，所得滤液进行0.22um水系膜过滤，两次过滤后的酶解上清液，用超滤离心管（孔径为3000Da）于2500 rpm/min离心过滤得3000Da以下的过滤液，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得血源酶解肽粉末。利用DSS建立C57BL/6小鼠的急性肠道炎症模型：利用浓度为2.5%的DSS建模，将配好的DSS溶液装在饮水瓶中，供给4组小鼠自由饮用，每天对每只小鼠的状态、体重、便血情况进行观察，以确保建模成功建立。在5天结束后，撤去DSS溶液，更换装有自来水的饮用水。将小鼠分为4组分别为阴性对照组、血源粉末组、血源酶解组、阳性对照组，与实验开始第一天，即饮用DSS第一天，阴性对照组、血源粉末组、血源酶解组、阳性对照组剂量分别按0、500 C/mg˙kg-1、500 C/mg˙kg-1、8 C/mg˙kg-1，每组在同一时间定量用配制好各组不同剂量的溶液喂食，在撤去DSS溶液换为正常饮用水后，从每组中各随机取3支，乙醚麻醉后断颈处死，解剖取其肠道，进行肠黏膜RNA提取，进行炎症因子Q-PCR检测对常见炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10进行定量分析。
[0025] 如图7所示，在TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10四种炎症因子的定量检测中，血源酶解组含量最低，远远低于PBS组和血源粉末组，诺氟沙星组含量稍高于血源酶解组，但低于其他两组，表明血源酶解肽的抑制炎症效果优于诺氟沙星。
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