一株可低温降解纤维素的Pseudomonasgraminis菌及应用
阅读：223发布：2020-05-08
专利汇可以提供一株可低温降解纤维素的Pseudomonasgraminis菌及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株可低温降解 纤维 素的Pseudomonas graminis菌及应用，其保藏号为CGMCC NO.18751。该菌株在4℃低温下和10℃条件下具有较强的降解 纤维素 的能 力 ，且降解纤维素能力基本相同，在30℃条件下降解纤维素能力虽有所减弱但下降幅度不大，同时KY240菌株还具有解 钾 和解无机磷能力，有望用于制备成为降解纤维素的菌肥，促进秸秆腐熟，提高 土壤 肥力，特别是提高土壤中 植物 可利用钾、磷的量。，下面是一株可低温降解纤维素的Pseudomonasgraminis菌及应用专利的具体信息内容。
1.一株Pseudomonas graminis菌，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.:18751。
2.一种微生物制剂，其特征在于：其含有权利要求1所述的Pseudomonas graminis菌。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于：其用于以下至少一个方面：
降解含有纤维素的有机质；
促进秸秆腐熟；
解钾、解无机磷；
制备微生物肥。
4.权利要求1所述Pseudomonas graminis菌的应用，其特征在于：所述应用包括：
降解含有纤维素的有机质；
促进秸秆腐熟；
解钾、解无机磷；或
制备微生物肥。
5.一种促进纤维素降解的方法，包括将权利要求1所述Pseudomonas graminis菌与纤维素混合培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为0～40℃。
7.一种解钾的方法，其特征在于：将权利要求1所述Pseudomonas graminis菌与含钾的矿物混合培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述含钾的矿物选自钾长石、斜长石、微斜长石、伊利石、蛭石、蒙脱石、硅酸盐、云母。
9.一种解无机磷的方法，其特征在于：将权利要求1所述Pseudomonas graminis菌与含磷的矿物混合培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述含磷的矿物选自磷酸三钙、磷石灰、氟磷灰石、氯磷灰石、氢氧磷灰石、磷锶铝矿石、蓝铁矿、褐煤、泥炭土、银星石、磷铝石、红磷铁石。
一株可低温降解纤维素的Pseudomonas graminis菌及应用
技术领域
背景技术
[0002] 木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。木质纤维素包括三大类聚合物：纤维素、半纤维素与木质素。纤维素的纤丝在高等植物细胞壁维管组织中与木质素和半纤维素通过共价键和非共价键紧密缠绕相互嵌合，形成木质纤维素。木质纤维素在不同种、不同年龄及同一植物的不同部位的数量和种类都会有所不同。一般来说，木质纤维素含纤维素39％、半纤维素30％、木质素25％[1]。纤维素是以纤维二糖(葡萄糖-β-1，4-葡萄糖)为基本重复单元，由成千上万个葡萄糖分子组成的线状多聚物。纤维素链中β-1，4-连接的葡萄糖残基相对邻近单位旋转180°，链内以氢键维持稳定，纤维素在种属间结构变化很小。纤维素是植物细胞壁的主要成分，占生物质资源总量的90％以上，是自然界中最丰富的生物质资源。因此纤维素的降解是木质纤维素资源利用的一大突破点。据估计，木质纤维素占据[2]地球上光合产物的60％以上，并且全球每年产生的纤维素高达1000亿吨 ，利用丰富而廉价的纤维素物质将是人类解决未来粮食和能源问题的途径之一，意义深远。
[0003] 然而天然纤维类物质除少部分能被反刍动物低效率利用外,绝大多数就地烧毁或以废弃物的形式存在于自然环境中，在浪费能源的同时对环境造成了污染[3-4]。目前，对于纤维素的利用主要是通过化学或生物处理从而实现资源化。纤维素具有不溶性的刚性结构，在常温下不溶于水、也不溶于稀酸和稀碱[5]，在自然条件下分解缓慢，它的不溶性和异质性也导致了纤维素很难被降解[6]，因此很难作为工业原料及饲料，为此微生物分解纤维素成为纤维素生物处理技术的核心。为了充分开发利用这类丰富的可再生资源,早在1883年和1886年就有学者开始研究纤维素的生物降解[7],但真正利用微生物分解纤维素的研究开始于20世纪60年代，当时主要利用微生物分解纤维素生产单细胞蛋白；到70年代以后，随着能源危机和环境污染，研究的重点又逐步转移到开辟新能源和防止环境污染上来[8]。
[0004] 目前，国内外对纤维素的研究报道多为中、高温降解纤维素的微生物的研究和开发，而对于低温纤维素降解微生物的研究相对较少[9]，分离到的产低温纤维素酶的微生物也主要集中于来自海洋环境的一些海洋真菌[10-11]和细菌[12-14]，但这些菌株种类有限，酶活性较低，而中、高温纤维素降解菌是在一定的高温条件下才能进行，其对温度有一定的限制，因而也浪费了高温能源，因此低温纤维素降解菌具有一定的优势并具有很大的开发前景。
[0005] 我国是一个农业大国，农作物播种面积高居世界第一，秸秆资源也是当今世界最为丰富的国家之一，每年产生的农作物秸秆总量为6.87亿吨[15]，其中玉米秸秆2.2亿吨，是一种亟待进一步开发利用的生物物质资源[16]。东北及北方地区是我国的重要粮食储备区，是植物木质纤维素储量最多地区，作物收获后会有大量的作物秸秆等待处理，传统的处理方式多为焚烧和秸秆还田，由于北方地区雾霾气候严重，焚烧处理秸秆会加重的空气污染的问题，因此政府对焚烧秸秆做出了管制，大量的秸秆只能经还田腐解处理，但由于环境、温度会直接影响秸秆的腐解速率，东北及北方地区的寒冷条件使大量纤维素资源无法及时有效处理和利用。有学者研究发现，当土壤温度低于10℃时，土壤中微生物对秸秆的降解速度很慢；温度在20℃-30℃范围内时，微生物对秸秆的降解速度最快；当土壤温度低于30℃时，温度与秸秆的降解速度呈正相关，温度越低降解速度越慢[17]。我国北方大部分地区秋冬季节气温低，冰期长，气候干旱寒冷，秸秆还田后腐解缓慢，导致秸秆还田后不能及时腐解，土壤中残留大量的秸秆残渣直接影响农田整地和翌年作物的播种，同时还会使一些病虫在土壤中长时间存活，给作物生长带来严重的危害。为保证作物的正常播种和生长，许多地方还是采取田间焚烧来解决秸秆还田腐解缓慢给农田及作物带来的影响，这样虽暂时解决了作物的播种问题但是同时也给大气环境造成了严重的污染，因此还是不能合理有效的解决大量秸秆的处理利用问题。因此筛选低温降解纤维素的菌株的研究愈来愈成为国内学者研究的热点，若利用筛选到的低温降解纤维素菌株可加快还田秸秆在低温环境中腐解速度，使秸秆养分充分分解和释放，转变成极易被植物吸收利用的简单有机物，从而提高秸秆利用率进而增加产量，将具有重要的应用价值。
[0006] 目前报道中关于低温纤维素酶生产菌研究较少，穆春雷等[18]从秸秆还田土壤中分离出一株在13℃低温环境下高效分解纤维素的真菌M11,鉴定M11为草酸青霉[19](Penicillium oxalicum)；张丹等 分离得到两株细菌菌株B9(噬胞菌属，又名纤维粘菌属，Cytophage)和B21(纤维单胞菌属，Cellulomonas)，并确定其在10-15℃下对纤维素有明显降解作用；孟建宇等[20]在10℃下分离到一株极具开发潜力的低温纤维素酶产生菌；郑国香[21]等分离到一株菌株L-11，经鉴定该菌株为奥尔森青霉属，经测定其在15℃低温条件下具有降解微晶纤维素的功能；赵旭等[22]利用从渭源县山地采集的30份样品筛选出了1株能够在15℃条件下降解羧甲基纤维素、玉米秸秆纤维素和高产纤维素酶的真菌菌株D5，经ITS rDNA序列分析初步鉴定为Penicillium sp.。
[0007] 综上所述，现阶段对于低温纤维素降解菌的研究多集中在10℃-20℃，其虽然带来了一定的优势，但是应用范围依然较为有限。由此，筛选一种能在更低温度条件(4℃)下能够生长快速、高效降解纤维素的微生物菌株，且在较高的温度条件下也能有效降解纤维素的功能微生物菌株具有极为重要的现实意义和理论意义。
[0008] Pseudomonas graminis是Behrendt U,Ulrich A,Schumann P,et al.发现的一种新菌株[23]，和其他假单胞菌属一样，革兰氏阴性，有氧运动和杆状，带有极生鞭毛。分离物为过氧化氢酶阳性和氧化酶阴性，并且不能通过产生酸来氧化或发酵葡萄糖。分离物没有将硝酸盐还原为亚硝酸盐，但是能够单独利用多种化合物作为唯一的碳源，优选利用单糖。测试的二糖不用作底物。未有数据显示其可以降解纤维素。
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发明内容
[0034] 本发明的目的在于提供一株新Pseudomonas graminis菌株，该菌可在低温(4℃)降解纤维素，同时该菌株还具有解钾和解无机磷的功能。
[0035] 本发明所采取的技术方案是：
[0036] 发明人经过对来源于全国各地的土壤进行大量筛选，从近30万株微生物菌株中筛选到了一株KY240菌株，对该菌株16sDNA序列的测定结果表明，该菌株与Pseudomonas graminis高度同源，具有大于99.97％的同源性。此外，研究结果也表明该菌株还具有降解钾和降解无机磷的功能。KY240在4℃低温下降解纤维素，解钾和解无机磷的能力以及对小麦秸秆的腐熟具有促进作用的报道属于世界首次。
[0037] 本发明的第一个方面，提供：
[0038] 一株Pseudomonas graminis菌，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.:18751。保藏日期为2019年10月28日，保藏中心于同日登记入册并检测确定存活，建议的分类命名为：革兰氏假单胞菌Pseudomonas graminis。
[0039] 本发明的第二个方面，提供：
[0040] 一种微生物制剂，其含有本发明第一个方面的Pseudomonas graminis菌。
[0041] 在一些微生物制剂的实例中，其用于以下至少一个方面：
[0042] 降解含有纤维素的有机质；
[0043] 促进秸秆腐熟；
[0044] 解钾、解无机磷；
[0045] 制备微生物肥。
[0046] 本发明的第三个方面，提供：
[0047] 本发明第一个方面的Pseudomonas graminis菌的应用，所述应用包括：
[0048] 降解含有纤维素的有机质；
[0049] 促进秸秆腐熟；
[0050] 解钾、解无机磷；或
[0051] 制备微生物肥。
[0052] 本发明的第四个方面，提供：
[0053] 一种促进纤维素降解的方法，包括将本发明第一个方面的Pseudomonas graminis菌与纤维素混合培养。
[0054] 在一些促进纤维素降解的实例中，所述纤维素来自作物的秸秆、禽畜粪便、各种植物的枝叶和残体、蘑菇渣、制糖后的残渣、中草药的药渣、饮料原料的废弃物、农田中的植物残留物。
[0055] 在一些促进纤维素降解的实例中，所述培养的温度为0～40℃。
[0056] 本发明的第五个方面，提供：
[0057] 一种解钾的方法，包括将本发明第一个方面的Pseudomonas graminis菌与含钾的矿物混合培养。
[0059] 在一些解钾的实例中，云母包括黑云母、金云母、白云母和锂云母。
[0060] 本发明的第六个方面，提供：
[0061] 一种解无机磷的方法，包括将本发明第一个方面的Pseudomonas graminis菌与含磷的矿物混合培养。
[0063] 本发明的有益效果是：
[0064] 本发明的KY240菌株可4℃低温降解纤维素，经过对该菌株的16sDNA的序列测定分析，该菌株与Pseudomonas graminis高度同源。KY240与商业菌株枯草芽孢菌株92068相比，KY240菌株在4℃低温下和10℃条件下具有较强的降解纤维素的能力，且降解纤维素能力基本相同，在30℃条件下降解纤维素能力虽有所减弱但下降幅度不大，同时KY240菌株还具有解钾和解无机磷能力，对小麦秸秆的腐熟具有促进作用且作用明显优于商业用菌株92068。由此可见，KY240是一株工作范围广，兼具多功能的功能性微生物菌株，其在低温下(4℃)及中高温(10℃-30℃)下均可降解纤维素，同时兼具解钾、解无机磷能力且对小麦秸秆的腐熟具有促进作用。有望用于制备成为降解纤维素的菌肥，促进秸秆腐熟，提高土壤肥力，特别是提高土壤中植物可利用钾、磷的量。
附图说明
附图说明
[0065] 图1是KY240菌株与Pseudomonas graminis的同源对比分析(Neighbor-Join)；
[0066] 图2是KY240菌株在显微镜下的形态(10×100)；
[0067] 图3是KY240菌株在4℃下降解纤维素的结果；
[0068] 图4是KY240菌株在10℃下降解纤维素的结果；
[0069] 图5是KY240菌株在30℃下降解纤维素的结果；
[0070] 图6是KY240菌株的解钾能力的测定结果；
[0071] 图7是KY240菌株的解无机磷能力的测定结果；
[0072] 图8是菌株92068、KY240在30℃下有效活菌数的测定结果；
[0073] 图9是菌株92068、KY240在4℃下有效活菌数的测定结果；
[0074] 图10是4℃低温下KY240菌株与枯草芽孢杆菌92068菌株对小麦秸秆的腐熟情况。
具体实施方式
[0075] 发明人经过对来源于全国各地的土壤进行大量筛选，从近30万株微生物菌株中筛选到了一株在4℃低温下可稳定快速生长且降纤维素较稳定，同时在中温和高温下也能降解纤维素的菌株，命名为KY240。此外该菌株还具有降解矿物质钾、无机磷等多功能。
[0076] KY240菌株的16sDNA测定及菌株生理形态分析：
[0077] 菌株16sDNA的测定
[0078] CTAB法提取细菌DNA
[0079] 1)接种一单菌落于5mLR2A中，30℃培养过夜；
[0081] 3)5000r/min离心10分钟，弃去上清
[0082] 4)加入10mL TE离心洗涤后，用10mL TE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；
[0083] 5)取3.5mL菌悬液，加入184μL10％SDS，混匀，加入37μL10mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时；
[0084] 6)加入740μL5mol/L NaCl，再加入512μLCTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；
[0085] 7)加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
[0086] 8)上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；
[0087] 9)加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；
[0088] 10)用1mL TE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL RNaseA，4℃保存。
[0089] 扩增与测序
[0090] 采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.：1))和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.：2))进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行
1.5％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序(北京美亿美生物技术有限公司)，根据获得的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列并进行同源序列分析对比，建立系统发育树。
1.5％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序(北京美亿美生物技术有限公司)，根据获得的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列并进行同源序列分析对比，建立系统发育树。
[0091] KY240菌株16S测序结果
[0092] 经过对KY240菌株16sDNA序列的测定结果为：
[0093] ACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAAGCTCAAGGCTTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATGAGCCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTGCCCTACTCTAGCTTGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATTCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTCGCTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCCTTTCGAGACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCAGAGAGCAAGCTCTCTTCATCCGCTCGACTTGC(SEQ ID NO.：3).
[0094] 测序结果表明，该KY240菌株与Pseudomonas graminis具有大于99.97％的高度同源(图1是KY240菌株与Pseudomonas graminis的同源对比分析)。
[0095] KY240菌株形态观察
[0096] 菌株形态观察
[0097] 将筛选的菌株接种到R2A平板上，30℃培养2d，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征及有无芽孢等。
[0098] 菌株形态观察结果
[0099] 经观察KY240菌株(Pseudomonas graminis，假单胞菌属)在R2A培养基上培养生长2d，菌落形态菌落呈圆形，黄绿色不透明，表面光滑较湿润，边缘规则，有晕环，中央凸起，经显微镜测定其直径约2～3μm，圆形，有光泽，粘稠，微微隆起且边缘光滑整齐(图2，图中标尺长为10μm)。
[0100] KY240菌株解纤维素能力的测定
[0101] KY240菌株在不同温度下解纤维素能力的测定
[0102] 将在R2A培养基上培养生长2d的KY240菌株，接种于CMC培养基中，设置枯草芽孢杆菌(菌株92068)为阳性对照。KY240菌株和菌株92068同时分别在4℃和10℃下培养7d，30℃下培养2d后，用碘液熏蒸，测定解CMC圈的直径，单位mm。
[0103] 解CMC能力＝解CMC圈直径的毫米数+X
[0104] 注：X为加权系数，根据菌株水解圈的透明程度，相应的为：-1、0、1、2。数字2代表水解圈全完全透明；数字1代表溶解圈半透明；0代表溶解圈不透明，但在培养基表面具有水解痕迹，基本人眼观察不到溶解圈，但把菌落用水冲洗以后，在接种细菌处有微弱的水解的痕迹，-1代表无任何水解活性。该方法也被应用在测试细菌的解钾活性和解无机磷活性。
[0105] KY240菌株解纤维素能力的测定结果
[0106] 测定结果如表1和图3～图5所示，结果表明KY240菌株在4℃和10℃下解纤维素能力明显高于对照枯草芽孢杆菌菌株92068。
[0107] 表1.不同温度下CMC培养基上菌株降解纤维素的能力
[0108]
[0109]
[0110] 综上，枯草芽孢杆菌(92068)只在30℃高温条件下可高效降解纤维素；与枯草芽孢杆菌(92068)相比，KY240菌株在4℃低温下和10℃条件下具有很强的降解纤维素的能力，且降解纤维素能力基本相同，在30℃条件下降解纤维素能力虽有所减弱但下降幅度不大，由此可见，KY240是一株工作范围广，在低温(4℃～10℃)可降解纤维素菌株且在30℃下也可稳定高效降解纤维素的微生物菌株。
[0111] KY240菌株的多功能性测定
[0112] KY240菌株解钾能力的测定
[0113] 将在R2A培养基上培养生长2天的KY240菌株，接种于钾培养基(葡萄糖10.0g，酵母粉0.5g，硫酸铵1.0g，磷酸氢二钠2.0g，七水硫酸镁0.5g，碳酸钙1.0g，琼脂粉15.0g，钾长石1.0g，水1000mL)中，设置枯草芽孢杆菌(菌株92068)为阳性对照，室温下培养后，用水冲洗掉菌落后，测定解钾圈的直径，单位mm。
[0114] 解钾能力＝解钾圈直径的毫米数+X
[0115] 注：X为加权系数，根据菌株解钾圈的透明程度，相应的为-2、-1、0、1、2[0116] KY240菌株解钾能力的测定的结果
[0117] 结果如表2和图6所示，结果表明KY240菌株的解钾能力明显高于对照枯草芽孢杆菌菌株92068。
[0118] 表2.钾培养基上菌株的解钾能力
[0119]
[0120] KY240菌株解无机磷能力的测定
[0121] 将在R2A培养基上培养生长2天的KY240菌株，接种于无机磷培养基(葡萄糖10.0g，酵母提取物0.5g，硫酸铵0.5g，氯化钾0.02g，氯化钠0.02g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.0001g，硫酸铁0.0001g，琼脂粉10.0g，磷酸三钙5.0g，水1000mL)中，设置枯草芽孢杆菌(菌株92068)为阳性对照，室温下培养，用水冲洗掉菌落后，测定解磷圈的直径，单位mm。
[0122] 解无机磷能力＝解无机磷圈直径的毫米数+X
[0123] 注：X为加权系数，根据菌株解磷圈的透明程度，相应的为-2、-1、0、1、2[0124] KY240菌株解无机磷能力的测定结果
[0125] 结果如表3和图7所示，表明KY240菌株的解无机磷能力明显高于对照枯草芽孢杆菌菌株92068。
[0126] 表3.无机磷培养基上菌株的解无机磷能力
[0127]
[0128] KY240菌株在30℃/4℃下生长情况的测定
[0129] 将筛选得到的菌株，接种到50mLR2A液体培养基(酵母粉0.50g，蛋白胨0.50g，胰蛋白胨0.50g，葡萄糖0.50g，可溶性淀粉0.50g，磷酸氢二钾0.30g，丙酮酸钠0.30g，硫酸镁0.05g，水1000mL)，30℃/4℃，200rpm下摇瓶培养过夜，以R2A液体培养基为阳性对照，测定菌株OD600nm，定量OD600nm＝0.05重新接种于100mLR2A液体培养基中，分别测定菌株在(30℃：
4h、8h、12h、24h)/(4℃：0h、24h、48h、72h)的有效活菌数。取各时间点的菌液稀释到合适的稀释度后涂皿，每个稀释度作3个重复，于30℃温箱培养，计算平均菌落数。以时间/h为横坐标,有效菌落数为纵坐标作出曲线图。设置枯草芽孢杆菌菌株92068为阳性对照。
4h、8h、12h、24h)/(4℃：0h、24h、48h、72h)的有效活菌数。取各时间点的菌液稀释到合适的稀释度后涂皿，每个稀释度作3个重复，于30℃温箱培养，计算平均菌落数。以时间/h为横坐标,有效菌落数为纵坐标作出曲线图。设置枯草芽孢杆菌菌株92068为阳性对照。
[0130] 结果
[0131] KY240菌株在30℃下有效活菌数的测定
[0132] 实验结果如图8所示。从图8可以看出，在30℃下，KY240菌株在12h达0.38亿/mL，菌株92068是高温生长菌株，其在8h达峰值1.2亿/mL，是KY240菌株的3倍，12h后KY240菌株可继续生长。
[0133] KY240菌株在4℃下有效活菌数的测定
[0134] 实验结果如图9所示。从图9可以看出，KY240菌株在4℃下可以快速稳定的生长且在72h达到9.4亿/mL，相较之下，菌株92068在72h下没有生长。
[0135] KY240菌株在4℃条件下对小麦秸秆的腐熟能力测定
[0136] 以小麦秸秆为基质，每试管称取3g，加入少量、等量的液体R2A使其湿润，加入1mL菌液，震荡摇匀，放入4℃低温培养腐熟，按照其生长要求，适时、适量的浇灌等量的菌液，每周观察小麦秸秆腐熟情况。设置未接菌R2A液体培养基为空白对照CK1，接种枯草芽孢杆菌92068细菌的为阳性对照CK2。
[0137] KY240菌株在4℃条件下对小麦秸秆的腐熟能力测定的实验结果
[0138] 实验结果如图10所示。结果表明，KY240菌株低温下(4℃)对小麦秸秆的腐熟程度和速度明显高于对照枯草芽孢杆菌菌株92068。
[0139] 结论：KY240菌株可4℃低温降解纤维素，经过对该菌株的16sDNA的序列测定分析，该菌株与Pseudomonas graminis高度同源。KY240与商业菌株枯草芽孢菌株92068相比，KY240菌株在4℃低温下和10℃条件下具有较强的降解纤维素的能力，且降解纤维素能力基本相同，在30℃条件下降解纤维素能力虽有所减弱但下降幅度不大，同时KY240菌株还具有解钾和解无机磷能力，对小麦秸秆的腐熟具有促进作用且作用明显优于商业用菌株92068。由此可见，KY240是一株工作范围广，兼具多功能的功能性微生物菌株，其在低温下(4℃)及中高温(10℃-30℃)下均可降解纤维素，同时兼具解钾、解无机磷能力且对小麦秸秆的腐熟具有促进作用。有望用于制备成为降解纤维素的菌肥，促进秸秆腐熟，提高土壤肥力，特别是提高土壤中植物可利用钾、磷的量。
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