技术领域
[0001] 本
发明涉及磷矿废弃地生态修复及重金属污染治理技术领域，具体涉及一种利用土著微生物-植物联合去除磷矿废弃地中铅污染的方法。
背景技术
[0002] 我国是一个磷矿资源丰富的国家，磷资源储量仅次于摩洛哥居世界第二位，但是我国磷矿资源表现出富矿易选矿少、贫矿难选矿多，导致在磷矿开采过程中大多“采富弃贫”形成了大量磷矿废弃地。磷矿废弃地
土壤中含有一定量重金属元素，如铅、镉、铬、汞、砷等。这些重金属元素在长期的雨
水淋溶过程中会发生迁移，引起大气、水和土壤的严重污染，进一步造成土地退化、植被毁坏和人畜健康危害，因此必须进行有效的治理。
[0003] 目前去除土壤中重金属污染的方法主要有物理修复法、
化学修复法及
生物修复法。其中传统的物理法包括排土法、客土法、离子交换法、
吸附法等，这些方法存在易造成二次污染、破坏土壤肥
力和结构等缺点。化学法主要有电化学还原法、投入石灰性物质法、
氧化还原法等，这些方法虽然简单易行但仍存在诸多弊端，如操作繁琐、运行成本高、易产生二次污染等，不适用于长期可持续发展。所以开发一种专
门针对磷矿废弃地土壤重金属污染特点，能够高效去除其中所含重金属元素的治理方法显得十分紧迫和必要。
[0004] 生物修复技术是利用生物技术治理重金属污染土壤的一种新方法，主要是利用微生物或者植物的生命代谢活动，对土壤中的重金属进行富集或提取。生物修复技术包括
微生物修复技术和
植物修复技术，目前已经成为国内外研究的一个新热点。微生物修复技术是利用土壤中的某些特定微生物，通过其对重金属的吸附、沉淀和氧化还原等作用从而达到降低土壤中重金属含量的目的。该技术可以实现将重金属从土壤中去除的目的，但是与此同时微生物修复技术也存在一些局限性，如修复持续时间长、见效慢、形成的重金属络合物并不能完全从土壤中除去。植物修复技术是指利用植物及其根系，通过对
土壤污染物的吸收、挥发、转化、降解和固定作用而去除土壤中重金属污染的修复技术，该技术具有环境友好且成本低等优点，但是用于重金属污染
土壤修复的一些富集植物通常生长缓慢、耐受力差，导致该技术在实际中难以应用。
[0005] 目前国内外对磷矿废弃地的生态修复研究还处于探索阶段，主要的研究工作集中在土地复垦和植被恢复方面，尚未发现有关磷矿废弃地重金属污染，尤其是铅污染的土著微生物-植物联合去除的研究报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于针对
现有技术存在的不足，提供一种利用土著微生物-植物联合去除磷矿废弃地中铅污染的方法。该方法创造性的从磷矿废弃地土壤中筛选出土著耐铅溶磷微生物和土著铅富集植物，并利用两者联合对磷矿废弃地铅污染进行生态修复，取得了良好的效果实现了磷矿废弃地铅污染的高效和安全修复。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 利用土著微生物-植物联合去除磷矿废弃地中铅污染的方法，具体包括以下步骤：(a)从铅污染的磷矿废弃地采集土壤样品，经富集、纯化和筛选，得到土著高效溶磷微生物；
(b)对土著高效溶磷微生物进行耐铅筛选及驯化培养，得到土著高效耐铅溶磷微生物；(c)从铅污染的磷矿废弃地收集土著植物
种子，将其置于含铅土壤中育苗，筛选得到土著铅富集植物；(d)将土著铅富集植物栽种到铅污染的磷矿废弃地土壤中，接着将土著高效耐铅溶磷
微生物接种到土著铅富集植物的
根际土壤，联合培养一段时间即可。
[0008] 进一步的，步骤(a)具体步骤如下：将采集的土壤样品与无菌水按照100-200g:1L的比例混合均匀，过滤得到上清液；将上清液和溶磷微生物富集培养基按照1:3-5的比例混合，于28-35℃、120-170r/min转速下恒温摇床培养2-5天，富集得到土著溶磷微生物菌液；将富集得到的土著溶磷微生物菌液接种到溶磷微生物固体培养基中，于28-35℃倒置培养
2-5天，得到混合土著溶磷微生物菌落；选择单一的菌落利用划线培养的方式于28-35℃纯化培养2-5天，得到纯化土著溶磷微生物菌株；将纯化土著溶磷微生物菌株接种至溶磷微生物筛选培养基中，在28-35℃、120-170r/min下振荡培养5-7天，比较培养液的可溶磷含量高低最终确定土著高效溶磷微生物。
[0009] 进一步的，所述溶磷微生物富集培养基按照重量份数计的配方为：
葡萄糖8-10份，(NH4)2SO4 0.3-0.6份，MgSO4·7H2O 0.05-0.2份，KCl 0.1-0.3份，
酵母浸粉0.4-0.6份，FeSO4·7H2O 0.02-0.04份，Ca3(PO4)2 0.8-1.2份，蒸馏水1000份，pH为6-7。所述溶磷微生物固体培养基除了具备溶磷微生物富集培养基所有成分外，还加入了10-20份琼脂粉。所述溶磷微生物筛选培养基和溶磷微生物富集培养基成分基本相同，不同之处在于：将Ca3(PO4)2替换为等量的低品位磷矿粉。所述低品位磷矿粉中五氧化二磷的
质量百分数含量为5％-20％，其粒径为50-200目。
[0010] 进一步的，步骤(b)具体步骤如下：向溶磷微生物筛选培养基中加入一定量可溶性铅盐，使得其铅含量为10-200mg/L；将步骤(a)筛选出的土著高效溶磷微生物接种到含铅的溶磷微生物筛选培养基中，于28-35℃、120-170r/min条件下恒温振荡培养2-5天，过滤所得滤液即为土著高效耐铅溶磷微生物菌液；将所得土著高效耐铅溶磷微生物菌液按照同样的方法反复驯化培养3-5次，期间逐级增加培养基中铅含量至200mg/L，得到土著高效耐铅溶磷微生物。
[0011] 进一步的，步骤(c)具体步骤如下：调查铅污染的磷矿废弃地植物品种并取样，将采集到的植物种子
播种到含蛭石(5％-10％重量比)的无铅土壤中，20-35℃育苗10-30天，选取发芽率高、生长状态好的植物
幼苗移栽至试验花钵中，定时施浇铅含量为10-50mg/L的溶液，自然光照下生长30-60天后
采样；分析检测植物体内的铅含量，确定生长状态良好且植物体内铅含量高的植物品种为土著铅富集植物。
发明人通过实验从藜、黑麦草、苦苣、野菊、
艾草、狗尾草等土著植物中，筛选确定出黑麦草、苦苣两种土著铅富集植物。
[0012] 进一步的，步骤(d)具体步骤如下：将至少一种土著铅富集植物栽种到铅污染的磷矿废弃地，5-15天后采用灌根的方式反复多次将土著高效耐铅溶磷微生物接种到土著铅富集植物的根际土壤中，继续培养120-150天即可。其中土著铅富集植物的栽培
温度为20-35℃，栽种后定期浇水保持土壤中
含水量在60％-80％，铅污染的磷矿废弃地土壤中铅含量不超过50mg/kg，灌根接种时菌液的浓度为(1-5)×108个/mL，接种次数为1-3次。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0014] (1)所使用的土著高效耐铅溶磷微生物和土著铅富集植物均来自于磷矿废弃地，能很好的适应磷矿废弃地的生态环境，通过两者联合作用可有效去除磷矿废弃地的铅污染和过量磷；
[0015] (2)实验确定了假单胞菌和黑麦草、苦苣联合去除磷矿废弃地铅污染的方法，针对性强、成本低，且不产生二次污染；
[0016] (3)本发明对磷矿废弃地中铅污染的修复效率可达到80％以上，具有非常好的应用前景和推广价值。
具体实施方式
[0017] 为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体
实施例进行进一步说明。
[0018] 本发明使用的溶磷微生物富集培养基按照重量份数计的配方为：葡萄糖8-10份，(NH4)2SO4 0.3-0.6份，MgSO4·7H2O 0.05-0.2份，KCl 0.1-0.3份，酵母浸粉0.4-0.6份，FeSO4·7H2O 0.02-0.04份，Ca3(PO4)2 0.8-1.2份，蒸馏水1000份，pH为6-7。使用的溶磷微生物固体培养基除了具备溶磷微生物富集培养基所有成分外，还加入了10-20份琼脂粉。使用的溶磷微生物筛选培养基与溶磷微生物富集培养基成分基本相同，不同之处在于：将Ca3(PO4)2替换为等量的低品位磷矿粉，该低品位磷矿粉中五氧化二磷的质量百分数含量为5％-20％，其粒径为50-200目。
[0019] 本发明使用的铅污染磷矿废弃地土壤采集自湖北某磷矿废弃地，经XRF分析其主要成分为：Mg(1.7591％)、Al(6.7095％)、P(14.1891％)、Si(21.979％)、Na(0.6717％)、K(3.1089％)、Ca(27.9199％)、C(2.4074％)、Ti(0.7364％)、F(1.2865％)、Mn(0.0297％)、Fe(2.0766％)、Sr(0.068％)、Cr(0.242％)、Pb(0.0133％)、As(0.0056％)。
[0020] 土著高效溶磷微生物的筛选和富集培养过程如下：以100-200g:1L的比例将采集到的土壤样品与无菌水混合均匀，在恒温摇床上震荡15-30分钟，摇床转速控制为120-170r/min，
温度控制为28-35℃，然后静置1-2小时后过滤得到上清液；按照1:3-5的比例(体积比，下同)将上清液和溶磷微生物富集培养基混合，并于28-35℃、120-170r/min转速下恒温摇床培养2-5天，富集得到土著溶磷微生物菌液；将富集得到的土著溶磷微生物菌液接种到溶磷微生物固体培养基中，于28-35℃倒置培养2-5天，得到混合土著溶磷微生物菌落；挑选单一菌落利用划线培养方式于25-35℃下纯化培养2-5天，得到纯化土著溶磷微生物菌株；将纯化土著溶磷微生物菌株接种至溶磷微生物筛选培养基中，在28-35℃、120-170r/min转速下振荡培养5-7天，分析比较培养液的可溶磷含量确定土著高效溶磷微生物。
[0021] 土著高效溶磷微生物的耐铅驯化培养及鉴定过程如下：将上一步筛选得到的土著高效溶磷微生物以1:3-5的比例接种到溶磷微生物筛选培养基中，再加入一定量可溶性铅盐使其铅含量为10-200mg/L。28-35℃、120-170r/min转速下恒温摇床振荡培养2-5天，过滤所得滤液即为土著高效耐铅溶磷微生物菌液。将所得土著高效耐铅溶磷微生物菌液按照同样的培养方法反复驯化培养3-5次，期间逐级增加培养基中的铅含量至200mg/L，最终得到1株土著高效耐铅溶磷微生物。结合其生长形态、生理生化特征及16s rRNA基因序列分析，鉴定该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。将所测16s rRNA基因序列上传到GenBank
数据库，得到登录序列号为MK629319-20。
[0022] 土著铅富集植物的筛选确定过程如下：发明人于2018年10月对湖北宜昌地区某磷矿废弃地进行了实地调研，确定了磷矿废弃地生长旺盛的植物样本：藜、黑麦草、苦苣、野菊、艾草、狗尾草。采集这些植物的种子后播种到含蛭石(5％-10％重量比)的无铅土壤中，20-35℃下育苗10-30天，选取发芽率高、生长状态好的植物移栽至试验花钵中，定时施浇
10-50mg/L的可溶性铅盐溶液，自然光照下生长30-60天后采样。检测植物体内的铅含量，筛选生长状态良好且植物体内铅含量高的植物品种确定为土著铅富集植物。发明人从藜、黑麦草、苦苣、野菊、艾草、狗尾草等土著植物中，通过大量实验比较确定的土著铅富集植物为黑麦草和苦苣。
[0023] 模拟土壤实验：配制铅浓度为20mg/kg的污染土壤，稳定2-4周后分别将两株土著铅富集植物幼苗移栽到上述土壤中，定期浇水保证土壤中含水量为60％-80％，30-60天后将植物整体从土壤中取出并清净，将植物地上部分、地下部分分离后移至烘箱中于70-80℃烘干至恒重。将烘干后的不同部位植物样品
粉碎，采用湿法(HNO3-HClO4)消解得到待测液，用
原子吸收分光光度计测定待测液中的铅含量，结果如下表1所示。
[0024] 表1土著铅富集植物生物量及体内铅含量
[0025]
[0026] 以筛选出来的土著高效耐铅溶磷微生物假单胞菌、土著铅富集植物黑麦草和苦苣为材料，以含磷矿粉的铅污染土壤(模拟土样)和铅污染的磷矿废弃地土壤(真实土样)为修复对象，进行铅去除实验，具体实施例如下：
[0027] 实施例1
[0028] 将500g未被铅污染的普通土壤灭菌后与20-50g低品位磷矿粉混合均匀，再喷洒浓度为80-120mg/L的
硝酸铅溶液，稳定2-4周得到模拟土样。接种选用的微生物菌剂为步骤(b)筛选所得土著高效耐铅溶磷微生物菌液，即假单胞菌菌液。菌液使用前培养至对数期。
[0029] 对照组：将500g灭菌后的模拟土样装入直径约11cm的塑料花盆中，接着将高度为5-6cm的黑麦草幼苗以及高度为1-2cm的苦苣幼苗移栽至同一个花盆中，每个盆中保证有3-
4株植物。考虑到两种植物的适宜栽培温度均为20-35℃，在此温度下培养并定期浇水，保持土壤含水量为田间最大持水量的60％-80％，不接种菌液。
[0030] 实验组：将500g灭菌后的模拟土样装入直径约11cm的塑料花盆中，接着将高度为5-6cm的黑麦草幼苗以及高度为1-2cm的苦苣幼苗移栽至同一花盆中，每个盆中保证有3-4株植物。待幼苗稳定生长5-15天后，以灌根(菌液浓度为(1-5)×108个/mL，下同)的方式反复多次向植物根系土壤中接种假单胞菌菌液，用量为10-20mL。
[0031] 实验组和对照组均在植物移栽后相同天数
收获，取出植物并洗净，将植物地上部分、地下部分分离后移至烘箱中于70-80℃烘干至恒重。将烘干后的不同部位植物样品粉碎，通过湿法(HNO3-HClO4)消解得到测试样，采用原子吸收分光光度计测定样品液铅浓度，结果如表2-3所示。
[0032] 表2植物生物量
[0033]
[0034] 表3植物体内铅含量
[0035]
[0036] 由表2-3可知，接种土著高效耐铅溶磷微生物(假单胞菌菌液)对土著铅富集植物(黑麦草及苦苣)的生长发育起到了促进作用，实验组的整株植物干重比对照组分别高出98.42％和15.39％。与此同时，接种土著高效耐铅溶磷微生物可以加强土著铅富集植物富集模拟土样中铅的能力。实验组黑麦草和苦苣的地上部分和地下部分总含铅量比对照组分别高出43.03％和38.95％，转移系数A/R分别提高了约14％和16％。
[0037] 实施例2
[0038] 考虑到铅在土壤中大部分以难溶态的PbCO3存在，采用在普通土壤中加入一定量PbCO3的方式模拟铅污染土壤。将500g未被铅污染的普通土壤(提前灭菌)、20-50g低品位磷矿粉和1-3g PbCO3混合均匀，得到模拟土样。
[0039] 对照组：将500g灭菌后的模拟土样装入直径约11cm的塑料花盆中，接着将高度为5-6cm的黑麦草幼苗以及高度为1-2cm的苦苣幼苗移栽至同一花盆中，每个盆中保证有3-4株植物。栽培温度控制在20-35℃，保持土壤中含水量为田间最大持水量的60％-80％，不接种菌液。
[0040] 实验组：将500g灭菌后的模拟土样装入直径约11cm的塑料花盆中，接着将高度为5-6cm的黑麦草幼苗以及高度为1-2cm的苦苣幼苗移栽至同一花盆中，每个盆中保证有3-4株植物。待幼苗稳定生长5-15天后，以灌根的方式反复多次向植物根系土壤中接种假单胞菌菌液，用量为10-20mL。
[0041] 实验组和对照组均在植物移栽后相同天数收获，取出植物并洗净，将植物地上部分、地下部分分离后移至烘箱中于70-80℃烘干至恒重。将烘干后的不同部位植物样品粉碎，通过湿法(HNO3-HClO4)消解得到测试样，采用原子吸收分光光度计测定样品液铅浓度，结果如表4-5所示。
[0042] 表4植物生物量
[0043]
[0044] 表5植物体内铅含量
[0045]
[0046] 由表4-5可知，接种土著高效耐铅溶磷微生物(假单胞菌菌液)对土著铅富集植物(黑麦草及苦苣)的生长发育起到了促进作用，实验组的整株植物干重比对照组分别高出34.76％和27.66％。接种的土著高效耐铅溶磷微生物对模拟土样中的难溶铅、低品位磷矿粉具有较好的溶解作用，使土壤中难溶态的铅活化为可溶解态、难溶磷转
化成可溶磷被植物吸收，从而提高了植物对铅的吸收。实验组的黑麦草和苦苣的地上部分和地下部分总含铅量比对照组高出464％和207％，转移系数A/R分别提高了约37％和54％。
[0047] 实施例3
[0048] 以筛选出的土著高效耐铅溶磷微生物假单胞菌与土著铅富集植物黑麦草和苦苣为材料，以铅污染的磷矿废弃地土壤样品(真实土样)为去除对象，进行了相应的试验。
[0049] 对照组：将500g灭菌后的真实土样装入直径约11cm的塑料花盆中，接着将高度为5-6cm的黑麦草幼苗以及高度为1-2cm的苦苣幼苗移栽至同一个花盆中，每个盆中保证有3-
4株植物。考虑到两种植物的适宜栽培温度均为20-35℃，在此温度下培养并定期浇水，保持土壤含水量为田间最大持水量的60％-80％，不接种菌液。
[0050] 实验组：将500g灭菌后的真实土样装入直径约11cm的塑料花盆中，接着将高度为5-6cm的黑麦草幼苗以及高度为1-2cm的苦苣幼苗移栽至同一花盆中，每个盆中保证有3-4株植物。待幼苗稳定生长5-15天后，以灌根的方式反复多次向植物根系土壤中接种假单胞菌菌液，用量为10-20mL。
[0051] 实验组和对照组均在植物移栽后相同天数收获，取出植物并洗净，将植物地上部分、地下部分分离后移至烘箱中于70-80℃烘干至恒重。将烘干后的不同部位植物样品粉碎，通过湿法(HNO3-HClO4)消解得到测试样，采用原子吸收分光光度计测定样品液铅浓度，结果如表6-7所示。
[0052] 表6植物生物量
[0053]
[0054] 表7植物体内铅含量
[0055]
[0056] 由表6-7可知，接种土著高效耐铅溶磷微生物(假单胞菌菌液)对土著铅富集植物(黑麦草及苦苣)的生长发育起到了较好的促进作用，实验组的整株植物干重比对照组分别高出62.22％和260.7％。其次，接种土著高效耐铅溶磷微生物加强了植物富集铅的能力，实验组的黑麦草和苦苣的地上部分和地下部分总含铅量比对照组高出46.67％和42.38％，转移系数A/R分别提高了约16％和28％。
[0057] 上述以铅污染的磷矿废弃地土壤样品(真实土样)为例的实验结果表明，接种土著高效耐铅溶磷微生物(假单胞菌菌液)能够有效提高土著铅富集植物(黑麦草及苦苣)对磷矿废弃地中铅的富集能力，从而达到对磷矿废弃地铅污染的去除目的。
