技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物细胞代谢淬灭装置及其细胞代谢淬灭方法，涉及
微生物、动物、
植物、医药和化工技术领域。
背景技术
[0002] 生物技术领域在过去的几十年里得到了突飞猛进的发展，开辟了一个新纪元，以基因组学、转录组学、
蛋白质组学以及代谢组学为重要组成模
块的组学研究分析技术正发挥重要作用。与转录组和蛋白质组相同的是，代谢组学也是依赖生物背景的，每一种
代谢物的浓度高低都取决于细胞、组织或
机体的生理生化状态。然而，不同于mRNA和蛋白质，建立基因和代谢物之间的联系对于本领域目前
水平来说是极其困难甚至是不可能的。一个基因能转录形成多个mRNA，一段mRNA能够翻译形成多种蛋白质，一种酶蛋白能够催化形成多种代谢产物，尽管酶具有高度选择性，但是酶可以催化多个底物。研究表明，mRNA水平的变化其实不一定与蛋白水平的变化一致，而且翻译得到的蛋白也并不均具有酶学活性，所以在转录组或蛋白组研究中观察到的差异变化不一定与实际的表型变化相对应。因此，通过代谢组学方法定性或定量测定生物系统合成的代谢物成为了一种解析生物代谢过程的重要手段。
[0003] 代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后的新兴组学研究领域，是系统生物学的重要组成部分。通过代谢组学方法对生物
体细胞胞内代谢物进行定性或定量分析，需要周密而精确的实验设计和操作，尤其是代谢物样品预处理操作(细胞代谢淬灭和代谢物提取过程等)。细胞代谢是指细胞吸收营养物质维持生命和增殖并降解基质的一系列化学反应过程，其反应过程极快，能够在毫秒间实现相互转化。“如何对细胞进行及时、彻底代谢淬灭”以及“如何从细胞中准确、完整提取胞内代谢物”成为代谢组学研究的关键。细胞代谢淬灭过程是细胞代谢组学研究的关键第一步，其决定整个实验的成功与否。在代谢组学研究中常由于细胞代谢淬灭不完全，细胞酶活性不能得到及时抑制，而导致目标代谢物转化或分解，使得实验结果出现较大偏差。“如何对细胞进行及时、彻底代谢淬灭”以及“如何从细胞中准确、完整提取胞内代谢物”成为代谢组学研究的关键技术难题。
发明内容
[0004] 本发明以细胞代谢组学研究为主体，解决
现有技术中对细胞进行及时、彻底地代谢淬灭这一技术难题，提供了一种细胞代谢淬灭装置。该细胞代谢淬灭装置能够在取样时间点，瞬时
抽取细胞培养液并按一定比例使细胞培养液与低温细胞淬灭溶液得到充分混合效果，瞬间使细胞降至低温，抑制酶活
力，使其生理代谢活动停止。
[0005] 本发明的技术构思是：在细胞活动中，响应外界环境扰动的代谢反应会在几毫秒间完成，胞内代谢物会在瞬间转化为一种或多种其他代谢物，如果细胞淬灭过程中低温淬灭溶液与细胞培养液混合时间过长，会使细胞缓慢经历降温过程，这段时间内细胞会启动相应的应激代谢反应，直至
温度降至预设的低温条件时，目标代谢物可能已转
化成其他物质或降解，失去对目标代谢物的定量分析的意义。因此，为了使低温淬灭溶液瞬间与细胞培养液混合，使细胞温度迅速从培养温度(通常20～50℃)降至低温(–20～–30℃)，使细胞代谢活动停止，代谢物的分析数据才能准确表征细胞代谢状态。
[0006] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种细胞代谢淬灭系统，包括：
[0007] 细胞供给装置，用于微生物、动物或植物细胞的培养和
发酵；
[0008] 液液混合装置，将细胞培养液和低温淬灭溶液均匀混合；
[0009] 细胞收集装置，用于细胞
混合液的低温淬灭；及
[0010] 电磁反馈控制装置，控制细胞培养液和低温淬灭溶液的比例，控制细胞代谢淬灭反应。
[0011] 细胞供给装置、液液混合装置、细胞收集装置通过导
流管、连接管连接，由电磁反馈控制装置来控制整个系统中细胞培养液的导流，使终点淬灭溶液浓度可控，有利于准确控制细胞培养液和低温淬灭溶液的体积比。
[0012] 优选的，细胞供给装置为摇瓶体系、
发酵罐体系等
生物反应器中任一种。
[0013] 液液混合装置由三段导流管和混合室连接而成，三段导流管分别为细胞培养液段的导流管I、低温淬灭溶液段的导流管II以及细胞收集段的导流管III；导流管I和导流管II中各包含一个文丘里管
流体压缩喷射结构；导流管III中含有文丘里管流体压缩结构。
[0014] 由于细胞培养液的温度一般在20～50℃之间，而低温淬灭溶液的温度一般为–30～–40℃，如果细胞培养液与低温淬灭溶液混合不均匀，会造成细胞培养液中的水分来不及与淬灭
溶剂互溶，在低温条件下迅速结
冰，不利于混合，而造成混合后淬灭溶剂的浓度过高，影响代谢物分析结果。本发明中，通过将导流管I和II段设计成文丘里管结构，在导流管I段利用这种文丘里管结构将流体(细胞培养液)压缩形成高速流体，在混合室中喷射形成小液滴，与另一股流体(低温培养液)经压缩喷射形成的小液滴均匀混合，在气压差推动力作用下进入导流管III，导流管III中含有文丘里管流体压缩结构将混合液压缩为正常流体，最终以均质形态流入细胞收集瓶，实现了导流过程中低温淬灭溶液与细胞培养液的充分均匀混合。同时，这种文丘里管结构的设计内部无死
角，便于清洗，避免了引入其他混合器而带来的复杂内部结构，不会造成细胞残留或
试剂残留影响下次实验。
[0015] 本发明细胞收集装置包括细胞收集瓶、恒低温系统、缓冲瓶以及
真空泵，细胞收集瓶设在恒低温系统内部，细胞收集瓶、缓冲瓶以及
真空泵通过连接管连接。
[0016] 本发明对细胞收集瓶进行密闭处理，通过缓冲瓶连接真空泵，利用真空泵抽取细胞收集瓶和导流管中的空气产生低压，使导流管I、II和导流管III的两端形成气压差，而致使细胞培养液和低温淬灭溶液在压力差作用下迅速通过导流管混合流入细胞收集瓶。这种设计只需几毫秒就能将细胞培养液和低温淬灭溶液进行混合，使培养液中细胞温度能够在最短时间内降至低温(–20～–30℃)，最大程度地抑制细胞活性，使细胞代谢停滞在取样时刻，从而保证后续的代谢组学研究的数据真实、可靠。
[0017] 本发明电磁反馈控制装置由
电路①，电路②和电路③组成；电路①包括电磁继电器、低压电源、电路
开关Ⅰ以及金属触点A、B；电路②包括高压电源、电磁
阀、电路开关Ⅱ以及金属触点C、D；电路③包括高压电源、真空泵及金属触点E、F。电磁继电器包括电磁
铁、线圈、
衔铁和金属触片。
[0018] 进一步的，所述低温淬灭溶液由水、淬灭溶剂和强
电解质形成导电溶液，有利于连接低温淬灭溶液贮瓶底部的金属触点A和B，利用金属触点A和B连接产生的电
信号来控制细胞培养液的导流与否。
[0019] 本发明另一个目的是
请求保护采用上述系统进行快速细胞代谢淬灭的方法，该方法为：接通电路①、③，开启真空泵，使细胞培养液和低温淬灭溶液同时流入细胞收集瓶，当低温淬灭溶液被抽干后，自动断开电路①、③，接通电路②，真空泵停止工作，停止抽取细胞培养液；细胞收集瓶中的细胞混合液在低温环境中淬灭结束后，取出细胞收集瓶，离心，收集淬灭后的细胞。
[0020] 更为具体地，包括以下步骤：
[0021] S1.配制低温淬灭溶液，将其装入低温淬灭溶液贮瓶，闭合电路开关Ⅰ，金属触点A、B接通，接通电路①；
[0022] S2.电磁继电器使金属触片连
接触点E和F，接通电路③，开启真空泵；
[0023] S3.细胞培养液和低温淬灭溶液分别同时流入导流管Ⅰ和导流管Ⅱ中，在混合室中混合，经导流管Ⅲ进入细胞收集瓶中；
[0024] S4.当低温淬灭溶液被抽干后，金属触点A、B断开，电路①断开，电磁继电器上金属触片离开触点E和F，连接触点C和D，断开电路③，接通电路②，
电磁阀闭合阻止细胞培养液流动，真空泵停止工作；
[0025] S5.细胞收集瓶中的细胞混合液在低温环境中淬灭，淬灭结束后，取出细胞收集瓶，离心，收集淬灭后的细胞。
[0026] 本发明还请求保护由上述方法收集到的细胞在胞内代谢物提取中的应用。
[0027] 与现有技术相比，本发明有益效果是：本发明的生物细胞代谢淬灭系统通过对各部分装置的特殊设计，可以在几毫秒内抽取细胞培养液，适合生物细胞快速取样及细胞代谢淬灭操作，适用于各类淬灭溶剂。在液液混合装置、细胞收集装置和电磁反馈控制装置共同作用下，细胞培养液与低温细胞淬灭溶液得到充分混合，且细胞可瞬间降至低温，有效抑制酶活力、代谢淬灭完全，引入电磁反馈控制装置和真空泵使终点的淬灭溶剂浓度准确可控，实现细胞培养液与低温细胞淬灭溶液体积比的精确控制，使胞内代谢物数据真实可靠，此外，该系统还就有设备简单、组装方便等特点，该系统中各装置之间相辅相成，实现对细胞进行及时、彻底代谢淬灭。采用上述系统进行代谢淬灭的方法，简单易行，准确率高，为微生物、动物以及植物细胞的胞内代谢物研究提供技术支持。
附图说明
[0028] 图1为本
实施例细胞代谢淬灭装置示意图；
[0029] 图2为液液混合装置示意图；
[0030] 图3为触点A、B示意图；
[0031] 图4为电路①结构示意图；
[0032] 图5为电路②结构示意图；
[0033] 图6为电路③结构示意图。
[0034] 其中：1、细胞供给装置，2、取样管，3、止水夹，4、空气滤膜，5、电磁阀，6、导流管I，7、导流管II，8、导流管III，9、混合室，10、低温淬灭溶液贮瓶，11、细胞收集瓶，12、恒低温系统，13、连接管I，14、连接管II，15、缓冲瓶，16、真空泵，17、电磁继电器，18、电路开关I，19、电路开关II。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 实施例1
[0037] 细胞代谢淬灭操作要求细胞培养液体积与低温淬灭溶液体积控制一定比例，使得混合后溶剂浓度在一定范围内，该浓度条件下低温溶剂不仅要能够抑制胞内酶活性，淬灭细胞代谢，而且不能对细胞膜造成大的损伤，避免胞内代谢物在淬灭过程中的外泄。如果细胞培养液与低温淬灭溶液比例不合适，混合后淬灭溶剂浓度过高或过低，会造成细胞膜穿孔损伤(胞内代谢物外泄)或代谢淬灭不完全(酶活力没有完全抑制)。
[0038] 本发明中，根据胞内代谢物分析实验所需淬灭的细胞量，结合细胞培养液中的细胞浓度C1，计算本次实验所需细胞培养液的体积V1。按所选淬灭溶剂的最适淬灭浓度C2(混合后最终溶剂浓度，可参考现有技术相关文献报道)，计算出所需低温淬灭溶液的体积V2，量取所需体积的淬灭溶液进行低温预冷处理。确定好低温淬灭溶剂的体积V2后，实验过程中只需控制细胞培养液的取样体积V1就可以实现低温淬灭溶剂和细胞培养液的体积比的精确控制(V2/V1)，本发明中引入了电磁继电器控制电路①、②和③，在细胞代谢淬灭过程中实现了体积比的精确控制。具体操作步骤如下：
[0039] 1.配制低温淬灭溶液(由水、淬灭溶剂和强
电解质形成导电溶液)，本实施例中低温淬灭溶液为水、甲醇和NaCl配制形成的溶液(－40℃，60％(v/v)甲醇水溶液，其中含0.9％(w/v)NaCl溶液)。
[0040] 2.准确量取50mL低温淬灭溶液，装入低温淬灭溶液贮瓶10中，
瓶口连接导流管Ⅱ7，并使导流管Ⅱ7插入瓶底；细胞培养液段导流管Ⅰ6经电磁阀5与发酵罐取样管2连接。取样管2顶端设有止水夹3和空气滤膜4，细胞淬灭实验过程中止水夹3始终夹紧，待实验结束后打开，使取样管2内截留的细胞培养液回流到细胞供给装置1(本实施例中为发酵罐)中，空气滤膜4的设计确保了进入取样管2的空气为无菌空气，防止杂菌进入细胞培养系统。闭合电源开关II19连通控制电路②，确保电磁阀5处于打开状态(电路②断开时，电磁阀5为关闭状态)，此时导流管Ⅰ6与发酵罐取样管2连通。细胞收集瓶11和低温淬灭溶液贮瓶10均设在封闭的恒低温系统12内部(维持其中液体温度在-30～-40℃范围内)，细胞收集瓶11瓶口同时连接导流管Ⅲ8和连接管I 13，以实现与低温淬灭溶液贮瓶10和真空泵16的连接状态，在真空泵16和细胞收集瓶11之间还设有缓冲瓶15，缓冲瓶15可以防止真空泵16中液体倒吸流入细胞收集瓶11中。在低温淬灭溶液贮瓶10底部设有突起的金属触点A、B，通过金属触点A、B将电路①与低温淬灭溶液贮瓶10相连。
[0041] 3.闭合电路开关Ⅰ18(电路开关Ⅰ18初始状态为打开)，电路①接通，电磁继电器17产生磁力将衔铁吸住，金属触片在磁力作用下与金属触点E和F连接(金属触片初始
位置与金属触点C和D连接)，连通电路③，开启真空泵16开关，细胞收集瓶11、缓冲瓶15、导流管III 8和混合室9中形成真空，发酵罐中细胞培养液与低温淬灭溶液在气压差推动下快速进入导流管I 6和II 7中，经过文丘里管结构，两股流体都以分散的小液滴的形态从导流管中喷射出来进入混合室9得到均匀混合，混合后被抽入连接细胞收集瓶11的导流管Ⅲ8中，导流管Ⅲ8中含有的文丘里管流体压缩结构，其功能是为了使分散的液滴压缩至正常流体，最后进入恒低温系统12内的细胞收集瓶11中。本实施例中，低温淬灭溶液与细胞培养液混合后，淬灭溶剂甲醇的浓度会降低，混合后终浓度为50％(v/v)。
[0042] 4.低温淬灭溶液抽干后，低温淬灭溶液贮瓶10底部的金属触点A和B露出液面，A和B之间连接断开，由于溶液中无导
电介质(低温淬灭溶液)存在，闭合电路①断开，电磁继电器17线圈不再形成
磁场，失去了对电磁继电器17上金属触片的吸力，金属触片在
弹簧作用下离开触点E和F，连接触点C和D，断开电路③，接通电路②，电路②连通时电磁阀5“闭合”，阻止细胞培养液继续沿导流管Ⅰ6流入混合室9中。与此同时，触点E和F与金属触片分离也断开了真空泵16的电源开关，真空泵停止工作，致使整个取样过程终止，由于细胞收集瓶11中仍然保留一定的真空度，会继续保证混合室9内剩余混合液能够继续流入细胞收集瓶11中，至完全反应结束。停止细胞代谢淬灭操作。
[0043] 当低温淬灭溶液抽取完毕后，与低温淬灭溶液连接的导流管II 7低端连通空气，此时，理论上细胞收集瓶11中就不会再有液体流入，因为空气会优先进入导流管II 7中而阻断细胞培养液从导流管I 6的流入，从而达到按比例混合的效果。然而，在实际模拟实验中发现经导流管II 7进入的空气无法及时平衡混合室9、导流管III 8以及细胞收集瓶11内的
负压，导致仍然有细胞培养液会继续流向细胞收集瓶中。虽然只有少量细胞培养液会流入细胞收集瓶11中，但会导致终点的淬灭溶剂浓度不可控，给重复实验带来困难，影响胞内代谢物数据的真实可靠性。本发明装置中引入由电磁继电器控制电路①、②和③，通过电路的断开和闭合控制电磁阀5和真空泵16的开关，从而控制细胞培养液的取样量，能够实现细胞培养液和低温淬灭溶液的体积比的准确控制。
[0044] 5.细胞收集瓶11在恒低温系统12中，系统维持在－40℃左右，而细胞收集瓶11中的混合液由低温淬灭溶液(－40℃)和细胞培养液(30℃)组成，混合后的温度保持在－20～－30℃之间，混合液进入细胞收集瓶11后，混合液仍会维持在低温环境中。
[0045] 6.细胞混合液在低温条件下淬灭3min后，取出细胞收集瓶11，在－20℃，12000rpm条件下离心5min，收集淬灭后的细胞。
[0046] 7.为了洗除细胞表面残留的培养基成分，减小其对胞内代谢物定量的干扰，用5mL，－40℃，50％(v/v)甲醇水溶液重悬离心得到的细胞，在－20℃，12000rpm条件下离心
5min，收集细胞，－80℃超低温保存，用于胞内代谢物的提取。
