新的光遗传学工具
阅读：148发布：2020-05-08
专利汇可以提供新的光遗传学工具专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新表征的光诱导的向内质子 泵 及其在医学中的用途，其作为 光遗传学 工具的应用，编码其的核酸构建物，携带该核酸构建物的表达载体，包含所述核酸构建物或表达载体的细胞，以及它们各自的用途。，下面是新的光遗传学工具专利的具体信息内容。
1.一种用于医学用途的光驱动的向内指向的质子泵，其与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少59％序列相似性。
2.权利要求1所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少65％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少
92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少
97％，更优选至少98％，并且最优选99％序列相似性；和/或
其中所述光驱动的向内指向的质子泵与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少38％，更优选至少45％，更优选至少48％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少
96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％序列同一性。
3.权利要求1或2所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵不在SEQ ID NO:1的以下位置处突变：E4、H48、S55、W73、D76、S80、A87、P209、C212、K214和D220；和/或其中所述光驱动的向内指向的质子泵不在N-末端被截短。
4.权利要求1所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵包括选自以下的氨基酸序列并优选由其组成：SEQ ID NO:1(NsXeR)、2(HrvXeR1)、9(HrvXeR)、10(AlkXeR)、11(AlkXeR1)、12(AlkXeR2)、13(AlkXeR3)、14(AlkXeR4)和15(AlkXeR5)；特别是其中所述光驱动的向内指向的质子泵包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(NsXeR)。
5.权利要求1-4中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中
(i)所述光驱动的向内指向的质子泵在pH 6至pH 8之间有活性；优选在pH 5至pH 9之间；和/或
(ii)所述光驱动的向内指向的质子泵的最大吸收在560nm至580nm之间；
(iii)所述光驱动的向内指向的质子泵的光周期小于50ms，优选小于45ms，更优选小于
40ms，更优选小于35ms，甚至更优选小于30ms，诸如27ms，其是在如下条件下测量的：在显示
100：2：3的DMPC：MSP1E3：光驱动的向内指向的质子泵的摩尔比的蛋白纳米盘中，在20℃和pH 7.5下，以532nm波长和3mJ/脉冲的能量提供5ns持续时间的脉冲；和/或
-1 -1
(iv)所述光驱动的向内指向的质子泵的转换率大于250s ，优选大于300s ，更优选大于370s-1，更优选大于380s-1，更优选大于390s-1，诸如转换率为400s-1，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES；和/或
(v)所述光驱动的向内指向的质子泵能够以大于40hz的频率，优选以大于50Hz的频率，更优选以大于60Hz的频率，甚至更优选大于70hz的频率，最优选大于80Hz的频率触发动作电位，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES；和/或(vi)所述光驱动的向内指向的质子泵能够被λ＝532nm且强度为23mW/mm2的3ms脉冲宽度触发，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、
10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的
125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
6.一种核酸构建物，包含编码如权利要求1-5中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列经过密码子优化以在人细胞中表达。
7.一种表达载体，包含编码如权利要求1-5中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵的核苷酸序列或如权利要求6所述的核酸构建物，其中所述核苷酸序列经过优化以在人细胞中表达；特别是其中所述载体是病毒载体；和/或其中所述光驱动的向内指向的质子泵的编码序列处于神经元细胞特异性人启动子，优选人突触蛋白启动子的控制下。
8.一种表达如权利要求1-5中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵的哺乳动物细胞，条件是所述哺乳动物细胞不是人胚胎细胞或能够修饰人类种系遗传特性的细胞。
9.包含如权利要求6所述的核酸构建物或如权利要求7所述的表达载体的哺乳动物细胞。
10.如权利要求9所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是：
(a)海马细胞、光感受器细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜神经节细胞、双极神经元、神经节细胞、假单极神经元、多极神经元、锥体神经元、浦肯野细胞或颗粒细胞；或(b)神经母细胞瘤细胞，特别是NG108-15；HEK293细胞；COS细胞；BHK细胞；CHO细胞；骨髓瘤细胞；或MDCK细胞。
11.一种脂质体，包含如权利要求1-5中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵。
12.如权利要求6所述的核酸构建物、如权利要求7中任一项所述的表达载体、如权利要求8-10中任一项所述的哺乳动物细胞或如权利要求11所述的脂质体用于医学中的用途。
13.如权利要求1-5中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵、如权利要求6所述的核酸构建物、如权利要求7中所述的表达载体、如权利要求8-10中任一项所述的哺乳动物细胞或如权利要求11所述的脂质体用于恢复听觉活动、恢复视力或用于治疗或缓解碱中毒、神经损伤、脑损伤、癫痫发作或退行性神经病症如帕金森病和阿尔茨海默病的用途。
14.一种非人哺乳动物，包含根据权利要求8-10中任一项所述的细胞，优选其中所述细胞是内源性细胞；条件是排除这些动物，其不太可能对人或动物产生超过任何动物所遭受的痛苦的实质性医学利益。
15.如权利要求1-5中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵用于以下的非治疗性的，或离体的，或体外的用途：
(i)用于可电兴奋细胞的光刺激，
(ii)用于逆质子浓度梯度地在膜上转运质子，
(iii)用于酸化或碱化细胞、细胞室、囊泡或脂质体的内部，或
(iv)作为光遗传学工具。
新的光遗传学工具
[0001] 本发明涉及新表征的光诱导的向内质子泵(inward proton pump)及其在医学中的用途，其作为光遗传学工具的应用，编码其的核酸构建物，携带该核酸构建物的表达载体，包含所述核酸构建物或表达载体的细胞，以及它们各自的用途。
背景技术
[0002] 所有细胞的细胞质中均保持特定的H+、K+、Na+和Cl-离子浓度，这对于生命是重要的。跨细胞膜的离子梯度通过离子转运蛋白维持，所述离子转运蛋白是内在膜蛋白。在许多古生菌、细菌和单细胞真核生物中，这些梯度(在其他机制中)通过光驱动微生物视紫红质产生，后者是包含名为视黄醛的辅因子发色团的七次跨膜α-螺旋蛋白。质子梯度通过向外质子泵保持，并且在为大多数生物化学反应提供能量方面具有重要作用。尽管在很久以前就在古生菌中发现了光驱动质子泵视紫红质(细菌视紫红质)(OesterHelt,D.&Stoeckenius,W.RHodopsin-like Protein from tHe Purple Membrane of Halobacterium Halobium.Nature 233,149–152(1971))，并且后来在其它生活领域中也有发现，并且它们在土壤、高盐、海洋和淡水栖息地中具有最广泛的生态分布，但所有已知的质子泵视紫红质都是向外指向的(Ernst,O.P.et al.Microbial and Animal RHodopsins:Structures,Functions,and Molecular MecHanis ms.CHem.Rev.114,126–163(2014))。对于非视紫红质质子泵也同样如此。向内指向的细胞质子泵迄今尚不为人知。它们的存在甚至从未被讨论。尽管已知向内的细胞器质子泵如Na+/H+逆向转运蛋白(anti-porter)的事实，但向内的质膜质子泵仍是完全未知的。
[0003] 在2011年，发现了一类与其他视紫红质类型明显不同的新微生物视紫红质(Ugalde,J.A.,Podell,S.,Narasingarao,P.&Allen,E.E.XenorHodopsins,an enigmatic new class of microbial rHodopsins Horizontally transferred between arcHaea and bacteria.Biol.Direct 6,52(2011))。该工作的作者发现了鱼腥藻感觉视紫红质(Anabaena sensory rHodopsin,ASR)5的几个新同源物。该类的成员被命名为异视紫红质(xenorhodopsins,XeRs)。在这些蛋白质中，有来自古生菌的新主要种系的异视紫红质，特别是纳米卤古菌(nanohaloarchaeon)的纳沙利纳属j07AB43(Nanosalina sp.j07AB43)和纳沙利纳属J07AB56(Nanosalinarum sp.J07AB56)，它们之间具有89％的氨基酸同一性，但与ASR仅有34％同一性。在分析氨基酸序列比对后，作者得出的结论是异视紫红质不具有质子泵或盐细菌视紫红质泵所共有的特定特征。但是，它们类似于ASR，因为它们在供体位置缺乏常见的Asp，如当时已知的感觉视紫红质那样。因此，Ugalde等推测异视紫红质具有与感觉视紫红质相似的功能。同时，Ugalde等承认尚未通过实验验证ASR或任何其他异视紫红质蛋白的感觉或离子转运功能。
[0004] Kawanabe等报道了人工ASR突变体D217E，其表现出光驱动的向内质子运输活性(Kawanabe et al.Engineering an inward proton transport from a bacterial sensor rHodopsin.J Am CHem Soc.131,16439-16444(2009)；Kawanabe et al.An inward proton transport using Anabaena sensory rHodopsin.J Microbiol.49,1-6(2011))。另请参见Dong et al.Structure of an Inward Proton-Transporting Anabaena Sensory RHodopsin Mutant:MecHanistic InsigHts.BiopHys J.111,963-972(September
2016)。然而，Kawanabe等证明了D217E ASR的向内质子运输的效率很低(比BR的效率低15倍)。此外，Kawanabe等没有显示D217E ASR是否充当H+泵或通道。与此相反，本文所述和所表征的异视紫红质被证明是允许高效质子运输的光驱动的向内质子泵。
2016)。然而，Kawanabe等证明了D217E ASR的向内质子运输的效率很低(比BR的效率低15倍)。此外，Kawanabe等没有显示D217E ASR是否充当H+泵或通道。与此相反，本文所述和所表征的异视紫红质被证明是允许高效质子运输的光驱动的向内质子泵。
[0005] Inoue等描述了通过替换光驱动向外质子泵古生菌视紫红质3(AR-3)中位于视黄醛周围的三个残基(即M128A，G132V和A225T)来产生蓝移的光门控质子通道(AR3-T)(Inoue et al.Converting a ligHt-driven proton pump into a ligHt-gated proton cHannel.J Am CHem Soc.137,3291-3299(2015))。光门控质子通道AR3-T不允许质子逆电化学梯度来运输。还据报道，AR3-T具有非常慢的光周期，这使得AR3-T不适合于几种光遗传学应用。
[0006] 最近，Inoue等还报道发现了来自Parvularcula oceani的向内H+泵(Inoue et al.A natural light-driven inward proton pump.Nat Commun.7,13415(November 2016)，以及该物质在大肠杆菌和小鼠神经细胞中的表达。然而，来自Parvularcula oceani的向内H+泵的光诱导去极化电流不足以激活神经元细胞。值得注意的是，与本文所述和表征的异视紫红质相比，报道的动力学要慢得多，这通常限制了来自Parvularcula oceani的向内H+泵作为光遗传学工具的使用，并排除了具有高时间精度的神经元激活的可能性。
[0007] 首次表征了来自异视紫红质家族的三种蛋白质，即NsXeR(序列在Ugalde,et al.Biol.Direct 6,52(2011)中公开)，HrvXeR(序列在Ghai,R.et al.New Abundant Microbial Groups in Aquatic Hypersaline Environments.Sci.Rep.1,(2011)中公开)，和AlkXeR(序列在Vavourakis,C.D.et al.Metagenomic Insights into the Uncultured Diversity and Physiology of Microbes in Four Hypersaline Soda Lake Brines.Front.Microbiol.7,(2016)中公开)，并且发现这三种都是向内指向的质子泵。使用这些蛋白质之一进行了全面的功能和结构研究，其结果在下文中描述。此外，发现由NsXeR引起的光诱导去极化电流足以以高时间精度可靠地激活神经元细胞。因此，NsXeR作为质子泵对光遗传学研究具有吸引力，因为它具有非阳离子依赖性活性，并且是众所周知的阳离子选择性通道视紫红质的替代品。
[0008] 本公开的目的是提供新的光遗传学工具，其是非阳离子依赖性的，对pH不敏感的，并且可以在广谱的细胞中表达。这样的光遗传学工具在科学研究领域以及医学领域都被认为是有价值的。
发明内容
[0009] 电化学质子梯度的产生是细胞生物能学的第一和普遍的步骤。在原核生物中，梯度是由向外的膜蛋白质子泵产生的。向内质膜天然质子泵尚未可知。在本公开中，描述了来自微生物视紫红质的纳米嗜盐古菌(Nanohaloarchaea)家族的尚未表征的异视紫红质的代表的全面功能研究。在本文的实施例中首次证明了它们在模型膜系统、大肠杆菌细胞、人胚肾细胞、神经母细胞瘤细胞和大鼠海马神经元细胞中是向内质子泵。证明了，NsXeR是一种强有力的泵，其能够激发大鼠海马神经元细胞的动作电位，直至达到其最大内在激发频率，证明了向内指向的质子泵适用于光诱导的神经元远程控制，并且是公知的阳离子选择性通道视紫红质的替代。
[0010] 因此，如权利要求中进一步定义的，公开了一种用于医学的光驱动的向内指向的质子泵，其在SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长上具有至少59％的序列相似性。例如，光驱动的向内指向的质子泵可以包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:1(NsXeR)、2(HrvXeR1)、9(HrvXeR)、10(AlkXeR)、11(AlkXeR1)、12(AlkXeR2)、13(AlkXeR3)、14(AlkXeR4)和15(AlkXeR5)。
[0011] 还提供了一种核酸构建体，其包含编码如本文所公开的光驱动的向内指向的质子泵的核苷酸序列，其中该核苷酸序列经密码子优化以在人细胞中表达；以及一种表达载体，其包含编码如本文所公开的光驱动的向内指向的质子泵的核苷酸序列或所述核酸构建体，其中所述核苷酸序列被优化用于在人细胞中表达。
[0012] 还考虑了表达如本文所公开的光驱动的向内指向的质子泵的哺乳动物细胞，条件是该哺乳动物细胞不是人类胚胎细胞或者不是能够改变人类种系遗传特性的细胞；以及一种哺乳动物细胞，其包含本发明的核酸构建体或表达载体。此外，本公开还提供了脂质体，其包括如本文所公开的光驱动的向内指向的质子泵。
[0013] 本公开的光驱动的向内指向的质子泵、核酸构建体、表达载体、哺乳动物细胞或脂质体可有利地用于药物中，例如用于恢复听觉活性，恢复视力，或用于治疗或减轻碱中毒、神经系统损伤、脑损伤、癫痫发作或变性神经系统疾病，例如帕金森病和阿尔茨海默病。
[0014] 另外，本发明提供了一种非人哺乳动物，其包含本公开的细胞，优选其中所述细胞是内源性细胞；条件是排除这些动物，其不太可能对人或动物产生超过任何动物遭受的痛苦的实质性医疗利益。
[0015] 最后，还提供了本文所公开的光驱动的向内指向的质子泵(i)用于可电兴奋细胞的光刺激，(ii)用于逆质子浓度梯度地在膜上转运质子，(iii)用于酸化或碱化细胞，细胞室，囊泡或脂质体的内部，或(iv)或用作光遗传学工具的非治疗性或离体或体外用途。
[0016] 优选实施方式的详细说明
[0017] 本文的实施例显示了来自微生物视紫红质的纳米嗜盐古菌家族的尚未表征的异视紫红质代表的综合功能研究，并表明它们是向内指向的质子泵。对来自Nanosalina(NsXeR)的异视紫红质在模型膜系统、大肠杆菌细胞、人胚肾细胞、神经母细胞瘤神经胶质瘤细胞和大鼠海马神经元细胞中泵送活性的严密研究证实了在所有这些细胞中NsXeR都可作为向内指向泵。
[0018] 还证明了NsXeR是一种强有力的泵，其转换率(turnover rate)为400s-1，能够在大鼠海马神经元细胞内激发动作电位，直至达到其最大内在放电频率。NsXeR的晶体结构揭示了与已知视紫红质非常不同的离子易位途径。由于其作为质子泵的内在特性，NsXeR完全不受离子条件的影响，这使这种视紫红质成为有吸引力的光诱导的神经元远程控制的替代品，如众所周知的阳离子选择性通道视紫红质一样。
[0019] 因此，本文公开了用于医学的光驱动的向内指向的质子泵，其在SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长上具有至少59％的序列相似性。在优选的实施方式中，光驱动的向内指向的质子泵可与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少65％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，和最优选99％的序列相似性。
[0020] 可替代地，或另外地，光驱动的向内指向的质子泵可与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少38％，更优选地至少45％，更优选地至少48％，更优选地至少50％，更优选地至少55％，更优选至少56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少
85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少
90％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少
98％，和最优选至少99％的序列同一性。
85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少
90％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少
98％，和最优选至少99％的序列同一性。
[0021] 通常，当氨基酸序列与另一种氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1)之间的序列同一性为在所述另一种氨基酸序列的全长上为至少x％时，则所述氨基酸序列与比对序列(例如，上面的SEQ ID NO:1)具有“至少x％的同一性”。类似地，当氨基酸序列与另一种氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1)之间的序列相似性为在所述另一种氨基酸序列的全长上为至少x％时，则所述氨基酸序列与比对序列(例如，上面的SEQ ID NO:1)具有“至少x％的相似性”。
[0022] 可使用例如公众可获得的计算机同源性程序，诸如在EMBL主页http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/提供的“EMBOSS”程序，使用其中提供的默认设置来进行这样的比对。计算多组氨基酸序列的序列同一性或序列相似性百分比的其他方法是本领域已知的。
[0023] 光驱动的向内指向的质子泵具有七次跨膜α-螺旋(A-G)以及经由席夫碱共价结合至与SEQ ID NO:1中的213赖氨酸相对应的残基的辅因子视黄醛。螺旋A前面是一个小的N末端α-螺旋，其在胞外侧封端蛋白质。
[0024] 本公开的光驱动的向内指向的质子泵是具有至少5次跨膜螺旋的膜蛋白，其能够结合光敏多烯。具有6或7次跨膜螺旋的跨膜蛋白是优选的。然而，也包括具有多于7次的螺旋，例如8、9或10次跨膜螺旋的跨膜蛋白。此外，本发明涵盖除了跨膜部分外还包括C-和/或N-端序列的跨膜蛋白，其中C-端序列可以延伸到被膜包围的腔的内部，例如细胞的细胞质或脂质体的内部；或者也可被布置在膜的外表面上。对于任选存在的N-末端序列也是如此，其可以同样布置在腔内和膜的外表面上。C-和/或N-末端序列的长度原则上不受限制。但是，优选具有未嵌入膜中的C末端序列的光驱动的向内指向的质子泵具有1至1000个氨基酸，优选1至500个氨基酸，特别优选5至50个氨基酸。与C末端序列的长度无关，未嵌入膜中的位于N末端的序列优选包含1至500个氨基酸，特别优选5至50个氨基酸。在一个优选的实施方式中，光驱动的向内指向的质子泵在N端不被截短。跨膜螺旋的概念是技术人员众所周知的。这些通常是通常包含20至25个氨基酸的α-螺旋蛋白结构。但是，取决于膜的性质(其可以是天然膜，例如细胞膜或质膜；或者可以是合成膜)，跨膜片段也可以更短或更长。例如，人造膜中的跨膜片段可包含多达30个氨基酸，但另一方面也可仅包含少量氨基酸，例如12至16个氨基酸。
[0025] 最优选地，光驱动的向内质子泵XeR具有七次跨膜α-螺旋(A-G)和经由席夫碱共价结合至213赖氨酸的辅因子视黄醛。螺旋A的前面是一个小的N末端α-螺旋，其在胞外侧封端蛋白质。
[0026] 优选地，光驱动的向内指向的质子泵与SEQ ID NO:1相比仅包含(半)保守性取代。保守性取代是发生在其侧链和化学性质方面相关的氨基酸家族中的那些。这样的家族的实例是具有碱性侧链的氨基酸，具有酸性侧链的氨基酸，具有非极性脂族侧链的氨基酸，具有非极性芳族侧链的氨基酸，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸，具有小侧链的氨基酸，具有大侧链的氨基酸等。典型的半保守性和保守性取代为：
[0027]
[0028]
[0029] 此外，本领域技术人员将理解，在空间要求高的位置上的甘氨酸不应被取代，并且脯氨酸不应被引入到具有α-螺旋或β-折叠结构的蛋白质部分中。特别是，光驱动的向内指向的质子泵可能不会在对应于SEQ ID NO:1的E4、H48、S55、W73、D76、S80、A87、P209、C212、K214和D220的位置处发生突变。换句话说，光驱动的向内指向的质子泵最好在位置4处包含“E”，在位置48处包含“H”，依此类推。
[0030] 在一个甚至更优选的实施方式中，光驱动的向内指向的质子泵包含选自SEQ ID NO:1(NsXeR)、2(HrvXeR1)、9(HrvXeR)、10(AlkXeR)、11(AlkXeR1)、12(AlkXeR2)、13(AlkXeR3)、14(AlkXeR4)和15(AlkXeR5)的氨基酸序列；特别是其中光驱动的向内指向的质子泵包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(NsXeR)。在最优选的实施方式中，光向内指向的质子泵由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:1(NsXeR)、2(HrvXeR1)、9(HrvXeR)、10(AlkXeR)、11(AlkXeR1)、12(AlkXeR2)、13(AlkXeR3)、14(AlkXeR4)和15(AlkXeR5)；特别地，其中光驱动的向内指向的质子泵由SEQ ID NO:1(NsXeR)的氨基酸序列组成。
[0031] 如本文所用，术语“向内指向(inward directed)”是指当质子泵在细胞中表达并结合到细胞膜中时，它将质子(甚至逆梯度地)向内转移到细胞中。可以使用以下测定法来测试作为“光驱动的向内指向的质子泵”的功能要求。如先前所述，在大豆脂质体中重构纯化的候选蛋白质(Huang,K.S.,Bayley,H.&Khorana,H.G.Delipidation of bacteriorhodopsin and reconstitution with exogenous phospholipid.Proc.Natl.Acad.Sci.77,323–327(1980)；通过引用并入本文)。简言之，将磷脂(来自大豆的大豆磷脂，Sigma-AldricH)溶解于CHCl3(超纯氯仿，ApplicHem Panreac)中，并在玻璃小瓶中在N2流下干燥。用真空泵除去残留溶剂过夜。将干燥的脂质以1％(w/v)的最终浓度再悬于补充有2％(w/v)胆酸钠的0.15M NaCl中。通过在4℃超声处理使混合物澄清，并以7:100(w/w)的蛋白质/脂质比率添加异视紫红质。通过与吸收洗涤剂的珠粒(Amberlite XAD 2,Supelco)一起搅拌过夜除去洗涤剂。将混合物在4℃用调节至pH 7的0.15M NaCl透析1天(四次200ml变化)。在0℃对2ml的搅拌蛋白脂质体悬浮液进行测量。用卤素灯(Intralux 5000-1,VOLPI)将蛋白脂质体照射18分钟，然后避光再放置18分钟。用pH计(LAB 850,ScHott Instruments)监测pH变化。作为阴性对照，在40uM CCCP存在下在相同条件下重复测量。在向内指向的质子泵的情况下，照射后的pH变化表明膜外溶液的酸化。将CCCP添加到悬浮液时，这些pH变化消失。
[0032] 在某些实施方式中，其中光驱动的向内指向的质子泵在pH 6和pH 8之间，优选在pH 5至pH 9之间有活性。该特征可使用前述脂质体测定法来测试，但是可通过透析将蛋白脂质体调节至不同于pH 7.0的起始pH。
[0033] 使用前述脂质体测定法，也可以用不同波长的光进行照射。光驱动的向内指向的质子泵的典型特征是在560nm至580nm之间显示最大吸收。另见下面的实施例2。
[0034] 然而，本公开的光驱动的向内指向的质子泵也可以在其光周期方面进一步表征。优选地，光驱动的向内指向的质子泵的光周期小于50ms，优选小于45ms，更优选小于40ms，更优选小于35ms，甚至更优选小于30ms，例如27ms，其是在如下条件下测量的：在显示100：
2：3的DMPC：MSP1E3：光驱动的向内指向的质子泵的摩尔比的蛋白纳米盘(proteo-nanodiscs)中，在20℃和pH 7.5下，在532nm波长和3mJ/脉冲的能量下提供5ns持续时间的脉冲。
2：3的DMPC：MSP1E3：光驱动的向内指向的质子泵的摩尔比的蛋白纳米盘(proteo-nanodiscs)中，在20℃和pH 7.5下，在532nm波长和3mJ/脉冲的能量下提供5ns持续时间的脉冲。
[0035] 简单地，使用标准方法(Ritchie,T.K.et al.in Methods in Enzymology(ed.Düzgünes,N.)464,211–231(Academic Press,2009)；通过引用并入本文)组装蛋白纳米盘。使用1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DMPC(Avanti Polar Lipids,USA)作为脂质。使用了拉长的MSP1E3版本的载脂蛋白-1。组装期间的摩尔比为DMPC：MSP1E3：NsXeR＝100：
2：3。如上所述制备脂质体。
2：3。如上所述制备脂质体。
[0036] 使用Shimadzu UV-2401PC分光光度计记录吸收光谱。激光闪光光解设置类似于CHizHov及其同事所描述的(Chizhov,I.et al.Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle.Biophys.J.71,2329–2345(1996)；通过引用并入本文)。激发/检测系统的组成如下：使用Surelite II-10Nd:YAG激光(Continuum Inc,USA)，以
532nm波长和3mJ/脉冲的能量提供5ns持续时间的脉冲。将样品(5x5毫米光谱石英比色皿(Hellma GmbH&Co,Germany))放置在两个准直且机械耦合的单色仪(1/8m model 77250,Oriel Corp.,USA)之间的恒温室内。探测灯(75W氙弧灯,Osram,Germany)通过第一个单色仪，样品，并在第二个单色仪之后到达PMT检测器(R3896,Hamamatzu,Japan)。PMT的电流-电压转换器测定测量系统的时间分辨率为约50ns(以5ns激光脉冲的表观脉冲宽度测量)。使用两个数字示波器(LeCroy 9361和9400A，每个通道分别具有25和32KB的缓冲存储器)记录两个重叠时间窗口中瞬态转运变化的轨迹。每个数据点的最大数字化速率为10ns。从激光脉冲后10ns记录瞬态吸收变化，直到光转化完全完成为止。在每个波长处，对25个激光脉冲进行平均以提高信噪比。准对数数据压缩将每条迹线的初始数据点数量(约50000个)减少到均匀分布在对数时间范围内的约600个点，给出每十个时间点约100个点(100pionts per time decade)。使用计算机控制的步进电机，波长以2nm的步长从300nm变化到730nm(总共
216个光谱点)。在每个实验之前和之后，在标准分光光度计(Beckman DU-800)上测量样品的吸收光谱。
532nm波长和3mJ/脉冲的能量提供5ns持续时间的脉冲。将样品(5x5毫米光谱石英比色皿(Hellma GmbH&Co,Germany))放置在两个准直且机械耦合的单色仪(1/8m model 77250,Oriel Corp.,USA)之间的恒温室内。探测灯(75W氙弧灯,Osram,Germany)通过第一个单色仪，样品，并在第二个单色仪之后到达PMT检测器(R3896,Hamamatzu,Japan)。PMT的电流-电压转换器测定测量系统的时间分辨率为约50ns(以5ns激光脉冲的表观脉冲宽度测量)。使用两个数字示波器(LeCroy 9361和9400A，每个通道分别具有25和32KB的缓冲存储器)记录两个重叠时间窗口中瞬态转运变化的轨迹。每个数据点的最大数字化速率为10ns。从激光脉冲后10ns记录瞬态吸收变化，直到光转化完全完成为止。在每个波长处，对25个激光脉冲进行平均以提高信噪比。准对数数据压缩将每条迹线的初始数据点数量(约50000个)减少到均匀分布在对数时间范围内的约600个点，给出每十个时间点约100个点(100pionts per time decade)。使用计算机控制的步进电机，波长以2nm的步长从300nm变化到730nm(总共
216个光谱点)。在每个实验之前和之后，在标准分光光度计(Beckman DU-800)上测量样品的吸收光谱。
[0037] 使用全局多指数非线性最小二乘拟合程序MEXFIT(Gordeliy,V.I.et al.Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II–transducer complex.Nature 419,484–487(2002)；通过引用并入本文)对每个数据集进行独立分析。增加指数分量的数量，直到加权残差的标准偏差不再进一步改善为止。在建立表观速率常数并将其分配给一系列弛豫过程的内部不可逆转变之后，将指数的振幅光谱转换为相对于最终状态光谱的相应中间体的差异光谱。随后，通过将除以转化分子的分数的差异光谱添加到最终态光谱来测定态的绝对吸收光谱。确定分数值的标准是不存在负吸光度以及从初始状态到最终状态的计算光谱的贡献。有关方法的更多详细信息，请参见(Chizhov,I.et al.Biophys.J.71,2329–2345(1996))。
[0038] 此外，可通过使用膜片钳测量在全细胞模式下使用AxonatcH 200B interface,Axon Instruments来进一步电生理学表征光驱动的向内指向的质子泵。使用聚焦在400μm光纤中的二极管泵浦固态激光(λ＝532nm)，响应于饱和强度为23mW/mm2的光脉冲来测量光电流。光脉冲由快速计算机控制的快门(Uniblitz LS6ZM2,Vincent Associates)施加。通过Opolette 355可调激光系统(OPTOPRIM)产生超短的纳秒级光脉冲。为了测量作用光谱，将不同波长的脉冲能量设置为与1019光子/m2的相等光子计数相对应的值。此外，还测量了膜电位在–100mV至+60mV范围内的光电流-电压关系(开/关动力学除外，其中膜电位在–80mV至+80mV范围内)。电阻为2-5MΩ的膜片吸管(patch pipettes)可以用薄壁硼硅玻璃(GB150F-8P)在水平拉拔器(P-1000型，Sutter Instruments)上制造。下面的实施例3中提供了进一步的指导。
[0039] 简言之，可以通过腺相关病毒介导的基因转移在大鼠海马神经元中异源表达候选的光驱动的向内指向的质子泵。从出生后的P1 Sprague-Dawley大鼠中分离出海马，并在37℃用木瓜蛋白酶(20U ml-1)处理20分钟。用补充有10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen/Gibco，高葡萄糖)清洗海马，并以少量该溶液滴定。将约96,000细胞接种在24孔板中的聚D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上。3小时后，用培养基(含有2％B-27补充物和2mM Glutamax-1的神经基础培养基A)代替铺层培养基(plating medium)。
[0040] 使用带有人突触蛋白启动子的pAAV2载体制备rAAV2/1病毒，所述载体包含光驱动的向内指向的质子泵的DNA序列，其C端与Kir2.1膜运输信号融合，P2A自切割肽，和GFP变体。简单地，在铺层后4-9天将5×109基因组拷贝/ml(AGC/ml)的rAAV2/1病毒添加到每个孔中。在转导后19-23天进行电生理记录。
[0041] 使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管进行电生理学表征，所述膜片吸管装有被滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP。胞外溶液含有滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。电生理信号在10kHz滤波，用Axon Digidata 1322A(50kHz)数字化，并使用pClamp9软件(Axon Instruments)进行采集和分析。
[0042] 在一些实施方式中，本公开的光驱动的向内指向的质子泵具有大于250s-1，优选地大于300s-1，更优选地大于370s-1，更优选地大于380s-1的转换率，更优选大于390s-1，例如-1400s 的转换率，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH
7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
[0043] 在某些实施例中，光驱动的向内指向的质子泵能够以大于40Hz的频率，优选地以大于50Hz的频率，更优选地以大于60Hz的频率，甚至更优选大于70hz的频率，和最优选大于80Hz的频率触发动作电位，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的
129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
[0044] 替代地或另外，光驱动的向内指向的质子泵能够用λ＝532nm且强度为23mW/mm2的3ms脉冲宽度触发，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH
7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
[0045] 在相关方面，本公开还提供了一种核酸构建体，其包含编码如上所述的光驱动的向内指向的质子泵的核苷酸序列。
[0046] 为确保最佳表达，还可以例如通过添加合适的调节序列和/或靶向序列和/或通过使编码DNA序列与所选宿主的优选密码子匹配来适当地修饰编码核苷酸序列。在特别优选的实施方式中，核苷酸序列经过密码子优化以在人细胞中表达。例如，核苷酸序列可以具有SEQ ID NO:16所示的序列。靶向序列可编码将光诱导的向内质子泵靶向细胞内特定位点或腔室的C末端延伸，例如靶向突触或突触后位点、靶向轴突-小丘或靶向内质网。核酸可以与其他元件组合，例如启动子和转录起始和终止信号以及翻译起始和终止信号和聚腺苷酸化信号，以便提供本公开的突变的光诱导向内质子泵序列的表达。启动子可以是诱导型或组成型的一般或细胞特异性的启动子。细胞特异性启动子的实例是对双极细胞具有特异性的mGlu6-启动子。在特定实施方式中，光驱动的向内指向的质子泵的编码序列在神经元细胞特异性人启动子(优选人突触蛋白启动子)的控制下。启动子、载体和其他元件的选择是本领域普通技术人员常规设计的问题。文献中描述了许多这样的元素，并且可以通过商业供应商获得。
[0047] 还公开了一种表达载体，其包含本文所公开的编码突变的可诱导的向内质子泵的核苷酸序列或核酸构建体，其中所述核苷酸序列被优化用于在人细胞中表达。在优选的实施方式中，载体适合于基因治疗，特别是其中载体适合于病毒介导的基因转移，即其中载体是病毒载体。术语“适合于病毒介导的基因转移”在本文中是指所述载体可以包装在病毒中并因此被递送至目的位点或细胞。适用于基因治疗的病毒的实例是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒、狂犬病病毒、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)和疱疹病毒。这些病毒的不同之处在于它们将基因转移到其所识别并能够感染的细胞中的能力，以及它们是否永久或暂时改变细胞DNA。但是，基因治疗也包括非病毒方法，例如裸DNA、脂复合物和多聚体以及树状聚合物的应用。
[0048] 可以例如使用病毒作为载体或通过转染，包括例如通过化学转染子(如Lipofectamine,Fugene等)、电穿孔、磷酸钙共沉淀和DNA的直接扩散来将得到的核酸序列导入到细胞中。在实施例中详述了用于转染细胞的方法，该方法可以适用于相应的受者细胞。用DNA转染产生稳定的细胞或细胞系(如果将转染的DNA整合到基因组中)，或不稳定的(瞬时)细胞或细胞系，其中转染的DNA以染色体外形式存在。此外，可通过使用附加型复制质粒获得稳定的细胞系，这意味着染色体外质粒的遗传由整合到细胞基因组中的控制元件控制。通常，合适载体或质粒的选择取决于预期的宿主细胞。
[0049] 因此，本公开还涉及表达如本文所公开的光驱动的向内指向的质子泵的哺乳动物细胞，条件是该哺乳动物细胞不是人胚胎细胞或能够修饰人种系遗传特性的细胞。类似地，本公开提供了包含本文所公开的核酸构建体或表达载体的哺乳动物细胞。
[0050] 可例如通过以下方式简单地实现将本发明的光驱动的向内指向的质子泵掺入本质上不表达相应通道的细胞膜中：使用重组DNA技术的已知方法，首先将编码该向内质子泵的DNA掺入合适的表达载体，例如质粒、粘粒或病毒，然后用其转化靶细胞，并在该宿主中表达蛋白质。接下来，以合适的方式(例如使用视黄醛)处理细胞以使得能在蛋白质和视黄醛之间建立席夫碱连接
[0051] 可有利地在某些哺乳动物细胞系统中实现本发明的光驱动的向内指向的质子泵的表达。可用附加型载体进行为瞬时表达的表达，优选在神经母细胞瘤细胞(例如NG108-15细胞)，黑素瘤细胞(例如BLM细胞系)，COS细胞(通过感染“非洲绿猴肾CV1”产生)，或HEK细胞(“人胚肾细胞”，例如HEK293细胞)，或BHK细胞(“幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cell)”)中，或以稳定表达的形式(通过整合到基因组中)在CHO(“中国仓鼠卵巢细胞)、骨髓瘤细胞或MDCK细胞(“Madine-Darby犬肾细胞”)或在用杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中进行。在更优选的实施方式中，哺乳动物细胞是神经母细胞瘤细胞，特别是NG108-15；HEK293细胞；COS细胞；BHK细胞；CHO细胞；骨髓瘤细胞；或MDCK细胞。
[0052] 在另一个优选的实施方式中，哺乳动物细胞是可电兴奋的细胞。进一步优选地，细胞是海马细胞、光感受器细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜神经节细胞、双极神经元、神经节细胞、假单极神经元、多极神经元、锥体神经元、浦肯野细胞(Purkinje cell)或颗粒细胞。
[0053] 神经元是通过电和化学信号传导处理和传递信息的可电兴奋细胞，其中化学信号传导通过突触，与其他细胞的专门连接发生。存在许多特殊类型的神经元，例如响应于触摸、声音、光和影响感觉器官细胞的许多其他刺激的感觉神经元，从大脑和脊髓接收信号并引起肌肉收缩和影响腺体的运动神经元，以及将神经元与大脑或脊髓的相同区域中的其他神经元相连接的中间神经元。通常，神经元具有胞体(soma)、树突和轴突。树突是从细胞体中产生的细丝，通常延伸数百微米并多次分枝。轴突是起源于细胞体上在被称为轴丘的部位上的特殊细胞细丝。尽管轴突可能在终止前分枝数百次，但神经元的细胞体通常会产生多个树突而从不会产生多于一个轴突。在大多数突触中，信号从一个神经元的轴突发送到另一个神经元的树突。但是，这些规则有很多例外：缺少树突的神经元，没有轴突的神经元，将轴突连接到另一个轴突或将树突连接到另一个树突的突触等。大多数神经元在解剖学上可以进一步表征为单极或伪单极(树突和轴突来自同一过程)、双极(轴突和单个树突位于胞体的相对两端)、多极(具有两个以上的树突，并且可以进一步分类为(i)高尔基I神经元，其具有长突起的轴突过程，例如锥体细胞、浦肯野细胞和前角细胞，以及(ii)高尔基II：其轴突过程在局部突出的神经元，例如颗粒细胞。
[0054] 光感受器细胞是在视网膜中发现的能够进行光转导的特殊神经元。两种经典的光感受器是视杆和视锥，它们各自提供视觉系统使用的信息。视网膜神经节细胞是位于眼睛视网膜内表面附近的一种神经元。这些细胞具有树突和突出到保护层(中脑)、下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus in the hypothalamus)和外侧膝状体(丘脑)的长轴突。一小部分对视觉的贡献很小或没有贡献，但它们本身是感光的。它们的轴突形成视网膜下丘脑束，有助于昼夜节律和瞳孔光反射，从而调节瞳孔的大小。它们通过两种中间神经元类型从光感光器接收视觉信息：双极细胞和无长突细胞。无长突细胞是视网膜中的中间神经元，负责视网膜神经节细胞输入的70％。负责视网膜神经节细胞输入的另外30％的双极性细胞由无长突细胞调节。作为视网膜的一部分，双极细胞存在于光感受器(视杆细胞和视锥细胞)和神经节细胞之间。它们直接或间接地将信号从光感受器传递到神经节细胞。
[0055] 细胞可以在合适的温度和气体混合物(通常为37℃，5％CO2)条件下任选地在细胞培养箱中分离(并进行基因修饰)、保持和培养，如技术人员已知并且在实施例中针对某些细胞系或细胞类型举例说明的。每种细胞类型的培养条件可能会有所不同，特定细胞类型的条件变化可能会导致不同的表型。除了温度和气体混合物外，细胞培养系统中最常见的变化因素是生长培养基。生长培养基的配方可以在pH、葡萄糖浓度、生长因子以及存在其他营养成分等方面不同。生长培养基可以商购获得，或者可以根据可从美国组织培养库(American Tissue Culture Collection(ATCC))获得的组成制备。用于补充培养基的生长因子通常来自动物血液，例如小牛血清。另外，可以将抗生素添加到生长培养基中。在培养细胞上进行的常见操作包括培养基更换和传代细胞。
[0056] 因此，本公开的光驱动的向内指向的质子泵特别可用作研究工具，例如在电可兴奋细胞(特别是神经元细胞)的光刺激的非治疗用途中。可以在下面的实施例部分中找到关于海马神经元培养和海马神经元电生理记录以及HEK293细胞的电生理记录的进一步指导。
[0057] 作为细胞的替代，本公开还提供了脂质体，其包含如本文公开和/或权利要求中定义的光驱动的向内指向的质子泵。
[0058] 通常，本公开的光驱动的向内质子泵实现功能所必需的视黄醛或视黄醛衍生物是通过将要用所述的向内质子泵转染的细胞产生的。取决于其构象，视黄醛可以是全反式视黄醛、11-顺式-视黄醛、13-顺式-视黄醛或9-顺式-视黄醛。然而，如上所述，还考虑了本发明的光驱动的向内质子泵可以被结合到囊泡、脂质体或其他人工细胞膜中。因此，还公开了一种通道视紫红质(channelrhodopsin)，其包括本发明的光驱动的向内质子泵以及视黄醛或视黄醛衍生物。优选地，视黄醛衍生物选自由3,4-脱氢视黄醛，13-乙基视黄醛，9-dm-视黄醛，3-羟基视黄醛，4-羟基视黄醛，萘基视黄醛；3,7,11-三甲基-十二烷基-2,4,6,8,10-五烯醛；3,7-二甲基-癸-2,4,6,8-四烯醛；3,7-二甲基-辛基-2,4,6-三烯醛；以及6-7旋转受阻视黄醛，8-9旋转受阻视黄醛和10-11旋转受阻视黄醛组成的组。
[0059] 最后，存在许多这样的疾病：其中例如天然视觉细胞不再具有功能，但是所有神经连接都能够继续工作。如今，多个研究中心都在尝试在视网膜上植入带有人造陶瓷感光细胞的薄膜。这些感光细胞旨在将视网膜的仍然完整的次生细胞去极化，从而触发神经脉冲(仿生眼)。根据本公开的突变光控内向质子泵在这些神经节细胞、无长突细胞或双极细胞中的有意表达将是非常优雅的解决方案，并且能够实现更大的三维视觉分辨率。
[0060] 因此，本公开还考虑了用于医学的根据本公开的光驱动的向内质子泵、核酸构建体、表达载体、哺乳动物细胞或脂质体。
[0061] 如以下实施例所示，已经在本领域中验证了原理证明，其可以容易地适用于本公开的光驱动的向内质子泵。鉴于这些数据，可以预期的是，本公开的光可诱导的向内质子泵可以用于恢复失聪受试者的听觉活动或恢复失明受试者的视力。
[0062] 由于其pH调节能力，光驱动质子泵还可用于治疗或减轻碱中毒。同样，可以预期的是，由于其电生理学性能，本公开的光驱动的向内质子泵可以适当地用于治疗或减轻神经损伤、脑损伤、癫痫发作或退行性神经疾病，例如帕金森病和阿尔茨海默病。在所有这些治疗情况下，光驱动的向内质子泵可以通过脂质体的方式递送给要被治疗的受试者，并且更优选通过施用本公开的核酸构建体或表达载体的方式递送给要被治疗的受试者。
[0063] 进一步描述了非人动物，所述非人动物包含根据本公开的细胞，即功能性表达根据本公开的光驱动的向内质子泵的细胞，例如，在诸如神经元的细胞中，特别是在螺旋神经节神经元中，正如对本公开的细胞所描述的那样。在优选的实施方式中，细胞是内源性细胞。非人动物可以是人类以外的任何动物。在一个优选的实施方式中，非人动物是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物(例如小鼠或大鼠)或灵长类动物。
[0064] 特别地，某些模型生物体是优选的，例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、Arbacia punctulata、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、果蝇(Drosophila)(通常为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、夏威夷短尾鱿鱼(Euprymna scolopes)、水螅(Hydra)、Loligo pealei、Pristionchus pacificus、紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus)、Symsagittifera roscoffensis和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。在脊椎动物中，这些是几种啮齿动物，例如豚鼠(Cavia porcellus)、仓鼠、小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus)以及其他物种，诸如鸡(Gallus gallus domesticus)、猫(Felis cattus)、狗(Canis lupus friendlyis)、七鳃鳗(Lamprey)、青鳉(Oryzias latipes)、猕猴、刚毛棉花鼠(Sigmodon Hispidus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、河豚(Takifugu rubripres)、非洲爪蛙(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)。还优选的是非人灵长类动物，即不是人类的其他灵长类动物的所有物种，例如猕猴、黑猩猩、狒狒、狨猴和绿猴。然而，这些实施例并非旨在限制本发明的范围。无论如何，要指出的是，以下动物要被排除在外，这些动物不可能对人类或动物产生实质性的医学利益，因此根据相应的专利法或司法管辖不具有可专利性。此外，技术人员将采取适当的措施，例如如在国际动物福利准则中规定的，以确保对人或动物的实质性医疗利益将超过任何动物遭受的痛苦。
[0065] 最后，还考虑了本公开的光驱动的向内指向的质子泵的非治疗性或离体或体外用途。例如，本公开的光驱动的向内指向的质子泵可以有利地应(i)用于电可激发细胞的光刺激，(ii)用于逆质子浓度梯度地在膜上转运质子，(iii)用于酸化或碱化细胞、细胞室、囊泡或脂质体的内部，或(iv)或作为光遗传学工具。
[0066] 通过以下实施方式进一步说明本发明：
[0067] 1.一种用于医学用途的光驱动的向内指向的质子泵，其与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少59％序列相似性。
[0068] 2.用于实施方式1所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少65％，更优选至少70％，更优选至少71％，更优选至少72％，更优选至少73％，更优选至少74％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少77％，更优选至少78％，更优选至少79％，更优选至少80％，更优选至少
81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少
86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少
91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少
96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选99％序列相似性；和/或[0069] 其中所述光驱动的向内指向的质子泵与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少
38％，更优选至少45％，更优选至少48％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少
56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少
65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少
90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少
95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％序列同一性。
81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少
86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少
91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少
96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选99％序列相似性；和/或[0069] 其中所述光驱动的向内指向的质子泵与SEQ ID NO:1(NsXeR)的全长具有至少
38％，更优选至少45％，更优选至少48％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少
56％，更优选至少57％，更优选至少58％，更优选至少59％，更优选至少60％，更优选至少
65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少
90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少
95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％序列同一性。
[0070] 3.用于实施方式1或2所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵不在SEQ ID NO:1的以下位置处突变：E4、H48、S55、W73、D76、S80、A87、P209、C212、K214和D220。
[0071] 4.用于实施方式1-3中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵不在N-末端被截短。
[0072] 5.如实施方式1所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1(NsXeR)、2(HrvXeR1)、9(HrvXeR)、10(AlkXeR)、11(AlkXeR1)、12(AlkXeR2)、13(AlkXeR3)、14(AlkXeR4)和15(AlkXeR5)；特别是其中所述光驱动的向内指向的质子泵包含SEQ ID NO:1(NsXeR)的氨基酸序列。
[0073] 6.如实施方式1所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1(NsXeR)、2(HrvXeR1)、9(HrvXeR)、10(AlkXeR)、11(AlkXeR1)、12(AlkXeR2)、13(AlkXeR3)、14(AlkXeR4)和15(AlkXeR5)；特别是其中所述光驱动的向内指向的质子泵由SEQ ID NO:1(NsXeR)的氨基酸序列组成。
[0074] 7.用于实施方式1-6中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵在pH 6至pH 8之间有活性；优选在pH 5至pH 9之间。
[0075] 8.用于实施方式1-7中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵的最大吸收在560nm至580nm之间。
[0076] 9.用于实施方式1-8中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵的光周期小于50ms，优选小于45ms，更优选小于40ms，更优选小于35ms，甚至更优选小于30ms，诸如27ms，其是在如下条件下测量的：在显示100：2：3的DMPC：MSP1E3：光驱动的向内指向的质子泵的摩尔比的蛋白纳米盘中，在20℃和pH 7.5下，以532nm波长和3mJ/脉冲的能量提供5ns持续时间的脉冲。
[0077] 10.用于实施方式1-9中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵的转换率大于250s-1，优选大于300s-1，更优选大于370s-1，更优-1 -1 -1选大于380s ，更优选大于390s ，诸如转换率为400s ，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、
1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
[0078] 11.用于实施方式1-10中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，其中所述光驱动的向内指向的质子泵能够以大于40hz的频率，优选以大于50Hz的频率，更优选以大于60Hz的频率，甚至更优选大于70hz的频率，最优选大于80Hz的频率触发动作电位，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
[0079] 12.用于实施方式1-11中任一项所述用途的光驱动的向内指向的质子泵，所述光驱动的向内指向的质子泵能够用λ＝532nm且强度为23mW/mm2的3ms脉冲宽度触发，其是在以下条件下测量的：在大鼠海马神经元中，通过使用电阻为3-8MΩ的膜片吸管在全细胞模式下进行膜片钳测量，所述膜片吸管装有滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP，并且胞外溶液包含滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。
[0080] 13.一种核酸构建物，包含编码如实施方式1-12中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列经过密码子优化以在人细胞中表达，优选其中所述核苷酸序列具有如SEQ ID NO:16中所示的序列。
[0081] 14.一种表达载体，包含编码如实施方式1-12中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵的核苷酸序列或如实施方式13所述的核酸构建物，其中所述核苷酸序列经过优化以在人细胞中表达。
[0082] 15.如实施方式14所述的表达载体，其中所述载体是病毒载体。
[0083] 16.如实施方式14或15所述的表达载体，其中所述光驱动的向内指向的质子泵的编码序列处于神经元细胞特异性人启动子，优选人突触蛋白启动子的控制下。
[0084] 17.一种表达如实施方式1-12中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵的哺乳动物细胞，条件是所述哺乳动物细胞不是人胚胎细胞或能够修饰人类种系遗传特性的细胞。
[0085] 18.包含如实施方式13所述的核酸构建物或如实施方式14-16中任一项所述的表达载体的哺乳动物细胞。
[0086] 19.如实施方式17或18所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是：
[0087] i.海马细胞、光感受器细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜神经节细胞、双极神经元、神经节细胞、假单极神经元、多极神经元、锥体神经元、浦肯野细胞或颗粒细胞；或[0088] ii.神经母细胞瘤细胞，特别是NG108-15；HEK293细胞；COS细胞；BHK细胞；CHO细胞；骨髓瘤细胞；或MDCK细胞。
[0089] 20.一种脂质体，包含如实施方式1-12中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵。
[0090] 21.如实施方式13所述的核酸构建物、如实施方式14-16中任一项所述的表达载体、如实施方式17-19中任一项所述的哺乳动物细胞或如实施方式20所述的脂质体用于医学中的用途。
[0091] 22.如实施方式1-12中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵、如实施方式13所述的核酸构建物、如实施方式14-16中任一项所述的表达载体、如实施方式17-19中任一项所述的哺乳动物细胞或如实施方式20所述的脂质体用于恢复听觉活动、恢复视力或用于治疗或缓解碱中毒、神经损伤、脑损伤、癫痫发作或退行性神经病症如帕金森病和阿尔茨海默病的用途。
[0092] 23.一种非人哺乳动物，包含根据实施方式17-19中任一项所述的细胞，优选其中所述细胞是内源性细胞；条件是排除这些动物，其不太可能对人或动物产生超过任何动物所遭受的痛苦的实质性医学利益。
[0093] 24.如实施方式1-12中任一项所述的光驱动的向内指向的质子泵用于以下的非治疗性的，或离体的，或体外的用途：
[0094] (i)用于可电兴奋细胞的光刺激，
[0095] (ii)用于逆质子浓度梯度地在膜上转运质子，
[0096] (iii)用于酸化或碱化细胞、细胞室、囊泡或脂质体的内部，或
[0097] (iv)作为光遗传学工具。
附图说明
[0099] 图1：微生物视紫红质的序列比对。用Clustal Omega进行序列比对。螺旋区域标有“+”号，N末端和跨膜螺旋均被标注。基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体突出显示。
[0100] 序列的UniProtIDs说明。NsXeR(G0QG75)、HrvXeR1(H0AAK5)、ASR(Q8YSC4)、HsBR(P02945)、PR(Q9F7P4)、NpHR(P15647)、DeKR2(N0DKS8)、NpSR2(P42196)、HrvXeR(GHai et al.，同上)、AlkXeR(Vavourakis et al.，同上)、AlkXeRs1-5(Vavourakis et al.，同上)。
[0101] 图2：XeR的电学性质。a.在表达不同XeR的大肠杆菌细胞悬浮液中照射后的pH变化。图表示出了添加和不添加CCCP时的pH变化。b.在含有重构NsXeR的脂质体悬浮液(有和没有CCCP)中照射后的pH变化。c.在不同pH值下测得的在脂质体悬浮液中照射后的pH变化。
[0102] 图3：NsXeR的光谱表征。a.溶解在去污剂DDM中的异视紫红质家族的代表的吸收光谱。在图例中显示了相应的最大吸收位置。b.NsXeR(pH 7.5，T＝20℃)在三个特征波长378、408和564nm处的瞬态吸收变化。黑线是实验数据，浅灰线和深灰线表示使用五个指数(exponents)整体拟合的结果。测量了两种制剂的光周期：NsXER在纳米盘(浅灰色)和脂质体(深灰色)中。请注意，样品之间幅度的差异是由于脂质体中NsXeR的浓度比纳米盘中的浓度高大约两倍(见图4)。c.纳米盘中NsXeR光周期的建议模型。
[0103] 图4：NsXeR在纳米盘(ND，上排)和脂质体(LIP，下排)制剂(20℃，pH 7.5)中的光周期。通过对图3b中所示的快速光解数据进行全局多指数分析，可获得五个动力学上不同的蛋白质状态(红线)。每幅图包含未兴奋蛋白的对应光谱作为参考(P0，黑线)。根据指数的对应光谱计算出Pi＝1..5状态的光谱，并假定光周期的顺序不可逆模型，将其进一步转换为该状态的微分光谱。在面板之间描绘了反应的半衰期。循环分子的分数在ND中为12.5％，在LIP中为15％。
[0104] 图5：HEK293和NG108-15细胞中的光电流。从-100mV开始以20mV步长变化的膜电位下表达NsXeR的细胞中的光电流以及相应的I-V曲线。a.带有吸管溶液1和浸浴溶液1的HEK293。b.带有吸管溶液2和浸浴溶液2的NG108-15细胞(对照测量以确认质子负责向内指向的电流)。
[0105] 图6：不同光脉冲频率下的尖峰轨迹(spiking traces)。通过膜片钳实验以全细胞模式在当前钳位条件下研究了异源表达NsXeR的大鼠海马神经元。动作电位由指定频率的2
40个光脉冲触发。光脉冲的脉冲宽度为3ms，波长为λ＝532nm，强度为23mW/mm。
40个光脉冲触发。光脉冲的脉冲宽度为3ms，波长为λ＝532nm，强度为23mW/mm。
[0106] 图7：尖峰延迟(spike latency)的可变性。在不同神经元细胞中测量的示例性尖峰轨迹。光脉冲的脉冲宽度为A)3毫秒和B)10毫秒。通过膜片钳实验以全细胞模式在当前钳位条件下研究了异源表达NsXeR的大鼠海马神经元。峰值由波长为λ＝532nm，强度为23mW/mm2的光脉冲触发。
[0107] 图8：在指定的膜电位下在NG108细胞中测量的NsXeR的开关动力学。由Opolette 355在λ＝570nm的波长处产生了超短的纳秒光脉冲。相应的I-V曲线显示在右侧，绘制了峰值光电流对膜电位的图。
[0109] SEQ ID NO:1(NsXeR；UniProtID G0QG75，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0110]
[0111] SEQ ID NO:2(HrvXeR1；UniProtID H0AAK5，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0112]
[0113] SEQ ID NO:3(ASR；UniProtID Q8YSC4)
[0114]
[0115] SEQ ID NO:4(HsBR；UniPotID P02945)
[0116]
[0117] SEQ ID NO:5(PR；UniProtID:Q9F7P4)
[0118]
[0119] SEQ ID NO:6(NpHR；UniProtID P15647)
[0120]
[0121] SEQ ID NO:7(DeKR2；UniProtID N0DKS8)
[0122]
[0123] SEQ ID NO:8(NpSR2；UniProtID P42196)
[0124]
[0125] SEQ ID NO；9(HrvXeR，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0126]
[0127] SEQ ID NO:10(AlkXeR，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0128]
[0129] SEQ ID NO:11(AlkXeR1，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0130]
[0131] SEQ ID NO:12(AlkXeR2，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0132]
[0133] SEQ ID NO:13(AlkXeR3，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0134]
[0135] SEQ ID NO:14(AlkXeR4，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0136]
[0137] SEQ ID NO:15(AlkXeR5，N-末端螺旋以下划线示出；基序氨基酸和H48-D220质子受体对以粗体示出)
[0138]
[0139] SEQ ID NO:16(人密码子优化的NsXeR)
[0140]实施例
[0141] 实施例1–异视紫红质的表征
[0142] 大肠杆菌悬浮液中的pH变化
[0143] NsXeR(Uniprot ID G0QG75)、HrvXeR(GHai、R.et al.Sci.Rep.1,(2011))和AlkXeR(Vavourakis,C.D.et al.Front.Microbiol.7,(2016))、编码DNA均商业合成TM(Eurofins)。使用GeneOptimizer 软件(Life TecHnologies,USA)优化核苷酸序列以用于大肠杆菌表达。将该基因与5'核糖体结合位点以及编码其他LEHHHHHH*标签的3'延伸片段一起通过XbaI和BamHI限制性酶切位点引入pET15b表达载体(Novagen)中。
[0144] 如先前所述加以改进地表达带有修饰的蛋白质(Gushchin,I.et al.Crystal structure of a light-driven sodium pump.Nat.Struct.Mol.Biol.22,390–395(2015)；通过引入以其整体并入本文)。用表达质粒转化菌株C41(DE3)(Lucigen)的大肠杆菌细胞。
转化细胞于37℃在振荡的带挡板烧瓶(shaking baffled flasks)中在包含100mg/L阿莫西林的自诱导培养基ZYP-5052(Studier,F.W.Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.Protein Expr.Purif.41,207–234(2005)；通过引用以其整体并入本文)中生长，并在0.6-0.7的光密度OD600下用1mM异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导和补充有10μM全反式视黄醛。在诱导后三小时，通过以3,000g离心10分钟收集细胞，并用无缓冲的盐溶液(100mM NaCl和10mM MgCl2)清洗3次，每次清洗之间间隔
30分钟以使细胞内部的离子与主体交换。之后，将细胞重悬于100mM NaCl溶液中，并调节至
8.5的OD600。在保持在于1℃的3ml等分搅拌细胞悬浮液中进行测量。用卤素灯(Intralux
5000-1,VOLPI)照射细胞5分钟，并用pH计(LAB850,ScHott Instruments)监测光诱导的pH变化。
转化细胞于37℃在振荡的带挡板烧瓶(shaking baffled flasks)中在包含100mg/L阿莫西林的自诱导培养基ZYP-5052(Studier,F.W.Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.Protein Expr.Purif.41,207–234(2005)；通过引用以其整体并入本文)中生长，并在0.6-0.7的光密度OD600下用1mM异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导和补充有10μM全反式视黄醛。在诱导后三小时，通过以3,000g离心10分钟收集细胞，并用无缓冲的盐溶液(100mM NaCl和10mM MgCl2)清洗3次，每次清洗之间间隔
30分钟以使细胞内部的离子与主体交换。之后，将细胞重悬于100mM NaCl溶液中，并调节至
8.5的OD600。在保持在于1℃的3ml等分搅拌细胞悬浮液中进行测量。用卤素灯(Intralux
5000-1,VOLPI)照射细胞5分钟，并用pH计(LAB850,ScHott Instruments)监测光诱导的pH变化。
[0145] 细胞悬浮液的pH在光照后增加，并且在关闭光照后降低(图2a)。在添加30μm羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)后，在相同条件下重复进行时，pH变化的影响完全消失。先前使用其他质子泵(如细菌视紫红质(BR))进行的类似实验在照射细胞后产生了相反的pH行为(数据未示出)。在本工作中研究的异视紫红质家族的另外两个成员HrvXeR和AlkXeR给出了与NsXeR相同的结果(图2a)。因此，pH实验提供了证据，表明纳米嗜盐古菌视紫红质是向内指向的质子泵。
[0146] 脂质体悬浮液的pH变化
[0147] 如上所述表达蛋白质。然而，在诱导后三小时，通过在3,000g下离心30分钟来收集细胞。在M-110P Lab均质机(microfluidics,USA)中，在25,000psi下，在含有20mM Tris-HCl pH 8.0、5％甘油、0.5％Triton X-100(Sigma-AldricH,USA)和50mg/L DNA酶I(Sigma-Aldrich,USA)的缓冲液中，破坏收集的细胞。通过于4℃以90,000g超速离心1小时来分离细胞裂解物的膜级分。将团粒重悬在含有50mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 8.0、0.1M NaCl和1％DDM的缓冲液(Anatrace,Affymetrixm,USA)中，并搅拌过夜以溶解。通过于4℃以90,000g超速离心1小时去除不溶级分。将上清液装载到Ni-NTA柱(Qiagen,Germany)上，并将异视紫红质在含50mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7.5、0.1M NaCl、0.3M咪唑和0.2％DDM的缓冲液中洗脱。将洗脱液用100体积的50mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7.5、0.1M NaCl缓冲液中进行两次为期两小时的透析以去除咪唑。
[0148] 如先前所述将纯化的NSXeR在大豆脂质体中重构(Huang,K.S.,Bayley,H.&Khorana,H.G.Delipidation of bacteriorhodopsin and reconstitution with exogenous phospholipid.Proc.Natl.Acad.Sci.77,323–327(1980)；通过引用并入本文)。简言之，将磷脂(来自大豆的大豆磷脂，Sigma-AldricH)溶解在CHCl3(超纯氯仿，ApplicHem Panreac)中，并在N2流下在玻璃小瓶中干燥。用真空泵除去残留溶剂过夜。将干燥的脂质重悬于补充有2％(w/v)胆酸钠的0.15M NaCl中，终浓度为1％(w/v)。通过于4℃超声处理使混合物澄清，并以7:100(w/w)的蛋白质/脂质比添加异视紫红质。通过与吸附洗涤剂的珠粒(Amberlite XAD 2,Supelco)一起搅拌过夜来去除洗涤剂。将混合物于4℃用0.15M NaCl(调节至所需pH)透析1天(四次200毫升变化)以获得一定的pH。
[0149] 在0℃对2ml搅拌的蛋白脂质体悬浮液进行测量。用卤素灯(Intralux 5000-1，VOLPI)将蛋白脂质体照射18分钟，然后避光放置18分钟。用pH计(LAB 850,ScHott Instruments)监测pH变化。在相同条件下，在40uM CCCP的存在下，针对不同的起始pH重复测量。
[0150] 照射后的pH变化表明膜外的溶液被酸化(图2b)。当将CCCP添加到悬浮液中时，这些pH变化消失。由于在类似的实验中，所有已知的向外定向的质子泵(如BR和PR)都显示出相反的pH行为(Racker,E.&Stoeckenius,W.Reconstitution of purple membrane vesicles catalyzing light-driven proton uptake and adenosine triphosphate formation.J.Biol.Chem.249,662–663(1974))，我们得出的结论是NsXeR是真正的向内指向的质子泵。有趣的是，在很宽的pH值范围(pH值为5至9)之间，我们的实验仍显示出质子向内泵送(图2c)。
[0151] 吸收光谱和光周期
[0152] 在这里，我们报告2个数据集的分析结果：XeR蛋白在纳米盘和脂质体中重构。使用标准方案组装蛋白纳米盘(Ritchie,T.K.et al.in Methods in Enzymology(ed.Düzgünes,N.)464,211–231(Academic Press,2009)；通过引用并入本文)。使用1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DMPC(Avanti Polar Lipids,USA)作为脂质。使用了拉长的msP1E3版本的载脂蛋白-1。组装期间的摩尔比为DMPC：MSP1E3：NsXeR＝100：2：3。如上所述制备脂质体。
[0153] 使用Shimadzu UV-2401PC分光光度计记录吸收光谱。激光闪光光解设置类似于CHizHov及其同事所描述的那些(Chizhov,I.et al.Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle.Biophys.J.71,2329–2345(1996)；通过引用并入本文)。激发/检测系统的组成如下：使用Surelite II-10Nd：YAG激光(Continuum Inc,USA)，以532nm波长和3mJ/脉冲的能量提供5ns持续时间的脉冲。将样品(5x5毫米光谱石英比色皿(Hellma GmbH&Co,Germany))放置在两个准直且机械耦合的单色仪(1/8m model 77250,Oriel Corp.,USA)之间的恒温室内。探测灯(75W氙弧灯,Osram,Germany)通过第一个单色仪，样品，并在第二个单色仪之后到达PMT检测器(R3896,Hamamatzu,Japan)。PMT的电流-电压转换器测定测量系统的时间分辨率为约50ns(以5ns激光脉冲的表观脉冲宽度测量)。使用两个数字示波器(LeCroy 9361和9400A，每个通道分别具有25和32KB的缓冲存储器)记录两个重叠时间窗口中瞬态转运变化的轨迹。每个数据点的最大数字化速率为10ns。从激光脉冲后10ns记录瞬态吸收变化，直到光转化完全完成为止。在每个波长处，对25个激光脉冲进行平均以提高信噪比。准对数数据压缩将每条迹线的初始数据点数量(约50000个)减少到均匀分布在对数时间范围内的约600个点，给出每十个时间点约100个点。使用计算机控制的步进电机，波长以2nm的步长从300nm变化到730nm(总共216个光谱点)。在每个实验之前和之后，在标准分光光度计(Beckman DU-800)上测量样品的吸收光谱。
[0154] 使用全局多指数非线性最小二乘拟合程序MEXFIT(Gordeliy,V.I.et al.Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II–transducer complex.Nature 419,484–487(2002)；通过引用并入本文)对每个数据集进行独立分析。增加指数分量的数量，直到加权残差的标准偏差不再进一步改善为止。在建立表观速率常数并将其分配给一系列弛豫过程的内部不可逆转变之后，将指数的振幅光谱转换为相对于最终状态光谱的相应中间体的差异光谱。随后，通过将除以转化分子的分数的差异光谱添加到最终态光谱来测定态的绝对吸收光谱。确定分数值的标准是不存在负吸光度以及从初始状态到最终状态的计算光谱的贡献。有关方法的更多详细信息，请参见(Chizhov,I.et al.Biophys.J.71,2329–2345(1996))。
[0155] 溶解形式的NsXeR的最大吸收为565nM(图3a)。当缓冲液的pH在4.5至9.0之间变化时，其位置不会移动。NsXeR不显示明暗适应。同源物AlkXeR是红移的变体，其最大吸收为577nM(图3a)。显示了NsXeR(pH 7.5，T＝20℃)在三种特征波长378、408和564nm处的瞬态吸收变化，其中NsXeR以两种不同方式制备：纳米盘(浅灰色)，和单脂质囊泡(深灰色)(图3b)。
使用5个指数的整体拟合结果如图4所示。NsXeR在纳米盘中的光周期(27毫秒)比脂质小泡中的光周期(50毫秒)更快。NsXeR在纳米盘中的光周期如图3c所示。
使用5个指数的整体拟合结果如图4所示。NsXeR在纳米盘中的光周期(27毫秒)比脂质小泡中的光周期(50毫秒)更快。NsXeR在纳米盘中的光周期如图3c所示。
[0156] NsXeR的光周期包含一个微秒部分，通常将其归属于释放出荷能离子(在我们的情况下为H+)以及毫秒部分的离子驰豫和再吸收的多步反应。
[0157] 然而，NsXeR光周期揭示了一些独特的特征，据我们所知，在以前的视黄醛蛋白研究中从未报道过这些特征(图4)。在光周期的微秒部分(P1，P2，P3)(其包括具有K和L-样广谱位移的典型中间体(intermediates)(P1，λmax＝570nm，P2，λmax＝530nm)之后，在毫秒时域我们得到了两个光谱和动力学上不同的M中间体(P4和P5)。第一个M型(P4)具有特征性的三波段吸收光谱，在360、378和398nm处具有最大值。这种状态在纳米盘中的半衰期为2毫秒(在脂质囊泡中为3毫秒)，其转换为状态P5，其在392nm处有单个最大值。两种中间体均应对应于视黄醛席夫碱的去质子化状态。有趣的是，状态P4具有与以前报道11的细菌视紫红质(BR)中逆向视黄醛(retro-retinal)的光谱相同的光谱特征。这种形式的视黄醛的特征在于主链碳C14从CH转化为CH2形式，同时C14＝C13双键变为单键，并且沿视黄醛的π电子共轭的改变。据报道，BR的逆向视黄醛形式是通过样品的深紫外线照射和(或)添加至盐酸溶液而获得的。该retro-BR不显示光活性。另一方面，在视黄醛的激发态中，π电子共轭的改变可能导致去质子化状态下的相似光谱特征，而C14上的共价键没有变化。提出了在光激发时沿视黄醛的电荷分离和伴随的π电子共轭改变的孤子机制(Chernavskii,D.S.An alternative model of the bacteriorhodopsin action and unusual properties of the K-610-intermediate.Biofizika(1994)，并在理论上得到进一步证实(Buda,F.,de Groot,H.J .M .&Bifone ,A .Charge Localization and Dynamics in Rhodopsin.Phys.Rev.Lett.77,4474–4477(1996))。也许，我们正在观察提出的机制的第一个实验证据。有趣的是，与其他视黄醛质子泵(BR、pSRII、PR)相反，我们在再质子化路径上看不到任何其他中间体(N或O样)。MII(P5)状态直接以27毫秒(在脂质囊泡中为50毫秒)的半衰期直接转换为NsXeR的基态。
[0158] 实施例2–NsXeR的表征
[0159] 如实施例1中所述制备和纯化NsXeR蛋白。最后将蛋白浓缩至70mg/ml以结晶。NsXeR晶体以介观方式(meso approach)生长(Landau,E.M.&Rosenbusch,J.P.Lipidic cubic phases:A novel concept for the crystallization of membrane proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.93,14532–14535(1996)；and Caffrey,M.&Cherezov,V.Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.Nat.Protoc.4,706–
731(2009)；每篇均通过引用并入本文)，类似于先前的工作中所使用的(Gordeliy,V.I.et al.Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II–transducer complex.Nature 419,484–487(2002)；其通过引用并入)。将结晶缓冲液中的溶解蛋白与在47℃预熔的十一碳烯酸甘油二酯(Nu-CHek Prep)混合以形成脂质中间相(mesophase)。将100nl蛋白质-中间相混合物的等分试样点在96孔LCP玻璃夹心板(Marienfeld)上，并通过NT8结晶机器人(Formulatrix)用600nL沉淀剂溶液覆盖。用20mg/ml的蛋白质浓度和2.0M的丙二酸钠pH 8.0(Hampton ResearcH)可获得最佳晶体。晶体在22℃下生长，并在1-4周内出现。
731(2009)；每篇均通过引用并入本文)，类似于先前的工作中所使用的(Gordeliy,V.I.et al.Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II–transducer complex.Nature 419,484–487(2002)；其通过引用并入)。将结晶缓冲液中的溶解蛋白与在47℃预熔的十一碳烯酸甘油二酯(Nu-CHek Prep)混合以形成脂质中间相(mesophase)。将100nl蛋白质-中间相混合物的等分试样点在96孔LCP玻璃夹心板(Marienfeld)上，并通过NT8结晶机器人(Formulatrix)用600nL沉淀剂溶液覆盖。用20mg/ml的蛋白质浓度和2.0M的丙二酸钠pH 8.0(Hampton ResearcH)可获得最佳晶体。晶体在22℃下生长，并在1-4周内出现。
[0160] 使用PILATUS 6M检测器，于100K在ESRF的ID23-1光束线上收集X射线衍射数据(波长0.969和 )。衍射图像用XDS处理(Kabsch,W.XDS.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.66,125–132(2010)；通过引用并入本文)。反射强度使用来自CCP4套件的SCALA调节(Winn,M.D.et al.Overview of the CCP 4suite and current developments.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.67,235–242(2011)；通过引用并入)。下表显示了晶体学数据的收集和精化(refinement)统计数据。
[0161]
[0162]
[0163] 将结构精化至分辨率 选择分子置换的参考模型(古生菌视紫红质-2，PDB 2EI4)，带有MoRDa管道(Vagin,A.&Lebedev,A.MoRDa,an automatic molecular replacement pipeline.Acta Crystallogr.Sect.Found.Adv.71,s19–s19(2015)；以引用方式并入)。通过使用自动构建(Autobuild)的自动化模型构建和重建(Automated Model Building and Rebuilding)在P212121空间组中成功获得了初始相(Adams,P.D.et al.PHENIX:a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.66,213–221(2010)；通过引用并入)。
使用REFMAC5(Murshudov,G.N.et al.REFMAC 5for the refinement of macromolecular crystal structures.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.67,355–367(2011)；通过引用并入)，PHENIX和Coot(Emsley,P.&Cowtan,K.Coot:model-building tools for molecular graphics.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60,2126–2132(2004)；通过引用并入)反复精化初始模型。
使用REFMAC5(Murshudov,G.N.et al.REFMAC 5for the refinement of macromolecular crystal structures.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.67,355–367(2011)；通过引用并入)，PHENIX和Coot(Emsley,P.&Cowtan,K.Coot:model-building tools for molecular graphics.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60,2126–2132(2004)；通过引用并入)反复精化初始模型。
[0164] P212121空间组晶体在不对称单元中包含一个NsXeR三聚体。环CD中残基95-97，环EF中残基154-156的位置无法解析。
[0165] 光驱动的向内质子泵XeR具有七次跨膜α螺旋(A-G)和通过席夫碱共价结合到213赖氨酸的辅因子视黄醛。螺旋A之前是一个小的N末端α-螺旋，该小的N末端α-螺旋在胞外侧封端蛋白质。
[0166] 与BR结构(PDB 1C3W)的比较表明，螺旋的定位和形式存在很大差异，A和G螺旋明显扭曲，可能是由于这些螺旋中存在脯氨酸所致。异视紫红质具有保守的残基Pro-209(在NsXeR中的位置)，其位于BR中的Asp212的位置。我们的实验表明，用Asp替代它会使蛋白质不稳定。如果更改为甘氨酸，则泵送活性急剧下降(请参见下表)。因此，Pro209对于质子泵至关重要。
[0167]
[0168]
[0169] 质子摄入区和活性中心
[0170] 视黄醛是13-顺式构象。但是，由于分辨率不足，我们无法区分它是15-syn还是15-anti构象。NsXeR有一个大的质子吸收腔，其通过蛋白质胞外部分上的N-末端极短螺旋与主体隔开。我们建议腔中充满水分子。假定的质子供体Asp76可以从该腔中获得。Asp76突变为Glu、Ser、THr和Asn不能使蛋白质正确折叠(突变体未着色，请参见上表)。这证明这些氨基酸不仅具有功能，而且具有重要的结构作用。Ser55位于Asp76附近，可以稳定此残基。用丙氨酸(BR中的Ala53)取代Ser55也破坏了蛋白质折叠。
[0171] 残基来自N末端螺旋的残基Tyr3和残基Trp73，后者是高度保守的氨基酸Arg82(在BR中的位置)的类似物，可将质子摄取腔与蛋白质胞外部分的主体分开，从而使质子可以通过螺旋A和B与BC环之间的空间进入蛋白质。用Arg取代Trp73对于蛋白质折叠是致命的(W73R突变体未着色)。W73A突变体与视黄醛结合，具有野生型蛋白的颜色，但显示没有泵送活性，这意味着该残基对于质子转移至关重要。
[0172] 质子释放区
[0173] NsXeR与其他已知的微生物视黄醛质子泵的另一个主要区别是，它在BR中与Asp96(在NsXeR中为Ala71)等效的位置没有带电荷的氨基酸。但是，通过氢键连接的残基His48(在基态时距离席夫碱 )和Asp220 位于靠近预期的质子受体位置。用Asn替代Asp220会完全摧毁质子泵送。
[0174] His48是不在其他抑制微生物视紫红质中类似位置处存在的独特残基。我们的实验表明，用任何其他氨基酸取代组氨酸48都会破坏蛋白质结构(所有突变体均未着色)，这表明其在蛋白质结构中的关键作用。我们认为His48-Asp220对是质子受体，并且质子化由席夫碱通过His48残基进行，更确切地说，通过His48-Asp220对。值得注意的是，它与蛋白视紫红质中的质子受体对完全相同。但是，与XeR相反，它被放置在靠近席夫碱的蛋白质胞外部分，并作为席夫碱质子受体，其可通过大的质子释放腔从主体进入，因此很容易进一步释放质子沿着质子梯度直接前进到主体。因此，NsXeR中一组独特且不寻常的关键残基导致向内指向的质子泵送。
[0175] 向内质子运输的推定机制
[0176] 突变氨基酸的结构和实验提供了向内指向的质子运输的机理的见解。在照射后，视黄醛异构化并且被疏水环境包围的席夫碱去质子化，并且质子转移到去质子化的His48-Asp220对。它在MI和MII中间体状态下发生，因为两种中间体都对应于视黄醛席夫碱的去质子化状态。确实，众所周知，Asp-His相互作用通过稳定其去质子化状态而大大降低了Asp的pKa。上面提到的突变的Asp和His的实验支持了Asp-His对在质子转移中的关键作用。我们认为在视黄醛重新异构化后，连接到亲水腔(“质子释放腔”)的质子化的Asp-His对将质子直接释放到细胞质中。在视黄醛异构化之后，Asp76通过亲水腔质子化。视黄醛的再异构化还导致D76的席夫碱再质子化。
[0177] 实施例3-光遗传学意义
[0178] 人类胚胎肾脏(HEK)和神经母细胞瘤神经胶质瘤(NG)细胞的实验
[0179] 人密码子优化的NsXeR基因是商业合成的(Eurofins)。将该基因克隆到pcDNA3.1(-)载体中，所述载体带有额外的膜运输信号(Gradinaru,V.et al.Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics.Cell 141,154–165(2010)；通过引用并入)、P2A自裂解肽(Kuzmich,A.I.,Vvedenskii,A.V.,Kopantzev,E.P.&Vinogradova,T.V.Quantitative comparison of gene co-expression in a bicistronic vector harboring IRES or coding sequence of porcine teschovirus
2A peptide.Russ.J.Bioorganic Chem.39,406–416(2013)；通过引用并入)和C端的GFP变体(Shcherbo,D.et al.Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging.Nat.Methods 4,741–746(2007)；通过引用并入)。在CMV启动子作用下克隆基因。
通过测序验证序列。
2A peptide.Russ.J.Bioorganic Chem.39,406–416(2013)；通过引用并入)和C端的GFP变体(Shcherbo,D.et al.Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging.Nat.Methods 4,741–746(2007)；通过引用并入)。在CMV启动子作用下克隆基因。
通过测序验证序列。
[0180] 根据生产商的方法(THermoFisHer Scientific,USA)，用质粒和Lipofectamine LTX转染融合度为80％的HEK293和NG108-15细胞。在测量之前，将细胞在5％CO2下于37℃温育两天。
[0181] 为了对NsXeR进行电生理学表征，进行了全细胞膜片钳记录(AxopatcH 200B接口，Axon Instruments)。用薄壁硼硅玻璃(GB150F-8P)在水平拉拔器(Model P-1000,Sutter Instruments)上制备电阻为2-5M的膜片吸管。对于在HEK293细胞中进行实验，吸管溶液包含110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH 7.4(吸管溶液1)，且浸浴溶液包含140mM NaCl、2mM MgCl2、10mM HEPES，pH 7.4(浸浴溶液1)。对于在NG108-15细胞中进行的实验，吸管溶液包含110mM Na2SO4、4mM MgSO4、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4(含H2SO4)(吸管溶液2)，且浸浴溶液包含140mM N-甲基-D-葡糖胺、4mM MgSO4、10mM HEPES，pH7.4(含H2SO4)(浸浴溶液2)。
[0182] 使用聚焦在400μm光纤中的二极管泵浦固态激光(λ＝532nm)，测量响应于饱和强度为23mW/mm2的光脉冲的光电流。光脉冲由快速计算机控制的快门(Uniblitz LS6ZM2,Vincent Associates)施加。通过Opolette 355可调激光系统(OPTOPRIM)产生超短的纳秒级光脉冲。为了测量作用光谱，将不同波长的脉冲能量设置为与1019光子/m2的相等光子计数相对应的值。此外，还测量了膜电位在–100mV至+60mV范围内的光电流-电压关系(开/关动力学除外，其中膜电位在–80mV至+80mV范围内)。
[0183] 图5a显示了HEK293细胞中由NsXeR产生的光电流。在–60mV的施加电压下，典型的光电流值在40至150pA之间变化，而标准化为细胞电容(即尺寸)的电流约为1-2pA/pF。在NG108-15细胞中进行了另一个对照实验。为了排除Cl-离子的转运(这可能解释了明显的“向内”电流)，将缓冲液中的氯化物盐替换为硫酸盐。为了排除单价离子转运至细胞，我们用大的N-甲基-D-葡萄糖胺代替了浸浴溶液中的Na+。溶液的pH是对称的(pH 7.4)。但是，在该实验配置中记录了类似的光电流(图5b)，这使我们确信质子的转运是造成这种效应的原因。因此，用HEK和NG细胞进行的实验也证实了NsXeR是一种向内指向的泵，并显示了NsXeR能够在照射细胞后产生通过质膜的大量电流。
[0184] 大鼠海马神经元的光触发尖峰
[0185] 我们通过腺相关病毒介导的基因转移在大鼠海马神经元中异源表达NsXeR。从出生后的P1 Sprague-Dawley大鼠中分离出海马，并在37℃用木瓜蛋白酶(20U ml-1)处理20分钟。用补充有10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen/Gibco，高葡萄糖)清洗海马，并在少量该溶液中滴定。将约96,000细胞铺板在24孔板中的聚D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上。3小时后，用培养基(含有2％B-27补充物和2mM Glutamax-1的神经基础培养基A)代替接种培养基。
[0186] 使用具有人突触蛋白启动子的pAAV2载体制备rAAV2/1病毒，所述人突触蛋白启动子包含NsXeR的人源化DNA序列、其C端与Kir2.1膜运输信号融合、P2A自切割肽和GFP变体。简单地，在铺板后4-9天将5×109基因组拷贝/ml(AGC/ml)的rAAV2/1病毒添加到每个孔中。
在转导后19-23天进行电生理记录。
在转导后19-23天进行电生理记录。
[0187] 为了进行电生理学表征，我们在当前钳位条件下进行了全细胞膜片钳实验。简言之，用滴定至pH 7.3的129mM葡糖酸钾、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATP和0.3mM Na3GTP填充电阻为3-8MΩ的膜片吸管。胞外溶液含有滴定至pH 7.3的125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、30mM葡萄糖和25mM HEPES。电生理信号在10kHz处滤波，用Axon Digidata 1322A(50kHz)数字化，并使用pClamp9软件(Axon Instruments)采集和分析。
[0188] NsXeR介导的、光触发的向内质子转运导致膜电位的去极化。因此，在大鼠海马神经元中出现光触发的尖峰是可能的(图6)。NsXeR实现了快速的神经光刺激，激发成功率为100％，高达40Hz的频率。由于大多数大鼠海马神经元的最大激发频率为40-60Hz(Gunaydin,L.A.et al.Ultrafast optogenetic control.Nat.Neurosci.13,387–392(2010))，较高刺激频率下的尖峰失败(spike failures)可以用大鼠海马神经元的固有特性来解释。
[0189] 一个重要的观察结果是，仅用3ms的脉冲宽度即可实现光触发的尖峰(图7a)，这大约相当于泵的转换(turnover)时间(图8)。因此，由于每个NsXeR转运单个质子而引起的去极化程度足以成功触发动作电位。但是，观察到了尖峰延迟的变化(图7)，在某些情况下，对于光触发的尖峰来说，需要更长的脉冲宽度(图7b)。较长的尖峰延迟可以用这些神经元中较低的NsXeR表达来解释。
[0190] 实施例4–听觉通道的光遗传学刺激
[0191] Hernandez et al.J Clin Invest.124,1114-1129(2014)(通过引用并入本文)证实了啮齿类动物的听觉途径的光遗传刺激的策略。特别是，作者描述了表征光遗传学刺激的动物模型，这是经过基因工程改造以表达光门控离子通道的通道视紫红质-2(ChR2)的神经元的光刺激。螺旋神经节神经元(SGNs)的光遗传学刺激激活了听觉通路，正如单个神经元和神经元群体反应的记录所证明的。此外，SGN的光遗传学刺激可恢复失聪小鼠的听觉活性。通过记录响应于阈上的光、声和电刺激的下丘脑中的局部场电位(LFP)进行的耳蜗兴奋的空间传播的估算表明光遗传刺激比单极电刺激实现了更好的频率分辨率。
[0192] 将本公开的可光诱导的向内质子泵(如NsXeR)的编码序列引入到，例如，如Hernandez等人所述的构建体中，代表了常规做法。
[0193] 实施例5–视觉恢复的光遗传学方法
[0194] Macéet al.Mol Ther.23,7-16(2015)(通过引用并入本文)描述了由腺相关病毒(AAV)基因疗法介导的视网膜神经元的光遗传学再活化。大多数遗传的视网膜营养不良显示进行性光感受器细胞变性，其导致严重的视觉障碍。腺相关病毒(AAV)基因治疗介导的视网膜神经元的光遗传学再激活具有恢复视力的潜力，无论患者特异性突变如何。临床可翻译性的挑战是在对脆弱的退化视网膜使用外科手术安全的递送途径的同时，恢复尽可能接近自然视力的视力。为了保持内部视网膜的视觉加工，靶向在疾病晚期仍然存在的ON双极性细胞。为了安全地递送基因，使用了最近工程化的AAV变体，在将变体在注入眼睛中易接近的玻璃体液后，其可用于转导双极细胞。显示在玻璃体内给药后，在ON双极细胞特异性启动子下编码通道视紫红质的AAV介导了限于ON双极细胞的长期基因传递。通道视紫红质在ON双极性细胞中的表达导致视网膜和皮层水平上ON和OFF反应的恢复。此外，光诱导的运动行为在所治疗的失明小鼠中得以恢复。
[0195] 将本公开的光诱导的向内质子泵(例如NsXeR)的编码序列引入到，例如，如Macé等人所述的构建体中，代表了常规做法。本公开的新型光诱导的向内质子泵被插入盒中以激活ON双极细胞以及视网膜中的神经节细胞。
[0196] 参考文件列表
[0197] Oesterhelt,D.&Stoeckenius,W.Rhodopsin-like Protein from the Purple Membrane of Halobacterium halobium.Nature 233,149–152(1971).
[0198] Ernst,O.P.et al.Microbial and Animal Rhodopsins:Structures,Functions,and Molecular Mechanisms.Chem.Rev.114,126–163(2014).
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