技术领域
[0001] 本
发明涉及肿瘤
治疗技术领域，具体而言，涉及一种载药微球、抗肿瘤药物及制备方法。
背景技术
[0002] 免疫治疗是最具临床应用前景的肿瘤治疗策略。肿瘤免疫治疗的基本原理为通过
生物学方法增强自身免疫效应细胞功能或者过继抗肿瘤活性细胞来控制肿瘤。对于实体肿瘤而言，肿瘤免疫治疗取得疗效的一个重要环节是免疫效应细胞迁移进入肿瘤内，实现与肿瘤细胞的直接
接触，从而杀灭肿瘤细胞。
[0003] 在肿瘤内部，肿瘤细胞与基质细胞等能分泌多种趋化因子，但多数趋化因子功能为促进免疫抑制细胞向肿瘤内迁移，而能促使免疫效应细胞迁移的趋化因子较少，导致杀灭肿瘤的免疫效应细胞并不能有效达到肿瘤内部，肿瘤免疫治疗对实体肿瘤普遍疗效较差。此外，现有的负载
化疗药物效率低，且现有的肿瘤免疫治疗不能改善肿瘤免疫抑制微环境，无法逆转肿瘤免疫逃逸。
[0004] 鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种载药微球、抗肿瘤药物及制备方法以解决上述技术问题。
[0006] 本发明是这样实现的：
[0007] 一种载药微球，其包括负载基质和活性因子，活性因子
吸附于负载基质上；活性因子包括趋化因子和细胞因子中的任意一种或者两者的组合。
[0008] 本发明提供了一种载药微球，该载药微球通过负载基质吸附活性因子。使用时，一方面载药微球通过动脉
插管导入肿瘤内，能同时达到栓塞肿瘤血管与调节肿瘤免疫微环境的双重作用，减少了肿瘤免疫逃逸；另一方面，采用直接瘤体内注射载药微球的方式，负载的活性因子缓慢释放，达到比较稳定局部浓度，持续吸引免疫效应细胞向瘤体内迁移，可以增强细胞免疫治疗与免疫检查点
抗体治疗的疗效。因此，载药微球与现有的载化疗药物微球相比更具临床应用前景。通过在载药微球中负载趋化因子和细胞因子可以促进靶向瘤体内免疫效应细胞的迁移。
[0009] 在本发明应用较佳的
实施例中，上述趋化因子为促使免疫效应细胞向肿瘤内迁移、促使免疫效应
细胞增殖或存活的趋化因子；
[0010] 优选的，趋化因子包括CCL19、CXCL9、CXCL10和CCL3中的任意一种及多种的趋化因子的组合；
[0011] 优选的，趋化因子为CXCL10。
[0012] 趋化因子为一类能趋化免疫细胞定向移动的小分子分泌蛋白，趋化因子CCL19在T细胞和多种肿瘤细胞上表达。CCL19能趋化CD4+和CD8+T细胞浸润肿瘤，介导免疫细胞释放细胞因子，抑制肿瘤增殖、迁移和侵袭。
[0013] CXCL9是γ-干扰素诱导单核细胞产生的小分子
蛋白质，属于趋化因子α-亚家族(CXC家族)，CXCL9趋化因子已证实能趋化炎性细胞迁移、诱导
炎症反应、促进新生血管生长、抑制由
成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子诱导的新生血管生长。
[0014] CXCL9和CXCL10能活化并趋化效应淋巴细胞，如T淋巴细胞、NK细胞。
[0015] CXCL10又称为干扰素γ诱导蛋白10，属于CXC趋化因子超家族的非ELR类，参与多种自身免疫性
疾病。CXCL10能够抑制造血细胞集落的形成，趋化单核细胞、活化T细胞和自然杀伤细胞，刺激T细胞黏附内皮细胞以及自然杀伤细胞介导的细胞融解，抑制血管生成等。主要的靶细胞是活化的T淋巴细胞。人成纤维细胞、单核细胞、内皮细胞、肝实质细胞、
角化细胞及HL60和U937细胞株均能被干扰素γ诱导表达CXCL10。
[0016] CCL3也称为巨噬细胞炎性蛋白1-aMIP-1α，人体内多种细胞均具有分泌CCL3的能
力。CCL3在人体内的受体有CCR1、CCR5和CCR9，这些受体均属于G蛋白偶联受体，两者特异性结合后产生瀑布样细胞活化作用从而诱导趋化炎症细胞到达效应部位。CCL3除对单核细胞、中性粒细胞等产生趋化作用之外，还参与NK细胞和NTL介导的细胞溶解作用，参与炎症和肿瘤局部免疫过程，介导其他细胞因子的释放。
[0017] 在肿瘤免疫方面，CCL3既可以促进单核巨噬细胞细胞系统产生MIP-3α来加强其对DC的趋化作用，还可以直接或间接促使CD4+T、CD8+T释放炎性细胞因子来减免肿瘤生长，但同时CCL3还可以促进肿瘤癌灶区域血管形成，增强癌细胞和血管内皮的粘附作用使金属蛋白酶
水解活性上调而促进肿瘤的转移。
[0018] 本发明通过提供负载有上述趋化因子的载药微球，从而趋化肿瘤细胞和免疫效应细胞的转移，促进免疫效应细胞靶向杀死肿瘤细胞，从而实现肿瘤的免疫治疗。
[0019] 载药微球可通过动脉插管导入肿瘤内，同时达到栓塞肿瘤血管与调节肿瘤免疫微环境的双重作用，为肿瘤介入治疗提供新的栓塞剂。这种载药微球也可通过负载相应的趋化因子直接瘤体内注射的形式，与其他免疫治疗如Car-T细胞、免疫检查点PD-1/PD-L1单克隆抗体联合应用，促进免疫效应细胞向瘤内迁移，起到相互协同增效的作用。通过载药微球在瘤体内直接注射的方式，可实现负载的趋化因子与细胞因子缓慢释放，为开发直接瘤体内注射的趋化因子与细胞因子治疗药物提供可能。
[0020] 在本发明应用较佳的实施例中，上述细胞因子为促使免疫效应细胞向肿瘤内迁移、促使免疫效应细胞增殖或存活的细胞因子；
[0021] 优选的，细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤
坏死因子和生长因子中的任意一种及多种细胞因子的组合。
[0022] 优选的，细胞因子包括白细胞介素和干扰素中的任意一种及多种细胞因子的组合。
[0023] 更优选的，白细胞介素为IL-2或IL-7。
[0024] 通过负载上述细胞因子可以促进免疫效应细胞向肿瘤内迁移，促使免疫效应细胞增殖或存活，从而实现肿瘤的免疫治疗。
[0025] 在本发明应用较佳的实施例中，上述负载基质的材料为高分子聚合材料或胶体材料。
[0026] 在本发明应用较佳的实施例中，上述负载基质的材料为高分子聚合材料；
[0027] 高分子聚合材料选自甲壳素、
纤维素、聚
氨基酸、聚乙烯醇、聚乳酸、聚己内酯或聚磷腈；
[0028] 优选的，负载基质通过
物理吸附的方式连接活性因子。
[0029] 负载基质通过物理吸附方式负载活性因子，这样作用具有临床应用易操作的特点。
[0030] 一种载药微球的制备方法，其包括：将负载基质与活性因子混合静置。通过将负载基质与活性因子混合，使得活性因子负载在负载基质上。
[0031] 在本发明应用较佳的实施例中，上述混合静置的时间为30-40min。通过30-40min的混合静置使得活性因子以物理吸附或共价连接的方式吸附在负载基质上，以形成载药微球。
[0032] 一种抗肿瘤药物，其含有载药微球。将载药微球包覆于抗肿瘤药物中，进行特异性抑制或杀死靶向肿瘤细胞。
[0033] 在本发明应用较佳的实施例中，上述肿瘤选自：腺瘤、淋巴瘤、肠癌、肝癌、头颈癌或结肠癌。优选的，上述肿瘤选自肝癌或结肠癌。经实验验证，本发明提供的载药微球及抗肿瘤药物能促进T细胞向结肠癌内浸润，从而实现免疫治疗。
[0034] 在本发明应用较佳的实施例中，上述抗肿瘤药物的剂型选自片剂、冲剂、袋泡剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、合剂、酊剂、灌肠剂、膜剂或针剂。
[0035] 抗肿瘤药物的剂型可根据需要进行调整。优选为针剂，这样方便临床注射应用。
[0036] 本发明具有以下有益效果：
[0037] 本发明提供了一种载药微球、抗肿瘤药物及制备方法，该载药微球通过载药基质负载趋化因子能趋化肿瘤细胞和免疫效应细胞的转移，促进免疫效应细胞靶向杀死肿瘤细胞，载药基质负载细胞因子能促进免疫效应细胞向肿瘤内迁移，促使免疫效应细胞增殖或存活，从而实现肿瘤的免疫治疗。该载药微球临床
给药治疗可通过直接瘤体注射给药或动脉插管灌注途径给药，直接瘤体注射可实现负载的趋化因子与细胞因子缓慢释放，达到比较稳定局部浓度，持续吸引免疫细胞向瘤体迁移，增强细胞免疫治疗与免疫检查点抗体治疗的疗效。载药微球与现有的载化疗药物微球相比更具临床应用前景。而动脉插管灌注具有栓塞的效果和调节肿瘤免疫微环境的双重作用，起到免疫治疗的作用。其制备方法简单，易于推广与应用。利用该载药微球可以制得抗肿瘤药物，靶向作用于肿瘤细胞。
附图说明
[0038] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0039] 图1为实验例1中四个治疗组流式细胞仪分析典型图；
[0040] 图2为实验例1中四组小鼠治疗后肿瘤浸润CD4+与CD8+T细胞的数量统计结果图(t检验，***P＜0.001，n＝5)。
具体实施方式
[0041] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用
试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0042] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例提供了载药微球的制备方法。从市场上购买获得负载基质(Callispher，100-300μm，恒瑞医药)和CXCL10，分别取1×104个负载基质，0.1ug CXCL10混合，静置负载
30min获得载有CXCL10的载药微球。
[0045] 实验例1
[0046] 本实验例进行了实施例1制得的载药微球进行小鼠结肠癌治疗实验。具体包括如下步骤：
[0047] (1)细胞的培养传代：实验所用的小鼠CT26结肠癌细胞株常规培养于含有10％灭活胎
牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5％的CO2
培养箱中培养，隔天换液。用
磷酸盐缓冲液(PBS)配制的0.15％的胰蛋白酶[含有0.02％的
乙二胺四乙酸(EDTA)]消化细胞传代，每隔3天传代1次，收集对数生长期的细胞用于实验。
[0048] (2)小鼠肿瘤模型的建立：收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2.5×106个/ml。BALB/C小鼠背部备皮，在小鼠右侧背部皮下注射细胞悬液0.2ml(5×105细胞/侧)，每天观察成瘤情况，待接种部位出现质地较硬的小结节认定为成瘤。用游标卡尺测量瘤体的长(a)和宽(b)，瘤体体积按照公式V＝a×b2/2表示。
[0049] (3)小鼠治疗：当步骤(2)的肿瘤生长至直径约为5cm时，将荷瘤小鼠分为四组(每组小鼠5只)：空白对照组(A组)、负载基质治疗组(B组)、趋化因子CXCL10治疗组(C组)和载药微球治疗组(D组)。A组瘤内注射PBS 0.1mL；B组瘤内注射PBS0.1mL+实施例1的负载基质1×104个；C组注射PBS 0.1mL+CXCL10 0.1ug；D组注射PBS0.1mL+实施例1的载药微球(负载基质1×104个+CXCL10 0.1ug)。
[0050] (4)肿瘤浸润淋巴细胞与脾淋巴细胞采集：治疗五天后脱颈处死小鼠，摘除侧肿瘤与脾脏，剪碎，将胶原酶、透明质酸酶和DNA酶用RPMI1640培养基稀释后加入肿瘤组织，37摄氏度孵育2小时。然后将肿瘤组织转移至干净的玻璃皿中
研磨，细胞悬液经40μm
过滤器过滤，除去杂物和细胞团
块。细胞悬液经清洗、重悬备用。
[0051] (5)流式细胞分析：取制备的细胞悬液调整细胞浓度5.0×106/ml，每个EP管中加入100μl细胞悬液，按
说明书加入对应的
荧光标记的检测抗体混匀，4℃避光孵育30min，PBS洗去未结合抗体，最后加入500μl PBS液体混匀，标记CD45、CD4与CD8抗体，转移至流式管中上机检测CD4+与CD8+T细胞的数量。
[0052] 4个治疗组流式细胞分析结果参照图1所示，四组小鼠治疗后肿瘤浸润CD4+与CD8+T细胞的数量统计结果参照图2所示(t检验，***P＜0.001，n＝5)，图2中，从左至右依次为A、+ +B、C和D组的CD4T细胞的数量和A、B、C和D组的CD8T细胞的数量。由图1和图2可知，利用高分子材料负载趋化因子CXCL10，可以显著提升CD4+T细胞和CD8+T细胞的数目，即瘤内注射时能促进T细胞向肿瘤内浸润，进而实现肿瘤的免疫治疗。
[0053] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
