一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法
阅读：183发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法，属于 生物 技术领域。该诱导方法包括以下步骤：首先，对红车轴草 种子 进行消毒和清洗处理后，再将红车轴草种子置于MS液体培养基中进行培养，得到红车轴草无菌苗；将上述红车轴草无菌苗作为侵染材料，并将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；接着，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香 酮 的MS培养基中进行共培养处理后，再转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中进行抑菌培养处理，即可得到诱导转化的毛状根。本发明通过筛选合适的外植体与改良菌液侵染方式，同时，通过控制乙酰丁香酮和头孢噻肟钠添加浓度，以及控制共培养时间，可以大大提高毛状根的诱导转化率和成活率。，下面是一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法专利的具体信息内容。
1.一种红车轴草毛状根的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对红车轴草种子进行消毒和清洗处理后，再将红车轴草种子置于MS液体培养基中进行培养7～14天，得到红车轴草无菌苗；
(2)先取整株红车轴草无菌苗作为侵染材料；接着，将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；然后，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中进行共培养处理；所述含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度为80～120μmol/L；
(3)将上述共培养处理后的侵染材料取出，并转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中进行抑菌培养处理，得到诱导转化的毛状根；所述含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度为450～550mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种红车轴草毛状根的诱导方法，其特征在于，所述发根农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：先将发根农杆菌接种于含有氨苄青霉素的YEB固体培养基中进行暗培养，形成单菌落；接着，将单菌落接种于含有氨苄青霉素的YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD600值为0.6～1，得到活化菌液；然后，将活化菌液接种于新鲜YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD600值为0.5～1，得到所述的发根农杆菌侵染液。
3.根据权利要求1所述的一种红车轴草毛状根的诱导方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，消毒处理的方法包括以下步骤：先用乙醇溶液对红车轴草种子进行初步消毒；接着，将初步消毒后的红车轴草种子用无菌水进行清洗；然后，将清洗后的红车轴草种子用氯化汞溶液进行再次消毒。
4.根据权利要求3所述的一种红车轴草毛状根的诱导方法，其特征在于，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为75％～90％。
5.根据权利要求3所述的一种红车轴草毛状根的诱导方法，其特征在于，所述氯化汞溶液中氯化汞的质量百分比浓度为0.1％～0.3％。
6.根据权利要求1所述的一种红车轴草毛状根的诱导方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，共培养处理的时间为36～72h。
7.一种利用权利要求1-6中任一项所述的诱导方法得到的红车轴草毛状根的增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，往MS液体培养基中添加蔗糖，得到培养液；然后，将毛状根接种于上述培养液中，并置于24～32℃的恒温条件下进行摇床振荡培养20～30天。
8.根据权利要求7所述的一种红车轴草毛状根的增殖方法，其特征在于，所述培养液中蔗糖的添加量为25～35g/L。
9.根据权利要求7所述的一种红车轴草毛状根的增殖方法，其特征在于，所述毛状根的接种量为1～2g/L。
10.根据权利要求7所述的一种红车轴草毛状根的增殖方法，其特征在于，所述的步骤中，摇床振荡培养的摇床转速为100～120g/L。
一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法
技术领域
背景技术
[0002] 红车轴草异黄酮类化合物是其重要的次生代谢活性成分，具有多种重要的药理功效，
[0003] 具有较高的医用价值。尽管栽培红车轴草资源丰富，但其生长周期长，活性成分含量易受环境变化与病虫害等因素的影响，易造成药材产量与质量的下降的问题。相比之下，毛状根培养体系具有遗传稳定、生长迅速、安全可靠、异黄酮次生代谢产物合成能力高以及规模化生产等特点。因此，目前亟待研究一种红车轴草毛状根的诱导以及对高产异黄酮毛状根体系进行系统优化的方法。
[0004] 另外，虽然在现有技术中，发根农杆菌可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，通过发根农杆菌感染植物，可以诱导产生毛状根；但是，现有技术还未成功利用发根农杆菌对红车轴草进行高效诱导以及对该毛状根体系的液体培养体系进行系统优化。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
[0007] 一种红车轴草毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
[0009] (2)先取整株红车轴草无菌苗作为侵染材料；接着，将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；然后，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中进行共培养处理；所述含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度为80～120mg/L；
[0010] (3)将上述共培养处理后的侵染材料取出，并转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中进行抑菌培养处理，得到诱导转化的毛状根；所述含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度为450～550mg/L。
[0011] 本发明实施例提供的一种优选方案，所述发根农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：先将发根农杆菌接种于含有氨苄青霉素的酵母甘露醇肉汤(Yeast Mannitol Broth，YEB)固体培养基中进行暗培养，形成单菌落；接着，将单菌落接种于含有氨苄青霉素的YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD600值为0.6～1，得到活化菌液；然后，将活化菌液接种于新鲜YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD600值为0.5～1，得到所述的发根农杆菌侵染液。
[0012] 本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(1)中，消毒处理的方法包括以下步骤：先用乙醇溶液对红车轴草种子进行初步消毒；接着，将初步消毒后的红车轴草种子用无菌水进行清洗；然后，将清洗后的红车轴草种子用氯化汞溶液进行再次消毒。
[0013] 本发明实施例提供的另一种优选方案，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为75％～90％。
[0014] 本发明实施例提供的另一种优选方案，所述氯化汞溶液中氯化汞的质量百分比浓度为0.1％～0.3％。
[0015] 本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(2)中，共培养处理的时间为36～72h。
[0016] 本发明实施例还提供了一种利用上述诱导方法得到的红车轴草毛状根的增殖方法，其包括以下步骤：首先，往MS液体培养基中添加蔗糖，得到培养液；然后，将毛状根接种于上述培养液中，并置于24～32℃的恒温条件下进行摇床振荡培养20～30天。
[0017] 本发明实施例提供的另一种优选方案，所述培养液中蔗糖的添加量为25～35g/L。
[0018] 本发明实施例提供的另一种优选方案，所述毛状根的接种量为1～2g/L。
[0019] 本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤中，摇床振荡培养的摇床转速为100～120g/L。
[0020] 与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
[0021] (1)本发明实施例提供的诱导方法，通过在MS固体培养基中添加适合浓度的乙酰丁香酮以及在MS液体培养基中添加适合浓度的头孢噻肟钠，并通过将整株红车轴草无菌苗作为待浸染材料以及控制侵染材料与发根农杆菌的共培养时间，可以大大提高毛状根的诱导转化率和成活率。
[0022] (2)本发明实施例得到的红车轴草毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等优点，可用于为将来利用毛状根工业化生产红车轴草异黄酮成分提供了新的途径，同时改善了栽培红车轴草资源生长周期长，易受环境变化而造成的品种退化，药材质量和产量下降等缺点，从而有利于保证品质良好的红车轴草的药用成分的供给，以满足市场需求。
[0023] (3)本发明实施例成功建立了一个高效快速体外诱导红车轴草毛状根体系，并通过PCR分析相关基因实现对高产异黄酮类次生代谢成分毛状根株系的分子鉴定。
[0025] 图1为红车轴草无菌苗的外观图。
[0026] 图2为红车轴草不同浸染部位的外观图。
[0027] 图3为实施例3得到的毛状根的外观图。
[0028] 图4为红车轴草毛状根的诱导和增殖的过程图。
[0029] 图5为实施例3得到的毛状根在分子鉴定时的PCR产物的凝胶电泳图。
[0030] 图6为实施例6得到的HPLC标准曲线图。
[0031] 图7为实施例6得到的毛状根的HPLC曲线图。
[0032] 图8为实施例6得到的红车轴草全草的HPLC曲线图。
具体实施方式
[0033] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。
[0034] 实施例1
[0035] 该实施例提供了一种红车轴草毛状根的诱导方法，其包括以下步骤：
[0036] (1)对红车轴草种子进行消毒和清洗处理后，再将红车轴草种子置于MS液体培养基中进行培养，得到红车轴草无菌苗，如附图1所示；具体的，先取饱满的红车轴草种子，用温水浸泡1h后，再用无菌水进行清洗3次；接着，用体积分数为90％的乙醇溶液对红车轴草种子进行初步消毒40s后，再将初步消毒后的红车轴草种子用无菌水进行清洗3次，每次清洗30s；然后，将清洗后的红车轴草种子用质量百分比浓度为0.3％的氯化汞溶液进行再次消毒7min后，再用无菌水对红车轴草种子进行清洗10次，每次清洗3min；再接着，将清洗后的红车轴草种子置于滤纸上发芽后，再置于MS液体培养基中(保证种子100％发芽以及苗健壮)，并置于温度为25℃、光强为2000xl、光照12h/d、黑暗12h/d的条件下进行交替培养7～14天，即可得到红车轴草无菌苗，备用。
[0037] (2)先取整株红车轴草无菌苗作为侵染材料；接着，将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；然后，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中，并将该培养基置于25℃黑暗条件下的恒温培养箱中进行共培养处理72h。其中，含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度为120mg/L，其采用的MS培养基为现有的MS固体培养基(含有琼脂)。
[0038] 另外，发根农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：先将-80℃条件下保存的发根农杆菌A4(内蒙古民族大学生命科学学院张继星教授提供)融化后，再用接种环蘸取少许发根农杆菌于含有氨苄青霉素的YEB固体培养基平板上划线(“Z”字形)，并将该培养基倒置于28℃恒温培养箱中进行暗培养40h以上直到菌种复苏，形成单菌落；接着，将单菌落接种于含有氨苄青霉素的YEB液体培养基中，并置于28℃的摇床中，在180rpm的条件下进行摇床振荡培养至OD600值为1，得到活化菌液；然后，将活化菌液接种于新鲜YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD600值为0.5时，即可得到所述的发根农杆菌侵染液，备用。
[0039] (3)将上述共培养处理后的侵染材料取出，并转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中，然后，将该培养基置于恒温培养箱中，并在24℃的黑暗条进行抑菌培养处理，即可得到诱导转化的毛状根；其中，含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度为550mg/L。另外，待毛状根长到约2.0cm长时，将其转移入新的含有头孢噻肟钠的MS固体培养基中，每1周进行继代培养并逐步降低培养基中头孢噻肟钠的浓度，直至毛状根除菌完全。
[0040] 实施例2
[0041] 该实施例提供了一种红车轴草毛状根的诱导方法，其包括以下步骤：
[0042] (1)对红车轴草种子进行消毒和清洗处理后，再将红车轴草种子置于MS液体培养基中进行培养，得到红车轴草无菌苗；具体的，先取饱满的红车轴草种子，用温水浸泡1h后，再用无菌水进行清洗3次；接着，用体积分数为75％的乙醇溶液对红车轴草种子进行初步消毒40s后，再将初步消毒后的红车轴草种子用无菌水进行清洗3次，每次清洗30s；然后，将清洗后的红车轴草种子用质量百分比浓度为0.1％的氯化汞溶液进行再次消毒7min后，再用无菌水对红车轴草种子进行清洗10次，每次清洗3min；再接着，将清洗后的红车轴草种子置于滤纸上发芽后，再置于MS液体培养基中(保证种子100％发芽以及苗健壮)，并置于温度为25℃、光强为2000xl、光照12h/d、黑暗12h/d的条件下进行交替培养7天，即可得到红车轴草无菌苗，备用。
[0043] (2)先取整株红车轴草无菌苗作为侵染材料；接着，将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；然后，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中，并将该培养基置于25℃黑暗条件下的恒温培养箱中进行共培养处理36h。其中，含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度为80mg/L，其采用的MS培养基为现有的MS固体培养基(含有琼脂)。
[0044] 另外，发根农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：先将-80℃条件下保存的发根农杆菌A4(内蒙古民族大学生命科学学院张继星教授提供)融化后，再用接种环蘸取少许发根农杆菌于含有氨苄青霉素的YEB固体培养基平板上划线(“Z”字形)，并将该培养基倒置于28℃恒温培养箱中进行暗培养40h以上直到菌种复苏，形成单菌落；接着，将单菌落接种于含有氨苄青霉素的YEB液体培养基中，并置于28℃的摇床中，在180rpm的条件下进行摇床振荡培养至OD600值为0.6，得到活化菌液；然后，将活化菌液接种于新鲜YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD600值为1.0时，即可得到所述的发根农杆菌侵染液，备用。
[0045] (3)将上述共培养处理后的侵染材料取出，并转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中，然后，将该培养基置于恒温培养箱中，并在24℃的黑暗条进行抑菌培养处理，即可得到诱导转化的毛状根；其中，含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度为450mg/L。另外，待毛状根长到约2.0cm长时，将其转移入新的含有头孢噻肟钠的MS固体培养基中，每1周进行继代培养并逐步降低培养基中头孢噻肟钠的浓度，直至毛状根除菌完全。
[0046] 实施例3
[0047] 该实施例提供了一种红车轴草毛状根的诱导方法，其包括以下步骤：
[0048] (1)对红车轴草种子进行消毒和清洗处理后，再将红车轴草种子置于MS液体培养基中进行培养，得到红车轴草无菌苗；具体的，先取饱满的红车轴草种子，用温水浸泡1h后，再用无菌水进行清洗3次；接着，用体积分数为75％的乙醇溶液对红车轴草种子进行初步消毒40s后，再将初步消毒后的红车轴草种子用无菌水进行清洗3次，每次清洗30s；然后，将清洗后的红车轴草种子用质量百分比浓度为0.1％的氯化汞溶液进行再次消毒7min后，再用无菌水对红车轴草种子进行清洗10次，每次清洗3min；再接着，将清洗后的红车轴草种子置于滤纸上发芽后，再置于MS液体培养基中(保证种子100％发芽以及苗健壮)，并置于温度为25℃、光强为2000xl、光照12h/d、黑暗12h/d的条件下进行交替培养7天，即可得到红车轴草无菌苗，备用。
[0049] (2)先取整株红车轴草无菌苗作为侵染材料；接着，将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中(具体可注射到侵染材料的根中)；然后，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中，并将该培养基置于25℃黑暗条件下的恒温培养箱中进行共培养处理48h。其中，含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度为100mg/L，其采用的MS培养基为现有的MS固体培养基(含有琼脂)。
[0050] 另外，发根农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：先将-80℃条件下保存的发根农杆菌A4(内蒙古民族大学生命科学学院张继星教授提供)融化后，再用接种环蘸取少许发根农杆菌于含有氨苄青霉素的YEB固体培养基平板上划线(“Z”字形)，并将该培养基倒置于28℃恒温培养箱中进行暗培养40h以上直到菌种复苏，形成单菌落；接着，将单菌落接种于含有氨苄青霉素的YEB液体培养基中，并置于28℃的摇床中，在180rpm的条件下进行摇床振荡培养至OD600值为0.8，得到活化菌液；然后，将活化菌液接种于新鲜YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD600值为0.8时，即可得到所述的发根农杆菌侵染液，备用。
[0051] (3)将上述共培养处理后的侵染材料取出，并转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中，然后，将该培养基置于恒温培养箱中，并在24℃的黑暗条进行抑菌培养处理，即可得到诱导转化的毛状根，如附图3所示；其中，含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度为500mg/L。另外，待毛状根长到约2.0cm长时，将其转移入新的含有头孢噻肟钠的MS固体培养基中，每1周进行继代培养并逐步降低培养基中头孢噻肟钠的浓度，直至毛状根除菌完全。
[0052] 另外，将该实施例得到的毛状根使用现有的发根农杆菌A4引物进行分子鉴定，同时建立阳性对照组(Positive control)和阴性对照组(Negative control)进行对比。其中，所采用鉴定的rolB基因上游引物的核苷酸序列为：GCTCTTGCAGTGCTAGATTT(如序列表SEQ ID No:1所示)；rolB基因下游引物的核苷酸序列为：GAAGGTGCAAGCTACCTCTC(如序列表SEQ ID No:2所示)；rolC基因上游引物的核苷酸序列为：CTCCTGACATCAAACTCGTC(如序列表SEQ ID No:3所示)；rolC基因下游引物的核苷酸序列为：TGCTTCGAGTTATGGGTACA(如序列表SEQ ID No:4所示)；毛状根基因组DNA提取选用市售的索莱宝植物基因组试剂盒，发根农杆菌Ri质粒DNA提取选用市售的索莱宝质粒小提试剂盒，所涉及的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)反应步骤为现有技术，其对应得到PCR产物的凝胶电泳图如附图5所示。从图中可以看到，本发明实施例提供的诱导方法通过发根农杆菌A4可以成功浸染红车轴草，其可以成功诱导出红车轴草毛状根。
[0053] 实施例4
[0054] 该实施例提供了一种利用上述诱导方法得到的红车轴草毛状根的增殖方法，其包括以下步骤：
[0056] (2)然后，取2g上述实施例3得到的毛状根，接种于1L上述培养液中，并置于24℃的恒温条件下以及100rpm的摇床转速条件下进行摇床振荡培养20天，即可完成对毛状根的增殖。
[0057] 实施例5
[0058] 该实施例提供了一种利用上述诱导方法得到的红车轴草毛状根的增殖方法，其包括以下步骤：
[0059] (1)往现有的MS液体培养基(pH为5.8)中添加蔗糖(碳源)，得到培养液；其中，培养液中蔗糖的添加量为35g/L。
[0060] (2)然后，取1g上述实施例3得到的毛状根，接种于1L上述培养液中，并置于32℃的恒温条件下以及140rpm的摇床转速条件下进行摇床振荡培养30天，即可完成对毛状根的增殖。
[0061] 实施例6
[0062] 该实施例提供了一种利用上述诱导方法得到的红车轴草毛状根的增殖方法，其包括以下步骤：
[0063] (1)往现有的MS液体培养基(pH为5.8)中添加蔗糖(碳源)，得到培养液；其中，培养液中蔗糖的添加量为30g/L。
[0064] (2)然后，取1.5g上述实施例3得到的毛状根，接种于1L上述培养液中，并置于28℃的恒温条件下以及120rpm的摇床转速条件下进行摇床振荡培养25天，即可完成对毛状根的增殖。其中，该增殖方法所采用的液体培养条件是通过根据毛状根生物量及总异黄酮含量来筛选液体培养体系中的以下6个单因素条件，选择其中的4种进行响应面BBD优化设计得到的：液体培养基(N5液体培养基、B6液体培养基、MS液体培养基、1/2MS液体培养基、1/4MS液体培养基)、摇床转速(80rpm、100rpm、120rpm、140rpm、160rpm)、糖添加量(15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L)、接种量(0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L)、培养温度(20℃、24℃、28℃、32℃、36℃)℃、培养天数(10d、15d、20d、25d、30d)。
[0065] 另外，实施例6的增殖的过程如附图4所示，图中a为红车轴草无菌苗；b为侵染后的红车轴草；c为诱导得到的毛状根；d为增值培养后的毛状根，从中可以看出，经过采用上述优化的液体培养条件的增殖方法可以大大提高毛状根的生物量。
[0066] 另外，将上述培养得到的毛状根以及对应的红车轴草全草置于电热恒温干燥箱中烘干至恒重，并对毛状根和红车轴草全草中的葛根素、大豆苷、鹰嘴豆芽素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元的含量分别进行高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析测定，其测定结果如附图6-8所示，图6-8中从左至右的1-6峰分别对应为樱黄素(Prunetin)、大豆苷(Daidzin)、大豆苷元(Daidizein)、染料木素(Genistein)、刺芒柄花黄素(Formoononetin)、鹰嘴豆芽素A(Biochanin A)成分，其中，图6为各成分的标准曲线图，其线性关系如下表1所示；图7为毛状根的HPLC曲线图；图8为红车轴草全草的HPLC曲线图。根据图6～8以及表1可以计算毛状根以及红车轴草全草中各成分的含量。
[0067] 表1
[0068] 成分 标曲线性关系 全草(mg/g) 毛状根(mg/g)樱黄素 Y＝1.68*107-1.75*105 R2＝0.994 0.077872083 0.116687679
大豆苷 Y＝1.74*107+9.38*104 R2＝0.997 0.134007759 0.063134253
大豆苷元 Y＝3.76*107-3.6*104 R2＝0.991 0.140760319 0.137713085
染料木素 Y＝1.17*107-7.3*104 R2＝0.996 0.463553077 0.501946325
刺芒柄花黄素 Y＝1.08*107-9.31*104 R2＝0.995 3.340837963 3.029211389鹰嘴豆芽素A Y＝1.29*107+3.35*104 R2＝0.990 2.81327124 2.369146202
大豆苷 Y＝1.74*107+9.38*104 R2＝0.997 0.134007759 0.063134253
大豆苷元 Y＝3.76*107-3.6*104 R2＝0.991 0.140760319 0.137713085
染料木素 Y＝1.17*107-7.3*104 R2＝0.996 0.463553077 0.501946325
刺芒柄花黄素 Y＝1.08*107-9.31*104 R2＝0.995 3.340837963 3.029211389鹰嘴豆芽素A Y＝1.29*107+3.35*104 R2＝0.990 2.81327124 2.369146202
[0069] 对比例1
[0070] 该对比例提供了一种传统方式的红车轴草毛状根的诱导方法，其与实施例3的唯一区别在于，将步骤“将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；然后，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中，并将该培养基置于25℃黑暗条件下的恒温培养箱中进行共培养处理48h”替换为“将红车轴草无菌苗的外植体(根，如附图2所示)浸泡在农杆菌侵染液中，并使外植体与农杆菌侵染液充分接触10min后，再将外植体取出，并用无菌滤纸吸干外植体表面残留的菌液；然后，将该外植体接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中，并将该培养基置于25℃黑暗条件下的恒温培养箱中进行共培养处理48h”。
[0071] 对比例2
[0072] 该对比例除了将外植体替换成红车轴草无菌苗的叶片(如附图2所示)，其余步骤均与对比例1相同。
[0073] 对比例3
[0074] 该对比例除了将外植体替换成红车轴草无菌苗的茎(如附图2所示)，其余步骤均与对比例1相同。
[0075] 对比例4
[0076] 该对比例除了将外植体替换成红车轴草无菌苗的叶柄，其余步骤均与对比例1相同。
[0077] 对比例5
[0078] 该对比例除了将实施例3步骤(1)中交替培养的时间替换成21天，其余步骤均与实施例3相同。
[0079] 对比例6
[0080] 该对比例除了将实施例3步骤(1)中交替培养的时间替换成35天，其余步骤均与实施例3相同。
[0081] 对比例7
[0082] 该对比例除了将实施例3步骤(1)中交替培养的时间替换成42天，其余步骤均与实施例3相同。
[0083] 对比例8
[0084] 该对比例除了将实施例3步骤(2)中共培养处理的时间替换成24h，其余步骤均与实施例3相同。
[0085] 对比例9
[0086] 该对比例除了将实施例3步骤(2)中共培养处理的时间替换成96h，其余步骤均与实施例3相同。
[0087] 对比例10
[0088] 该对比例除了将实施例3步骤(2)中共培养处理的时间替换成120h，其余步骤均与实施例3相同。
[0089] 对比例11
[0090] 该对比例除了将含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度替换为0mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0091] 对比例12
[0092] 该对比例除了将含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度替换为50mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0093] 对比例13
[0094] 该对比例除了将含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度替换为150mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0095] 对比例14
[0096] 该对比例除了将含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度替换为200mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0097] 对比例15
[0098] 该对比例除了将含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度替换为300mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0099] 对比例16
[0100] 该对比例除了将含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度替换为400mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0101] 对比例17
[0102] 该对比例除了将含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度替换为600mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0103] 对比例18
[0104] 该对比例除了将含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度替换为700mg/L，其余步骤均与实施例3相同。
[0105] 分别对上述实施例3以及对比例1～18提供的诱导方法进行诱导转化率和毛状根成活率统计，统计结果如下表2。其中，诱导转化率为含有毛状根的侵染材料数与总侵染材料数的比值。
[0106] 表2
[0107]
[0108]
[0109] 从上表2可以看到，本发明实施例提供的诱导方法，通过在MS固体培养基中添加适合浓度的乙酰丁香酮以及在MS液体培养基中添加适合浓度的头孢噻肟钠，并通过选择整株红车轴草无菌苗作为待浸染材料以及控制侵染材料与发根农杆菌的共培养时间，可以大大提高毛状根的诱导转化率和成活率。
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