在真菌里氏木霉中恢复有性繁殖的方法
阅读：79发布：2020-05-12
专利汇可以提供在真菌里氏木霉中恢复有性繁殖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种使用辅助菌株ΔMAT在里氏木霉的两个雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，所述辅助菌株是其中已消除有性型基因座MAT的里氏木霉的雌性可育菌株。，下面是在真菌里氏木霉中恢复有性繁殖的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，包括以下步骤：
-a)在合适的培养基中孵育ΔMAT辅助菌株，所述菌株是其中已敲除MAT交配型基因座的里氏木霉雌性可育菌株，
-b)用第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子第一次浇灌所述ΔMAT辅助菌株，-c)用第二交配型的第二里氏木霉菌株的分分生孢子第二次浇灌来自步骤b)的所述ΔMAT辅助菌株。
2.权利要求1所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中所述第一交配型的第一里氏木霉菌株是MAT1-1或MAT1-2，尤其是MAT1-1。
3.权利要求1所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中所述第二交配型的第二里氏木霉菌株是MAT1-1或MAT1-2，尤其是MAT1-2。
4.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中所述里氏木霉菌株是QM6a菌株或衍生自QM6a菌株的菌株。
5.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中在合适的培养基中孵育所述ΔMAT辅助菌株的步骤a)持续至少2天，优选2-6天，尤其是至少4天，优选4-5天。
6.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中在合适的培养基中孵育所述ΔMAT辅助菌株的步骤a)是在黑暗中孵育。
7.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中所述第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和/或所述第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子以至少106个分生孢子/ml，特别是106-108个分生孢子/ml，优选
107-108个分生孢子/ml的浓度存在。
8.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，在第一次浇灌和第二次浇灌之间另外还包括在合适的培养基中孵育来自步骤b)的所述ΔMAT辅助菌株的步骤。
9.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中步骤b)和任选地在合适的培养基中孵育来自步骤b)的所述ΔMAT辅助菌株的步骤持续至少2天，优选2-7天，尤其是至少3天或4天。
10.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中步骤b)和任选地在合适的培养基中孵育来自步骤b)的所述ΔMAT辅助菌株的步骤在光照和黑暗交替下进行，优选3-12小时光照和12-21小时黑暗。
11.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，在第二次浇灌之后另外还包括在合适的培养基中孵育来自步骤c)的ΔMAT辅助菌株的步骤，尤其是直至子座出现。
12.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中步骤c)和任选地在合适的培养基中孵育来自步骤c)的所述ΔMAT辅助菌株的步骤持续至少5天，优选2-15天。
13.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，其中步骤c)和任选地在合适的培养基中孵育来自步骤c)的所述ΔMAT辅助菌株的步骤在光照和黑暗交替下进行，优选3-12小时光照和12-21小时黑暗。
14.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，在子座出现之后另外还包括扩增子座的步骤。
15.前述权利要求任一项所述的用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，另外还包括获得里氏木霉菌株的步骤。
16.通过前述权利要求任一项所述的方法获得的里氏木霉菌株用于制备纤维素酶或生物燃料的用途。
在真菌里氏木霉中恢复有性繁殖的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种在真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的两个雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法。
背景技术
[0002] 里氏木霉是木霉属的一种纤维素分解丝状真菌，第二次世界大战期间在南太平洋被发现。这种真菌能够分泌大量纤维素的酶(纤维素酶和半纤维素酶)，目前主要用于第二代生物燃料生产循环。实际上，由这种真菌产生的酶对于将植物生物质转化为工业上有用的生物产品如生物乙醇特别有用。
[0003] 第二代生物燃料(源自非食品资源)目前特别受关注，因为第一代生物燃料(源自食品资源)由于与食品生产竞争而只能以有限量生产。
[0005] 尽管可以而且必须优化第二代生物燃料生产的所有步骤(以增加产量)，但酶水解步骤还是要特别强调。该水解步骤涉及由丝状真菌里氏木霉产生的纤维素酶型酶。
[0006] 更一般地，里氏木霉可以用作生产工业上同源或异源蛋白质的平台菌株。为了优化里氏木霉的性能，必须改善产生目标蛋白的里氏木霉菌株。
[0007] 因此，在为降低水解成本而设想的改进方法中，里氏木霉的基因工程是一种解决方案。它可以改善产生纤维素酶的丝状真菌的分泌性能品质和酶的性质，并可以在工业条件下控制菌株的稳定性。
[0008] 诱变是基因疗法中常用的一种技术。它旨在有意地将突变引入DNA中，以产生基因修饰的基因。这使得可以产生的菌株具有从工业角度来看有利的特性。通常有两种诱变方法将突变引入里氏木霉：随机诱变和定点诱变。
[0009] 随机诱变在于在DNA中的任何位置诱导非靶向突变。这些突变通过将目标生物暴露于化学诱变剂或辐射引起。鉴于突变是自然现象，因此随机诱变被认为是这种自然过程的加速器，并且所产生的生物被认为是自然的而不是转基因生物(GMO)；因此，它们不具有可追溯性义务。但是，除了负责目标特征的突变外，这种方法还会导致大量不需要的突变(称为“附带”突变)，其通过累积导致不稳定性、健康状况不良，甚至导致突变生物的死亡。
[0010] 定点诱变能够将鉴定出的突变引入精确基因。为此，合成包含突变的目标DNA，然后将其引入待突变的细胞中，在其中DNA修复机制负责将其整合到基因组中。使用可选择标记能够相对于未整合突变的细胞鉴定已整合突变的细胞。然而，经历这种诱变的生物被认为是GMO(由于引入了外源DNA)，因此具有可追溯性义务。
[0011] 因此，在使用里氏木霉生产第二代生物燃料的情况下，通过将突变(随机或定点)引入里氏木霉来改进水解步骤并不令人满意，因为造成不良突变的积累，或者由于外源DNA的引入。因此，需要一种改进水解步骤的新方法。
[0012] 因此，本发明的发明人开发了一种利用里氏木霉的有性繁殖来改善里氏木霉的性能品质的新方法。目前，里氏木霉的有性繁殖从未被用作改善的工具，因为一直认为里氏木霉不能进行有性繁殖。尽管如此，在里氏木霉中性征的发现(Seidl等，2009)为菌株的遗传改良开辟了新的可能性。有性繁殖尤其有可能创造遗传多样性、保存有益的突变并从基因组中删除“附带”突变。
[0013] 里氏木霉是一种被称为异宗的真菌，即，只有在相配的交配型个体(MAT1-1和MAT1-2)之间才能进行有性繁殖。此外，里氏木霉是雌雄同体，即，一个菌株会同时产生雄性和雌性的性器官(图1)。
[0014] 两个可育的且相配的里氏木霉天然分离株之间的有性繁殖产生包含子代的子座(图2A)。
[0015] 为了测试工业菌株的有性繁殖，通过基因工程构建了菌株QM6a MAT1-1(Seidl等，2009)。相配的QM6a菌株之间的有性繁殖无法获得子座，因为这些菌株是不育的雌性菌株(图2B)(Seidl等，2009)。
[0016] 所有已知的现有的里氏木霉工业菌株均由天然菌株QM6a产生。鉴于天然菌株QM6a是MAT1-2交配型，目前所有的里氏木霉工业菌株都是MAT1-2交配型且都是雌性不育，但雄性可育。
[0017] 有性繁殖可能是一种快速且有效的改良手段，但如果不能在工业菌株之间发生，则其用途仍然有限。科学研究试图了解为什么里氏木霉工业菌株是雌性不育的，以及如何对此进行补救。这些研究使得能够鉴定决定雌性不育的idc1基因，并表明用功能基因取代缺陷基因可以重新建立QM6a菌株的雌性可育性并进行有性繁殖(Kubicek等，2014(WO2014/102241)；Linke等，2015)。
[0018] 然而，该策略具有一个主要的缺点。实际上，它需要将功能基因引入每个待繁殖的工业菌株中，以便能够在工业菌株中恢复雌性可育性。其次，该策略没有考虑到以下事实：工业菌株来源于连续诱变，并且可能已经改造了对雌性可育性重要的其他基因。因此，提供功能性的idc1基因不足以恢复雌性可育性，从而不能在两个里氏木霉的雌性不育菌株之间恢复有性繁殖。因此，能够在QM6a菌株中恢复雌性可育性并不意味着有可能在由所述QM6a菌株产生的工业菌株中恢复雌性可育性。
[0019] 因此，需要一种方法，其能够在两个里氏木霉雌性不育菌株(特别是QM6a菌株或衍生自QM6a菌株的雌性不育工业菌株或任何其他里氏木霉的雌性不育菌株)之间恢复有性繁殖。
[0020] 因此，本发明的发明人开发了一种用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的策略，该策略既不需要将功能性版本的idc1基因引入雌性不育菌株中，也不需要验证idc1基因功能性版本的存在是否足以恢复有性繁殖，甚至没有必要鉴定和替换可能有缺陷的其他基因。因此，本发明的发明人已经开发了一种简单有效的在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的策略。
[0021] 实际上，本发明基于发明人的结果，根据该结果，使用ΔMAT辅助菌株(即里氏木霉的雌性可育菌株，其中交配型基因座MAT1-1或MAT1-2已被敲除)与顺序浇灌第一交配型的里氏木霉雌性不育菌株的分生孢子，然后浇灌第二交配型的里氏木霉雌性不育菌株的分生孢子有可能在这两个雌性不育菌株之间恢复有性繁殖。
[0022] 辅助菌株已经被使用，但不是在里氏木霉种中(Silar，P.(2014))。更具体地，Jamet-Vierny等已经描述了使用辅助菌株的方法，该辅助菌株能够在柄孢霉(Popospora anserina)菌株繁殖的情况下提供子座发育所需的IDC1蛋白。这种基于三核体生产的方法可以恢复柄孢霉菌株的可育性。但是，应该注意的是，该方法不能用于里氏木霉菌株，因为仅使用三核体方法无法在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖(参见实施例2a)。
[0023] 然而，本发明的发明人令人惊讶地表明，当与连续浇灌技术(即，浇灌第一交配型的里氏木霉雌性不育菌株的分生孢子，然后浇灌第二交配型的里氏木霉雌性不育菌株的分生孢子)结合使用时，三核体方法可以在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖。这种顺序浇水与ΔMAT辅助菌株结合使用能够在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖，并能够重复获得子座(参见实施例2i)。
发明内容
[0024] 因此，在第一方面，本发明涉及一种用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，包括以下步骤：
[0025] -在合适的培养基中孵育ΔMAT辅助菌株，所述菌株是其中已敲除MAT交配型基因座的里氏木霉雌性可育菌株，
[0026] -用第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子第一次浇灌所述ΔMAT辅助菌株，[0027] -用第二交配型的第二里氏木霉菌株的分分生孢子第二次浇灌所述ΔMAT辅助菌株和第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子。
[0028] 根据本发明，“恢复有性繁殖”应理解为通过ΔMAT菌株，从第一交配型的第一里氏木霉雌性不育菌株和第二交配型的第二里氏木霉雌性不育菌株的分生孢子中获得子座。
[0029] 根据本发明，“里氏木霉雌性不育菌株”应理解为是指所有的雌性不育且雄性可育的里氏木霉菌株。这些是其中雌性可育性可以被恢复且可以在根据本发明的恢复有性繁殖的方法中使用的里氏木霉菌株。这种菌株例如是QM6a、NG14、RUTC30、QM9414、CL847、QM9136、QM9978、QM9979、PC3-7、TU-6等菌株。换言之，它涉及从QM6a菌株产生的所有雌性不育菌株，但是这些菌株也可以是源自其他地理分离株的雌性不育且雄性可育的里氏木霉菌株。
[0030] 根据本发明，“在合适的培养基中孵育”被理解为是指在适合于真菌生长的培养基中的孵育。这样的培养基例如是PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基、SDA(萨布罗葡萄糖琼脂)培养基、SPDA(甘薯葡萄糖琼脂)培养基、MEA(麦芽提取物琼脂)培养基、燕麦琼脂培养基、玉米面琼脂培养基，优选是完全培养基。根据本发明的完全培养基是这样的培养基，其除了最小培养基的组分外还包含生长所需的最终代谢产物，例如氨基酸、维生素、碱等，其与最小培养基(一种包含生物生长严格必需的化学元素的培养基)相反。
[0031] 根据本发明，“ΔMAT辅助菌株”应理解为其中MAT1-1或MAT1-2交配型基因座已被敲除的里氏木霉菌株。所述ΔMAT辅助菌株可以通过本领域技术人员熟知的任何基因位点敲除技术获得，或例如通过实施例1中描述的方法获得。获得ΔMAT辅助菌株的菌株必须是雌性可育的。尽管属于里氏木霉种，但是由于敲除了MAT1-1或MAT1-2交配型基因座，该辅助菌株不属于根据本发明的“里氏木霉雌性不育菌株”的定义。该辅助菌株不涉及核配过程，因为它已经敲除了调节所述过程的交配型基因座。辅助菌株的机制尚不清楚，但有关其工作方式的假设如下：
[0032] -在两个雌性不育菌株之间进行有性繁殖的情况：可能存在核融合，但是由于idc1基因/IDC1蛋白存在缺陷，因此没有募集菌丝用于子座(其中发生核配和子代发育)的构建和发育。
[0033] -在辅助菌株存在下，两个雌性不育菌株之间进行繁殖的情况(图3)：可能存在亲本的核融合。在这种情况下，辅助菌株表达idc1基因，从而合成IDC1蛋白。假定存在核融合和IDC1蛋白，则可能存在菌丝募集用于子座(其中能够发生核配和子代发育)的构建和发育。雌性组织由ΔMAT菌株提供，而合子组织由雌性不育菌株提供。
[0034] 根据本发明，术语“分生孢子”应理解为是指由于真菌(例如里氏木霉)的营养繁殖而产生的孢子。根据相同条件获得MAT1-1交配型或MAT1-2交配型的里氏木霉菌株的分生孢子。例如，第一交配型或第二交配型的根据本发明的分生孢子可以通过以下获得：在合适的培养基(例如PDA)中分别培养和孵育第一交配型的里氏木霉菌株或第二交配型的里氏木霉菌株，直到分生孢子出现。优选地，将菌株在约24-30℃的温度下在光照下孵育，直到分生孢子出现。然后可以通过用蒸馏水/无菌水冲洗培养皿来回收分生孢子。根据本发明，术语“第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子”应理解为是指在根据本发明的恢复有性繁殖的方法中使用的两个里氏木霉菌株之一的分生孢子。根据本发明，术语“第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子”应理解为是指与第一菌株相配的里氏木霉菌株的分生孢子。
[0035] 根据本发明，第一里氏木霉菌株的交配型是MAT1-1或MAT1-2，特别是MAT1-1。
[0036] 根据本发明，第二里氏木霉菌株的交配型是MAT1-1或MAT1-2，特别是MAT1-2。
[0037] 术语“MAT1-1”或“MAT1-2”是指真菌的交配型标志。它们是两种相配的交配型。鉴于里氏木霉是一种被称为雌雄异体的真菌，如果第一里氏木霉菌株的交配型是MAT1-1，那么第二里氏木霉菌株的交配型必然是MAT1-2。相反，如果第一里氏木霉菌株的交配型是MAT1-2，那么第二里氏木霉菌株的交配型必然是MAT1-1。在根据本发明的一个优选实施方案中，第一里氏木霉菌株的交配型是MAT1-1，而第二里氏木霉菌株的交配型是MAT1-2。
[0038] 只要交配型相配，在根据本发明的恢复有性繁殖的方法中使用的第一里氏木霉菌株和第二里氏木霉菌株可以是相同或不同的菌株。例如，当菌株相同时，第一菌株可以是QM6a MAT1-1菌株，第二菌株可以是QM6a MAT1-2菌株。相反，当菌株不同时，第一菌株可以是NG14 MAT1-1菌株，第二菌株可以是RUTC30 MAT1-2菌株。
[0039] 根据本发明，里氏木霉菌株是任何雌性不育菌株，例如QM6a菌株或衍生自QM6a菌株的菌株。因此，在本发明的一个实施方案中，第一里氏木霉菌株是QM6a MAT1-1或衍生菌株，和第二里氏木霉菌株是QM6a MAT1-2或衍生菌株。在本发明的另一个实施方案中，第一里氏木霉菌株是QM6a MAT1-2或衍生菌株，和第二里氏木霉菌株是QM6a MAT1-1或衍生菌株。在根据本发明的一个优选的实施方案中，里氏木霉菌株是QM6a MAT1-1或衍生菌株，和第二里氏木霉菌株是QM6a MAT1-2或衍生菌株。优选地，QM6a MAT1-2菌株是指在参考号13613下保藏的菌株。可以通过以下方法获得雌性不育的MAT1-1菌株(例如QM6a MAT1-1)：(i)用MAT1-1基因座替换MAT1-2基因座(例如根据文章Linke，R等(2015)中描述的方法)；(ii)通过杂交(例如，将QM6a MAT1-2菌株与MAT1-1交配型的天然分离株杂交)。在获得的后代中，MAT1-1交配型的雌性可育个体可以与例如QM6a MAT1-2菌株回交。该过程至少重复7次。将后代与QM6a MAT1-2亲本连续系统回交七次，就可以得到遗传同一性与QM6a MAT1-2菌株相同但交配型为MAT1-1的最终后代。这是回交。最终后代为MAT1-1交配型且雌性不育。国际申请WO 2014/102241中提供了回交的实例。但是，在这些回交的每一步中，都可以得到MAT1-1或MAT1-2不育菌株，并将其用于该方法中。根据本发明，术语“源自QM6a菌株的菌株”应理解为从QM6a天然分离株获得的所有菌株。这尤其涉及当前已知的所有里氏木霉工业菌株或所有雌性不育的里氏木霉菌株。
[0040] 根据本发明，术语“浇灌”旨在是指倒入包含第一交配型的分生孢子的溶液(例如107-108个MAT1-1分生孢子)或倒入包含第二交配型的分生孢子的溶液(例如107-108个MAT1-2分生孢子)。根据本发明的一个优选的实施方案，浇灌仅用第一和/或第二交配型的分生孢子进行(例如不添加细胞提取物)。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，使用仅包含第一和/或第二交配型的分生孢子的合适的溶液进行浇灌。合适的溶液应理解为是指例如水，例如蒸馏水或无菌水。
[0041] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株在合适的培养基中的孵育是在黑暗中的孵育。黑暗限制了分生孢子的产生，并促进雄性性器官接近雌性性器官。
[0042] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株在合适的培养基中的孵育持续至少2天，优选2至6天。
[0043] 更具体地，根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株在合适的培养基中的孵育持续至少4天，优选4至5天。孵育4到5天可以优化恢复方法(实施例2i)。
[0044] 根据本发明的一个实施方案，第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和/或第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子以至少105个分生孢子/ml的浓度存在。
[0045] 更特别地，根据本发明的一个优选的实施方案，第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和/或第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子以至少106个分生孢子/ml，特别是106-108个分生孢子/ml，优选107-108个分生孢子/ml的浓度存在。107-108个分生孢子/ml的浓度可以优化修复方法(参见实施例2i)。
[0046] 顺序浇灌的最佳条件是将ΔMAT辅助菌株孵育(或预孵育)4天或5天，以及分生孢子的浓度为107-108个分生孢子/ml(参见实施例2i)。
[0047] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株在合适的培养基中的孵育是在环境温度下，特别是在24℃下进行的。
[0048] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法在第一次和第二次浇灌之间还包括在合适的培养基中孵育所述ΔMAT辅助菌株和第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子的步骤。
[0049] 根据一个实施方案，所述第一次浇灌以及任选地在合适的培养基中孵育所述ΔMAT辅助菌株和第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子的步骤持续至少2天，优选2-7天，尤其是至少3天或4天。优选地，根据该实施方案，所述第一次浇灌以及任选地在合适的培养基中孵育所述ΔMAT辅助菌株和第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子的步骤是在光照和黑暗交替下进行，优选3-12小时光照(白天)，12-21小时黑暗(夜晚)。
[0050] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株和第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子在合适的培养基中的所述孵育是在白天/夜晚交替下孵育。优选地，白天/夜晚交替是12小时光照和12小时黑暗的交替。这是有性繁殖的最有利条件(Seidl，V.等(2009))。
[0051] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株和第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子在合适的培养基中的所述孵育持续5-7天，优选7天。
[0052] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株和第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子在合适的培养基中的所述孵育在环境温度下，特别是在24℃下进行。
[0053] 根据本发明的一个优选实施方案，所述用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法还包括获得子座的步骤。根据本发明，术语“子座”应理解为是指由有性繁殖产生的宏观结构(直径为3-4mm至2cm)。这些结构由母本来源的组织(形成它们的组织来自充当雌性的辅助菌株)组成，并且表面着色(棕色)。
[0054] 根据本发明的一个优选实施方案，所述用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法还包括以下步骤：在第二次浇灌之后，在合适的培养基中孵育ΔMAT辅助菌株、第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子，特别是直到子座出现，并且更特别地直到肉眼可见着色的子座为止。
[0055] 根据一个实施方案，所述第二次浇灌以及任选地在合适的培养基中孵育ΔMAT辅助菌株、第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子的步骤持续至少5天，优选5-15天。优选地，根据该实施方案，所述第二次浇灌以及任选地在合适的培养基中孵育ΔMAT辅助菌株、第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子的步骤在白天和夜晚交替下进行，优选在3-12小时光照(白天)和12-21小时黑暗(夜晚)下进行。
[0056] 根据本发明的一个优选实施方案，所述ΔMAT辅助菌株、第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子在合适的培养基中的所述孵育是在白天/夜晚交替下孵育。优选地，白天/夜晚交替是12小时光照和12小时黑暗的交替。
[0057] 根据本发明的一个优选的实施方案，所述ΔMAT辅助菌株、第一交配型的第一里氏木霉菌株的分生孢子和第二交配型的第二里氏木霉菌株的分生孢子在合适的培养基中的所述孵育在环境温度下，特别是在24℃下进行。
[0058] 根据本发明的一个实施方式，所述方法另外包括在子座出现之后，扩增所述子座的步骤。所述扩增步骤通过以下来进行：至少一次将获得的子座转移到新的合适培养基(例如PDA)中。新的合适培养基可以与先前使用的培养基相同，也可以不同。将子座转移到新的合适培养基中(例如转移到包含合适的培养基的新皮氏培养皿中)可以非常显著且出乎意料地使获得的子座的最终数目成倍增加(实施例4)。根据本发明的这个方面，可以进行几次连续的继代培养，这意味着可以多次将几次转移的先前获得的子座转移到新的合适的培养基中(例如可以进行1、2、3、4、5或6次子座转移)。根据一个实施方案，所述扩增步骤持续至少3天，例如3-21天，优选5-15天，并且优选在光照/黑暗交替下进行，特别是在3-12小时光照(白天)和12-21个小时黑暗(夜晚)，尤其是12小时光照和12小时黑暗下进行。扩增步骤(即将子座转移到新的合适培养基中)使得可以：(1)与没有扩增步骤的方法相比，将子座数量定量增加至少20％甚至至少50％，而且(2)增加子座的成熟度。
[0059] 根据本发明的一个特别优选的实施方案，所述方法是一种用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，包括以下步骤：
[0060] -在合适的培养基中，特别是在黑暗中孵育ΔMAT辅助菌株，所述菌株是其中MAT交配型基因座已经被敲除的里氏木霉雌性可育菌株，
[0061] -用MAT1-1第一雌性不育菌株的分生孢子第一次浇灌所述ΔMAT辅助菌株，[0062] -孵育(特别是在白天/夜晚交替下)所述ΔMAT辅助菌株和MAT1-1第一雌性不育菌株的分生孢子的步骤，
[0063] -用MAT1-2第二雌性不育菌株的分生孢子第二次浇灌所述ΔMAT辅助菌株和MAT1-1第一雌性不育菌株的分生孢子，
[0064] -孵育(特别是在白天/夜晚交替下)所述ΔMAT辅助菌株和MAT1-1第一雌性不育菌株的分生孢子和MAT1-2第二雌性不育菌株的分生孢子的步骤，特别是直到子座出现，[0065] -任选地，扩增子座的步骤。
[0066] 根据本发明的一个特别优选的实施方案，所述方法是一种用于在两个里氏木霉雌性不育菌株之间恢复有性繁殖的方法，包括以下步骤：
[0067] -在合适的培养基中，特别是在黑暗中孵育ΔMAT辅助菌株，所述菌株是其中MAT交配型基因座已经被敲除的里氏木霉雌性可育菌株，
[0068] -用MAT1-1第一QM6a菌株或MAT1-1雌性不育菌株的分生孢子第一次浇灌所述ΔMAT辅助菌株，
[0069] -孵育(特别是在白天/夜晚交替下)所述ΔMAT辅助菌株和MAT1-1 QM6a菌株或MAT1-1雌性不育菌株的分生孢子的步骤，
[0070] -用MAT1-2第二QM6a菌株或衍生自MAT1-2 QM6a菌株的菌株或MAT1-2雌性不育菌株的分生孢子第二次浇灌所述ΔMAT辅助菌株和MAT1-1 QM6a菌株或MAT1-1雌性不育菌株的分生孢子，
[0071] -孵育(特别是在白天/夜晚交替下)所述ΔMAT辅助菌株和MAT1-1 QM6a菌株或MAT1-1雌性不育菌株的分生孢子和MAT1-2QM6a菌株或衍生自MAT1-2 QM6a菌株的菌株或MAT1-2雌性不育菌株的分生孢子的步骤，特别是直到子座出现，
[0072] -任选地，扩增子座的步骤。
[0073] 根据本发明的一个优选实施方案，所述恢复方法还包括获得里氏木霉菌株。从里氏木霉的雌性不育菌株获得这种新的里氏木霉菌株意味着根据本发明的方法，确实已经恢复了两个里氏木霉雌性不育菌株之间的有性繁殖。
[0074] 因此，在第二个方面，本发明涉及通过上述方法获得的里氏木霉菌株在生产纤维素酶或生物燃料中的用途。
附图说明
[0076] 图1表示丝状真菌里氏木霉的有性繁殖的原理。
[0077] 图2表示里氏木霉的有性繁殖。(A)部分代表两个天然分离株之间的有性繁殖(A)，(B)代表两个QM6a菌株之间的有性繁殖。
[0078] 图3表示辅助菌株方法的原理。
[0079] 图4表示用于实施根据本发明的辅助菌株的方法的方案。
[0080] 图5表示实施根据本发明的辅助菌株的方法后获得的子座。
[0081] 图6表示pUC19质粒(用于获得根据本发明的ΔMAT辅助菌株的质粒)中敲除盒的最终组装。线对应于不按比例放置的引物。数字对应于引物：1＝5’mat1-2-F；2＝5’mat1-2-R；3＝mat1-2/Hph-F；4＝mat1-2/Hph-R；5＝3’mat1-2-F；6＝3’mat1-2-R；7＝K7 Del Mat1-2-F和8＝K7-Del-Mat1-2-R。
[0082] 图7表示选择用于扩增敲除盒的各个片段的引物的位置。数字“(1)”代表“5’侧翼+标记”片段，数字“(2)”代表“标记+3’侧翼”片段。
[0083] 图8表示子座的扩增。实施根据本发明的辅助菌株的方法后获得的子座(例如图5中获得的子座)存在于皮氏培养皿A1和B1中。将子座转移到PDA培养基上(这对应于培养皿A2和B2)，从而子座数量可以成倍增加。可以通过将获得的子座转移到新的PDA培养基上(对应于皮氏培养皿A3和B3)，将该扩增/倍增步骤重复几次。
具体实施方式
[0084] 实施例1：材料和方法
[0085] 本发明使用三个不同的菌株。实施例中使用的三个菌株如下：
[0086] -待杂交的两个不育菌株：QM6a MAT1-1菌株和QM6a MAT1-2菌株。为了获得QM6a MAT1-1菌株，将QM6a MAT1-2菌株中的MAT1-2基因座替换为MAT1-1基因座。QM6a MAT1-2菌株获自ATCC(参考 13631)。它是所有工业菌株起源的天然分离株。
[0087] -ΔMAT辅助菌株，其是已敲除MAT交配型基因座的菌株。可以根据以下所示的方案构建此菌株：
[0088] 构建ΔMAT辅助菌株
[0089] 该菌株必须在遗传操作之前由可以与待杂交的两个不育菌株杂交的雌性可育菌株构建。
[0090] 为了构建MAT1-2基因座敲除盒，根据制造商的建议，使用Gibson组装试剂盒(New England Biolabs)，将潮霉素B抗性基因以及MAT1-2基因座的5'和3'序列组装到质粒pUC19中(图6)。潮霉素B抗性基因在本发明中用作选择标记，但绝对可以使用其他选择标记。
[0091] 预先用XbaI和EcoRI酶消化pUC19受体质粒。MAT1-2基因座上游和下游大约1000bp的序列使用5'mat1-2-F和5'mat1-2-R引物(用于上游区域)以及3'mat1-2-F和3'mat1-2-R引物(用于下游区域)扩增(表1)。这些引物含有同源性区域，其允许在一侧与pUC19重组，在另一侧与潮霉素抗性基因重组。通过mat1-2/Hph-F和mat1-2/Hph-R引物从pUT1140质粒扩增潮霉素B抗性基因。这些引物包含同源区域，其允许在一侧与MAT1-2基因座重组，在另一侧与pUC19重组。
[0092] 其次，通过K7-Del-Mat1-2-F和K7-Del-Mat1-2-R引物从细菌DNA扩增敲除盒。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化获得的PCR产物，并使用CaCl2和聚乙二醇(PEG)将其用于转化B31野生型可育菌株的原生质体。可以使用除B31菌株以外的其他菌株，只要它是雌性可育的。用于转化B31菌株的质粒的序列如SEQ ID No：17所示。
[0093] B31菌株(MAT1-2交配型)是里氏木霉菌株CBS999.97 (来自南美土壤的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的繁殖力强的蔗糖和硝酸盐同化菌株(里氏木霉))的后代。它等同于Seidl等(2009)文章的MAT1-2菌株CBS999.97。
[0094] 使转化体稳定并在含有0.8M蔗糖和100μg/ml潮霉素B的PDA培养基上再生。然后将菌落继代培养，并通过在PDA-潮霉素选择培养基上分离分生孢子来纯化。然后对它们进行表型筛选，这在于将B31转化体与MAT1-1交配型且与B31菌株相配的A2天然分离株杂交：如果MAT基因座确实被敲除，则将有没有有性繁殖，因此没有子座。
[0095] 然后通过PCR扩增可以验证天然基因确实已被敲除盒替代。此验证分两个步骤进行。首先在于用扩增基因的引物(Mat1-2-F内部和Mat1-2-R内部)进行PCR来验证基因的敲除(图7)。如果所述基因确实被敲除，则不应获得扩增。但是，为了验证该结果确实是由于基因缺失而不是PCR操作不佳的结果，还使用一对对照引物(EF1和EF2)，从而可以扩增所有里氏木霉菌株基因组中存在的tef1基因(编码α1翻译延伸因子)的880bp内部片段。在第二步中，扩增“5′侧翼+标记”和“标志+3′侧翼”片段，以验证基因座上敲除盒的存在。所选引物的位置如图7所示。为了验证基因盒在该位点的插入，必须在5'侧翼片段的下游和3'侧翼片段的上游选择引物(引物Dmat1-2verif5F与verifHygro5'相关，Dmat1-2verif3R与verifHygro3'相关)。
[0096] 本发明所用的引物序列如下表1所示。
[0097]
[0098] 表1：用于敲除并替换MAT基因座的引物的总结
[0099]
[0100]
[0101] 表2：用于转化B31菌株的质粒序列。
[0102] 在这些表型和分子验证之后，获得B31::ΔMAT-hph辅助菌株。它是根据本发明的ΔMAT辅助菌株(其中已敲除MAT交配型基因座的里氏木霉菌株)。
[0103] 实施例2：与旨在恢复两个QM6a里氏木霉工业菌株之间的有性繁殖的各种方法的比较实施例
[0104] 所有测试均在含有PDA培养基的皮氏培养皿中进行。这是里氏木霉有性繁殖的最佳培养基。
[0105] a/方法1：制备三核体
[0106] 此方法与P.anserina(Jamet-Vierny,C.,Debuchy,R.,Prigent,M.&Silar,P.(2007).IDC1,a pezizomycotina-specific gene that belongs to the PaMpk1 MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina.Fungal genetics and biology FG&B 44,1219-1230)中所述的方法相同。
[0107] 为了获得三核体，分别将菌株在最多30℃下孵育两天，以防止分生孢子形成并仅获得菌丝体。生长两天后，切出0.5厘米x 0.5厘米的每个均含有菌株的琼脂植入物(用于三核体的三个)，并将其放入装有500μl无菌水的2ml Eppendorf管中。用 (MP Biomedicals)将菌丝体以4m/s的速度混合20秒，然后将10μl研磨材料沉积在皮氏培养皿上。在培养箱中，于24℃在光照12小时和黑暗12小时交替下孵育培养皿。
[0108] 实验首先是三次重复。没有获得子座。将培养皿放在培养箱中直至培养基干燥，即大约一个月。
[0109] 由于获得三核体是罕见的事件，因此重复实验并接种10个不同的皮氏培养皿。没有获得子座。
[0110] b/方法2：制备三核体
[0111] 该方法与方法1相同，但区别在于孵育不同。在该情况下，没有将皮氏培养皿放在24℃或有12小时光照和12小时黑暗的培养箱中，而是放在温度不恒定(每天变化)且没有亮度控制(自然亮度)的实验室工作台上。将三个菌株的混合物接种到十个不同的皮氏培养皿中。没有获得子座。
[0112] c/方法3：三个菌株的对抗
[0113] 以距皮氏培养皿中心最大的距离将三个菌株以彼此相等的距离接种到皮氏培养皿上。在24℃白天/夜晚交替(光照12小时和黑暗12小时)下孵育培养皿。没有获子座。
[0114] d/方法4：在皮氏培养皿中心的三个菌株的混合物
[0115] 将三个菌株分别接种到置于皮氏培养皿上的玻璃纸片上。在黑暗中生长2-3天后，去除菌丝体，在 中用球研磨，以1∶1∶1的比例混合，然后以各种浓度(1、1/10、1/100、1/1000)沉积到皮氏培养皿中心。没有获得子座。
[0116] e/方法5：分别接种三个菌株
[0117] 将三个菌株分别接种到置于皮氏培养皿上的玻璃纸片上。在黑暗中生长2-3天后，去除菌丝体，在FastPrep中用球研磨，然后以1∶1∶1的比例混合。将此混合物接种到补充有1％KH2PO3的PD(马铃薯葡萄糖肉汤)液体培养基中，孵育(振摇或不振摇)1-2天，然后以各种浓度(1、1/10)沉积到添加或不添加5mM抗坏血酸的皮氏培养皿中心。没有获得子座。
[0118] f/方法6：接种三个菌株
[0119] 将三个菌株从分生孢子一起接种到补充有1％KH2PO3的PD(马铃薯葡萄糖肉汤)液体培养基中，孵育(振摇或不振摇)1-2天，然后以各种浓度(1、1/10)沉积到添加或不添加5mM抗坏血酸的PDA皿中心。没有获得子座。
[0120] g/方法7：分别接种三个菌株
[0121] 将三个菌株分别接种到置于皮氏培养皿上的玻璃纸片上。在黑暗中生长2-3天后，去除菌丝体，在FastPrep中用球研磨，然后以1∶1∶1(QM6a 1-1：QM6a 1-2：ΔMAT)或1∶1∶2或1∶1∶5的比例混合。将该混合物(i)铺板在整个培养皿上，或(ii)以各种稀释度(1、1/10和1/
100)接种到PDA培养基的培养皿中心，所述培养基添加或不添加5mM抗坏血酸。然后将培养皿在24℃和以下条件下孵育：(i)白天/夜晚交替，(ii)或在黑暗中孵育一天，然后白天/夜晚交替，(iii)或在黑暗中孵育3天，然后白天/夜晚交替，(iv)或在黑暗中孵育15天，然后白天/夜晚交替。没有获得子座。
100)接种到PDA培养基的培养皿中心，所述培养基添加或不添加5mM抗坏血酸。然后将培养皿在24℃和以下条件下孵育：(i)白天/夜晚交替，(ii)或在黑暗中孵育一天，然后白天/夜晚交替，(iii)或在黑暗中孵育3天，然后白天/夜晚交替，(iv)或在黑暗中孵育15天，然后白天/夜晚交替。没有获得子座。
[0122] h/方法8：顺序浇灌并加入细胞提取物
[0123] 将里氏木霉菌株的野生型可育分离株对置放置在PDA上的玻璃纸片上。接种后，从T＝0至T＝96h回收这些杂交的生物材料，并进行蛋白质提取。通过过滤将蛋白质提取物灭菌。最后，应用浇灌方法并将获得的各种细胞提取物添加到分生孢子中。第一次用MAT1-1分生孢子浇灌，然后第二次用MAT1-2分生孢子浇灌(反之亦然)。没有获得子座。
[0124] i/方法9：根据本发明的顺序浇灌
[0125] 获取分生孢子：
[0126] 浇灌前4-6天，将用于浇灌辅助菌株的每个分生孢子供体菌株(MAT1-1然后MAT1-2)接种到皮氏培养皿中，并在光照下于30℃孵育，以制备分生孢子。
[0127] 在浇灌的当天，将4ml无菌水置于供体菌株(MAT1-1或MAT1-2)上，收获分生孢子。对分生孢子计数，并将其浓度调节至106至108个分生孢子/ml。
[0128] 浇灌：
[0129] 在浇灌技术中，ΔMAT辅助菌株具有将提供生产子座所需的母本组织的雌性菌株的功能。辅助菌株将依次被MAT1-1和MAT1-2分生孢子浇灌。
[0130] 将ΔMAT辅助菌株用1ml第一交配型分生孢子均匀浇灌，然后孵育7天，再用1ml第二交配型分生孢子浇灌，孵育直至获得子座。
[0131] 在PDA培养基上培养ΔMAT辅助菌株，并在黑暗中于24℃孵育4天。孵育4天后，用1ml MAT1-1交配型分生孢子浇灌辅助菌株，并在24℃和12h光照和12h黑暗交替下孵育7天。
[0132] 最后，用1ml MAT1-2分生孢子浇灌辅助菌株，并在24℃和12h光照和12h黑暗交替下孵育，直至出现子座。该方法使得获得子座成为可能。
[0133] 进行了六个不同的实验(实验1至实验6)。后者的区别在于预孵育时间(4、5或6天)和浇灌的分生孢子数。结果列于下表3。
[0134]
[0135] 表3：用6个培养皿获得的子座总数
[0136] *：获得与子座类似但尺寸非常小(大约2mm)的着色结构。它们太多以至于互相粘连而难以计数。
[0137] 顺序浇灌技术能够重复获得子座。获得子座的最佳条件如下：
[0138] -辅助菌株的预孵育：4或5天；
[0139] -分生孢子浓度：107-108个分生孢子/ml。
[0140] 实施例3：用于根据本发明的顺序浇灌的各种条件
[0141] 在此实施例中，如表4所示，用以下浇灌辅助菌株：
[0142] -MAT1-1交配型菌株，然后是MAT1-2交配型的相同菌株，或
[0143] -MAT1-2交配型菌株，然后是MAT1-1交配型的相同菌株，或
[0144] -每次用水浇灌(阴性对照)。
[0145] 浇灌1 浇灌2
ΔMAT辅助菌株 MAT1-1 MAT1-2
ΔMAT辅助菌株 MAT1-2 MAT1-1
ΔMAT辅助菌株 H2O H2O
ΔMAT辅助菌株 MAT1-1 MAT1-2
ΔMAT辅助菌株 MAT1-2 MAT1-1
ΔMAT辅助菌株 H2O H2O
[0146] 表4：各种测试条件的总结
[0147] 在浇灌1和浇灌2之间，在24℃和12h光照和12h黑暗交替下孵育7天。结果如下表5所示。
[0148]浇灌1 浇灌2 在2个培养皿上获得的子座数
MAT1-1 MAT1-2 40
MAT1-2 MAT1-1 12
H2O H2O 0
MAT1-1 MAT1-2 40
MAT1-2 MAT1-1 12
H2O H2O 0
[0149] 表5：在2个培养皿上获得的子座总数
[0150] 因此，与用MAT1-2交配型菌株进行第一次浇灌相比，用MAT1-1交配型菌株进行第一次浇灌有利于获得大量子座。
[0151] 实施例4：扩增子座
[0152] 在12h光照和12h黑暗交替下进行扩增7-21天：第一组照片(A1或B1)和第二组照片(A2或B2)之间经过的时间是15天。将根据本发明获得的A1/B1皮氏培养皿的子座(例如在实施例2中获得的那些)转移到新的合适培养基(在这种情况下为PDA)中。转移结束时获得的子座存在于A2/B2皮氏培养皿中。然后第二次转移到新的合适培养基中：将A2/B2皮氏培养皿的子座转移到新的合适培养基中。转移结束时获得的子座存在于A3/B3皮氏培养皿中。
[0153] 这些转移的结果如图8所示。
[0154] 对获得的子座数的分析可以得出以下结论：
[0155] 1)与没有扩增步骤的方法相比，扩增步骤可以(即将子座转移到新的合适培养基中)将子座数定量地增加至少20％，甚至至少50％，
[0156] 2)扩增步骤还可以增加子座的成熟度。
[0157] 参考文献
[0158] Jamet-Vierny，C.，Debuchy，R.，Prigent，M.，and Silar，P.(2007).IDC1，a pezizomycotina-specific gene that belongs to the PaMpk1 MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina.Fungal genetics and biology：FG&B 44，1219-1230.
[0159] Kubicek，C.，Linke，R.，Seiboth，B.，Haarmann，T.and Lorenz，P.(2014).Genes/Genetic Elements Associated With Mating Impariment In Trichoderma reesei QM6a And Its Derivatives And Process For Their Identification(WO2014/102241).[0160] Linke，R.，Thallinger，G.G.，Haarmann，T.，Eidner，J.，Schreiter，M.，Lorenz，P.，Seiboth，B.，and Kubicek，C.P.(2015).Restoration of female fertility in Trichoderma reesei QM6a provides the basis for inbreeding in this industrial cellulase producing fungus.Biotechnology for biofuels8，155.
[0161] Seidl，V.，Seibel，C.，Kubicek，C.P.，and Schmoll，M.(2009).Sexual development in the industrial workhorse Trichoderma reesei.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106，13909-13914.[0162] Silar，P.(2014).Simple Genetic Tools to study fruiting body development in Fungi.The Open Mycology Journal，8，148-155)；Jamet-Viemy，C.，Debuchy，R.，Prigent，M.&Silar，P.(2007).IDC1，a Pezizomycotina-specific gene that belongs to the PaMpkl MAP kinase transduction cascade of the filamentous fungus Podospora anserina.Fungal genetics and biology：FG & B 44，1219-1230
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