治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物
阅读：544发布：2024-02-11
专利汇可以提供治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且通过施用有效剂量的药物抑制主体中补体成分以 治疗 补体－介导的眼部失调的方法，其中选择的实施方案中，所述的药物是一种抗－补体适体，优选实施方案中，是一种抗－C5适体。，下面是治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物专利的具体信息内容。
1. 一种治疗，稳定和/或者预防一种补体介导的眼部疾病的方法，这种方法包括给所需病人施用一种抗-补体适体的治疗有效剂量的步骤。
2. 根据权利要求1的方法，其中被治疗的眼部疾病是一种眼部 f斤生血管疾病。
3. 根据权利要求1的方法，其中被治疗的眼部疾病是黄斑变性。
4. 根据权利要求1的方法，其中被治疗的眼部疾病是糖尿病4见 网月莫病变。
5. 才艮据权利要求1的方法，其中被治疗的补体介导的眼部疾病 是年龄相关性黄斑变性。
6. 才艮据权利要求l的方法，其中被治疗的补体介导的眼部疾病 是从由炎症性结膜炎，包括过敏性巨乳头性结膜炎，黄斑水 肿，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃烂，干眼症，青光 眼，^唐尿病一见网月莫病，角膜移才直排斥，眼部手术相关的并发 症，如人工晶体才直入术和白内障手术相关的炎症，Behcet's 疾病，眼底黄色斑点症，免疫复合月永管炎，Fuch's疾病，小 柳原田病，亚一见网膜纤维化，角膜炎，玻璃体-一见网膜炎， 眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞病毒一见网月莫 炎，脉络膜炎组成的组中选4奪的。
7. 稳定4卜体介导的眼部新生血管疾病的方法包括:纟会所需病人 施用充足剂量的一种抗-补体适体来稳定补体介导的眼部 #斤生血管疾病。
8. 才艮据权利要求7的方法，其中用于稳定眼部新生血管的疾病 是黄斑变性。
9. 根据权利要求7的方法，其中被稳定的眼部新生血管疾病是 #唐尿病3见网"莫病变。
10. 根据权利要求7的方法，其中被稳定的黄斑变性是年龄相关 性黄斑变性。
11. 根据权利要求7的方法，其中被稳定的黄斑变性是渗出型A MD。
12. 根据权利要求7, 8, 9， 10或者11中任意一种的方法，其 中施用有效剂量的抗-补体适体以维持主体中至少与施用 抗-补体适体的主体的视觉精度相同的视觉精度。
13. 根据权利要求7， 8, 9, 10， 11或者12中任意一种的方法， 其中施用有效剂量的抗-补体适体以维持主体中至少与施 用抗-补体适体的主体相同的视网膜血管密度。
14. 治疗补体介导的眼部新生血管失调的方法，包括给所需病人 施用充足剂量的一种抗-补体适体来稳、定补体_介导的眼 部新生血管失调。
15. 4艮据冲又利要求14的方法，其中治疗的眼部新生血管的失调 是黄斑变性。
16. 根据权利要求15的方法，其中治疗的黄斑变性是年龄相关 性黄扭王变寸生。
17. 根据权利要求14的方法，其中治疗的黄斑变性是渗出性年 龄相关性黄斑变性。
18. 才艮据外又利要求14的方法，其中治疗的眼部新生血管的失调 是糖尿病3见网膜病变。
19. 才艮据沐又利要求14, 15， 16, 17或者18中l壬意一种的方法， 其中施用有效剂量的抗-补体适体以4吏主体的一见觉4青度与 施用抗-补体适体的主体的3见觉姊青度相比有所冲是高。
20. 才艮据权利要求14, 15， 16, 17， 18或者19中任意一种的方 法，其中施用有效剂量的抗-补体适体以使主体的^L网膜血 管密度与施用抗-补体适体的主体视网膜血管密度相比有 所减少。
21. 治疗临床补体介导的眼部新生血管失调的方法，包括「纟会所需 病人施用充足剂量的一种抗-补体适体来预防补体-介导 的眼部#斤生血管失调的临床症^!犬。
22. 根据权利要求21的方法，其中预防的眼部新生血管失调症 状是黄斑变性症状。
23. 才艮据权利要求22的方法，其中预防的黄斑变性症状是年龄 相关性黄斑变性症状。
24. 根据权利要求23的方法，其中预防的黄斑变性症状是渗出 性年龄相关性黄斑变性症状。
25. #4居4又利要求21的方法，其中预防的眼部新生血管的失调 症状是并唐尿病#见网力莫病变症状。
26. 才艮才居4又利要,，21， 22， 23， 24， 25或26中4壬意一种的方、法， 进一步包括鉴定主体是否处于临床补体-介导的眼部新生 血管失调的危险的步骤。
27. 根据权利要求26的方法，其中鉴定步骤包括测定主体中玻 璃体疣的存在并测定一见觉##度无临床损失。
28. 根据权利要求26的方法，进一步包括测定主体中相对于野 生型补体因子H的补体因子H变体，鉴定处于危险的主体。
29. 才艮才居一又矛J要,，21, 22, 23, 24, 25, 26, 27或28中4壬意一 种的方法，其中施用有效剂量的抗-补体适体以预防与施用 抗-补体适体的主体纟见觉^青度相比的主体纟见觉^青度的损失。
30. 才艮才居斗又利要,泉21， 22， 23, 24， 25, 26， 27或28中4壬意一 种的方法，其中施用有效剂量的抗-补体适体以预防与施用 抗-补体适体的主体的^见网力莫血管密度相比的主体^见网月莫血管密度的充分升高。
31. 前述的权利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体是一径成分和非-酶补体途径成分。
32. 前述的权利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体是一 种抑制补体目标的适体，其中补体目标是一种膜攻击途径成分。
33.前述的权利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体是一 途径成分，选择性补体途径成分，血凝素途径成分。
34. 前述的权利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体是一 种与从包括以下的组中选择的补体成分目标结合并抑制的 适体：Cl, Clq， Clr, Cls， C2， C3, C3a, C3a受体，C4, C5, C5a, C5a受体，C5b， C6， C7, C8， C9,因子B,因 子D,备解素，甘露糖结合血凝素（MBL)， MBL相关丝氨 酸蛋白酶1和MBL相关丝氨酸蛋白酶2。
35. 才艮据前述的权利要求中任意一种的方法，其中补体成分目标 是一种人类目标蛋白。
36. 根据前述的权利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体 是一种抑制C5的适体。
37. 根据前述的权利要求中任意一种的方法，其中C5结合适体 是从包括以下的组中选4奪的：序列号1至69, 75, 76， 81, 91, 95和96。
38. 才艮据权利要求32的方法，其中C5结合适体是ARC186， A RC187, ARC1905。
39. 根据前述的权利要求1至35中任意一种的方法，其中抗-补体适体是一种结合并抑制C3的适体。
40. 根据前述的权利要求1至35中任意一种的方法，其中抗-补体适体是一种结合并抑制Clq的适体。
41. 根据前述的权利要求1至35中任意一种的方法，其中抗-补体适体是一种结合并抑制Clq的适体。
42. 才艮据前述的权利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体 是一种结合并抑制因子B和因子D的适体。
43. 根据前述的权利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体 通过玻璃体内输送给药。
44. 才艮据前述的4又利要求中任意一种的方法，其中抗-补体适体 通过眼周输送给药。
45. 根据前述的权利要求中任意一种的方法，其中施用的抗-补 体适体包括在储存形式中。
46. 根据前述的权利要求中任意一种的方法，其中主体是人类。
47. —种治疗C5， C5a和/或C5b-9介导的眼部失调的方法，其 中方法包括对所需的主体施用有效治疗眼部失调剂量的抗 -C5药物。
48. 根据权利要求47的方法， 新生血管失调。
49. 根据权利要求47的方法， 变性或lt尿病^L网力莫病。
50. 根据权利要求47的方法， 寸生是;参出'l"生AMD。其中治疗的眼部失调是一种眼部 其中治疗的眼部失调是一种黄J赶 其中治疗的年龄-相关的黄斑变
51. —种稳定C5， C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调的 方法，其中方法包括对所需的主体施用有效稳定C5， C5a和 /或C5b-9介导的眼部新生血管失调剂量的抗-C5药物。
52. 根据权利要求51的方法，其中稳定的眼部新生血管失调是 黄斑变性。
53. 根据权利要求52的方法，其中黄斑变性是渗出性AMD。
54. 根据权利要求51的方法，其中稳定的眼部新生血管失调是 并唐尿病3见网力莫病。
55. 4艮据4又利要求51, 52, 53或54中4壬意一种的方法，其中施 用有岁文剂量的4元_ C5药物适体以维持与施用4元-C5药物主 体视觉精度水平至少相同的主体浮见觉精度水平。
56. 根据权利要求51， 52， 53或54中任意一种的方法，其中施 用有效剂量的抗-C5药物适体以维持与施用抗_ C5药物主 体至少相同的视网膜血管密度。
57. —种治疗C5, C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调的 方法，其中方法包括对所需的主体施用有效减少C5, C5a和 /或C5b-9介导的眼部新生血管失调症状剂量的抗-C5药 物。
58. 才艮据权利要求57的方法，其中治疗的眼部新生血管失调是 黄扭王变'性。
59. 根据权利要求58的方法，其中黄斑变性是渗出性AMD。
60. 根据权利要求57的方法，其中治疗的眼部新生血管失调是 并唐尿病一见网力莫病。
61. 才艮据权利要求57, 58, 59或60中任意一种的方法，其中施 用有效剂量的抗-C5药物以提供与施用抗-C5药物的主体 一见觉精度相比提高的主体浮见觉精度。
62. 根据权利要求57, 58, 59或60中任意一种的方法，其中施 用有效剂量的抗-C5药物以^是供与施用抗-C5药物的主体 视网膜血管密度水平相比减少的主体视网膜血管密度水平。
63. —种包4舌乂于主体施用4元-C5药物以在主体中子贞防临床C5, C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调的方法，其中方 法包括-对所需的主体施用有岁文预防C5， C5a和/或C5b-9介 导的眼部新生血管失调临床症状剂量的抗-C5药物。
64. 根据权利要求63的方法，其中预防的眼部新生血管失调症 状是黄斑变性症状。
65. 根据权利要求64的方法，其中预防的年龄-相关的黄斑变 性症状是;参出性AMD症a犬。
66. 根据权利要求63的方法，其中预防的眼部新生血管失调症 状是糖尿病3见网膜病症状。
67. 根据权利要求63， 64或65的方法，其中主体处于发生眼部 新生血管失调的危险。
68. 根据权利要求67的方法，其中进一步包括通过测定玻璃体 疣的存在并测定一见觉精度无临床损失鉴定处于危险的主体 的步芬聚。
69. 4艮据权利要求67或68的方法，进一步包括测定主体中补体 因子H变体，鉴定处于危险的主体。
70. 才艮才居4又利要求63, 64, 65, 66, 67, 68或69中4壬意一种的 方法，其中施用有效剂量的抗-C5药物以预防与施用抗-C 5药物的主体视觉精度相比的主体视觉精度的损失。
71. 根据权利要求63， 64， 65， 66， 67, 68或69中任意一种的 方法，其中施用有步文剂量的4元-C5药物以预防与施用4元-C 5药物的主体视网膜血管密度水平相比的主体视网膜血管密 度水平的提高。
72. 才艮据上述权利要求47至71中任意一种的方法，进一步包括 乂于主体施用4元-VEGF药物的步骤。
73. 根据权利要求72的方法，其中抗-VEGF药物是从包括以下 的组中选择的：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子， 蛋白质，多肽，环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
74. 根据上述权利要求47至73中任意一种的方法，进一步包括 对主体施用抗-PDGF药物的步-骤。
75. 根据权利要求74的方法，其中抗-PDGF药物是乂人包括以下 的组中选择的：核S臾分子，适体，反义分子，RNAi分子， 蛋白质，多肽，环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
76. 才艮据上述权利要求47至75中任意一种的方法，其中抗-C5 药物是从包括以下的组中选择的：核酸分子，适体，反义分 子，RNAi分子，蛋白质，多肽，环肽，抗体或抗体片段， 糖，聚合体，小分子。
77. 根据上述权利要求47至76中任意一种的方法，其中抗-C5 药物是一种C5特异适体。
78. 根据权利要求77的方法，其中C5特异适体是从以下组中选 4奪的：序歹'J号1 — 67, 75 _ 81禾口 88 - 98。
79. 根据权利要求78的方法，其中C5特异适体是序列号：5或 序列号：67。
80. 根据上述权利要求47至79中任意一种的方法，其中施用的 :阮- C5药物是一种前药物。
81. 才艮据上述权利要求47至80中任意一种的方法，其中抗-V EGF药物是一种前药物。
82. 根据上述权利要求47至81中任意一种的方法，其中抗-P DGF药物是一种前药物。
83. 根据上述权利要求47至83中任意一种的方法，其中进一步 包4舌施用一种4元-血管药物。
84. 根据权利要求83的方法，其中抗-血管药物是一种卟啉派 生物。
85. 根据权利要求84的方法，其中进一步包括以激光激活卟啉 :派生物的方法。
86. 根据上述权利要求47至85中任意一种的方法，其中抗-C5 药物通过眼部纟会药输送。
87. 根据上述权利要求47至86中任意一种的方法，其中抗-C5 药物通过3皮璃体内*合药l叙送。
88. 根据上述权利要求47至87中任意一种的方法，其中主体是 人类。
治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-C5药物 相关申请
本专利申请要求2006年3月8日递交的美国临时专利申请 系歹'J号60/780905号和2006年9月29日递交的美国临时专利申 请系列号60/848274号的优先权，上述专利通过引证在此全部并 入本文。
发明领域
本发明通常涉及核酸领域，更特别地为可以结合补体系统的 蛋白质的适体，用于补体-相关眼，心，炎症，哞喘，和自身免 疫失调，缺血再灌注损伤和/或其他C5介导的补体活性相关的疾 病或失调的治疗和it断。优选实施方案中，本发明更特定涉及治 疗和诊断眼部失调的方法和材料，包括但不局限于，治疗和-珍断 C5介导的失调3口 C5介导的眼部失调。本发明进一步涉及施用可 以结合包括C5蛋白的补体系统蛋白的适体的材料和方法。
发明背景
定义的适体是一种分离的核酸分子，其通过不同于Watson -Crick碱基对的交互作用以高特异性和亲和性结合一些目标， 如一种蛋白质。虽然适体是核酸分子，在适体和其他核酸分子如 基因和mRNA之间仍有基本的不同。后者中，核酸结构通过其 线性》咸基序列编码信息，该序列对于信息存储功能是重要的。与 之相反的，适体的功能，其基于与目标分子的特定结合，不依赖于保守的线性碱基序列，而更关注特定的二级/和三级结构。适体 是非-编码序列。适体的任何潜在编码能力完全是巧合，并在合 体与其同源目标的结合中是无作用的。这样，结合相同目标，甚 至目标上的相同位点的适体，可以具有相同的石成基序列，更多情 况下是不同的。
适体也与自然产生的结合特定蛋白质的核酸序列不同。这些 后者序列是整合在生物体基因组中的自然发生的序列，其与涉及 自然核酸的转录，翻译和转运的蛋白质的特定亚基结合，例如， 核酸结合蛋白。另一方面，适体是短小的，分离的，非自然产生 的核酸分子。虽然适体具有与结合核酸的蛋白结合的特征，i午多 情况下这些适体具有4交少的或没有与可#皮自然核酸结合蛋白识 别的序列一致的序列。更重要的，适体事实上可以结合4壬4可蛋白 质（不仅仅是核酸结合蛋白）以及包括小分子，碳水化合物，多 肽等的任何针对的目标。对于大多数目标，甚至蛋白质，并不存
在其结合的自然产生的核酸序列；对于那些具有此序列的目标， 例如，核酸结合蛋白，这些序列与适体不同，与高亲和力适体相 比，其在自然状态的结合亲和力相对较低。
适体，与噬菌体显示或抗体所产生的多肽类似，可以特异结 合选定的目标并调整目标活性或结合力，例如，通过结合适体可 以阻抑其目标功能的能力。在抗体存在时，特定结合目标的功能 特性是一种固有特性。在抗体存在时，虽然技术人员可以不知道 一种适体对于一个目标的精确结构特性，技术人员知道在缺失精 确结构定义的情况下怎样鉴定，制备和使用这些分子。
适体也与小分子治疗剂类似，其单一结构的改变，似乎非常 微小，也可以极大影响（数个级別或量级）适体的结合和/或其他 活性。另一方面， 一些结构改变将少有或没有效果。这些结果来 自于适体结构的二级/三级的重要性。l灸而言之，适体是一种具有固定构造的三维结构，提供与其给定目标结合的化学结合力。因
此：（1) 一些区域或特定序列对于（a)结合目标的特定点，和/ 或（b)定位分子与目标的结合的序列是必需的；（2) —些区域 或特定序列具有变异范围，例如，核苷X必须是嘧啶，或核苷Y 必须是嘌呤，或核苷X和Y必须互补；和（3)—些区i或或特定 序列可以是4壬意的，其可以是充分的间隔元素，例如，其可以4吏 任何给定长度的核苷链或甚至非-核香间隔，如PEG分子。
任意寡核苷酸序列集合的体外选择试验发现，产生的适体针 对超过130种蛋白质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫球蛋 白，和受体。典型的适体为10- 15 kDa大小（20-45个才亥普）， 以」微毫摩尔至亚-樣i毫摩尔亲和力结合其目标，并区分紧密相关 的目标（例如，适体可以典型地不与来自同一基因家族的蛋白质 结合）。 一系列的结构研究已经显示适体可以z使用相同的集合交 互型（例如，氩4建，静电互补，疏水作用，空间排阻）驱动抗体 -抗原复合物的亲和力和特异性。
适体具有许多期望的用于治疗和i貪断的特性，包括高特异性 和亲和力，生物功效，和良好的药代动力学特性。此外，其提供 了优于抗体和其他蛋白生物制剂的特定竟争优势，例如：
1) 速度和控制。适体完全由体外方法制备，可以进行提前量 的快速准备，包括治疗提前量。体外选纟奪使得适体的特异性和亲 和力是高度受控的并制备引导，包括针对毒素和非-免疫原目标 的引导。
2) 毒性和免疫原性。适体作为一种类型，具有显著的治疗可 接受毒性并缺少免疫原性。然而许多单克隆抗体的效果可被其抗 体自身的免疫反应限制，而激发适体的抗体是非常困难的，主要因为适体不能通过mhc #皮t-细月包表达，而免疫应答通常#:驯
化为对核酸片#殳无识别。
3) 给药。许多目前提供的抗体治疗剂通过静脉灌输给药（通 常超过2-4小时），而适体可以通过皮下注射纟会药（适体通过皮 下给药的生物利用率在猴子试验研究中〉80% (Tucker等，J.Chr omatography B. 732: 203 — 212, 1999))。 jt匕区另'J主要由于》、台疗 性mAbs相当低的可溶性从而需要的体积较大。具有良好溶解性 (>150mg/mL)和相对更低的分子量（适体：10-50kDa;抗体： 150 kDa),适体的周使用剂量可以以小于0.5mL的体积注射输 送。此外，另一个适体-基础的治疗或预防优点为，适体的较小 体积可以使其渗透入紧缩构想区域，而抗体或抗体片段无法渗透 入。
4) 可度量性和价格。治疗适体是化学合成的因此可以容易地 根据生产需求度量。而对生产的度量的困难性限制了 一些生物制. 剂的实用性，并且高-通量蛋白质制备设备的费用也是巨大的， 而一个高-通量寡核苷酸合成系统的产量至少为100kg/年，并且 只需要相对适度的初始才殳资。目前千克级的适体合成的费用估计 为500美元/克，与高度优化的抗体具有可比性。研究过程中的不 断进步可以预计在5年内费用将降低至低于100美元/克。
5) 稳定性。治疗性适体是化学稳健的。其在暴露于各种因子 如热和变性剂时能固有地j呆持活性，并且以冻干4分末在室温下能 保存相当长时间（〉1年）。相反，抗体必须冰冻保存。
补体系统。补体系统包括一组至少为20- 30胞质和膜蛋白， 其在受调控的级4关系统中共同作用以攻击细月包外的病原体形式 (例如，细菌）。补体系统包括三个不同的酶活性级联，经典，凝集素和选择性路径（图1 ),其集合了 C5的活性并产生已知为膜 攻击途径的非-酶途径。
第一种酶活性级联，其已知为经典途径，包括几种成分，Cl， C4， C2, C3和C5 (以途径中的顺序排列）。随着第一种补体成 分（Cl )通过免疫和非-免疫活性因子而结合和激活，补体系统 的经典途径的开始发生。Cl包4舌一个Clq, Clr和Cls的4丐-依 赖复合物，并且通过结合Clq成分而激活。Clq包括六个相同的 亚基，并且每个亚基包括三条链（A, B和C链）。每个链具有一 个连4妄力交原质-类似物尾部的5求状头部。抗原-抗体复合物乂于于 Clq的结合和激活发生在Clq的头部区域。大量的非-抗体Clq 激活物质，包括蛋白质，脂质和核酸，通过月交原-类似颈部区域 的独特位点结合和激活Clq。通过Clq的补体激活剂的分子识别 引发了构象改变，刺激酶原Clr自身激活，其反过来促进Cls的 蛋白水解。Cs随后催化补体成分C4和C2的活性，形成具C3 转化酶功能的C4bC2a复合物。
第二个已知为凝集素途径酶活化级联，除了 MBL/MASP-2 复合物取代C1之外，都与第一个类似。甘露聚糖-结合凝集素 (MBL)直接识别细菌表面的含有甘露糖的多糖，并在结构和功 能上与Cl的成分Clq同源。MBL与激活剂的结合引导了 MBL —相关蛋白酶2 (MASP —2)的活寸生。MASP-2,反过来以Cls 功能同源的方式激活C4和C2,引导C3转化酶的形成。
第三种酶活性级^:，已知为选才奪性途径，是一种快速的，抗 体_不依赖的补体系统激活和方法途径。选才奪性途径包括几种成 分，C3，因子B,和因子D (以途径中的顺序排列）。选择性途 径的激活发生于C3b, —种C3的水解裂解形式，与活性表面如 细菌的结合时。因子B随后与C3b结合，并被因子D切割形成 C3转化酶C3bBb。当产生和沉积额外的C3b时发生C3转化酶活性的放大。阳性调节蛋白备解素（P)的结合进一步促进放大反
应，其提高活化转化酶的降解稳定性，使半衰期从l-2分钟延 长至18分钟。
这样，所有三个途径都产生裂解因子C3为C3a和C3b的C 3转化酶。这时，C3转化酶（经典/凝集素和选择性）进一步装 配为C5转化酶（C4b2a3b和C3b3bBb )。这些复合物随后裂解补 体成分C5为两种成分：C5a多肽（9kDa)和C5b多肽（170kDa)。 C5a多肽结合7重跨膜G -蛋白结合受体，其最初与白细胞相关， 并且目前已知在多种组织中表达，包括肝细胞和神经细胞。C5a 分子是人补体系统最初的趋化成分，并可以引发多种生物应答， 包括白细胞趋化性，平滑月几收缩，细胞内信号传导途径的激活， 嗜中性粒细月包-内皮细月包附着，细月包因子和脂质调节释》文和氧化 剂形成。
更大的C5b片段继而与随后的补体级联，C6， C7, C8和C 9结合形成C5b-9膜攻击复合物（'MAC，)。 C5b - 9 MAC可以 直接裂解红血球，并在更大程度上，其对白细胞裂解并损害组织， 如肌肉，上皮和内皮细胞。亚溶破剂量中，MAC可以刺激上调 分子的附着，细胞内4丐的释放和细胞因子的释放。此夕卜，C5b-9 MAC可以刺激内皮细胞和血小板细胞而不导致细胞裂解。C5a 和C5b-9 MAC的非-裂解效应有时非常相似。
虽然补体系统在维持i^康中具有非常重要的作用，-f旦其也具 有导致或引发疾病的潜在可能。例如，补体系统已经在冠状动月永 搭桥术（f'CABG，）手术，众多肾脏，风湿，神经，皮肤病，血液 病，动"永/力申，过壽文，感染，和生物适应性A沐克疾病和/或情况中 表现出其副作用。补体系统不是疾病的唯一导致因素， <旦其可能 是导致疾病的几种因素之一。目前，数据显示在眼疾中也包括补体。此外，拥有新的补体 系统抑制剂有助于补体_相关眼疾的治疗和it断。
附图说明
图1是描述补体系统的经典和选择性途径的示意图。
图2是描述从寡核苷酸随机序列集合中进行体外适体选择（S ELEXTM)方法的示意图。
图3A是描述抗-C5适体的核酸序列和二级结构（序列号： 1 )的示意图，其中带下划线的残基是2'-H嘧啶残基或2'-氟 嘧咬残基，加框的残基是2'-氟嘧咬残基或2' - OMe嘧啶残基， 以箭头（—）表示的残基表示必须含有2'-氟修饰的残基。
图3B是描述ARC330抗-C5适体的核酸序列和二级结构 (序列号：2)的示意图，其中带圈的残基是2'-H残基，嘧啶残 基是2，-氟替换的，主要的嘌呤残基是2'-OMe替换，除了突出 显示的三个2' - OH噤p令歹戋基。
图3C是描述ARC186抗-C5适体的核酸序列和二级结构 (序列号：4)的示意图，其中所有21个嘧i定残基具有2'-氟〈奮 饰，主要的噤^令（14个残基）具有2'-OMe》务饰，除了突出显 示的三个2' - OH噤p令残基。
图4是40 kD分支PEG ( 1, 3 -双（mPEG - [20 kDa])-丙基-2- (4'-丁唑酰胺）的示意图。
图5是4妄触适体5'末端的40 kD分支PEG (1, 3 - 乂又（mP EG-[20kDa])-丙基-2 - ( 4'- 丁^坐酰胺）的示意图。
18图6描述各种合成高分子量PEG-核酸共轭物的方法示意图。
图7A是PEG化抗-C5适体（ARC657 (序列号：61), AR C658 (序列号：62)，和ARC187(序列号：5)),相对于非-P EG化抗-C5适体（ARC186 (序列号：4))的剂量依赖的溶血 抑制作用；图7B是图7A中描述的在溶血试验中使用的适体的I Cso值表;图7C是比较PEG化抗-C5适体ARC187(序列号：5)， ARC1537 (序列号：65)， ARC1730 (序列号：66)，和ARC 190 5 (序列号：67)的剂量依赖的溶血抑制作用；图7D是图7A中 描述的在溶血试—睑中^f吏用的适体的ICs。值表。
图8是猕猴血清补体相对于人类血清补体中抗-C5适体，A RC658 (序列号：62)的;容血抑制百分率示意图。
图9是37度和室温（23度）孵育15分钟时ARC186 (序列 号：4)结合纯化C5蛋白的示意图。
图10是37度和室温（23度）孵育4小时时ARC186 (序歹。 号：4)结合纯化C5蛋白的示意图。
图11是C5 - ARC 186复合物在23度时的分解时间过程示意图。
图12是C5 - ARC 186复合物在23度时形成的平衡时间过程 示意图。
图13是C5蛋白相对于补体级耳关中的上游和下游蛋白成分与 ARC186 (序列号：4)的结合示意图。图14是存在未标记竟争物ARC186 (序列号：4)， ARC657 (序列号：61), ARC658 (序歹'J号：62 )或ARC187 (序列号：5) 时，放射标记的ARC186 (序列号：4 )结合C5的百分率示意图。
图15是描述以不同浓度的ARC186 (序列号：4)适体，25 度和37度孵育5小时，血液样本中C5b补体蛋白的产生数量示 意图。
图16是描述未稀释人类血清，柠檬酸处理人全血和猕猴血 清中，存在酵母聚糖时ARC187(序列号：5)的补体抑制百分率。
图17是显示实施例1D管状回环模型中ARC658 (序列号： 62)对于补体活性（C5a)的完全抑制。
图18是描述第10轮C5选4奪集合的分离常数示意图。通过 将数字带入等式：分离片段结合z增幅xKd/(Kd+[C5]),评估分 离常数（Kds)。"ARC520"(序列号：70)指天然未选择的dRmY 集合，"+ "指存在竟争物（0.1mg/ml tRNA, 0.1mg/ml鮭精DNA )。
图19是描述C5克隆分离常数曲线的示意图。通过将数字带 入等式：片段RNA结合-增幅xKd/ (Kd+[C5])，评估分离常数 (KdS )。
图20是描述不同浓度的抗C5适体克隆ARC913 (序列号： 75)对比于ARC186 (序列号：4)对于溶血活性的抑制效应IC5 0曲线。
图21是ARC187 (序列号：5)的结构示意图。 图22是ARC1905 (序列号：67)的结构示意图。图23是描述第一个分离灌注心脏研究的试验设计大纲表。
图24是描述暴露于人血浆（A)的分离心脏左心房（LV) 心房内压力的压力轨迹与暴露于对照适体溶液（B)的LVP压力 轨迹比4交示意图。
图25是分离心脏暴露于等摩尔，10x和50x适体/C5溶液（正 常的，未稀释的人血浆中C5的估计浓度约为500nm)时，左心 房（LV)心室内压力轨迹比较示意图。
图26是分离小鼠心脏暴露于人血浆和不同的血浆/适体溶液 的每分钟心跳（bpm)心律改变比较示意图。
图27是分离小鼠心脏暴露于含有0- lx摩尔比值ARC186 (序列号：4)(失效心脏），或10-50x摩尔比值（C5适体保护心 脏）前后的心脏重量改变比4交示意图。
图28是灌注分离小鼠心脏中，含有不同浓度适体的人血浆 的相关C5a产生比较示意图。相关C5a浓度以吸收单位（Abs ) 注释，其中更高的读凄t表示存在更高水平的C5a。
图29是灌注分离小鼠心脏中，含有不同浓度适体的人血浆 的相关可溶性C5b - 9产生比4支示意图。
图30是小鼠心脏流出物中ARC186 (序列号：4)对于C3 裂解效应的示意图。
图31是分离灌注心脏研究中免疫组化染色结果示意表。
图32是显示人血清和灵长类血清中，保护心脏不受C5b-介 导损害的所需ARC658 (序列号：62)的摩尔比率图标。
21图33是显示大鼠和猕猴血浆中，作为孵育时间函数的全长A RC186剩余百分数的对数-线性图。
图34是显示实施例5中描述的以Sprague - Dawley率表示的 药«动力学研究试-验i殳计示意图。
图35是ARC657 (序歹'J号：61)， ARC658 (序歹'J号：62 )或 ARC187 (序列号：5)相对于Sprague - Dawley率中时间的平均
血浆浓度示意图。
图36是大鼠经静脉施用适体后，各时间的ARC657(序列号： 61), ARC658 (序列号：62)或ARC187 (序列号：5)平均血
浆浓度示意图。
图37是显示图35和图36描述的浓度相对于时间数据的非 间隔分析示意图。
图38A是描述小鼠中ARC187(序列号：5)和ARC1905 (序 列号：67)的药代动力学研究设计图。图38B是描述CD- 1小 鼠中ARC187 (序列号：5)和ARC1905 (序列号：67)的药代^ 动力学研究i史计图；图38C是显示图38B描述的浓度相对于时 间数据的非间隔分析表。
图39是显示静脉内给药后小鼠心脏组织中所列适体的测定 结果表。
图40是显示实施例5E中描述的动物研究1的试-验-没计表。
图41是显示对猕f吳静脉内推注施用适体后相对于时间的适 体血浆浓度表。图42是研究1中对猕猴静脉内给药后ARC657 (序列号：6 1), ARC658 (序列号：62)和ARC 187 (序列号：5)的药代动 力学参凄t表。
图43 ( a )和43 ( c )是4葛述浙尔《美静月永内施用4元—C5适体A RC657 (序列号：61)， ARC658 (序列号：62)和ARC187 (序 列号：5)后各时间sC5b-9和C5a的血浆浓度示意图；图43 ( b ) 和43 ( d)是描述sC5b - 9和C5a的血浆浓度相对于才元-C5适 体ARC657 (序歹'J号：61)， ARC658 (序歹'J号：62)和ARC187 (序列号：5)浓度的示意图。
图44是显示实施例5F中描述的研究2试-验i殳计表。
图45是描述猕猴静脉内施用ARC658 (序列号：62)或AR C187 (序列号：5)后不同时间点平均适体血浆浓度示意图。
图46是显示你后l争月永内推注施用适体后浓度相对于时间的 两个房室分一斤表。
图47是描述猕猴血浆中存在酵母聚糖时C5b - 9浓度相对于 ARC187(序列号：5 )和ARC658 (序列号：62)浓度的示意图。
图48是描述猕猴血浆中存在酵母聚^唐时C5a浓度相对于AR C187(序列号：5)和ARC658 (序列号：62)浓度的示意图。
图49是描述猕猴静脉内推注给药时和之后ARC 187(序列号： 5)的PK-PD研究表。
图50是描述猕猴静脉内推注给药后ARC187 (序列号：5) 的药代动力学参数表。图51是描述猕lf吳静脉内推注《会药后ARC187 (序列号：5) 的计算和实际测定的药代动力学参数示意图。
图52是描述猕猴^争脉内推注症合药后剩余活性ARC187(序列 号：5)的血浆浓度水平示意图。
图53是CABG手术中预测的抗-C5适体人用需要剂量表。
图54是以凝血时间（PT)和活化部分凝血活酶时间（APTT) 测定的显示ARC187 (序列号：5 )没有体外相对凝血效应的示意图。
图55是显示ARC187 (序列号：5)对于肝素的抗-凝血活 性，和鱼精蛋白促凝集活性的体外效应表。
图56是显示ARC187 (序列号：5)不影响肝素体内抗達是血 的示意图。
图57是以酵母聚糖补体活性抑制测定的，肝素和鱼4青蛋白 对于ARC187 (序列号：5)抗-补体功能无岁文应的示意图。
图58是显示存在人血清时作为抗-C5适体ARC1905(序歹'J 号：67)或ARC672 (序列号：63)的函凄t的绵羊红细月包溶血4中 制百分数的示意图。
图59A是存在人，猕猴和大鼠血清时ARC1905 (序列号：6 7)的溶血抑制百分数示意图；图59B是存在人，猕猴和大鼠血 清时，ARC1905, —种抗-C5适体，或ARC127， 一种不结合C 5的非相关适体（阴性对照）的补体活性抑制IQ。值表。图60是在竟争结合试验中，作为未标记的竟争物ARC1905 (序列号：67)或ARC672 (序列号：63 )(水平轴）浓度的函数， 放射标记ARC186 (序列号：4)(纵轴）的抑制ICso值示意图。
图61是竟争结合试验中，37度和25度时，作为未标记的竟 争物ARC 1905 (序列号：67)(水平轴）浓度的函数，放射标记 ARC186 (序列号：4)(纵轴）的抑制ICso值示意图。
图62是描述人C5a (hC5a)和猕f美C5a ( hC5a eq )的标准
曲线示意图。
图63是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试-睑测定的，人 和猕猴血清中ARC1905 (序列号：67 ) C5活性抑制IC50, IC90，
和IC99值表。
图64是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试一验测定的，作 为人和猕猴血清中ARC1905 (序列号：67)函数的C5a产生的 承卩制百分率。
图65是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试-验测定的，人 和猕《吳血清中ARC1905 (序列号：67)对C3a生成的效应示意图。
图66是以补体活性回环4莫型测定的，来源于5未志愿者的 人血清中ARC1905 (序列号：67 )补体活性抑制平均IC5Q, IC90，
和IC99值表。
图67是补体活性回环模型中，作为ARC1905, —种抗-C5 适体，或ARC127, —种不结合C5的非相关适体（阴性对照） 浓度的函凄t, C5a和C3a产生的抑制百分率示意图。发明内容
本发明4是供了治疗，预防和/或稳、定补体-相关的眼部疾病 (这里指眼部失调）的材料和方法。
本发明的一些实施方案中，抗-补体适体调节补体成分或其 变体的功能。特定优选实施方案中， 一种抗-补体适体抑制或减 弱补体成分或其变体的功能，优选地，在体内，特别是脊推动物 中，特别是哺乳动物中，更合适地在人体内。本发明的一些实施
方案中，例如，当C2， C3, C4， C5和/或因子B是4卜体目才示， 适体的功能调整，更适宜地为抑制，是通过蛋白裂解完成的。本 发明的一些实施方案中，例如，当C2b, C5b， C5， C7， C8, C 9，因子B和/或备解素是补体目标时，适体的功能的调整，更适 宜地为抑制，是通过活性补体成分的聚集，如转化酶或膜攻击复 合物完成的。本发明的一些实施方案中，例如，当C3b,因子D, Cl (包括Clr和/或Cls)和/或甘露糖相关丝氨酸蛋白酶CMAS P')是补体目标时，适体的功能调整，更适宜的为抑制，是通过 酶活性。本发明的一些实施方案中，例3口当C3a, C5a, C3a受 体或C5a受体是补体目标时，适体的功能调整，更适宜的为抑制， 是通过配体/受体结合。
一个实施方案中，^是供了稳定，治疗和/或预防C5a, C5a和 /或C5b-9介导的眼部失调的方法，该方法包括对需要的主体施 用稳定，治疗和/或预防眼部失调的有效数量的抗-C5药物步骤。 一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是眼部新 血管生成失调。 一些实施方案中，所稳、定的，治疗和/或预防的眼 部失调是糖尿病视网膜病变或黄斑变性，特别是年龄-相关黄斑 变性（"AMD")。 一些实施方案中，所稳、定的，治疗和/或子贞防的 AMD是渗出性AMD。 一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或 预防的AMD是非;参出性AMD。一些实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防补体介导的的
眼部失调的方法，该方法包括^对需要的主体施用有步文^i:量的抗-C5补体适体步骤。 一些实施方案中，抗-补体适体的治疗有效 凄史量是稳定，治疗和/或预防眼部失调的有效凄t量。本发明的一些 实施方案中，主体是一种脊坤,动物， 一些实施方案中是一种哺乳 动物， 一些实施方案中是人类。 一些实施方案中，稳、定，治疗和 /或预防的补体-介导的眼部失调是畸形或'f曼性炎症和/或面积介 导的眼部失调。 一些实施方案中，稳、定，治疗和/或预防的补体-介导的眼部失调是从以下组中选择的：炎症结膜炎，包括巨乳头 状结膜炎，黄斑水肺，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃疡， 干眼症，青光眼，萎缩性视网膜病，角膜移植排斥，眼内手术相 关并发症如眼内晶状体移才直和白内障手术相关炎症，Behcet's病， Stargardt病，免疫才寻合月永管炎，Fuch's病，Vogt - Koyanagi — Har ada病，视网膜下纤维化，角膜炎，玻璃体视网膜炎症，眼部寄 生虫感染/转移，视网膜色素变性，巨细胞病毒性视网膜炎和脉络 月莫炎。 一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是 黄斑变性，特别是年龄-相关黄斑变性（f'AMD，)。 一些实施方案 中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是是非-渗出性(f'干燥" 和/或"萎缩，）型AMD。 一些实施方案中，所稳、定，治疗和/或预 防的眼部失调是一种眼部新生血管失调，如#唐尿病一见网"莫病变或 渗出性e'湿，）型AMD。
一些实施方案中，提供了稳定C5， C5a和/或C5b-9介导的 眼部新生血管失调的方法，4争别是;参出性AMD或4唐尿病3见网月莫 炎，包括对需要的主体施用稳定C5, C5a和/或C5b-9介导的眼 部新生血管失调的有效ft量的抗-C5药物。 一些实施方案中， 施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视觉精度与抗-C5药物 治疗过程中主体的视觉精度水平相比，维持至少相同的水平。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视网膜 血管密度与治疗过程中的主体相比，维持大约相同的水平。
一些实施方案中，提供了稳定补体-介导的眼部新生血管失 调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要 的主体施用稳、定补体-介导的眼部新生血管失调的有效凄t量的 抗-补体适体。 一些实施方案中，施用有效凄t量的抗-补体适体， ^吏主体的纟见觉4青度与抗-补体适体治疗过程中主体的纟见觉津貪度 水平相比，维持至少相同的水平。 一些实施方案中，施用有岁文数 量的抗-补体适体，使主体的视网膜血管密度与适体治疗过程中 的主体相比，维持大约相同的水平。 一些实施方案中，施用有效 凄t量的抗-补体适体， -使以主体中新生血管-相关的出血，流液 聚集，一见网膜分离和/或疤痕形成的水平与抗-补体适体治疗过程 中主体的新生血管-相关的出血，流液聚集， 一见网膜分离和/或痣 痕形成的水平相比保持稳定或维持。
一些实施方案中，^是供了治疗C5， C5a和/或C5b-9介导的 眼部新生血管失调的方法，特别是渗出性AMD或冲唐尿病—见网月莫 炎，包括对需要的主体施用减少C5， C5a和/或C5b-9介导的眼 部新生血管失调症状的有效凄t量的抗-C5药物。 一些实施方案 中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视觉精度与抗-C5 药物治疗过程中主体的视觉精度水平相比有所提高。 一 些实施方 案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视网膜血管密度 与治疗过禾呈中的主体相比有所减少。
一些实施方案中，提供了治疗补体-介导的眼部新生血管失 调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要 的主体施用减少补体-介导的眼部新生血管失调症状的有岁文凄史 量的抗-补体适体。 一些实施方案中，施用有效凄t量的抗-补体 适体，使主体的视觉精度与抗-补体适体治疗过程中主体的视觉精度水平相比有所提高。 一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使主体的视网膜血管密度与治疗过程中的主体相比有 所减少。 一些实施方案中，施用有效lt量的抗-补体适体，〗吏以 主体中新生血管-相关的出血，流液聚集，#见网膜分离和/或疤痕 形成的水平与抗-补体适体治疗过程中主体的新生血管-相关 的出血，流液聚集，^见网膜分离和/或疤痕形成的水平相比有所减少。
一些实施方案中，提高了预防临床补体_介导的眼部新生血
管失调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对 需要的主体施用减少补体-介导的眼部新生血管失调临床症状 的有效数量的抗-补体适体。 一些实施方案中，施用有效数量的 抗 - 补体适体以预防主体的^见觉精度临床损害。 一些实施方案 中，施用有效数量的抗-补体适体以预防主体中临床眼部新生血 管失调相关的视网膜血管密度水平。 一些实施方案中，主体具发 生眼部達斤生血管失调的危险。 一些实施方案中，方法进一步包括-在施用抗-补体适体之前，对具有补体-相关眼部新生血管失调 危险的主体进4亍-珍断。 一些实施方案中，i貪断步-骤包4舌测定主体 玻璃疣和/或视网膜色素改变和测定视觉精度无临床减弱。 一些实 施方案中，诊断步骤包括测定主体中与野生型因子H相关的变体 因子H。 Ripoche等（1998 )才艮导了野生型因子H的氨基酸序列， 人才卜体因子H的全氛基酉臾序歹'J , Biochemj.249, 593 — 602。 一些 实施方案中，当才是供了稳定，治疗和/或预防主体的补体-介导的 新生血管眼部失调，特别是糖尿病视网膜病的方法时，抗-补体 适体的给药途径是眼部或眼周给药。
一些实施方案中j是供了包4舌对主体施用抗-C5药物预防主 体临床C5， C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调，特别是 :渗出型AMD或并唐尿病一见网月莫病的方法，该方法包4舌了对主体施用有效数量的抗-C5药物步骤，以预防C5， C5a和/或C5b-9 介导的眼部新生血管失调临床症状。 一些实施方案中，施用有效 数量的抗-C5药物以预防主体视觉精度的临床损失。 一些实施 方案中，施用有效凄t量的抗-C5药物以预防主体中临床眼部新 生血管疾病相关的视网膜血管密度水平。 一些实施方案中，主体 处于发生眼部新生血管4匕失调的危险中。 一些实施方案中，该方 法进一步包括在施用抗-C5药物前对具发生C5, C5a和/或C5b -9介导的眼部新生血管失调的主体进行鉴定。 一些实施方案中， 鉴定步骤包括测定主体中玻璃疣的存在和测定视觉精度无临床 损失。 一些实施方案中，鉴定步骤包4舌测定主体中补体因子H的 变体。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包括^于主体施用^t-VEGF药物的步骤，特别是从包括以下物质的组中选才奪的VEGF 药物：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白质，多肽， 环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包4舌对主体施用4元-PDGF药物的步骤，特别是/人包括以下物质的组中选择的PDGF 药物：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白质，多肽， 环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包括1寸主体施用4元-血管药物的步骤。 一些实施方案中，抗-血管药物是吟啉派生物。 卟啉派生物的一些实施方案中，是用于注射的verteporfm ( Visud yneR， Novartis药物^>司，East Hanover, NJ )。 一些实施方案中， 该方法进一步包括以激光激活卟啉派生物的方法。
一个实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防C5， C5a和/ 或C5b-9介导的非-渗出性AMD的方法，包括对需要的主体
30施用有效凄欠量的抗-C5药物以稳定，治疗和/预防非-渗出性A MD。 一个实施方案中，当非-渗出性AMD被稳定时，施用有 效凄t量的抗-C5药物，以维持与施用抗-C5药物过程中主体的 j波璃疣水平相比大约相同的5皮璃疣水平。 一个实施方案中，当非 -渗出性AMD被稳定时，施用有效数量的抗-C5药物，以维持 与施用抗-C5药物过程中主体的—见觉精度水平相比大约相同的 -现觉沣青度水平。 一个实施方案中，当治疗非-渗出性AMD时， 施用有效数量的抗-C5药物，使其玻璃疣水平与施用抗-C5药 物过程中主体的J皮璃疣水平相比有所减少。 一个实施方案中，当
治疗非-渗出性AMD时，施用有效数量的抗-C5药物，使其视 觉精度水平与施用抗-C5药物过程中主体的视觉精度水平相比 有所增高。 一个实施方案中，当予贞防非-;参出性AMD时，方法 包括对需要的主体施用有效数量的抗-C5药物以预防C5, C5a 和/或C5b-9介导的非-渗出性AMD的临床症状。 一些实施方 案中，施用有效凄t量的抗-C5药物以预防主体中碎见觉精度的临 床损失。 一些实施方案中，施用有效凄t量的抗-C5药物以预防 玻璃疣的临床水平聚集。 一些实施方案中，主体具发生非-渗出 寸生AMD的危险。 一些实施方案中，方法进一步包4舌在施用4元-C5药物前只于具发生C5， C5a和/或C5b-9介导的非-渗出性A MD危险的主体进行鉴定。 一些实施方案中，鉴定步骤包括测定 主体中3皮璃疣的存在和测定#见觉#青度无临床损失。 一些实施方案 中，鉴定步骤包4舌测定主体中补体因子H的变体。
上述方法的 一 些实施方案中，抗C 5 -药物是从包括以下物质 的组中选择的：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白 质，多肽，环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。特定 实施方案中，抗C5-药物是一种C5特异性适体，更特别的是从 包4舌序列号1 — 67， 75 - 81和88 - 98的组中选择的C5 4争异适体。优选实施方案中，上述方法中施用的C5特异适体是从包括ARC 187 (序列号：5)和ARCD1905 (序列号：67)的纟且中选择的。
上述方法的一些实施方案中，抗-c5药物通过眼部给药车lr 送，特别通过玻璃体内《会药。上述方法的一些实施方案中，抗-
VEGF药物，抗-PDGF药物和/或抗-血管生成药物通过眼部纟会 药输送。上述方法的一些实施方案中，施用的抗-C5药物，抗 - VEGF药物，抗-PDGF药物和/或抗-血管生成药物是一种前 体药物。上述方法的一些实施方案中，主体是人类。
上述方法中使用的术语"抗-C5药物施用过程中"包括抗-C 5药物施用前对怀*是的症状进4亍临床4企测的时间。
一个实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防补体介导的非 -渗出性AMD的方法，包括对需要的主体施用治疗有效凄t量的 抗-补体适体。稳定非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用 有效数量的抗-补体适体，使其玻璃疣水平（例如，大小，数量， 面积和/或形态）维4寺与抗-补体适体《会药过禾呈中的玻璃疣水平相 同。非-渗出性AMD被稳定的一个实施方案中，施用有效凄史量 的抗-补体适体，以稳定地理性萎缩的发展，包括视网膜色素上 皮细胞，感光受体和/或脉络毛细管的萎缩，以维持与抗-补体适 体施用过程中主体水平相同的地理性萎缩水平。稳定非-渗出性 AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使其 的主体^L觉精度水平维持与抗-补体适体施用过禾呈中主体的賴L 觉精度水平相同。
治疗非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有刻:tt量的 抗-补体适体，以侵JE皮璃疣的水平，特别是大的，柔l欠的3皮璃疣 相比于施用抗-补体适体的过程中主体玻璃疣水平有所减少。治 疗非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补
32体适体，以使主体的视觉精度与施用抗-补体适体的过程中主体 的视觉精度相比有所提高。
一个实施方案中，^是供了预防非-渗出性AMD的方法，包 括对需要的主体施用有效数量的抗-补体适体以预防补体-介 导的非-渗出性AMD临床症状。 一个实施方案中，施用有效凄t 量的抗-补体适体，以预防主体的3见觉4青度临床损失。 一些实施 方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以防止临床水平的玻璃 疣聚集，特别是大的，柔4欠J波璃疣。 一些实施方案中，施用有岁丈 数量的抗-补体适体，以预防临床水平的地理性萎缩。 一些实施 方案中，对具有非-渗出性AMD的主体施用有效数量的抗-补 体适体，以防止主体中渗出性AMD的发展。依稀实施方案中， 对具有年龄-相关黄斑变性的主体（以玻璃疣的存在，视网膜色 素改变和/或小区域的萎缩为特4正）施用有效凄t量的抗-补体适 体，以防止主体的渗出性AMD的发展或临床水平的地理性萎缩。
一些实施方案中，主体具有发生非-渗出性AMD的危险。 一些实施方案中，方法进一步包括在施用抗-补体适体之前对具 发生补体-介导的非-渗出性AMD的主体进行鉴定。 一些实施 方案中，鉴定步骤包括测定主体中^皮璃疣的存在，特别是大的， 柔软玻璃疣，视网膜色素改变和/或萎缩区域和测定无视觉精度临 床损失。 一些实施方案中，鉴定步艰《包4舌测定主体中野生型补体 因子H的变体。
上述方法的一些实施方案中，抗-补体适体抑制^v以下组中 选捧的补体目标：经典补体途径成分，选择性补体途径成分和血 凝途径成分。 一些实施方案中，抗-补体适体以力莫攻击途径抑制 补体目标。 一些实施方案中，抗-补体适体抑制从以下组中选择 的才卜体目才示：Cl, Clq, Clr, Cls, C2, C3， C3a, C3a受体， C4, C5, C5a, C5a受体，C5b， C6， C7， C8, C9，因子B,因子D,备解素，甘露糖结合血凝素（这里为"MBL，)， MBL相关 丝氨酸蛋白酶1 e'MASP 1，）和MBL相关丝氨酸蛋白酶2 ('MAS P 2，)。 一些实施方案中，抗-补体适体不是一种从以下组中选择 的对补体目标具有高亲和力和特异性的适体：C3a, C3a受体，C 5a,和C5a受体。 一些实施方案中，抗-补体适体不是一种/人以 下组中选4奪的对补体目标具有高亲和力和特异性的适体：因子B 和因子D。
上述方法的一些实施方案中，通过眼内给药，特别是通过晶 状体内或眼-周给药输送抗-补体适体。 一些实施方案中，对主 体施用的抗-补体适体包4舌在存^f诸形式中。
这里使用的术语"抗-补体适体给药过程中"包括对所怀疑的 症状进行临床测定或评估的时间，其中测定或评估的时间从抗-才卜体适体纟合药前至4元-4卜体适体纟会药时和之后4豆时间内，侈'B口， 纟会药12小时后，24小时后，或48小时后。
一些实施方案中，提供了包括治疗有效数量抗-补体适体的 眼部药物组合物，例如，可稳定，治疗和/或预防补体-介导的眼 部失调的有效数量。本发明的药物组合物可以包括一种药物可接 受载体或稀释剂。该方面，本发明提供了抑制眼部补体目标体内 功能，特别是人体内的，包括治疗有效tt量适体的药物组合物， 或其盐和一种药物可4妄受载体或稀释剂。 一些实施方案中，眼部 药物成分包括一种储存形式。
一种实施方案中，上述方法中^f吏用的抗-补体适体是一种抑 制体内C5,特别是人体内C5的适体。特定实施方案中，提供了 上述方法中使用的与PEG配基结合的ARC186 (序列号：4)抗 - C5适体或包括核酸序列ARC186 (序列号：4)的适体。特定 实施方案中，ARC186适体/PEG共价物与包括序列号：4序列但缺失PEG配基的适体具有基本上相同的C5补体蛋白结合亲和 力。这里使用的基本上相同的结合亲和力指以斑点印迹分析测定 的分离常tt不超过2至10倍差异，3艮合适地为不超过2至5倍 差异。 一些实施方案中分离常凄t以下述实施例1A中描述的竟争 斑点印迹分析测定。 一些实施方案中，聚乙二醇配基的包括大于 10kDa的分子量，特别是大于20kDa的分子量，更特别的是大于 30kDa的分子量和大于40kDa的分子量。 一些实施方案中，PEG 配基与ARC186 (序列号：4)的5，末端结合。 一些实施方案中， 以实施例5E中描述的两室才莫型测定的适体/PEG共^f介物的灵长类 中的半衰期，合适地为终端半衰期，至少为15小时，合适地为2 4小时，更合适地为至少48小时。 一些实施方案中，适体/PEG 共价物的两室模型半衰期，在大鼠中至少为10小时，更合适地 为15小时。 一些实施方案中，结合ARC186 (序列号：4)5，末 端的PEG是一种40 kDa PEG。净争定的实施方案中40 kDa PEG 是一种分支PEG。 一些实施方案中该分支40 kDa PEG是1, 3 —只又（mPEG-[20 kDa ])—丙基—2 - (4'-丁峻酰胺）。其4也 实施方案中分支40 kDa PEG是2, 3 -双（mPEG - [20 kDa ]) -丙基-1 -氨基曱酰。
在分支40 kDa PEG是1, 3 — 乂又（mPEG — [20 kDa ])—丙 基-2- (4'-丁唑酰胺）的实施方案中，提供了具有以下结构式 的适体：
20 kDa mPEG-NH-C-O— 20 k加mPEG-NH"C-0—1
O 卜OCH2CH2CH2-S-R^"^ 5'适体3'
其中，
------表示一种连接物适体=
fCmGiCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGniAmGfUfCfUmGmAinGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG-3T (序列号：4),
其中《^和£11 = 2'-氟核苷，mG和mA-2'-OME核苦，其 他核苷是2'-OH, 3T表示反向胸^^嘧p定脱氧核普。
在分支40 kDa PEG是2， 3 -又又（mPEG - [20 kDa〗）-丙
基- 1 -氨基甲酰的实施方案中，提供了具有以下结构式的适体：
formula see original document page 36
其中
------表示一种连接物
适体=
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUinGmAmGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG-3T (序列号：4),
其中fC和fU-2'-氟核苷，mG和mA-2'-OME核苦，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸A泉嘧。定脱氧核苦。
本发明的一些实施方案中连接物是一种烷基连接物。特定实 施方案中，烷基连接物包括2至18个连续CH2基团。合适的实 施方案中，烷基连接物包括2至12个连续CH2基团。特别合适 的实施方案中烷基连接物包括3至6个连续CH2基团。
特别实施方案中，适体ARC187 (序列号：5)具有以下结构
式：formula see original document page 37
其中适体-
{CmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUinGmAmGfUfCfUinGniAmGfUfUfUAiCf CfUmG£CmG-3T ( *列号：4 ),
其中fC和fU = 2，-氟核苷，mG和mA-2'-OME核苷，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸腺嘧啶脱氧核苦。
适体的另一实施方案中，ARC1905 (序列号：67)具有以下 结构式：
formula see original document page 37
其中适体=
fCmGfCfbGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUinGmAmGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG國3T (序歹ij号：4 )
其中fC和fU-2'-氟核普，mG和mA-2'-OME核苦，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸腺嘧咬脱氧核苦。
一个实施方案中，提供了包括有效数量的ARC186(序列号： 4)， ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)或其盐 类的眼部药物组合物，以在主体中治疗，稳定和/或预防补体-介 导的眼部失调。本发明的药物组合物可以包4舌一种药物可4妄受载 体或稀释剂。本方面，发明提供了一种包括治疗有效数量适体的药物组合物或其盐类和药物可接受载体或稀释剂，抑制C5补体 蛋白体内裂解。本发明的该方面，提供了体内治疗，稳定和/或预 防眼部疾病的ARC186 (序列号：4), ARC187(序列号：5)或 ARC1905 (序列号：67)药物组合物。本发明的该方面，也提供 了用于制备体内治疗，稳、定和/或预防眼部疾病药物组合物的AR C186 (序列号：4)， ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列 号：67)。
另 一实施方案中，提供了包括治疗有效凄t量抗-C5适体的眼 部药物组合物，其包括从以下组中选择的核酸序列：序列号：1 至69， 75， 76, 81， 91, 95和96,用于制备补体-介导药物治 疗方案使用的药物组合物。该方面，本发明提供了抑制C5补体 蛋白体内裂解的包括治疗有效数量适体的药物组合物或其盐类， 和药物可接受载体或稀释剂。
另一实施方案中，本发明^是供了药物组合物。 一个实施方案 中，提供了包括治疗有效数量的ARC187 (序列号'.5)或ARC1 905 (序列号：67)或其盐类的药物组合物。本发明的药物组合 物可以包括药物可接受载体或稀释剂。该方面，发明提供了包括 抑制C5补体蛋白体内裂解的包括治疗有效凄t量适体的药物组合 了物或其盐类，和药物可接受载体或稀释剂。发明的该方面，才是 供用于治疗，预防或改善体内疾病的ARC187 (序列号：5)或A RC1905 (序列号：67)药物组合物。发明的该方面也4是供了用 于制备药物纟且合物的ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序歹" 号：67)。
发明的另一方面，4是供了治疗的方法。 一个实施方案中，本 发明的方法提供了治疗，预防或改善C5补体蛋白，和/或其派生 物C5a和C5b - 9介导的疾病，该方法包括对脊推动物施用包括 ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)的药物纟且合物。 一些实施方案中，该方法包括^j"哺乳动物施用本发明的药物 组合物。 一些实施方案中，哺乳动物是人类。
一些实施方案中，由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾 病是急性萎缩性疾病（心肌梗死，中风，萎缩性/再灌注损伤）； 急性炎症疾病（感染疾病，败血病，中风，急性/过急性移植排斥）、 慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病^L网膜病，黄斑变性， 包括渗出性和非-渗出性AMD，并也包括过敏，哞喘，风湿性 关节炎，和其他风湿性疾病，多发性石更化和其他神经疾病，牛皮 癣和其他皮月夫病疾病，重症月几无力，系统性红斑3良痴（SLE )); 和亚急性/慢性炎症，和/或免疫-介导疾病（包括移植排斥，血 管J求性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病）。 一些实施方案中，C5 补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括偷袭或循环相关的补 体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。 一些实施方案中， C5补体蛋白，C5a和C5b - 9介导的疾病包括CABG手术相关的 心肌损伤，球嚢血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌 损伤。 一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的失 调包括CABG手术相关的心肌损伤，3求嚢血管成形术相关的心肌 损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术相关的补体蛋白介导 的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补体蛋白介导的并发 症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急性移植排斥，亚急 性移植排斥，和慢性移植排斥。 一些实施方案中所治疗的C5补 体蛋白C5a和/或C5b-9介导的疾病是CABG手术相关的并发 症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术相关的心肌损伤。 本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症状^皮减弱，稳、定和 /或预防的疾病是一种眼部失调，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性 和/或非-渗出性AMD。一些实施方案中，本发明的方法包4舌施用ARC187(序列号： 5)或ARC 1905 (序列号：67)的药物组合物以获得比内源性C 5补体蛋白高5至10倍的适体血浆浓度。 一些实施方案中，施用 药物ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)适体组 合物以获得比内源性C5补体蛋白高0.75至约5倍，0.75至3倍， 和1.5倍至约2倍于内源性C5补体蛋白的适体血浆浓度，而其 他实施方案中施用适体组合物以获得与内源性补体蛋白相等的 血浆浓度。 一些实施方案中，施用包括ARC187 (序列号：5)或 ARC1905 (序列号：67 )的药物组合物以获4寻约5pM,约4jaM, 约3pM,约2pM,约1.5(iM,约lpM或约500nM的适体血浆浓 度。
任<可给药的途径，过程，和速度都可以〗吏用，以有效获得本 发明的适体血浆浓度。 一些实施方案中，药物组合物通过《争月永内 纟会药。 一些实施方案中，药物组合物通过4,注和/或通过连续灌注 给药。
治疗，预防和/或改善CABG手术相关的并发症，特别是CA BG手术相关的心肌损伤的特别实施方案中，方法包括在手术前 施用药物组合物并连续纟合药至少24小时， 一些实施方案中为48 小时或， 一些实施方案中为72小时。本发明的特别实施方案中， 在静脉灌注较低剂量适体之前，同时或之后通过静脉内推注约0. 75至1.25,合适地为lmg适体每kg病人的适体，以获得约两倍 于内源性补体蛋白浓度的血浆适体浓度，其中mg剂量不包括共 价PEG的重量。 一些实施方案中，较低剂量将以0.001至0.005 mg/kg/min的速度灌注，其中mg剂量不包括共价PEG重量。一 个特别实施方案中，较低剂量将以0.0013mg/kg/min的速度灌注。 本发明方面的其他实施方案中，其中适体/共价物包括充分长的半
40衰期，适体药物组合物可以每天通过静月永内4,注 一 次或两次给药。
本发明的另一方面，4是供了i貪断方法。 一个实施方案中，衫、
断方法包括将ARC187 (序列号：5 )或ARC1905 (序列号：67) 与怀疑包括C5补体蛋白或其变体的组合物接触，并测定C5补 体蛋白质或其变体的存在或缺失。 一些实施方案中补体蛋白或变 体是属于脊推动物，特别是哺乳动物，更特别是人类。本发明提 供了用于体外或体内诊断的ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)组合物。
本发明的另 一方面，提供了包括从下列组中选择核苦序列的 适体：ARC330 (序歹U号；2), ARC188 - 189， ARC250, ARC2 96 - 297, ARC331 - 334， ARC41卜440， ARC457-459， ARC4 73， ARC522 - 525， ARC532， ARC543 - 544， ARC550 - 554, ARC657 - 658, ARC672， ARC706, ARC1537，和ARC1730 (序 列号：6至序列号：66)。另一实施方案中，^是供了用于制备药物 纟且合4勿的ARC330 (序列号；2), ARC188 - 189， ARC250， AR C296- 297, ARC331 - 334, ARC411 -440， ARC457-459， AR C473, ARC522 - 525, ARC532, ARC543 - 544, ARC550- 554， ARC657 - 658， ARC672， ARC706, ARC1537,和ARC1730 (序 列号：6至序列号：66)中的4壬一种。在此方面，本发明^是供了 包括抑制C5补体蛋白体内裂解的治疗有效数量的适体或其盐类 和一种药物可接受载体或稀释剂。
特别实施方案中，提供了包括序列号：l的核苷序列的适体。 特别实施方案中，提供了从序列号：61,序列号：62,序列号： 64至序列号：66中选择核苷序列的适体。 一些实施方案中，当 适体包括从序列号：61,序列号：62,序列号：64至序列号：66中选择的核苷序列时，该适体对C5补体蛋白的结合亲和力与 包括序列号：4但缺少PEG配基的适体充分相同。
特别实施方案中，当适体包括从序列号：61，序列号：62, 序列号：64至序列号：66中选择的核芬序列时，以实施例5E中 的两室模型测定的半衰期，特别是终端半衰期，在灵长类中至少 为16,合适地为30小时。 一些实施方案中，当适体包括从序列 号：61,序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的核苦 序列时，以实施例5E中的两室才莫型测定的半衰期，特别是终端 半衰期，在大鼠中至少为1个半小时，合适地为至少7个小时。
本发明该方面的一些实施方案中，当适体包括从序列号：61, 序列号：62,序列号：64至序列号：66中选4奪的核苷序列时，
适体如下以带有5'连4妾物形式合成：H2N---5'适体3',其
中---表示连4妄物。 一些实施方案中该连4矣物是》克基连4妄物：
H2N- ( CH2) n-5'适体3',其中11 = 2至18,合适地"2- 12, 更合适地n = 3 至 6, 更合适地 n = 6, 并且适体
fCmGfCKGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG-3T (序歹'J号：4 )
其中fC和fU = 2'-氟核苦，mG和mA = 2' - OME核苦，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸腺嘧咬脱氧核苷。最后的氨 基-1务饰适体可以与乂人包4舌10 kDa PEG, 20kDa PEG, 30kDa PEG和40kDa PEG线性PEG的组中选4奪的PEG配基结合。一 些实施方案中，提供了治疗有效数量适体或其盐类的药物组合 物，其包括「乂人序列号：1,序列号：2和序列号6至序列号：66 的组中选择的核苷序列，特别是从序列号：61，序列号：62，序 列号：64至序列号：66中选才奪的核苷序列。本发明的药物组合 物可以包括药物可4妄受载体或稀释剂。本发明的该方面，纟是供了 用于治疗，预防或改善体内疾病的药物组合物，其包括从序列号：2和序列号6至序列号：66中选择核苷序列的适体，特别是乂人序 列号：61,序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的。
另一实施方案中，^是供了治疗，预防或改善C5补体蛋白介 导的疾病的方法，包括对脊推动物施用包括一种适体或其盐类的 药物组合物，其中适体包括从：序列号2和序列号：6至序列号： 66的组中选才奪的核酸序列，特别是序列号：61,序列号：62,和 序列号：64至66。本发明的一些实施方案中，方法包括^f哺乳 动物，合适地为人类施用本发明的药物组合物。
一些实施方案中，治疗的C5 4卜体蛋白，C5a和/或C5b-9 -介导的疾病是急性萎缩性疾病（心肌梗死，中风，萎缩性/再灌 注损伤）；急性炎症疾病（感染疾病，败血病，中风，急性/过急 性移植排斥）、慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病视网 膜病，黄斑变性，包括渗出性和非-渗出性AMD,并也包括过 敏，哮喘，风湿性关节炎，和其他风湿性疾病，多发性硬化和其 寸也神经疾病，牛皮裤和其他皮月夫病疾病，重症月几无力，系统性红 斑《良掩（SLE));和亚急性/'隄性炎症，和/或免疫-介导疾病（包 括移一直排斥，血管5求性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病。 一些实 施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括<俞袭或 循环相关的补体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。一 些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括C ABG手术相关的心力几损伤，J求嚢血管成形术相关的心"几损伤和 再3夹窄相关的心月几损伤。 一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a 和C5b - 9介导的失调包括CABG手术相关的心肌损伤，^求嚢血 管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术 相关的补体蛋白介导的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补 体蛋白介导的并发症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急 性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥。 一些实施方案中所治疗的C5补体蛋白C5a和/或C5b- 9介导的疾病是CABG 手术相关的并发症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术 相关的心月几损伤。本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症 状一皮减弱，稳定和/或预防的疾病是一种眼部失调，特别是并唐尿病 3见网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的方法包4舌对主体施用包4舌一种适 体的药物组合物，其包括^人序列号：2，序列号：6至序列号：6 6中选l奪的核酸序列，特别是序列号：61,序列号：62，和序列 号：64至序列号：66,使主体的适体血浆浓度为内源性C5补体 蛋白浓度的0.5至10倍。 一些实施方案中，施用药物适体组合物 以获得比内源性C5补体蛋白高0.75至约5倍，0.75至3倍，和 1.5倍至约2倍于内源性C5补体蛋白的适体血浆浓度，而其他实 施方案中施用适体组合物以获得与内源性补体蛋白相等的血浆 浓度。 一些实施方案中，施用本发明的药物组合物以获得约5ja M,约4|_iM,约3pM，约2jiM,约1,5pM,约lnM或约500nM 的适体血浆浓度。
可以使用任何有效获得本发明适体浓度的给药途径，过程， 和速度。 一些实施方案中，药物组合物通过静脉内给药。 一些实 施方案中，药物组合物通过4,注和/或连续灌注《会药。
在治疗，预防和/改善CABG手术相关的并发症，特别是CA BG手术相关的心月几损伤的特别实施方案中，本发明包4舌在手术 前和之后至少24小时连续^吏用药物症且合物， 一些实施方案中为4 8小时或在一些实施方案中为72小时。本发明的特定实施方案 中，所期望的适体血浆浓度，例如，在一些实施方案中为内源性 补体蛋白浓度的两倍，是对所治疗的病人静脉内灌注低剂量适体 之前，同时，或之后，通过静脉内推注给药而获得的。本发明的
44另一实施方案中，当适体/共价物包括充分长的半衰期时，适体药
物组合物可以通过静脉内推注每天虛会药1至2次。
本发明的另一实施方案中提供了诊断方法。 一个实施方案 中，诊断方法包括将组合物与一种适体接触，其包括序列号：2 和序列号：6至序列号66的核酸序列，特别是序列号：61，序列 号：62,和序列号：64至序列号：66,并测定组合物中C5补体 蛋白或其变体的存在或缺失。 一些实施方案中，补体蛋白或变体 是脊推动物的，特别是哺乳动物的，更特别是人类的。本发明提 供的适体组合物具有包括^人序列号：2和序列号6至序列号66 中选择的核酸序列的适体，用于体外或体内诊断。目前的发明中， 提供了包括从序列号：2和序列号6至序列号66中选择的核酸序 列的适体，用于制备药物组合物。
本发明的另一方面，提供了包括一种核酸序列的适体，其与 序列号：75至81,序列号：83,和序列号88至98中选^奪的序 列具有80%—致性。 一些实施方案中，提供了包括一种核酸序列 的适体，其与序列号：75至81,序列号：83，和序列号88至9 8中选择的任意序列的唯一区域具有80%—致性。另一实施方案 中，纟是供了包括一种核酸序列的适体，其与序列号：75至81， 序列号：83,和序列号88至98中选择的序列具有90%—致性。 一种特别实施方案中，提供了包括一种核酸序列的适体，其与序 列号：75至81,序列号：83,和序列号88至98中选择的^f壬意 序列的唯一区域具有90%—致性。而在另一实施方案中，提供了 包括一种核酸序列的适体，其中的40个连续核苷与序列号：75 至81，序列号：83，和序列号88至98中任意选"t奪的序列中的4 0个连续核苷一致。另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列 的适体，其中的30个连续核苷与序列号：75至81,序列号：83， 和序列号88至98中任意选择的序列中的30个连续核苷一致。而另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列的特异结合C5补 体蛋白的适体，其中的10个连续核苷与序列号：75至81,序列 号：83,和序列号88至98中任意选择的序列中的10个连续核 苷一致。 一种合适的实施方案中，提供了包括一个核苷序列的适 体，其与序列号：75至81,序列号：83，和序列号88至98中 任意选择的序列一致。
一些实施方案中，上述的本发明的适体可以进一步包括下列 组中选择的化学修饰：糖基位置的化学替换；磷酸位置的化学替 换；核酸序列的碱基位置的划足额替换。 一些实施方案中，修饰 是从以下组中选择的：修饰核苷的整合；3'加帽子，与高分子量 非-免疫原化合物的共价结合；亲脂化合物的共价结合；磷酸骨 架的纟务饰。
本发明的特别实施方案中，适体调整C5补体蛋白或其变体 的功能。特别合适的实施方案中，适体抑制C5补体蛋白或其变 体的功能，特别是在体内，更特别是在人体内。本发明的一个实 施方案中，适体的功能调整，合适地为抑制，是对C5补体蛋白 的裂解。
另一方面的一些实施方案中，本发明提供了抑制C5补体蛋 白体内裂解的包4舌治疗有效凄吏量适体或其盐类的药物组合物和 一种药物可接受载体或稀释剂。
一些实施方案中，提供了 一种包括治疗有效数量的药物组合 物或其盐类，其与序列号：75至81，序列号：83,和序列号88 至98中选4奪的序列具有80% ,合适地为90%的一致性。 一些实 施方案中，提供了 一种包括治疗有效数量的药物组合物或其盐 类，其与序列号：75至81,序列号：83,和序列号88至98中 选4奪的任意序列的唯一区域具有80% ，合适地为9Qo/。的一致性。其他实施方案中，提供了包括一种治疗有效数量适体的药物组合
物，其中的40, 30或10个连续4亥苷与序列号：75至81,序列 号：83,和序列号88至98中选择的核苦序列的40, 30或10个 连续核苷一致。迸发明的药物组合物也可以包4舌一种药物可4妄受 载体或稀释剂。本发明的该方面提供了用于治疗，预防或改善体 内疾病的药物组合物，其中该药物组合物包4舌的适体或其盐类具 有从序列号：3至4,序列号：75至81,序列号：83和序列号： 88至98中选择的核苷序列。本方面，^是供了用于制备药物组合 物的具有从序列号：3至4，序列号：75至81,序列号：83和序 列号：88至98中选择的核苷序列的适体。本方面，本发明提供 了包括一种治疗有效lt量的适体或其盐类的药物组合物，其可抑 制C5补体蛋白的体内裂解，及一种药物可接受载体或稀释剂。
一些实施方案中，治疗的C5 4卜体蛋白，C5a和/或C5b-9 -介导的疾病是急性萎缩性疾病（心肌梗死，中风，萎缩性/再灌 注损伤）；急性炎症疾病（感染疾病，败血病，中风，急性/过急 性移植排斥）、慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病视网 膜病，黄斑变性，包括渗出性和非-渗出性AMD,并也包4舌过 ^t,哞喘，风湿性关节炎，和其他风湿性疾病，多发性^:化和其 他神经疾病，牛皮癣和其他皮肤病疾病，重症肌无力，系统性红 斑《良疳（SLE));和亚急性/'隄性炎症，和/或免疫-介导疾病（包 括移植排斥，血管^求性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病。 一些实 施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括-愉袭或 循环相关的补体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。一 些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括C ABG手术相关的心l几损伤，5求嚢血管成形术相关的心力几损伤和 再3夹窄相关的心月几损伤。 一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a 和C5b-9介导的失调包括CABG手术相关的心肌损伤，5求嚢血 管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术相关的补体蛋白介导的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补 体蛋白介导的并发症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急 性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥。 一些实施方案
中所治疗的C5补体蛋白C5a和/或C5b- 9介导的疾病是CABG 手术相关的并发症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术 相关的心肌损伤。本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症 状萍皮减弱，稳定和/或预防的疾病是一种眼部失调，特别是净唐尿病 #见网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的方法包括对主体施用包括一种适 体的药物组合物，其包括:/人序列号：3至4,序列号：75至81, 序列号：83和序列号：88至98中选择的核酸序列，特別是序列 号：61，序列号：62,和序列号：64至序列号：66， 4吏主体的适 体血浆浓度为内源性C5补体蛋白浓度的0.5至10倍。 一些实施 方案中，施用药物适体组合物以获得比内源性C5补体蛋白高0. 75至约5倍，0.75至3倍，和1.5倍至约2倍于内源性C5补体 蛋白的适体血浆浓度，而其他实施方案中施用适体组合物以获得 与内源性补体蛋白相等的血浆浓度。 一些实施方案中，施用本发 明的药物《且合物以获4寻约5|aM,约4pM,约3jiM,约2pM,约 1.5jiM，约lpM或约500nM的适体血浆浓度。
可以使用任何有效获得本发明适体浓度的给药途径，过程， 和速度。 一些实施方案中，药物组合物通过静月永内给药。 一些实 施方案中，药物组合物通过4,注和/或连续灌注症合药。
在治疗，预防和/改善CABG手术相关的并发症，特别是CA BG手术相关的心月几损伤的特別实施方案中，本发明包4舌在手术 前和之后至少24小时连续^吏用药物《且合物， 一些实施方案中为4 8小时或在一些实施方案中为72小时。本发明的特定实施方案 中，所期望的适体血浆浓度，例如，在一些实施方案中为内源性补体蛋白浓度的两倍，是对所治疗的病人静脉内灌注低剂量适体 之前，同时，或之后，通过静脉内推注给药而获得的。本发明的 另一实施方案中，当适体/共价物包括充分长的半衰期时，适体药
物组合物可以通过静月永内推注每天,会药1至2次。
本发明的另一实施方案中4是供了it断方法。 一个实施方案 中，诊断方法包括将怀疑暴扣C5补体蛋白或其变体的组合物与 一种适体接触，其包4舌序列号：75至81，序列号：83和序列号 88至98的核酸序列，并测定组合物中C5补体蛋白或其变体的 存在或缺失。 一些实施方案中，补体蛋白或变体是脊推动物的， 特别是哺乳动物的，更特别是人类的。本发明提供的适体组合物 具有包括^人序列号：75至81，序列号：83和序列号88至98中 选择的核酸序列的适体，用于体外或体内i貪断。
一些实施方案中，4是供了包括一种核苷序列的适体，其本质 上由乂人序列号：68和69中选4奪的核普序列组成。 一些实施方案 中，l是供了包括一种核苷序列的适体，其由乂人序列号：68和69 中选^奪的核普序列组成。本发明的一些实施方案中，适体可以用 于i貪断方法。
一个实施方案中，本发明的一种方法直4妄治疗，稳定和/或预 防补体-介导的眼部失调，该方法包括对需要的主体使用治疗有 效数量的抗-补体适体的步骤。 一个实施方案中，所治疗的眼部 失调是黄斑变性。 一个实施方案中，所治疗的眼部失调是一种眼 部一斤血管生成失调。
适体也与自然产生的结合特定蛋白质的核酸序列不同。这些 后者序列是整合在生物体基因组中的自然发生的序列，其与涉及 自然核酸的转录，翻译和转运的蛋白质的特定亚基结合，例如， 核酸结合蛋白。另一方面，适体是短小的，分离的，非自然产生 的核酸分子。虽然适体具有与结合核酸的蛋白结合的特征，i午多 情况下这些适体具有4交少的或没有与可#皮自然核酸结合蛋白识 别的序列一致的序列。更重要的，适体事实上可以结合4壬4可蛋白 质（不仅仅是核酸结合蛋白）以及包括小分子，碳水化合物，多 肽等的任何针对的目标。对于大多数目标，甚至蛋白质，并不存
在其结合的自然产生的核酸序列；对于那些具有此序列的目标， 例如，核酸结合蛋白，这些序列与适体不同，与高亲和力适体相 比，其在自然状态的结合亲和力相对较低。
适体，与噬菌体显示或抗体所产生的多肽类似，可以特异结 合选定的目标并调整目标活性或结合力，例如，通过结合适体可 以阻抑其目标功能的能力。在抗体存在时，特定结合目标的功能 特性是一种固有特性。在抗体存在时，虽然技术人员可以不知道 一种适体对于一个目标的精确结构特性，技术人员知道在缺失精 确结构定义的情况下怎样鉴定，制备和使用这些分子。
适体也与小分子治疗剂类似，其单一结构的改变，似乎非常 微小，也可以极大影响（数个级別或量级）适体的结合和/或其他 活性。另一方面， 一些结构改变将少有或没有效果。这些结果来 自于适体结构的二级/三级的重要性。l灸而言之，适体是一种具有固定构造的三维结构，提供与其给定目标结合的化学结合力。因
此：（1) 一些区域或特定序列对于（a)结合目标的特定点，和/ 或（b)定位分子与目标的结合的序列是必需的；（2) —些区域 或特定序列具有变异范围，例如，核苷X必须是嘧啶，或核苷Y 必须是嘌呤，或核苷X和Y必须互补；和（3)—些区i或或特定 序列可以是4壬意的，其可以是充分的间隔元素，例如，其可以4吏 任何给定长度的核苷链或甚至非-核香间隔，如PEG分子。
任意寡核苷酸序列集合的体外选择试验发现，产生的适体针 对超过130种蛋白质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫球蛋 白，和受体。典型的适体为10- 15 kDa大小（20-45个才亥普）， 以」微毫摩尔至亚-樣i毫摩尔亲和力结合其目标，并区分紧密相关 的目标（例如，适体可以典型地不与来自同一基因家族的蛋白质 结合）。 一系列的结构研究已经显示适体可以z使用相同的集合交 互型（例如，氩4建，静电互补，疏水作用，空间排阻）驱动抗体 -抗原复合物的亲和力和特异性。
适体具有许多期望的用于治疗和i貪断的特性，包括高特异性 和亲和力，生物功效，和良好的药代动力学特性。此外，其提供 了优于抗体和其他蛋白生物制剂的特定竟争优势，例如：
1) 速度和控制。适体完全由体外方法制备，可以进行提前量 的快速准备，包括治疗提前量。体外选纟奪使得适体的特异性和亲 和力是高度受控的并制备引导，包括针对毒素和非-免疫原目标 的引导。
2) 毒性和免疫原性。适体作为一种类型，具有显著的治疗可 接受毒性并缺少免疫原性。然而许多单克隆抗体的效果可被其抗 体自身的免疫反应限制，而激发适体的抗体是非常困难的，主要因为适体不能通过mhc #皮t-细月包表达，而免疫应答通常#:驯
化为对核酸片#殳无识别。
3) 给药。许多目前提供的抗体治疗剂通过静脉灌输给药（通 常超过2-4小时），而适体可以通过皮下注射纟会药（适体通过皮 下给药的生物利用率在猴子试验研究中〉80% (Tucker等，J.Chr omatography B. 732: 203 — 212, 1999))。 jt匕区另'J主要由于》、台疗 性mAbs相当低的可溶性从而需要的体积较大。具有良好溶解性 (>150mg/mL)和相对更低的分子量（适体：10-50kDa;抗体： 150 kDa),适体的周使用剂量可以以小于0.5mL的体积注射输 送。此外，另一个适体-基础的治疗或预防优点为，适体的较小 体积可以使其渗透入紧缩构想区域，而抗体或抗体片段无法渗透 入。
4) 可度量性和价格。治疗适体是化学合成的因此可以容易地 根据生产需求度量。而对生产的度量的困难性限制了 一些生物制. 剂的实用性，并且高-通量蛋白质制备设备的费用也是巨大的， 而一个高-通量寡核苷酸合成系统的产量至少为100kg/年，并且 只需要相对适度的初始才殳资。目前千克级的适体合成的费用估计 为500美元/克，与高度优化的抗体具有可比性。研究过程中的不 断进步可以预计在5年内费用将降低至低于100美元/克。
5) 稳定性。治疗性适体是化学稳健的。其在暴露于各种因子 如热和变性剂时能固有地j呆持活性，并且以冻干4分末在室温下能 保存相当长时间（〉1年）。相反，抗体必须冰冻保存。
补体系统。补体系统包括一组至少为20- 30胞质和膜蛋白， 其在受调控的级4关系统中共同作用以攻击细月包外的病原体形式 (例如，细菌）。补体系统包括三个不同的酶活性级联，经典，凝集素和选择性路径（图1 ),其集合了 C5的活性并产生已知为膜 攻击途径的非-酶途径。
第一种酶活性级联，其已知为经典途径，包括几种成分，Cl， C4， C2, C3和C5 (以途径中的顺序排列）。随着第一种补体成 分（Cl )通过免疫和非-免疫活性因子而结合和激活，补体系统 的经典途径的开始发生。Cl包4舌一个Clq, Clr和Cls的4丐-依 赖复合物，并且通过结合Clq成分而激活。Clq包括六个相同的 亚基，并且每个亚基包括三条链（A, B和C链）。每个链具有一 个连4妄力交原质-类似物尾部的5求状头部。抗原-抗体复合物乂于于 Clq的结合和激活发生在Clq的头部区域。大量的非-抗体Clq 激活物质，包括蛋白质，脂质和核酸，通过月交原-类似颈部区域 的独特位点结合和激活Clq。通过Clq的补体激活剂的分子识别 引发了构象改变，刺激酶原Clr自身激活，其反过来促进Cls的 蛋白水解。Cs随后催化补体成分C4和C2的活性，形成具C3 转化酶功能的C4bC2a复合物。
第二个已知为凝集素途径酶活化级联，除了 MBL/MASP-2 复合物取代C1之外，都与第一个类似。甘露聚糖-结合凝集素 (MBL)直接识别细菌表面的含有甘露糖的多糖，并在结构和功 能上与Cl的成分Clq同源。MBL与激活剂的结合引导了 MBL —相关蛋白酶2 (MASP —2)的活寸生。MASP-2,反过来以Cls 功能同源的方式激活C4和C2,引导C3转化酶的形成。
第三种酶活性级^:，已知为选才奪性途径，是一种快速的，抗 体_不依赖的补体系统激活和方法途径。选才奪性途径包括几种成 分，C3，因子B,和因子D (以途径中的顺序排列）。选择性途 径的激活发生于C3b, —种C3的水解裂解形式，与活性表面如 细菌的结合时。因子B随后与C3b结合，并被因子D切割形成 C3转化酶C3bBb。当产生和沉积额外的C3b时发生C3转化酶活性的放大。阳性调节蛋白备解素（P)的结合进一步促进放大反
应，其提高活化转化酶的降解稳定性，使半衰期从l-2分钟延 长至18分钟。
这样，所有三个途径都产生裂解因子C3为C3a和C3b的C 3转化酶。这时，C3转化酶（经典/凝集素和选择性）进一步装 配为C5转化酶（C4b2a3b和C3b3bBb )。这些复合物随后裂解补 体成分C5为两种成分：C5a多肽（9kDa)和C5b多肽（170kDa)。 C5a多肽结合7重跨膜G -蛋白结合受体，其最初与白细胞相关， 并且目前已知在多种组织中表达，包括肝细胞和神经细胞。C5a 分子是人补体系统最初的趋化成分，并可以引发多种生物应答， 包括白细胞趋化性，平滑月几收缩，细胞内信号传导途径的激活， 嗜中性粒细月包-内皮细月包附着，细月包因子和脂质调节释》文和氧化 剂形成。
更大的C5b片段继而与随后的补体级联，C6， C7, C8和C 9结合形成C5b-9膜攻击复合物（'MAC，)。 C5b - 9 MAC可以 直接裂解红血球，并在更大程度上，其对白细胞裂解并损害组织， 如肌肉，上皮和内皮细胞。亚溶破剂量中，MAC可以刺激上调 分子的附着，细胞内4丐的释放和细胞因子的释放。此夕卜，C5b-9 MAC可以刺激内皮细胞和血小板细胞而不导致细胞裂解。C5a 和C5b-9 MAC的非-裂解效应有时非常相似。
虽然补体系统在维持i^康中具有非常重要的作用，-f旦其也具 有导致或引发疾病的潜在可能。例如，补体系统已经在冠状动月永 搭桥术（f'CABG，）手术，众多肾脏，风湿，神经，皮肤病，血液 病，动"永/力申，过壽文，感染，和生物适应性A沐克疾病和/或情况中 表现出其副作用。补体系统不是疾病的唯一导致因素， <旦其可能 是导致疾病的几种因素之一。目前，数据显示在眼疾中也包括补体。此外，拥有新的补体 系统抑制剂有助于补体_相关眼疾的治疗和it断。
附图说明
图1是描述补体系统的经典和选择性途径的示意图。
图2是描述从寡核苷酸随机序列集合中进行体外适体选择（S ELEXTM)方法的示意图。
图3A是描述抗-C5适体的核酸序列和二级结构（序列号： 1 )的示意图，其中带下划线的残基是2'-H嘧啶残基或2'-氟 嘧咬残基，加框的残基是2'-氟嘧咬残基或2' - OMe嘧啶残基， 以箭头（—）表示的残基表示必须含有2'-氟修饰的残基。
图3B是描述ARC330抗-C5适体的核酸序列和二级结构 (序列号：2)的示意图，其中带圈的残基是2'-H残基，嘧啶残 基是2，-氟替换的，主要的嘌呤残基是2'-OMe替换，除了突出 显示的三个2' - OH噤p令歹戋基。
图3C是描述ARC186抗-C5适体的核酸序列和二级结构 (序列号：4)的示意图，其中所有21个嘧i定残基具有2'-氟〈奮 饰，主要的噤^令（14个残基）具有2'-OMe》务饰，除了突出显 示的三个2' - OH噤p令残基。
图4是40 kD分支PEG ( 1, 3 -双（mPEG - [20 kDa])-丙基-2- (4'-丁唑酰胺）的示意图。
图5是4妄触适体5'末端的40 kD分支PEG (1, 3 - 乂又（mP EG-[20kDa])-丙基-2 - ( 4'- 丁^坐酰胺）的示意图。
18图6描述各种合成高分子量PEG-核酸共轭物的方法示意图。
图7A是PEG化抗-C5适体（ARC657 (序列号：61), AR C658 (序列号：62)，和ARC187(序列号：5)),相对于非-P EG化抗-C5适体（ARC186 (序列号：4))的剂量依赖的溶血 抑制作用；图7B是图7A中描述的在溶血试验中使用的适体的I Cso值表;图7C是比较PEG化抗-C5适体ARC187(序列号：5)， ARC1537 (序列号：65)， ARC1730 (序列号：66)，和ARC 190 5 (序列号：67)的剂量依赖的溶血抑制作用；图7D是图7A中 描述的在溶血试—睑中^f吏用的适体的ICs。值表。
图8是猕猴血清补体相对于人类血清补体中抗-C5适体，A RC658 (序列号：62)的;容血抑制百分率示意图。
图9是37度和室温（23度）孵育15分钟时ARC186 (序列 号：4)结合纯化C5蛋白的示意图。
图10是37度和室温（23度）孵育4小时时ARC186 (序歹。 号：4)结合纯化C5蛋白的示意图。
图11是C5 - ARC 186复合物在23度时的分解时间过程示意图。
图12是C5 - ARC 186复合物在23度时形成的平衡时间过程 示意图。
图13是C5蛋白相对于补体级耳关中的上游和下游蛋白成分与 ARC186 (序列号：4)的结合示意图。图14是存在未标记竟争物ARC186 (序列号：4)， ARC657 (序列号：61), ARC658 (序歹'J号：62 )或ARC187 (序列号：5) 时，放射标记的ARC186 (序列号：4 )结合C5的百分率示意图。
图15是描述以不同浓度的ARC186 (序列号：4)适体，25 度和37度孵育5小时，血液样本中C5b补体蛋白的产生数量示 意图。
图16是描述未稀释人类血清，柠檬酸处理人全血和猕猴血 清中，存在酵母聚糖时ARC187(序列号：5)的补体抑制百分率。
图17是显示实施例1D管状回环模型中ARC658 (序列号： 62)对于补体活性（C5a)的完全抑制。
图18是描述第10轮C5选4奪集合的分离常数示意图。通过 将数字带入等式：分离片段结合z增幅xKd/(Kd+[C5]),评估分 离常数（Kds)。"ARC520"(序列号：70)指天然未选择的dRmY 集合，"+ "指存在竟争物（0.1mg/ml tRNA, 0.1mg/ml鮭精DNA )。
图19是描述C5克隆分离常数曲线的示意图。通过将数字带 入等式：片段RNA结合-增幅xKd/ (Kd+[C5])，评估分离常数 (KdS )。
图20是描述不同浓度的抗C5适体克隆ARC913 (序列号： 75)对比于ARC186 (序列号：4)对于溶血活性的抑制效应IC5 0曲线。
图21是ARC187 (序列号：5)的结构示意图。 图22是ARC1905 (序列号：67)的结构示意图。图23是描述第一个分离灌注心脏研究的试验设计大纲表。
图24是描述暴露于人血浆（A)的分离心脏左心房（LV) 心房内压力的压力轨迹与暴露于对照适体溶液（B)的LVP压力 轨迹比4交示意图。
图25是分离心脏暴露于等摩尔，10x和50x适体/C5溶液（正 常的，未稀释的人血浆中C5的估计浓度约为500nm)时，左心 房（LV)心室内压力轨迹比较示意图。
图26是分离小鼠心脏暴露于人血浆和不同的血浆/适体溶液 的每分钟心跳（bpm)心律改变比较示意图。
图27是分离小鼠心脏暴露于含有0- lx摩尔比值ARC186 (序列号：4)(失效心脏），或10-50x摩尔比值（C5适体保护心 脏）前后的心脏重量改变比4交示意图。
图28是灌注分离小鼠心脏中，含有不同浓度适体的人血浆 的相关C5a产生比较示意图。相关C5a浓度以吸收单位（Abs ) 注释，其中更高的读凄t表示存在更高水平的C5a。
图29是灌注分离小鼠心脏中，含有不同浓度适体的人血浆 的相关可溶性C5b - 9产生比4支示意图。
图30是小鼠心脏流出物中ARC186 (序列号：4)对于C3 裂解效应的示意图。
图31是分离灌注心脏研究中免疫组化染色结果示意表。
图32是显示人血清和灵长类血清中，保护心脏不受C5b-介 导损害的所需ARC658 (序列号：62)的摩尔比率图标。
21图33是显示大鼠和猕猴血浆中，作为孵育时间函数的全长A RC186剩余百分数的对数-线性图。
图34是显示实施例5中描述的以Sprague - Dawley率表示的 药«动力学研究试-验i殳计示意图。
图35是ARC657 (序歹'J号：61)， ARC658 (序歹'J号：62 )或 ARC187 (序列号：5)相对于Sprague - Dawley率中时间的平均
血浆浓度示意图。
图36是大鼠经静脉施用适体后，各时间的ARC657(序列号： 61), ARC658 (序列号：62)或ARC187 (序列号：5)平均血
浆浓度示意图。
图37是显示图35和图36描述的浓度相对于时间数据的非 间隔分析示意图。
图38A是描述小鼠中ARC187(序列号：5)和ARC1905 (序 列号：67)的药代动力学研究设计图。图38B是描述CD- 1小 鼠中ARC187 (序列号：5)和ARC1905 (序列号：67)的药代^ 动力学研究i史计图；图38C是显示图38B描述的浓度相对于时 间数据的非间隔分析表。
图39是显示静脉内给药后小鼠心脏组织中所列适体的测定 结果表。
图40是显示实施例5E中描述的动物研究1的试-验-没计表。
图41是显示对猕f吳静脉内推注施用适体后相对于时间的适 体血浆浓度表。图42是研究1中对猕猴静脉内给药后ARC657 (序列号：6 1), ARC658 (序列号：62)和ARC 187 (序列号：5)的药代动 力学参凄t表。
图43 ( a )和43 ( c )是4葛述浙尔《美静月永内施用4元—C5适体A RC657 (序列号：61)， ARC658 (序列号：62)和ARC187 (序 列号：5)后各时间sC5b-9和C5a的血浆浓度示意图；图43 ( b ) 和43 ( d)是描述sC5b - 9和C5a的血浆浓度相对于才元-C5适 体ARC657 (序歹'J号：61)， ARC658 (序歹'J号：62)和ARC187 (序列号：5)浓度的示意图。
图44是显示实施例5F中描述的研究2试-验i殳计表。
图45是描述猕猴静脉内施用ARC658 (序列号：62)或AR C187 (序列号：5)后不同时间点平均适体血浆浓度示意图。
图46是显示你后l争月永内推注施用适体后浓度相对于时间的 两个房室分一斤表。
图47是描述猕猴血浆中存在酵母聚糖时C5b - 9浓度相对于 ARC187(序列号：5 )和ARC658 (序列号：62)浓度的示意图。
图48是描述猕猴血浆中存在酵母聚^唐时C5a浓度相对于AR C187(序列号：5)和ARC658 (序列号：62)浓度的示意图。
图49是描述猕猴静脉内推注给药时和之后ARC 187(序列号： 5)的PK-PD研究表。
图50是描述猕猴静脉内推注给药后ARC187 (序列号：5) 的药代动力学参数表。图51是描述猕lf吳静脉内推注《会药后ARC187 (序列号：5) 的计算和实际测定的药代动力学参数示意图。
图52是描述猕猴^争脉内推注症合药后剩余活性ARC187(序列 号：5)的血浆浓度水平示意图。
图53是CABG手术中预测的抗-C5适体人用需要剂量表。
图54是以凝血时间（PT)和活化部分凝血活酶时间（APTT) 测定的显示ARC187 (序列号：5 )没有体外相对凝血效应的示意图。
图55是显示ARC187 (序列号：5)对于肝素的抗-凝血活 性，和鱼精蛋白促凝集活性的体外效应表。
图56是显示ARC187 (序列号：5)不影响肝素体内抗達是血 的示意图。
图57是以酵母聚糖补体活性抑制测定的，肝素和鱼4青蛋白 对于ARC187 (序列号：5)抗-补体功能无岁文应的示意图。
图58是显示存在人血清时作为抗-C5适体ARC1905(序歹'J 号：67)或ARC672 (序列号：63)的函凄t的绵羊红细月包溶血4中 制百分数的示意图。
图59A是存在人，猕猴和大鼠血清时ARC1905 (序列号：6 7)的溶血抑制百分数示意图；图59B是存在人，猕猴和大鼠血 清时，ARC1905, —种抗-C5适体，或ARC127， 一种不结合C 5的非相关适体（阴性对照）的补体活性抑制IQ。值表。图60是在竟争结合试验中，作为未标记的竟争物ARC1905 (序列号：67)或ARC672 (序列号：63 )(水平轴）浓度的函数， 放射标记ARC186 (序列号：4)(纵轴）的抑制ICso值示意图。
图61是竟争结合试验中，37度和25度时，作为未标记的竟 争物ARC 1905 (序列号：67)(水平轴）浓度的函数，放射标记 ARC186 (序列号：4)(纵轴）的抑制ICso值示意图。
图62是描述人C5a (hC5a)和猕f美C5a ( hC5a eq )的标准
曲线示意图。
图63是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试-睑测定的，人 和猕猴血清中ARC1905 (序列号：67 ) C5活性抑制IC50, IC90，
和IC99值表。
图64是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试一验测定的，作 为人和猕猴血清中ARC1905 (序列号：67)函数的C5a产生的 承卩制百分率。
图65是描述以酵母聚糖-介导的补体活性试-验测定的，人 和猕《吳血清中ARC1905 (序列号：67)对C3a生成的效应示意图。
图66是以补体活性回环4莫型测定的，来源于5未志愿者的 人血清中ARC1905 (序列号：67 )补体活性抑制平均IC5Q, IC90，
和IC99值表。
图67是补体活性回环模型中，作为ARC1905, —种抗-C5 适体，或ARC127, —种不结合C5的非相关适体（阴性对照） 浓度的函凄t, C5a和C3a产生的抑制百分率示意图。发明内容
本发明4是供了治疗，预防和/或稳、定补体-相关的眼部疾病 (这里指眼部失调）的材料和方法。
本发明的一些实施方案中，抗-补体适体调节补体成分或其 变体的功能。特定优选实施方案中， 一种抗-补体适体抑制或减 弱补体成分或其变体的功能，优选地，在体内，特别是脊推动物 中，特别是哺乳动物中，更合适地在人体内。本发明的一些实施
方案中，例如，当C2， C3, C4， C5和/或因子B是4卜体目才示， 适体的功能调整，更适宜地为抑制，是通过蛋白裂解完成的。本 发明的一些实施方案中，例如，当C2b, C5b， C5， C7， C8, C 9，因子B和/或备解素是补体目标时，适体的功能的调整，更适 宜地为抑制，是通过活性补体成分的聚集，如转化酶或膜攻击复 合物完成的。本发明的一些实施方案中，例如，当C3b,因子D, Cl (包括Clr和/或Cls)和/或甘露糖相关丝氨酸蛋白酶CMAS P')是补体目标时，适体的功能调整，更适宜的为抑制，是通过 酶活性。本发明的一些实施方案中，例3口当C3a, C5a, C3a受 体或C5a受体是补体目标时，适体的功能调整，更适宜的为抑制， 是通过配体/受体结合。
一个实施方案中，^是供了稳定，治疗和/或预防C5a, C5a和 /或C5b-9介导的眼部失调的方法，该方法包括对需要的主体施 用稳定，治疗和/或预防眼部失调的有效数量的抗-C5药物步骤。 一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是眼部新 血管生成失调。 一些实施方案中，所稳、定的，治疗和/或预防的眼 部失调是糖尿病视网膜病变或黄斑变性，特别是年龄-相关黄斑 变性（"AMD")。 一些实施方案中，所稳、定的，治疗和/或子贞防的 AMD是渗出性AMD。 一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或 预防的AMD是非;参出性AMD。一些实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防补体介导的的
眼部失调的方法，该方法包括^对需要的主体施用有步文^i:量的抗-C5补体适体步骤。 一些实施方案中，抗-补体适体的治疗有效 凄史量是稳定，治疗和/或预防眼部失调的有效凄t量。本发明的一些 实施方案中，主体是一种脊坤,动物， 一些实施方案中是一种哺乳 动物， 一些实施方案中是人类。 一些实施方案中，稳、定，治疗和 /或预防的补体-介导的眼部失调是畸形或'f曼性炎症和/或面积介 导的眼部失调。 一些实施方案中，稳、定，治疗和/或预防的补体-介导的眼部失调是从以下组中选择的：炎症结膜炎，包括巨乳头 状结膜炎，黄斑水肺，葡萄膜炎，眼内炎，巩膜炎，角膜溃疡， 干眼症，青光眼，萎缩性视网膜病，角膜移植排斥，眼内手术相 关并发症如眼内晶状体移才直和白内障手术相关炎症，Behcet's病， Stargardt病，免疫才寻合月永管炎，Fuch's病，Vogt - Koyanagi — Har ada病，视网膜下纤维化，角膜炎，玻璃体视网膜炎症，眼部寄 生虫感染/转移，视网膜色素变性，巨细胞病毒性视网膜炎和脉络 月莫炎。 一些实施方案中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是 黄斑变性，特别是年龄-相关黄斑变性（f'AMD，)。 一些实施方案 中，所稳定的，治疗和/或预防的眼部失调是是非-渗出性(f'干燥" 和/或"萎缩，）型AMD。 一些实施方案中，所稳、定，治疗和/或预 防的眼部失调是一种眼部新生血管失调，如#唐尿病一见网"莫病变或 渗出性e'湿，）型AMD。
一些实施方案中，提供了稳定C5， C5a和/或C5b-9介导的 眼部新生血管失调的方法，4争别是;参出性AMD或4唐尿病3见网月莫 炎，包括对需要的主体施用稳定C5, C5a和/或C5b-9介导的眼 部新生血管失调的有效ft量的抗-C5药物。 一些实施方案中， 施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视觉精度与抗-C5药物 治疗过程中主体的视觉精度水平相比，维持至少相同的水平。一些实施方案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视网膜 血管密度与治疗过程中的主体相比，维持大约相同的水平。
一些实施方案中，提供了稳定补体-介导的眼部新生血管失 调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要 的主体施用稳、定补体-介导的眼部新生血管失调的有效凄t量的 抗-补体适体。 一些实施方案中，施用有效凄t量的抗-补体适体， ^吏主体的纟见觉4青度与抗-补体适体治疗过程中主体的纟见觉津貪度 水平相比，维持至少相同的水平。 一些实施方案中，施用有岁文数 量的抗-补体适体，使主体的视网膜血管密度与适体治疗过程中 的主体相比，维持大约相同的水平。 一些实施方案中，施用有效 凄t量的抗-补体适体， -使以主体中新生血管-相关的出血，流液 聚集，一见网膜分离和/或疤痕形成的水平与抗-补体适体治疗过程 中主体的新生血管-相关的出血，流液聚集， 一见网膜分离和/或痣 痕形成的水平相比保持稳定或维持。
一些实施方案中，^是供了治疗C5， C5a和/或C5b-9介导的 眼部新生血管失调的方法，特别是渗出性AMD或冲唐尿病—见网月莫 炎，包括对需要的主体施用减少C5， C5a和/或C5b-9介导的眼 部新生血管失调症状的有效凄t量的抗-C5药物。 一些实施方案 中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视觉精度与抗-C5 药物治疗过程中主体的视觉精度水平相比有所提高。 一 些实施方 案中，施用有效数量的抗-C5药物，使主体的视网膜血管密度 与治疗过禾呈中的主体相比有所减少。
一些实施方案中，提供了治疗补体-介导的眼部新生血管失 调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对需要 的主体施用减少补体-介导的眼部新生血管失调症状的有岁文凄史 量的抗-补体适体。 一些实施方案中，施用有效凄t量的抗-补体 适体，使主体的视觉精度与抗-补体适体治疗过程中主体的视觉精度水平相比有所提高。 一些实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使主体的视网膜血管密度与治疗过程中的主体相比有 所减少。 一些实施方案中，施用有效lt量的抗-补体适体，〗吏以 主体中新生血管-相关的出血，流液聚集，#见网膜分离和/或疤痕 形成的水平与抗-补体适体治疗过程中主体的新生血管-相关 的出血，流液聚集，^见网膜分离和/或疤痕形成的水平相比有所减少。
一些实施方案中，提高了预防临床补体_介导的眼部新生血
管失调的方法，特别是渗出性AMD或糖尿病视网膜炎，包括对 需要的主体施用减少补体-介导的眼部新生血管失调临床症状 的有效数量的抗-补体适体。 一些实施方案中，施用有效数量的 抗 - 补体适体以预防主体的^见觉精度临床损害。 一些实施方案 中，施用有效数量的抗-补体适体以预防主体中临床眼部新生血 管失调相关的视网膜血管密度水平。 一些实施方案中，主体具发 生眼部達斤生血管失调的危险。 一些实施方案中，方法进一步包括-在施用抗-补体适体之前，对具有补体-相关眼部新生血管失调 危险的主体进4亍-珍断。 一些实施方案中，i貪断步-骤包4舌测定主体 玻璃疣和/或视网膜色素改变和测定视觉精度无临床减弱。 一些实 施方案中，诊断步骤包括测定主体中与野生型因子H相关的变体 因子H。 Ripoche等（1998 )才艮导了野生型因子H的氨基酸序列， 人才卜体因子H的全氛基酉臾序歹'J , Biochemj.249, 593 — 602。 一些 实施方案中，当才是供了稳定，治疗和/或预防主体的补体-介导的 新生血管眼部失调，特别是糖尿病视网膜病的方法时，抗-补体 适体的给药途径是眼部或眼周给药。
一些实施方案中j是供了包4舌对主体施用抗-C5药物预防主 体临床C5， C5a和/或C5b-9介导的眼部新生血管失调，特别是 :渗出型AMD或并唐尿病一见网月莫病的方法，该方法包4舌了对主体施用有效数量的抗-C5药物步骤，以预防C5， C5a和/或C5b-9 介导的眼部新生血管失调临床症状。 一些实施方案中，施用有效 数量的抗-C5药物以预防主体视觉精度的临床损失。 一些实施 方案中，施用有效凄t量的抗-C5药物以预防主体中临床眼部新 生血管疾病相关的视网膜血管密度水平。 一些实施方案中，主体 处于发生眼部新生血管4匕失调的危险中。 一些实施方案中，该方 法进一步包括在施用抗-C5药物前对具发生C5, C5a和/或C5b -9介导的眼部新生血管失调的主体进行鉴定。 一些实施方案中， 鉴定步骤包括测定主体中玻璃疣的存在和测定视觉精度无临床 损失。 一些实施方案中，鉴定步骤包4舌测定主体中补体因子H的 变体。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包括^于主体施用^t-VEGF药物的步骤，特别是从包括以下物质的组中选才奪的VEGF 药物：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白质，多肽， 环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包4舌对主体施用4元-PDGF药物的步骤，特别是/人包括以下物质的组中选择的PDGF 药物：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白质，多肽， 环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。
上述方法的一些实施方案中，方法额外包括1寸主体施用4元-血管药物的步骤。 一些实施方案中，抗-血管药物是吟啉派生物。 卟啉派生物的一些实施方案中，是用于注射的verteporfm ( Visud yneR， Novartis药物^>司，East Hanover, NJ )。 一些实施方案中， 该方法进一步包括以激光激活卟啉派生物的方法。
一个实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防C5， C5a和/ 或C5b-9介导的非-渗出性AMD的方法，包括对需要的主体
30施用有效凄欠量的抗-C5药物以稳定，治疗和/预防非-渗出性A MD。 一个实施方案中，当非-渗出性AMD被稳定时，施用有 效凄t量的抗-C5药物，以维持与施用抗-C5药物过程中主体的 j波璃疣水平相比大约相同的5皮璃疣水平。 一个实施方案中，当非 -渗出性AMD被稳定时，施用有效数量的抗-C5药物，以维持 与施用抗-C5药物过程中主体的—见觉精度水平相比大约相同的 -现觉沣青度水平。 一个实施方案中，当治疗非-渗出性AMD时， 施用有效数量的抗-C5药物，使其玻璃疣水平与施用抗-C5药 物过程中主体的J皮璃疣水平相比有所减少。 一个实施方案中，当
治疗非-渗出性AMD时，施用有效数量的抗-C5药物，使其视 觉精度水平与施用抗-C5药物过程中主体的视觉精度水平相比 有所增高。 一个实施方案中，当予贞防非-;参出性AMD时，方法 包括对需要的主体施用有效数量的抗-C5药物以预防C5, C5a 和/或C5b-9介导的非-渗出性AMD的临床症状。 一些实施方 案中，施用有效凄t量的抗-C5药物以预防主体中碎见觉精度的临 床损失。 一些实施方案中，施用有效凄t量的抗-C5药物以预防 玻璃疣的临床水平聚集。 一些实施方案中，主体具发生非-渗出 寸生AMD的危险。 一些实施方案中，方法进一步包4舌在施用4元-C5药物前只于具发生C5， C5a和/或C5b-9介导的非-渗出性A MD危险的主体进行鉴定。 一些实施方案中，鉴定步骤包括测定 主体中3皮璃疣的存在和测定#见觉#青度无临床损失。 一些实施方案 中，鉴定步骤包4舌测定主体中补体因子H的变体。
上述方法的 一 些实施方案中，抗C 5 -药物是从包括以下物质 的组中选择的：核酸分子，适体，反义分子，RNAi分子，蛋白 质，多肽，环肽，抗体或抗体片段，糖，聚合体，小分子。特定 实施方案中，抗C5-药物是一种C5特异性适体，更特别的是从 包4舌序列号1 — 67， 75 - 81和88 - 98的组中选择的C5 4争异适体。优选实施方案中，上述方法中施用的C5特异适体是从包括ARC 187 (序列号：5)和ARCD1905 (序列号：67)的纟且中选择的。
上述方法的一些实施方案中，抗-c5药物通过眼部给药车lr 送，特别通过玻璃体内《会药。上述方法的一些实施方案中，抗-
VEGF药物，抗-PDGF药物和/或抗-血管生成药物通过眼部纟会 药输送。上述方法的一些实施方案中，施用的抗-C5药物，抗 - VEGF药物，抗-PDGF药物和/或抗-血管生成药物是一种前 体药物。上述方法的一些实施方案中，主体是人类。
上述方法中使用的术语"抗-C5药物施用过程中"包括抗-C 5药物施用前对怀*是的症状进4亍临床4企测的时间。
一个实施方案中，提供了稳定，治疗和/或预防补体介导的非 -渗出性AMD的方法，包括对需要的主体施用治疗有效凄t量的 抗-补体适体。稳定非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用 有效数量的抗-补体适体，使其玻璃疣水平（例如，大小，数量， 面积和/或形态）维4寺与抗-补体适体《会药过禾呈中的玻璃疣水平相 同。非-渗出性AMD被稳定的一个实施方案中，施用有效凄史量 的抗-补体适体，以稳定地理性萎缩的发展，包括视网膜色素上 皮细胞，感光受体和/或脉络毛细管的萎缩，以维持与抗-补体适 体施用过程中主体水平相同的地理性萎缩水平。稳定非-渗出性 AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补体适体，使其 的主体^L觉精度水平维持与抗-补体适体施用过禾呈中主体的賴L 觉精度水平相同。
治疗非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有刻:tt量的 抗-补体适体，以侵JE皮璃疣的水平，特别是大的，柔l欠的3皮璃疣 相比于施用抗-补体适体的过程中主体玻璃疣水平有所减少。治 疗非-渗出性AMD的一个实施方案中，施用有效数量的抗-补
32体适体，以使主体的视觉精度与施用抗-补体适体的过程中主体 的视觉精度相比有所提高。
一个实施方案中，^是供了预防非-渗出性AMD的方法，包 括对需要的主体施用有效数量的抗-补体适体以预防补体-介 导的非-渗出性AMD临床症状。 一个实施方案中，施用有效凄t 量的抗-补体适体，以预防主体的3见觉4青度临床损失。 一些实施 方案中，施用有效数量的抗-补体适体，以防止临床水平的玻璃 疣聚集，特别是大的，柔4欠J波璃疣。 一些实施方案中，施用有岁丈 数量的抗-补体适体，以预防临床水平的地理性萎缩。 一些实施 方案中，对具有非-渗出性AMD的主体施用有效数量的抗-补 体适体，以防止主体中渗出性AMD的发展。依稀实施方案中， 对具有年龄-相关黄斑变性的主体（以玻璃疣的存在，视网膜色 素改变和/或小区域的萎缩为特4正）施用有效凄t量的抗-补体适 体，以防止主体的渗出性AMD的发展或临床水平的地理性萎缩。
一些实施方案中，主体具有发生非-渗出性AMD的危险。 一些实施方案中，方法进一步包括在施用抗-补体适体之前对具 发生补体-介导的非-渗出性AMD的主体进行鉴定。 一些实施 方案中，鉴定步骤包括测定主体中^皮璃疣的存在，特别是大的， 柔软玻璃疣，视网膜色素改变和/或萎缩区域和测定无视觉精度临 床损失。 一些实施方案中，鉴定步艰《包4舌测定主体中野生型补体 因子H的变体。
上述方法的一些实施方案中，抗-补体适体抑制^v以下组中 选捧的补体目标：经典补体途径成分，选择性补体途径成分和血 凝途径成分。 一些实施方案中，抗-补体适体以力莫攻击途径抑制 补体目标。 一些实施方案中，抗-补体适体抑制从以下组中选择 的才卜体目才示：Cl, Clq, Clr, Cls, C2, C3， C3a, C3a受体， C4, C5, C5a, C5a受体，C5b， C6， C7， C8, C9，因子B,因子D,备解素，甘露糖结合血凝素（这里为"MBL，)， MBL相关 丝氨酸蛋白酶1 e'MASP 1，）和MBL相关丝氨酸蛋白酶2 ('MAS P 2，)。 一些实施方案中，抗-补体适体不是一种从以下组中选择 的对补体目标具有高亲和力和特异性的适体：C3a, C3a受体，C 5a,和C5a受体。 一些实施方案中，抗-补体适体不是一种/人以 下组中选4奪的对补体目标具有高亲和力和特异性的适体：因子B 和因子D。
上述方法的一些实施方案中，通过眼内给药，特别是通过晶 状体内或眼-周给药输送抗-补体适体。 一些实施方案中，对主 体施用的抗-补体适体包4舌在存^f诸形式中。
这里使用的术语"抗-补体适体给药过程中"包括对所怀疑的 症状进行临床测定或评估的时间，其中测定或评估的时间从抗-才卜体适体纟合药前至4元-4卜体适体纟会药时和之后4豆时间内，侈'B口， 纟会药12小时后，24小时后，或48小时后。
一些实施方案中，提供了包括治疗有效数量抗-补体适体的 眼部药物组合物，例如，可稳定，治疗和/或预防补体-介导的眼 部失调的有效数量。本发明的药物组合物可以包括一种药物可接 受载体或稀释剂。该方面，本发明提供了抑制眼部补体目标体内 功能，特别是人体内的，包括治疗有效tt量适体的药物组合物， 或其盐和一种药物可4妄受载体或稀释剂。 一些实施方案中，眼部 药物成分包括一种储存形式。
一种实施方案中，上述方法中^f吏用的抗-补体适体是一种抑 制体内C5,特别是人体内C5的适体。特定实施方案中，提供了 上述方法中使用的与PEG配基结合的ARC186 (序列号：4)抗 - C5适体或包括核酸序列ARC186 (序列号：4)的适体。特定 实施方案中，ARC186适体/PEG共价物与包括序列号：4序列但缺失PEG配基的适体具有基本上相同的C5补体蛋白结合亲和 力。这里使用的基本上相同的结合亲和力指以斑点印迹分析测定 的分离常tt不超过2至10倍差异，3艮合适地为不超过2至5倍 差异。 一些实施方案中分离常凄t以下述实施例1A中描述的竟争 斑点印迹分析测定。 一些实施方案中，聚乙二醇配基的包括大于 10kDa的分子量，特别是大于20kDa的分子量，更特别的是大于 30kDa的分子量和大于40kDa的分子量。 一些实施方案中，PEG 配基与ARC186 (序列号：4)的5，末端结合。 一些实施方案中， 以实施例5E中描述的两室才莫型测定的适体/PEG共^f介物的灵长类 中的半衰期，合适地为终端半衰期，至少为15小时，合适地为2 4小时，更合适地为至少48小时。 一些实施方案中，适体/PEG 共价物的两室模型半衰期，在大鼠中至少为10小时，更合适地 为15小时。 一些实施方案中，结合ARC186 (序列号：4)5，末 端的PEG是一种40 kDa PEG。净争定的实施方案中40 kDa PEG 是一种分支PEG。 一些实施方案中该分支40 kDa PEG是1, 3 —只又（mPEG-[20 kDa ])—丙基—2 - (4'-丁峻酰胺）。其4也 实施方案中分支40 kDa PEG是2, 3 -双（mPEG - [20 kDa ]) -丙基-1 -氨基曱酰。
在分支40 kDa PEG是1, 3 — 乂又（mPEG — [20 kDa ])—丙 基-2- (4'-丁唑酰胺）的实施方案中，提供了具有以下结构式 的适体：
20 kDa mPEG-NH-C-O— 20 k加mPEG-NH"C-0—1
O 卜OCH2CH2CH2-S-R^"^ 5'适体3'
其中，
------表示一种连接物适体=
fCmGiCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGniAmGfUfCfUmGmAinGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG-3T (序列号：4),
其中《^和£11 = 2'-氟核苷，mG和mA-2'-OME核苦，其 他核苷是2'-OH, 3T表示反向胸^^嘧p定脱氧核普。
在分支40 kDa PEG是2， 3 -又又（mPEG - [20 kDa〗）-丙
基- 1 -氨基甲酰的实施方案中，提供了具有以下结构式的适体：
其中
------表示一种连接物
适体=
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUinGmAmGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG-3T (序列号：4),
其中fC和fU-2'-氟核苷，mG和mA-2'-OME核苦，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸A泉嘧。定脱氧核苦。
本发明的一些实施方案中连接物是一种烷基连接物。特定实 施方案中，烷基连接物包括2至18个连续CH2基团。合适的实 施方案中，烷基连接物包括2至12个连续CH2基团。特别合适 的实施方案中烷基连接物包括3至6个连续CH2基团。
特别实施方案中，适体ARC187 (序列号：5)具有以下结构
式：
其中适体-
{CmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUinGmAmGfUfCfUinGniAmGfUfUfUAiCf CfUmG£CmG-3T ( *列号：4 ),
其中fC和fU = 2，-氟核苷，mG和mA-2'-OME核苷，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸腺嘧啶脱氧核苦。
适体的另一实施方案中，ARC1905 (序列号：67)具有以下 结构式：
其中适体=
fCmGfCfbGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUinGmAmGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG國3T (序歹ij号：4 )
其中fC和fU-2'-氟核普，mG和mA-2'-OME核苦，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸腺嘧咬脱氧核苦。
一个实施方案中，提供了包括有效数量的ARC186(序列号： 4)， ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)或其盐 类的眼部药物组合物，以在主体中治疗，稳定和/或预防补体-介 导的眼部失调。本发明的药物组合物可以包4舌一种药物可4妄受载 体或稀释剂。本方面，发明提供了一种包括治疗有效数量适体的药物组合物或其盐类和药物可接受载体或稀释剂，抑制C5补体 蛋白体内裂解。本发明的该方面，提供了体内治疗，稳定和/或预 防眼部疾病的ARC186 (序列号：4), ARC187(序列号：5)或 ARC1905 (序列号：67)药物组合物。本发明的该方面，也提供 了用于制备体内治疗，稳、定和/或预防眼部疾病药物组合物的AR C186 (序列号：4)， ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列 号：67)。
另 一实施方案中，提供了包括治疗有效凄t量抗-C5适体的眼 部药物组合物，其包括从以下组中选择的核酸序列：序列号：1 至69， 75， 76, 81， 91, 95和96,用于制备补体-介导药物治 疗方案使用的药物组合物。该方面，本发明提供了抑制C5补体 蛋白体内裂解的包括治疗有效数量适体的药物组合物或其盐类， 和药物可接受载体或稀释剂。
另一实施方案中，本发明^是供了药物组合物。 一个实施方案 中，提供了包括治疗有效数量的ARC187 (序列号'.5)或ARC1 905 (序列号：67)或其盐类的药物组合物。本发明的药物组合 物可以包括药物可接受载体或稀释剂。该方面，发明提供了包括 抑制C5补体蛋白体内裂解的包括治疗有效凄t量适体的药物组合 了物或其盐类，和药物可接受载体或稀释剂。发明的该方面，才是 供用于治疗，预防或改善体内疾病的ARC187 (序列号：5)或A RC1905 (序列号：67)药物组合物。发明的该方面也4是供了用 于制备药物纟且合物的ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序歹" 号：67)。
发明的另一方面，4是供了治疗的方法。 一个实施方案中，本 发明的方法提供了治疗，预防或改善C5补体蛋白，和/或其派生 物C5a和C5b - 9介导的疾病，该方法包括对脊推动物施用包括 ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)的药物纟且合物。 一些实施方案中，该方法包括^j"哺乳动物施用本发明的药物 组合物。 一些实施方案中，哺乳动物是人类。
一些实施方案中，由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾 病是急性萎缩性疾病（心肌梗死，中风，萎缩性/再灌注损伤）； 急性炎症疾病（感染疾病，败血病，中风，急性/过急性移植排斥）、 慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病^L网膜病，黄斑变性， 包括渗出性和非-渗出性AMD，并也包括过敏，哞喘，风湿性 关节炎，和其他风湿性疾病，多发性石更化和其他神经疾病，牛皮 癣和其他皮月夫病疾病，重症月几无力，系统性红斑3良痴（SLE )); 和亚急性/慢性炎症，和/或免疫-介导疾病（包括移植排斥，血 管J求性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病）。 一些实施方案中，C5 补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括偷袭或循环相关的补 体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。 一些实施方案中， C5补体蛋白，C5a和C5b - 9介导的疾病包括CABG手术相关的 心肌损伤，球嚢血管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌 损伤。 一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的失 调包括CABG手术相关的心肌损伤，3求嚢血管成形术相关的心肌 损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术相关的补体蛋白介导 的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补体蛋白介导的并发 症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急性移植排斥，亚急 性移植排斥，和慢性移植排斥。 一些实施方案中所治疗的C5补 体蛋白C5a和/或C5b-9介导的疾病是CABG手术相关的并发 症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术相关的心肌损伤。 本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症状^皮减弱，稳、定和 /或预防的疾病是一种眼部失调，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性 和/或非-渗出性AMD。一些实施方案中，本发明的方法包4舌施用ARC187(序列号： 5)或ARC 1905 (序列号：67)的药物组合物以获得比内源性C 5补体蛋白高5至10倍的适体血浆浓度。 一些实施方案中，施用 药物ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)适体组 合物以获得比内源性C5补体蛋白高0.75至约5倍，0.75至3倍， 和1.5倍至约2倍于内源性C5补体蛋白的适体血浆浓度，而其 他实施方案中施用适体组合物以获得与内源性补体蛋白相等的 血浆浓度。 一些实施方案中，施用包括ARC187 (序列号：5)或 ARC1905 (序列号：67 )的药物组合物以获4寻约5pM,约4jaM, 约3pM,约2pM,约1.5(iM,约lpM或约500nM的适体血浆浓 度。
任<可给药的途径，过程，和速度都可以〗吏用，以有效获得本 发明的适体血浆浓度。 一些实施方案中，药物组合物通过《争月永内 纟会药。 一些实施方案中，药物组合物通过4,注和/或通过连续灌注 给药。
治疗，预防和/或改善CABG手术相关的并发症，特别是CA BG手术相关的心肌损伤的特别实施方案中，方法包括在手术前 施用药物组合物并连续纟合药至少24小时， 一些实施方案中为48 小时或， 一些实施方案中为72小时。本发明的特别实施方案中， 在静脉灌注较低剂量适体之前，同时或之后通过静脉内推注约0. 75至1.25,合适地为lmg适体每kg病人的适体，以获得约两倍 于内源性补体蛋白浓度的血浆适体浓度，其中mg剂量不包括共 价PEG的重量。 一些实施方案中，较低剂量将以0.001至0.005 mg/kg/min的速度灌注，其中mg剂量不包括共价PEG重量。一 个特别实施方案中，较低剂量将以0.0013mg/kg/min的速度灌注。 本发明方面的其他实施方案中，其中适体/共价物包括充分长的半
40衰期，适体药物组合物可以每天通过静月永内4,注 一 次或两次给药。
本发明的另一方面，4是供了i貪断方法。 一个实施方案中，衫、
断方法包括将ARC187 (序列号：5 )或ARC1905 (序列号：67) 与怀疑包括C5补体蛋白或其变体的组合物接触，并测定C5补 体蛋白质或其变体的存在或缺失。 一些实施方案中补体蛋白或变 体是属于脊推动物，特别是哺乳动物，更特别是人类。本发明提 供了用于体外或体内诊断的ARC187 (序列号：5)或ARC1905 (序列号：67)组合物。
本发明的另 一方面，提供了包括从下列组中选择核苦序列的 适体：ARC330 (序歹U号；2), ARC188 - 189， ARC250, ARC2 96 - 297, ARC331 - 334， ARC41卜440， ARC457-459， ARC4 73， ARC522 - 525， ARC532， ARC543 - 544， ARC550 - 554, ARC657 - 658, ARC672， ARC706, ARC1537，和ARC1730 (序 列号：6至序列号：66)。另一实施方案中，^是供了用于制备药物 纟且合4勿的ARC330 (序列号；2), ARC188 - 189， ARC250， AR C296- 297, ARC331 - 334, ARC411 -440， ARC457-459， AR C473, ARC522 - 525, ARC532, ARC543 - 544, ARC550- 554， ARC657 - 658， ARC672， ARC706, ARC1537,和ARC1730 (序 列号：6至序列号：66)中的4壬一种。在此方面，本发明^是供了 包括抑制C5补体蛋白体内裂解的治疗有效数量的适体或其盐类 和一种药物可接受载体或稀释剂。
特别实施方案中，提供了包括序列号：l的核苷序列的适体。 特别实施方案中，提供了从序列号：61,序列号：62,序列号： 64至序列号：66中选择核苷序列的适体。 一些实施方案中，当 适体包括从序列号：61,序列号：62,序列号：64至序列号：66中选择的核苷序列时，该适体对C5补体蛋白的结合亲和力与 包括序列号：4但缺少PEG配基的适体充分相同。
特别实施方案中，当适体包括从序列号：61，序列号：62, 序列号：64至序列号：66中选择的核芬序列时，以实施例5E中 的两室模型测定的半衰期，特别是终端半衰期，在灵长类中至少 为16,合适地为30小时。 一些实施方案中，当适体包括从序列 号：61,序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的核苦 序列时，以实施例5E中的两室才莫型测定的半衰期，特别是终端 半衰期，在大鼠中至少为1个半小时，合适地为至少7个小时。
本发明该方面的一些实施方案中，当适体包括从序列号：61, 序列号：62,序列号：64至序列号：66中选4奪的核苷序列时，
适体如下以带有5'连4妾物形式合成：H2N---5'适体3',其
中---表示连4妄物。 一些实施方案中该连4矣物是》克基连4妄物：
H2N- ( CH2) n-5'适体3',其中11 = 2至18,合适地"2- 12, 更合适地n = 3 至 6, 更合适地 n = 6, 并且适体
fCmGfCKGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCf CfUmGfCmG-3T (序歹'J号：4 )
其中fC和fU = 2'-氟核苦，mG和mA = 2' - OME核苦，其 他核苷是 2'-OH, 3T表示反向胸腺嘧咬脱氧核苷。最后的氨 基-1务饰适体可以与乂人包4舌10 kDa PEG, 20kDa PEG, 30kDa PEG和40kDa PEG线性PEG的组中选4奪的PEG配基结合。一 些实施方案中，提供了治疗有效数量适体或其盐类的药物组合 物，其包括「乂人序列号：1,序列号：2和序列号6至序列号：66 的组中选择的核苷序列，特别是从序列号：61，序列号：62，序 列号：64至序列号：66中选才奪的核苷序列。本发明的药物组合 物可以包括药物可4妄受载体或稀释剂。本发明的该方面，纟是供了 用于治疗，预防或改善体内疾病的药物组合物，其包括从序列号：2和序列号6至序列号：66中选择核苷序列的适体，特别是乂人序 列号：61,序列号：62，序列号：64至序列号：66中选择的。
另一实施方案中，^是供了治疗，预防或改善C5补体蛋白介 导的疾病的方法，包括对脊推动物施用包括一种适体或其盐类的 药物组合物，其中适体包括从：序列号2和序列号：6至序列号： 66的组中选才奪的核酸序列，特别是序列号：61,序列号：62,和 序列号：64至66。本发明的一些实施方案中，方法包括^f哺乳 动物，合适地为人类施用本发明的药物组合物。
一些实施方案中，治疗的C5 4卜体蛋白，C5a和/或C5b-9 -介导的疾病是急性萎缩性疾病（心肌梗死，中风，萎缩性/再灌 注损伤）；急性炎症疾病（感染疾病，败血病，中风，急性/过急 性移植排斥）、慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病视网 膜病，黄斑变性，包括渗出性和非-渗出性AMD,并也包括过 敏，哮喘，风湿性关节炎，和其他风湿性疾病，多发性硬化和其 寸也神经疾病，牛皮裤和其他皮月夫病疾病，重症月几无力，系统性红 斑《良掩（SLE));和亚急性/'隄性炎症，和/或免疫-介导疾病（包 括移一直排斥，血管5求性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病。 一些实 施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括<俞袭或 循环相关的补体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。一 些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括C ABG手术相关的心力几损伤，J求嚢血管成形术相关的心"几损伤和 再3夹窄相关的心月几损伤。 一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a 和C5b - 9介导的失调包括CABG手术相关的心肌损伤，^求嚢血 管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术 相关的补体蛋白介导的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补 体蛋白介导的并发症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急 性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥。 一些实施方案中所治疗的C5补体蛋白C5a和/或C5b- 9介导的疾病是CABG 手术相关的并发症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术 相关的心月几损伤。本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症 状一皮减弱，稳定和/或预防的疾病是一种眼部失调，特别是并唐尿病 3见网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的方法包4舌对主体施用包4舌一种适 体的药物组合物，其包括^人序列号：2，序列号：6至序列号：6 6中选l奪的核酸序列，特别是序列号：61,序列号：62，和序列 号：64至序列号：66,使主体的适体血浆浓度为内源性C5补体 蛋白浓度的0.5至10倍。 一些实施方案中，施用药物适体组合物 以获得比内源性C5补体蛋白高0.75至约5倍，0.75至3倍，和 1.5倍至约2倍于内源性C5补体蛋白的适体血浆浓度，而其他实 施方案中施用适体组合物以获得与内源性补体蛋白相等的血浆 浓度。 一些实施方案中，施用本发明的药物组合物以获得约5ja M,约4|_iM,约3pM，约2jiM,约1,5pM,约lnM或约500nM 的适体血浆浓度。
可以使用任何有效获得本发明适体浓度的给药途径，过程， 和速度。 一些实施方案中，药物组合物通过静脉内给药。 一些实 施方案中，药物组合物通过4,注和/或连续灌注《会药。
在治疗，预防和/改善CABG手术相关的并发症，特别是CA BG手术相关的心月几损伤的特别实施方案中，本发明包4舌在手术 前和之后至少24小时连续^吏用药物症且合物， 一些实施方案中为4 8小时或在一些实施方案中为72小时。本发明的特定实施方案 中，所期望的适体血浆浓度，例如，在一些实施方案中为内源性 补体蛋白浓度的两倍，是对所治疗的病人静脉内灌注低剂量适体 之前，同时，或之后，通过静脉内推注给药而获得的。本发明的
44另一实施方案中，当适体/共价物包括充分长的半衰期时，适体药
物组合物可以通过静脉内推注每天虛会药1至2次。
本发明的另一实施方案中提供了诊断方法。 一个实施方案 中，诊断方法包括将组合物与一种适体接触，其包括序列号：2 和序列号：6至序列号66的核酸序列，特别是序列号：61，序列 号：62,和序列号：64至序列号：66,并测定组合物中C5补体 蛋白或其变体的存在或缺失。 一些实施方案中，补体蛋白或变体 是脊推动物的，特别是哺乳动物的，更特别是人类的。本发明提 供的适体组合物具有包括^人序列号：2和序列号6至序列号66 中选择的核酸序列的适体，用于体外或体内诊断。目前的发明中， 提供了包括从序列号：2和序列号6至序列号66中选择的核酸序 列的适体，用于制备药物组合物。
本发明的另一方面，提供了包括一种核酸序列的适体，其与 序列号：75至81,序列号：83,和序列号88至98中选^奪的序 列具有80%—致性。 一些实施方案中，提供了包括一种核酸序列 的适体，其与序列号：75至81,序列号：83，和序列号88至9 8中选择的任意序列的唯一区域具有80%—致性。另一实施方案 中，纟是供了包括一种核酸序列的适体，其与序列号：75至81， 序列号：83,和序列号88至98中选择的序列具有90%—致性。 一种特别实施方案中，提供了包括一种核酸序列的适体，其与序 列号：75至81,序列号：83,和序列号88至98中选择的^f壬意 序列的唯一区域具有90%—致性。而在另一实施方案中，提供了 包括一种核酸序列的适体，其中的40个连续核苷与序列号：75 至81，序列号：83，和序列号88至98中任意选"t奪的序列中的4 0个连续核苷一致。另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列 的适体，其中的30个连续核苷与序列号：75至81,序列号：83， 和序列号88至98中任意选择的序列中的30个连续核苷一致。而另一实施方案中，提供了包括一种核酸序列的特异结合C5补 体蛋白的适体，其中的10个连续核苷与序列号：75至81,序列 号：83,和序列号88至98中任意选择的序列中的10个连续核 苷一致。 一种合适的实施方案中，提供了包括一个核苷序列的适 体，其与序列号：75至81,序列号：83，和序列号88至98中 任意选择的序列一致。
一些实施方案中，上述的本发明的适体可以进一步包括下列 组中选择的化学修饰：糖基位置的化学替换；磷酸位置的化学替 换；核酸序列的碱基位置的划足额替换。 一些实施方案中，修饰 是从以下组中选择的：修饰核苷的整合；3'加帽子，与高分子量 非-免疫原化合物的共价结合；亲脂化合物的共价结合；磷酸骨 架的纟务饰。
本发明的特别实施方案中，适体调整C5补体蛋白或其变体 的功能。特别合适的实施方案中，适体抑制C5补体蛋白或其变 体的功能，特别是在体内，更特别是在人体内。本发明的一个实 施方案中，适体的功能调整，合适地为抑制，是对C5补体蛋白 的裂解。
另一方面的一些实施方案中，本发明提供了抑制C5补体蛋 白体内裂解的包4舌治疗有效凄吏量适体或其盐类的药物组合物和 一种药物可接受载体或稀释剂。
一些实施方案中，提供了 一种包括治疗有效数量的药物组合 物或其盐类，其与序列号：75至81，序列号：83,和序列号88 至98中选4奪的序列具有80% ,合适地为90%的一致性。 一些实 施方案中，提供了 一种包括治疗有效数量的药物组合物或其盐 类，其与序列号：75至81,序列号：83,和序列号88至98中 选4奪的任意序列的唯一区域具有80% ，合适地为9Qo/。的一致性。其他实施方案中，提供了包括一种治疗有效数量适体的药物组合
物，其中的40, 30或10个连续4亥苷与序列号：75至81,序列 号：83,和序列号88至98中选择的核苦序列的40, 30或10个 连续核苷一致。迸发明的药物组合物也可以包4舌一种药物可4妄受 载体或稀释剂。本发明的该方面提供了用于治疗，预防或改善体 内疾病的药物组合物，其中该药物组合物包4舌的适体或其盐类具 有从序列号：3至4,序列号：75至81,序列号：83和序列号： 88至98中选择的核苷序列。本方面，^是供了用于制备药物组合 物的具有从序列号：3至4，序列号：75至81,序列号：83和序 列号：88至98中选择的核苷序列的适体。本方面，本发明提供 了包括一种治疗有效lt量的适体或其盐类的药物组合物，其可抑 制C5补体蛋白的体内裂解，及一种药物可接受载体或稀释剂。
一些实施方案中，治疗的C5 4卜体蛋白，C5a和/或C5b-9 -介导的疾病是急性萎缩性疾病（心肌梗死，中风，萎缩性/再灌 注损伤）；急性炎症疾病（感染疾病，败血病，中风，急性/过急 性移植排斥）、慢性炎症和/或免疫-介导疾病，包括糖尿病视网 膜病，黄斑变性，包括渗出性和非-渗出性AMD,并也包4舌过 ^t,哞喘，风湿性关节炎，和其他风湿性疾病，多发性^:化和其 他神经疾病，牛皮癣和其他皮肤病疾病，重症肌无力，系统性红 斑《良疳（SLE));和亚急性/'隄性炎症，和/或免疫-介导疾病（包 括移植排斥，血管^求性肾炎和其他肾脏疾病和眼部疾病。 一些实 施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括-愉袭或 循环相关的补体激活，其中血液经过合成管子和/或异体材料。一 些实施方案中，C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括C ABG手术相关的心l几损伤，5求嚢血管成形术相关的心力几损伤和 再3夹窄相关的心月几损伤。 一些实施方案中，C5补体蛋白，C5a 和C5b-9介导的失调包括CABG手术相关的心肌损伤，5求嚢血 管成形术相关的心肌损伤和再狭窄相关的心肌损伤，CABG手术相关的补体蛋白介导的并发症，经皮冠状动脉介入治疗相关的补 体蛋白介导的并发症，阵发性夜间血尿证，急性移植排斥，过急 性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥。 一些实施方案
中所治疗的C5补体蛋白C5a和/或C5b- 9介导的疾病是CABG 手术相关的并发症。特定实施方案中，治疗的疾病是CABG手术 相关的心肌损伤。本发明治疗方法的一个特别实施方案中，其症 状萍皮减弱，稳定和/或预防的疾病是一种眼部失调，特别是净唐尿病 #见网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD。
一些实施方案中，本发明的方法包括对主体施用包括一种适 体的药物组合物，其包括:/人序列号：3至4,序列号：75至81, 序列号：83和序列号：88至98中选择的核酸序列，特別是序列 号：61，序列号：62,和序列号：64至序列号：66， 4吏主体的适 体血浆浓度为内源性C5补体蛋白浓度的0.5至10倍。 一些实施 方案中，施用药物适体组合物以获得比内源性C5补体蛋白高0. 75至约5倍，0.75至3倍，和1.5倍至约2倍于内源性C5补体 蛋白的适体血浆浓度，而其他实施方案中施用适体组合物以获得 与内源性补体蛋白相等的血浆浓度。 一些实施方案中，施用本发 明的药物《且合物以获4寻约5|aM,约4pM,约3jiM,约2pM,约 1.5jiM，约lpM或约500nM的适体血浆浓度。
可以使用任何有效获得本发明适体浓度的给药途径，过程， 和速度。 一些实施方案中，药物组合物通过静月永内给药。 一些实 施方案中，药物组合物通过4,注和/或连续灌注症合药。
在治疗，预防和/改善CABG手术相关的并发症，特别是CA BG手术相关的心月几损伤的特別实施方案中，本发明包4舌在手术 前和之后至少24小时连续^吏用药物《且合物， 一些实施方案中为4 8小时或在一些实施方案中为72小时。本发明的特定实施方案 中，所期望的适体血浆浓度，例如，在一些实施方案中为内源性补体蛋白浓度的两倍，是对所治疗的病人静脉内灌注低剂量适体 之前，同时，或之后，通过静脉内推注给药而获得的。本发明的 另一实施方案中，当适体/共价物包括充分长的半衰期时，适体药
物组合物可以通过静月永内推注每天,会药1至2次。
本发明的另一实施方案中4是供了it断方法。 一个实施方案 中，诊断方法包括将怀疑暴扣C5补体蛋白或其变体的组合物与 一种适体接触，其包4舌序列号：75至81，序列号：83和序列号 88至98的核酸序列，并测定组合物中C5补体蛋白或其变体的 存在或缺失。 一些实施方案中，补体蛋白或变体是脊推动物的， 特别是哺乳动物的，更特别是人类的。本发明提供的适体组合物 具有包括^人序列号：75至81，序列号：83和序列号88至98中 选择的核酸序列的适体，用于体外或体内i貪断。
一些实施方案中，4是供了包括一种核苷序列的适体，其本质 上由乂人序列号：68和69中选4奪的核普序列组成。 一些实施方案 中，l是供了包括一种核苷序列的适体，其由乂人序列号：68和69 中选^奪的核普序列组成。本发明的一些实施方案中，适体可以用 于i貪断方法。
一个实施方案中，本发明的一种方法直4妄治疗，稳定和/或预 防补体-介导的眼部失调，该方法包括对需要的主体使用治疗有 效数量的抗-补体适体的步骤。 一个实施方案中，所治疗的眼部 失调是黄斑变性。 一个实施方案中，所治疗的眼部失调是一种眼 部一斤血管生成失调。
具体实施方式
本发明的一个或多种实施方案中细节在以下的描述中进行 说明。虽然任何与这里描述相似或相等的方法和材料可以用于本发明的实践或试验，但更合适的方法和材料正被描述。本发明的
其他特;f正，对象和优点在这里的描述中是显而易见的。在i兌明中， 单数形式也可以包括复数，除非上下文中另有明确身见定。除非另 有定义，这里使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属的领 域中的普通技术人员所通常理解的相同意义。如有冲突，本说明 将受控。
抗-C5药物和眼部失调
目前的数据显示年龄相关黄斑变性（AMD)仍是一种补体活 性参与作用的炎症介导的疾病。年龄-相关黄斑变性e'AMD，）是 一种慢性和进程性眼病，并且其是美国，欧洲，和日本导致无法 挽回的视觉损害的引导性原因。AMD以视网膜中心区域黄斑的 进程性恶化。进程性AMD的最明显的指标物是玻璃疣的出现， 在视网膜下具有黄-白沉积物，其是来源于视网膜细胞新陈代谢 废物的斑块。玻璃疣的出现是两种形式AMD:渗出性（'湿，）和 非 -渗出性（f'干，）的重要组成。当新血管在视网膜下生长并通过 已知为Bruch's膜的膜结构侵染视网膜时发生湿型AMD。此异常 血管生长通常指血管生成或U永纟各膜）新血管生成。这些新血管 容易破裂并经常出血并渗出液体至黄斑，结果有时会造成突然和 通常严重的纟见觉损害。虽然新的治疗（例如，LucentisTM)可以 停止血管生成并逆转液体的聚集，甚至在少数病人中恢复一见力， 然而血管生成的损害经常导致纟见网力莫细力包的结疤和/或损害而导 致永久性的视觉损失。玻璃疣的发展通常超前于湿型AMD ,其 汇集并包括补体蛋白，包括补体因子H (CFH)。大量的，中等 至大的^皮璃疣与疾病后阶4殳发展巨大危险性相关，其以地理性萎 缩和/或新血管生成为特征。大多数湿型AMD在疾病其^皮诊断出 后数月至两年内在受影响的眼睛发生严重的视觉损失，虽然—见觉 损失也可以在数小时或数天内发生。干型AMD通常是更緩慢的，
50并在黄斑光-敏感细胞中发生緩慢萎缩，使受影响的眼睛中心视 力发生緩慢模糊。玻璃疣的形成和聚集，有时是视网膜的恶化， 导致视觉损失的加速，虽然不伴随异常的血管生成和出血。
导致AMD -相关的视觉损失的损伤中观察到的玻璃疣和炎 症细胞中具有补体成分和其他炎症介导物（Haines等（2005 ) Sc ience 308: 419-421 )。 AMD与补体调节途径中的遗传缺陷强烈 相关（Haines等，2005 )。编码补体因子H ( CFH )基因的变体 通过其对玻璃疣发展的影响，新血管生成的前体和AMD相关的 -现觉损失，似乎才及大地或完全i也导致增加AMD的危险（Edward s等，（2005 ) Science 308: 421 —424)。 CFH的氺刀i台功肯fe是通过 结合并失活C3b或刺激因子Bb从C3b分离，下调选择性级联转 化酶的活性。（Hageman等（2005 ) PNAS 102 (2): 7227- 723 2)。目前的基因数据显示湿型-AMD玻璃疣病人具有50- 70% 的可能性才有CFH等位基因，导致强烈的补体干涉和AMD治疗 的关耳关（Klein等（2005 ) Science 308: 385 — 389 )。 一种承卩弗'J其 活性的抗-C5适体，也可以在带有AMD相关的缺陷CFH基因 的病人中起作用。同样地， 一种抑制选择性级联目标，如因子B， 因子D，和备解素，普通级耳关成分，特别是C3,和膜攻击复合 物成分的适体，可以抑制活性，即使病人带有AMD相关的缺陷 CFH基因。 一些补体因子H (CFH)基因的单才莫标本已经经测定 为与病人发展黄斑变性的危险性相关。特别是，在染色体l上补 体因子H (CFH) 402位氨基酸的酪氨酸-组氨酸改变造成与疾 病易感强烈相关的CFH基因变体结果。序列的改变位于结合肝 磷脂和C -反应蛋白CFH区域。先天带有此CFH基因变体的人 更易发生AMD。CFH基因变体可能导致美国15000000黄斑变性 病例中的一半。老年人中若带有CFH基因变体，其发生黄斑变 性的可能性将增加2.5至5.5倍。CFH基因在调节炎症途径（选择性补体途径）中起作用。此 表面炎症在黄斑变性中也具有重要作用。炎症标记物C-反应蛋 白（CRP)的血液水平已经发现可以促进黄斑变性的发展。（Sci ence.2005年四月15曰'，308 ( 5720): 419- 21， Science.2005年 四月15曰；308 ( 5720): 421 - 4, Science.2005年四月15曰；3 08 ( 5720): 385 - 9)。基于其在肝磷脂和因子H的CRP结合区 i或的定4立位置，Y402H变体可以石皮坏蛋白聚冲唐和CRP介导的宿 主细胞表面H因子的召集，排除了因子H对堆积细月包的C3b的 下调能力。由于C5a和C5b-9未受控的释放，补体途径在宿主 组织中的未受抑制的扩大导致;视网月莫中的炎症发生和血管生成。 CFH阻止未受控的补体活性和炎症；因此CFH中的突变将加重 炎症和其后果。通过减少黄斑变性中的过多补体（炎症途径）活 性，我们也许可以减緩疾病的进程。此外，相对与目前，将来对 基因变体的测定可以用于耳关合成傳4支术以更早鉴定产生高危AM D的个体。（JAMA. 2005年4月20日；293 ( 15 ): 18410)
补体活性已经涉及其他眼部疾病，如净唐尿病4见网月莫病，并可 肯fe复合或起i台血管4员害（Zhang等，（2002) Diabetes51: 3499)。 增值性糖尿病视网膜病变（PDR)是一种由视网膜血管改变引起 的糖尿病并发症。当^L网月莫中的血管受损害时，其可能渗血并变 脆，出现刷子样分支和疤痕组织。这将使视网膜传输至大脑的图 像出现污点或扭曲。据估计25%的I型糖尿病人将忍受糖尿病视 网月莫病变，并在5年后上升为60%， 10- 15年后为80%。该疾 病以高血^f唐症，基底力莫增厚，外周细月包丟失，樣i血管动乐^瘤和^见
网膜前新生血管化为特征，其由于出血和^L网膜牵连的脱离导致 失明。非扩散性的糖尿病视网膜并以视网膜内微血管瘤，出血， 新-纤维-层梗塞，硬性渗出和樣t血管畸形。黄斑水胂是^L觉损 害的主要机制。这是黄斑（视网膜中心区域）毛细管微血管瘤静 月永渗漏的结果。渗漏可以加剧黄斑增厚，其与石更性渗出或嚢才羊改变相关，并导致不同程度的中心视力损失。增值性糖尿病视网膜 病变以视网膜新生血管化为特征。其根据视网膜新生血管的存 在，位置，严重性和相关的出血活性进行分级。其与严重的4见力 损失相关。糖尿病一见网膜病的病因可以归结于以下疾病阶,殳。循 环问题导致视网膜区域缺血或萎缩。新生血管化导致新血管开始 在玻璃体中生长以维持适当的氧水平。新生毛细血管的渗血和疤 痕组织的形成产生对视网膜的牵引并导致小裂缝形成。流泪并随
后在^L网膜层下或之间出现流液和脱离。由于出血，浮肿和疤痕 产生，病人S见力出现才莫糊，漂移，闪光及突然失明。
低水平的恒定补体活性通常发生在非-糖尿病人眼中，其在 非-糖尿病大鼠目艮中以MAC的存在和补体调节蛋白为特征，表 明^卜体的失i周发生在4唐尿病人中（Sohe等，（2000) IOVS 4k 3 492 )。此外，已经在糖尿病人志愿者的视网膜血管中测定到C5b -9的沉积，而在非lt尿病人中则无（Zhang等），在^唐尿病^L网 膜中发现CD55和CD59的表达减少（Zhang等），并且在糖尿病 人尿中发现存在糖基化CD59 (Acosta等，（2002) PNAS 97, 5 450 — 5455 )。 it匕夕卜，已^口^卜体牙口血管系纟克在类型I冲唐尿病中4皮5款 活。见，例如，Hansen, T.K,等，#唐尿病，53: 1570— 1576 ( 20 04)。 C5a通过免疫和补体系统激活内皮细月包。见，例如，Albre cht, E.A.等，Am J Pathology, 164: 849 — 859 (2004)。血管系 统在包括糖尿病3见网膜病的眼部疾病中一皮激活。见，例如，Gert, V.B.等，Invest Opthalmol Vis Sci， 43: 1104— 1108 (2002)。补 体系统在糖尿病^见网膜病中也被激活。见，例如，Gert， V.B.等， Invest Opthalmol Vis Sci， 43: 1104- 1108 (2002)和Badouin, C等，Am J Opthalmol, 105: 383 - 388 ( 1988 )。
葡萄膜炎表示眼色素层的炎症，色素血管层（或膜）位于巩 膜（纤维膜）和视网膜（视觉光敏感层）之间，以虹膜，纤毛体和脉络膜（滋养视网膜的血管和连接组织层）。由于眼色素层的 解剖复杂性，葡萄膜炎分许多类型，并且由于眼色素层与眼部其 他结构（例如，视网膜）的解剖关系，眼色素层通常与其他组织 的炎症关联（例如，视网膜炎）。葡萄膜炎通常分为前葡萄膜炎 (主要影响虹"寞和相关的纤毛体，虹力莫和角膜之间的前室和包含 的流液），中间葡萄膜炎（影响纤毛体后的睫状体平坦部和:f见网 膜前"缘，)，或后葡萄膜炎（影响虹膜后的后室，其充满透明凝月交 状玻璃质液体并与视网膜直接相连）。前葡萄膜炎是最常见的形 式并通常与自身免疫疾病如风湿性关节炎相关。中间葡萄膜炎是 较次常见的形式。后葡萄膜炎是最不常见的形式，可能通过系统 感染引起（例如，病毒性，细菌性，真菌性，或毒素）或与自身 免疫疾病相关。自身免疫葡萄"莫炎的发生也可以不包4舌系统影 响。葡萄膜炎也可以由外伤引起（例如，受伤，手术等）或未知
原因e'先天性"。不考虑病原学，任何影响葡萄膜的炎症都将造 成葡萄膜炎。
眼部组织和液体通常含有多种补体成分，如葡萄膜组织中的
因子B和C2， C4, C3, C5, C6,和C7 ( Brawman — Mintzer O, Invest Ophthalmol Vis Sci.1989年10月；30 ( 10): 2240 — 4)， 房7JC中的C1， C4, C3和C5 (Mondino BJ, Arch Ophthalmol。 1983年3月；101 ( 3 ): 465 — 8 )，和角膜中的Cl, C4， C2， C3, C5, C6和C7 ( Mondino BJ， Arch OphthalmoU981年8月；99 (8 ): 1430 - 3 )。这些补体成分和相关的补体调节蛋白在眼部组 织中净皮i人为起重要的正常免疫^f呆护作用。
补体活性在葡萄膜炎病原学中的一个重要作用已经由下列 事实所表明：相对于视网膜血管炎病人（对照），前葡萄膜炎病 人的C4 (C4B2)异型发生率升高（Wakefield D, Hum Immuno 1. 1988年3月；21 ( 4): 233 - 7 );先天葡萄膜炎并人中C3d和包括-补体的免疫复合物的血浆浓度升高（Vergani S， Br J Op hthalmol.1986年1月；70 ( 1 ): 60- 3 );系统炎症疾病和并发葡 萄膜炎病人泪腺流液（泪液）补体-介导的溶血活性和C3和C4 ?K平的升高；（Drozdova EA， Vestn Oftalmol.2004年7 — 8月；1 20 (4): 24- 6);和在葡萄膜炎中作为最初事件的葡萄膜区域免 疫复合物和补体的沉积（O'Connor GR, Tmas Ophthalmol Soc UK, 1981年9月；101(Pt3 )( 3 ): 297 - 300 ).补体活性已经 包括在许多带有葡萄膜炎眼病的炎症和/或自身免疫疾病，包括B ehcet's疾病（Cuchacovich M， Clin Exp Rheumatol.2005年7 - 8 月；23 (4 Suppl 38): S27 - 34, Bardak Y, Ocul Immunol Inf lamm.2004年3月；12 ( 1 ): 53 - 8 )， Fuch's异色性虹膜睫^1犬体 炎（La Hey E, Am J Ophthalmol. 1992年1月15; 113 ( 1 ): 7 5 - 80 )， Vogt—Koyanagi - Harada疾病（Sakamoto T, Ophthal mol。 1991年9月；109 ( 9): 1270-4)，和亚^见网月莫纤维4匕,口十曼 性葡萄膜炎（Palestine AG, Ophthalmology. 1985年6月；92 ( 6 ): 939-44)。
大量试验-引发葡萄膜炎动物模型已经显示补体活性是葡 萄膜炎中重要病原因素（Jha P, Invest Ophthalmol Vis Sci. 20 06年3月；47 ( 3 ): 1030- 8， Kasp E, Clin Exp Immunol. 19 92年5月；88 ( 2): 307- 12)，并且该补体活性^皮补体调节蛋白 紧密调节（Bardenstein DS, Immunology. 2001年12月；104( 4 ): 423 - 30， Sohn JH， Invest Ophthalmol Vis Sci.2000年10月•， 4 1 ( 11 ): 3492 - 502 )。这些补体-介导葡萄膜炎才莫型中，补体的 损耗，如用眼镜蛇毒因子（CVF )处理或作为补体活性途径（C3 ) 遗传损耗的重要因素，可以预防或显著减少诱导的葡萄膜炎的严 重性。共同地，凄史据显示补体成分和调节蛋白是眼部组织和葡萄 膜的重要正常成分，补体活性是自身免疫葡萄膜炎试验模型中葡 萄膜炎的成因，补体活性在人体中与葡萄膜炎相关。这样， 一些
实施方案中，本发明的方法中，在C5激活并产生C5a和C5b-9 (MAC)之前，使用阻止选择性和经典补体活性途径的适体以减 少葡萄膜炎的发生，持续事件和/或严重性。
青光眼指由于一见觉神经和—见网力莫损害造成的^L觉损失的一 类疾病，通常与眼压升高（"IOP，）相关。开角型青光眼是最常见 的形式，由于流体通道（例如，小梁网）的长期狭窄或闭塞导致 水状体的形成而增加iop。青光眼分为两种类型，开角和闭角型。 原初开角型青光眼发展时较緩慢并无痛，通常伴随数年内的无感 觉视觉损失。次生开角型青光眼由其他疾病引起（例如，葡萄膜 炎或其他炎症疾病，津唐尿病，肿瘤，白内障），4屯性损伤或特定 药物如类固醇。闭角型青光眼（也指狭窄角型青光眼或畸形青光 眼）是由于虹膜处的变化引起液体流的突然阻塞，导致IOP的突 然增加引起的。闭角型青光眼的症状为包括眼部疼痛和恶心的朝L 觉损失。在一些个体中发生的神经损伤不伴随IOP的增加；此类 型的青光眼为常压（正常压力或^f氐压力）青光眼。此类型青光眼 中神经的损伤原因还未知。
补体在青光眼病原学中的作用已经3皮显示：1)大鼠青光眼 模型中，IOP升高时伴随补体成分（Clq, Clr, Cls， C3 ) mRN As的一见网月莫表达（Ahmed, F, Brown, KM, Stephan， DA， Mo rrison, JC, Johnson, EC， Tomarev, SI (2004) IOVS 45， 124 7-54); 2)猕猴青光眼才莫型中补体成分（C4, B, Clq， C3 ) m RNAs在视网膜中的表达增力口 （Miyahara， T， Kikuchi, T， Aki moto， M, Kurokawa, T， Shibuki, H.Yoshimura, N ( 2003 ) IO VS 44, 4347- 56); 3)小鼠和浙尔f吳青光目艮才莫型中一见网月莫月交质细
56胞内Clq mRNA和蛋白表达的增力口 （ Stasi， K, Nagel， D, Yan g, X, Wang, R， Ren, L, Podos， SM, Mittag, T, Danias， J (2006) IOVS 47, 1024 — 29); 4 )人体月交原细月包中Clq纟田月包的 免疫组化染色（Stasi等，2006)。补体Clq在试验性绿内障小鼠 中的表达显示与IOP的持续增加和对视网膜中心细胞的损伤进 禾呈相关（Stasi等，2006)。 #元—4卜体适体的治疗，例:V, —种#元 -C5适体，可以对高或低-压力青光眼中的神经变性具保护作 用。
相应地，本发明的 一些实施方案提供了治疗补体介导的眼部 疾病的抗-C5药物。 一些实施方案中，单独使用本发明的抗-C 5药物，而其他实施方案中其与抗-VEGF和/或抗-PDGF药物 联合使用。
本发明的其他实施方案提供了治疗，稳定和/或预防补体-介 导的眼部失调的抗-补体适体。抗-补体适体可以根据SELEXT M方法制备。特别实施方案中，本发明包括〗吏用一种抗-补体适 体，例如， 一种方法中对主体施用一种减少，稳、定和/或予贞防眼部 失调中至少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD的症状的抗-C5适体。
C5特异的适体
用于治疗，预防和/或减少补体-介导的眼部失调症状的C5 特异适体可以通过SELEXTM方法制备。特定实施方案中，本发 明包括在一种方法中对主体施用少，稳定和/或预防眼部失调中至 少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性A MD的症^大的4元-C5适体药物。
57适体是一种核酸分子，其与分子的特定结合亲和力是不同于
Watson - Crick义威基对的交互作用。
适体，类似于通过噬菌体显示或单克隆抗体e'mAbs，）制备的 多肽，可以特定结合选择的目标并调节目标的活性，例如，通过 与适体的结合可以阻止其目标的功能。
从随机序列寡核苷酸文库中进行体外选择制备的适体超过1 OO种蛋白质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫J求蛋白，和受 体。典型的适体为10- 15 kDa大小（30-45核苦），以亚-摩 尔亲和力结合其目标，并区分紧密向的目标（例如，适体典型地 不与来源于相关基因家族的其他蛋白结合）。 一系列结构研究已 经显示适体可以〗吏用相同的结合作用（例如，氢4建，经典互补， 疏水力，空间排阻），产生抗体-抗原复合物的亲和力和特异性。
适体具有许多期望的用于治疗和诊断的特征，包括高特异性 和亲和力，生物凌支应，和良好的药4戈动力学特性。
制备一种适体的首选方法，通常在图2中描述，是以"指凄丈 增长的配基系统演化，'SELEXTM，)。 SELEXTM过程， 一种体外汇 集高特异结合目标分子的核酸分子的方法，描述于，例如，U.S. 专利申i青系列号07/536， 428， 1990年6月11日归档，目前已废 弃，U.S.专利申请号5475096,题为"核酸配基，,，和U.S.专利申请 号5270163 (亦见WO 91/19813),题为"核酸配基'。，通过进行重 复的选择和扩增循环，SELEXTM可用于获得适体，在此也指具有 4壬4可期望的目标结合亲和力水平的"核酸配基'。，SELEXTM过程基于唯一的观察，即核酸具有形成二 -和三-维结构变体的能力，并具有作为任何化学化合物，无论是单体或 多聚体的配基的充分的单体化学多能性（例如，形成特定结合 对）。任何大小或成分的分子都可作为目标。
SELEX™过程基于结合目标的能力。通过SELEX™过程获 得的适体将具有目标金额和特性。然而，SELEXTM过程不同选裤， 适体或目标的其他特性，因此不能期望SELEX™过程制备的适 体具有除了结合期望目标的任何其他特性，虽然可以期望获得的 适体将具有其他特性。这样，虽然期望一种适体将具有特异结合 目标的能力，除了结合目标之外， 一种给定的适体可以没有，或 可以具有多种凌文应。例如，当目标是一种与多细月包表面受体作用 的蛋白质， 一种适体可以阻止或增强蛋白质和一种或多种该受体 的结合，或其可以对〈壬^可交互作用不具有效应。另一实施例中， 目标可以是一种接触反应类物质，而适体可以抑制或增强接触反 应功能的效果，或对4妄触反应功能无作用。然而，在合适的方法 试-险之前，4支术人员不能预测一种纟会定的适体具有的特性。事实 上，单纯的目标结合对于功能效应并不提供信息，而其在适体结 合的作用下可以外露。
目标分子特性的改变需要适体结合目标的特定位点，以对目 标特性的改变产生效应。理论上，SELEXTM过程可以鉴定大量适 体，其中每个适体结合目标的不同位点。实践中，适体-目标结 合作用通常发生在一个或少量适合的目标结合位点，其^是供了对 于交互作用的稳、定的和易达到的结构影响。此外，当对生理目标 分子使用SELEXTM过程时，」技术人员通常不能控制适体对于目 标的定位。因此，适体在目标上的结合位点可以位于，或不可以 位于，或接近于，可导致期望效应的潜在结合位点之一，或可以 对目标分子无任何效应。甚至当一种适体，由于其结合目标的能力，被发现具有一种 效应，而酶哟方法预测此效应的存在，或预先知道该效应的类型。
进行SELEX™试-验时，技术人员只能知道一种适体， 一种针对 目标点适体，将具有目标结合特性。可以进4亍SELEXTM试-睑， 期望一些纟皮鉴定的适体可以具有除了结合目标之外的效应， <旦这 是不确定的。
SELEX™方法作为包括随机序列的单链寡核苷酸文库或集 合的起始。寡核苷酸可以是^f务饰的或未修饰的DNA， RNA，或D NA/RNA杂交。 一些实施例中，集合包括100%随才几或部分随才几 寡核苷酸。其他实施例中，集合包括的随4几或部分随^几寡核香酸 包括至少 一种与随才几序列整合的固定序列和/或 <呆守序列。其他实 施例中，集合包4舌的随4几或部分随才凡寡核苷酸包4舌至少一种5' 和/或3'端固定序列和/或^f呆守序列，其可以包3舌寡核芬酸集合中 所有分子共享的序列。固定序列是集合中寡核苷酸的共同序列， 其出于预选4奪目的而被包括，如下文描述的CpG模体，PCR引 物的杂交位点，RNA聚合酶启动子位点（例如，T3, T4, T7, 和SP6)，限制性位点，或均聚序列，如聚A或聚T区域，催化 核心，选择结合亲和柱的位点，和其他有助于期望的寡核苷酸的 克隆和/或测序。保守序列是不同于前述的固定序列，由多种适体 共享并结合相同目标的序列。
寡核苷酸集合合适地包括有效扩增需要的随机序列部分和 固定序列。典型地，寡核苷酸的起始集合包括固定的5'和3'末端 序列，其在侧面具有30- 50个随机核苦的插入区域。随机核普 可以由多种方法制备，包括和血合成和从随机裂解的细胞核酸中 进行大小选择。选择/扩增循环前或过程中可以通过突变引入或增 加试-验核酸中的序列变体。寡核苷酸的随才几序列部分可以为{壬<可长度并可以包4舌核泮唐 核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并可以包4t修饰的或非-自然核苷
或核苦类似物。见，例如，美国专利号5958691;美国专利号56 60985;美国专利号5958691;美国专利号5698687;美国专利号 5817635;美国专利号5672695,和PCT公开WO 92/07065。随
才几寡核苷酸可以由本领域中抑制的固相寡核普酸合成才支术以磷:
酸二酯-交联核苷合成。见，例如，Froehler等，Nucl. Acid Re s. 14: 5399 - 5467 ( 1986 )和Froehler等，Tet丄ett.27: 5575 -5 578 ( 1986 )。随4凡寡核苷酸可以4吏用液相方法合成，如三酯合成 方法。见，例:^， Sood等，Nucl.Acid Res. 4: 2557 ( 1977)和 Hirose等，Tet.Lett， 28: 2449 ( 1987)。典型的合成是在自动D NA合成仪上进行，产生对于大多数SELEXTM试验足够的1014 -1016的单独分子。在序列-i殳计中，充分大范围的随才几序列增加 了每个合成分子代表一个唯一序列的可能性。
寡核苷酸的起始文库可以由DNA合成仪通过自动化学合成 制备。为合成随4几序列，在合成过程中每个核苷增加步-骤加入所 有四种核苷，使得核苦随机整合。如上所述， 一个实施方案中， 随才几寡核苦酸包4舌完全瑞即序列；然而，其j也实施方案中，随才几 序列可以包括一^殳非随才几或部分随才几序列。部分随才几序列可以通 过在每一核苦增加步艰《以不同摩尔比例加入四种核苦。
寡核苷酸起始文库可以是RNA, DNA，替换的RNA或DN A或其组合。该情况下当使用RNA文库作为起始文库时，其典 型地通过合成一个DNA文库，经合适的PCR扩增，使用T7 R NA聚合酶或^f务饰的T7 RNA聚合酶体外转录DNA文库，并纯 化转录的文库而制备。核酸文库在适合于结合的条件下与目标混 合并对结合进行逐步回归重复，分离并扩增，使用相同的常规选 择方案，以获得任何实际的集合亲和力和选择特性。更特别地，以包括核酸起始集合的混合物开始，SELEXTM方法包4舌以下步 骤：（a)在适合结合的条件下将混合物与目标接触；（b)将未结 合的核酸从已经特异结合目标分子的核酸上分离下来；（c)解离 核酸-目标复合物；（d)对乂人核酸-目标复合物中分离下的核酸 进行扩增以制备富含配基的核酸混合物；并（e)通过错综循环 重复结合，分离，解离和扩增步骤以制备对于目标分子高特异性， 高亲和力的核酸配基。这些情况下，当RNA适体被选才奪时，SE LEXTM方法进一步包括以下步骤：（i)在扩增步骤（d)进行前 将从核酸-目标复合物中解离的核酸进行反转录；并且（ii)重 新开始过程前对来源于步骤（d)的扩增的核酸进行转录。
在包括大量可能的序列和结构的核酸混合物中，对于 一 个夕合 定的目标具有大范围的结合亲和力。这些对于目标具有高亲和力 (更低解离常数）的核酸更趋向结合目标。分离，解离和扩增后， 产生了具有更高结合亲和力候选物的第二种核酸混合物。额外的 选捧循环有助于获得最佳的配基，直至最后的核酸混合物主要有 一种或几种序列构成。其可以,皮克隆，测序并单独作为配基或适 体测定l)目标结合亲和力；和2)影响目标功能的能力。
重复进行选4奪和扩增循环直至获得期望的结果。多^:情况 下，持续进行选择/扩增直至重复循环时结合力信号不再增强。该 方法典型地习惯于采用IO"不同核酸，^旦也可以耳又样多至1018 种不同核酸。通常，核酸适体分子经过15至20个循环过#呈#:选 择。 一个实施方案中，异质成分仅在开始选择阶段加入，并在重 复过程中不出现。
SELEXTM方法的 一个实施方案中，选4奪过程对于强力结合#皮 选目标的核酸是高效的，〗义需要一步选4奪和扩增循环。这些有岁丈 的选择可以发生于，例如，色谱-类型过程，其中核酸与柱结合
62目标的相互关系以一种方式进4亍，其中柱子可以高效地分离最高 亲和力的4亥酸配基。
许多情况下，不需要进行重复的SELEX™步骤以鉴定单个 核酸配基。目标-特异的核酸配基溶液可以包4舌核酸结构或才莫体 家族，其具有大量保守序列和大量经替换或增加后不显著影响核 酸配基对目标的亲和力的序列。在完成之前纟冬止SELEXTM步驶《， 可以测定许多核酸配基家族成员的序列。
已知存在大量核S吏一级，二级和三纟及结构。这些通常包4舌于 非- Watson - Crick型作用的模体结构指发夹环，对称或不对称 凸起，伪结和多重重复。几乎这些模体的所有已知情况显示其可 以形成不超过30个核苷的核酸序列。出于此原因，通常更优选 带有包括20至50个核苷的相邻随机片^殳的SELEXTM过程，一 些实施方案中，为30至40个4亥苷。 一个实施例中，5'-固定： 随机：3'固定序列包括了约30至约50个核苦的随机序列。
核心SELEXTM方法已经;故调整以获得许多特定的目标。例 如，美国专利号5707796描述了联合凝胶电泳使用SELEXTM方 法选4奪特别结构特4正的核酸分子，如bent DNA。美国专利号47 63177描述了基于SELEX™方法选择包括磷反应基团的核酸配 基，可以结合和/或磷-交联和/或磷失活目标分子。美国专利号 5567588和美国专利号5861254描述了基于SELEX™方法高效分 离对目标分子具有高亲和力和j氐亲和力的寡核苷酸。美国专利号
5496938描述了在进行SELEX™方法之后获得改善的核酸配基 的方法。美国专利号5705337描述了配基共〗介交联其目标的方法。
SELEX™方法也可以用于获得结合超过一种目标分子位点 的核酸配基，并获得包括非一核酸物质的结合目标特定位点的核 酸配基。SELEXTM方法提供了结合任何预想目标的核酸配基，包，括大的和小的生物分子，如核酸-结合蛋白和不知其功能的一部 分，是否结合核酸的蛋白质，以及辅因子和其他小分子。例如，
美国专利号5580737描述了通过SELEXTM方法筌定的核酸序列， 其可以高亲和力结合咖啡因和类4以物，茶碱。
反向-SELEXTM方法是一种通过评估核酸配基序列与一种 或多种非-目标分子的交联-反应，提高核酸配基对目标分子的 特异性的方法。反向-SELEXTM方法包括以下步骤：（a)制备核 酸混合候选物；（b)将候选混合物与目标接触，其中相对于候选 混合物对目标具有高亲和力的核酸可以乂人4矣选混合物中分离； (c)从剩余的候选混合物中分离增加亲和力的核酸；（d)从目标 上解离增加亲和力的核酸；（e) 将增加亲和力的核酸与一种或 多种非-目标分子4姿触，4吏得与非-目标分子具有亲和力的核酸 配基被除去；（f)将仅对目标分子具有特定亲和力的核酸进4亍扩 增，以制备可以测序的足量的核酸混合物，其具有相对更高的亲 和力并特定结合目标分子。如上SELEXTM方法所述，根据需要 重复选择和扩增循环直至获得期望的目标。
使用核酸作为治疗，诊断药物，和疫苗的潜在问题是，磷酸 二酯形式的寡核苷酸在其期望的效应出现之前将在体液内^皮月包 内和胞外酶，如核酸内切酶和核酸外切酶快速降解。SELEXTM 方法包括鉴定包括修饰的核普的高亲和力核酸配基，其提供配基 改善的特性，如提高体内稳定性或提高递呈特征。这些修饰的实 施例包括糖和/或磷和/或》咸基位置的化学替换。SELEX™方法-鉴定的核酸配基包括的修饰核香描述于，例如，美国专利号566 0985，其描述了在核糖2'位点，嘧吱的5位点，和嘌呤的8位点 被化学修饰的寡核苷酸，美国专利号5756703描述了包括不同2' -修饰嘧啶的寡核苷酸，美国专利号5580737描述了包括一种或多种2'-氨（2' - NH2 ), 2'-氟（2' - F )，和/或2' - O -曱基（2' -OMe) ^齐换的^f奮饰核普的高亲和力核酸配基。
本发明中预期的核酸配基的修饰包括，但不局限于，提供其 他化学基团，其为核酸配基碱基或核酸配基整合额外电荷，极化 性，疏水性，水键，静电力，和立体易变性。抗核酸酶的常身见寡 核苦酸的修饰包括一种或多种^辜换核香内交耳关，糖改变，石咸基改 变，或其组合。这些修饰包括，但不局限于，2'-位点糖修饰，5 - <立点。密"定^修饰，8 - 4立点噤p令^务饰，环外胺的 <务饰，4 -碌b尿。密 咬核苷核芬，5-溴或5_碘-尿嘧咬；骨架修饰，硫逐磷酸酯或 烷基磷修饰，曱基化，和不常见碱基-对的联合，如异碱基、异 月包嘧口定和异鸟嘌口令。》务饰也可以包4舌3'和54奮饰，如力。帽子，例 如，增加3'-3'dT帽子以增加外切核酸酶抗性（见，例如，美国 专禾'J号5674685; 5668264; 6207816;牙口 6229002，其中每个通 过引述在此全部合并于本文）。
一个实施方案中，提供的寡核苷酸其P (O) O基团被P (o) S ("石克代，)，P ( S ) S (f'二石危代，)，P ( O ) NR2 C酰胺化，)，P ( O ) R, P ( O ) OR; CO或CH2 e'formacetal，）或3'-胺（-NH - CH 2-CH2-),其中每个R或R'是独立的H或替换或非替换烷基。 交联基团可以通过-O-, -N-,或-S -交耳关与相邻核苷连4妄。 寡核苷酸中的所有连4妄不要求都相同。
额外实施方案中，寡核苷酸包4t修饰的津唐基，例如， 一种或 多种羟基被囟素，脂肪族基团替换，或作为酯或胺的功能。 一个 实施方案中，呋喃残基的2'-位点-故O-甲基，O-烷基，O-稀丙基，S-烷基，S-稀丙基，或卣化基团。合成2'-修饰糖的 方法描述于，例^口， Sproat，等，Nucl.Acid Res.l9: 733 - 738 (1 991); Cotten，等，Nucl.Acid Res. 19: 2629- 2635 ( 1991 );和 Hobbs,等，Biochemistry 12: 5138 - 5145 ( 1973 )。其他修饰是
65本领域中普通才支术人员已知的。这些々务饰可以是前-SELEXTM 过程修饰或后-SELEX™过程修饰（对先前鉴定的未修饰配基进 行修饰）或整合入SELEX™过程。
前-SELEX™过程修饰或那些由整合入SELEX™过程制备 的核酸配基具有对于SELEX™目标的特异性和提高的稳定性， 例如，体内稳定性。对核酸配基的后-SELEX™过程修饰可以提 高稳定性，例如，体内稳定性而不相反地影响核酸配基的结合能 力。
SELEXTM方法包括将选择的寡核苷酸与其他选择的寡核苷 酸和非-寡核苷酸功能单元耳关合，如美国专利号5637459和美国 专利号5683867中所描述。SELEX™方法进一步包括将选择的寡 核苷酸配基与亲脂性或非-免疫原性高分子量化合物在^t断或 治疗复合物中联合，描述于美国专利号6011020，美国专利号60 51698,和PCT^^开号WO 98/18480。这些专利和申请描述了大 量的形态和其他特性的联合，其带有寡核苷酸有效扩增和复制特 征，和其他分子的期望特征。
通过SELEXTM方法对小的，柔韧性多肽的核酸配基也进行 了鉴定。小多肽具有柔韧性并通常以多重均匀平衡性存在于i^液 中，因此其最初^皮i人为可以通过结合柔韧性多肽导致构象熵损失 而限制结合亲和力。然而，鉴定溶液中小多肽的核酸配基的可行 性在美国专利号5648214中已有描述。该专利中，鉴定了对于物 质P, —种11氨基酸多肽的高亲和RNA核酸配基。
如此所述，本发明通过SELEXTM方法选4奪对于补体目标具 有特异性和结合亲和力的适体。此夕卜，选4奪过程可以整合修饰核 苷以增加适体分子对于体内降解的稳定性。2'修饰SELEX™
为使适体适合于治疗或诊断使用，在体内安全，稳定地合成 是合适的和偏移的。野生型RNA和DNA适体由于其对于核酸酶 的降解壽丈感，在体内不稳定。可以通过整合入2'-位点l奮饰的基 团增加对核酸酶降解的抗性。
2'-氟和2'-胺基团已经成功地整合入选择适体的寡核苷酸 集合。然而，这些修饰极大地增加了合成最终适体的费用，并可 能在某种情况下，由于通过〗奮饰寡核香酸的降解进而〗吏用这些核 苷作为DNA合成的材冲牛，而H修饰的核苦循环进入宿主DNA造 成安全问题。
包括2'-O-曱基f2'-OMe，）核苷的适体，如前所述，克 服了许多这些缺点。包括2'- OMe核香的寡核香酸是抗-核酸酶 的并且合成较便宜。虽然2'-OMe核芬在生物系统中是到处存在 的，生理条件下自然的聚合酶不4妻受2'-OMe NTPs作为底物， 这样就不存在2' - OMe核苷进入宿主DNA的安全问题。制备2' -j多饰适体的SELEXTM方法见描述于，例如，美国临时专利申 ^青系歹']号60/430761, 2002年12月归档，美国临时专利申i青系列 号60/487474， 2003年7月15日归档，美国临时专利申if系列号 60/417039, 2003年11月4曰归冲当，美国专矛J申"i青号10/729581， 2003年12月3日归档，美国专利申请号10/873856, 2004年6 月21日归档，题目为"体外选择2'-O-甲基替换核酸的方法，，' 美国临时专利申请系列号60/696292, 2005年6月30曰归档，题 目为"制备全部2'-修饰的核酸转录的改良材料和方法"和美国专 利申请号11/480188， 2006年6月30日归档，题目为"制备全部 2'-纟务饰的核酸转录的材津+和方法',，其每一个在此通过引述全部 合并入本文。本发明包括结合并调节补体目标功能的适体，其包括修饰的
核苷（例如，在2'-位点修饰的核苷）使寡核苷酸比未》务饰的寡 核苷酸对于酶和化学降解以及热和无力降解更稳定。优选实施方 案中，所述的补体木笔哦啊是补体蛋白C5。文献中有几种包括2 '-OMe的适体的实施例（见，例如，Green等，Current Biology 2， 683 - 695, 1995 ),其通过体外选择修饰的转录物文库制备， 其中C和U残基是2'-氟（2' - F )替换而A和G残基是2' - O H。 一旦功能序列被鉴定，测试每个A和G残基对于2'-OMe ^,换的耐受性，所有A和G残基都具有2' - OMe ^^纟灸耐受性的 适体被重新合成。大多数以该两步法制备的适体的A和G残基 对于2'-OMe替换具有耐受性，虽然，平均有20%并无该特性。 因此，该方法制备的适体趋向于包括从2个至4个2' - OH残基， 并且最后得到折衷的稳定性和合成费用。通过在转录反应中整合 修饰核苷制备寡核苷酸集合中使用的稳定的寡核苷酸，通过SEL EXTM方法（和/或4壬4可其改变和改良，包i舌这里所述的）选择和 富集适体，本发明的方法评估了稳定选择的适体寡核香酸的需要 (例如，通过修饰核苦重新合成适体寡核香酸）。
一个实施方案中，本发明提供了包括2'-OH, 2'-F, 2'-脱 氧，和2'-OMe》务饰的ATP, GTP, CTP， TTP,和UTP核普联 合物的适体。其他实施方案中，本发明提供了包括2'-OH， 2' -F， 2'-脱氧，和2'-OMe, 2'- NH2和2'-甲氧基乙基修饰的 ATP, GTP， CTP, TTP,和UTP核苷联合物的适体。另一实施 方案中，本发明提供了包括2'-OH, 2'-F, 2'-脱氧，和2'-0 Me， 2'-NH2和2'-甲氧基乙基l务饰的ATP， GTP, CTP, TTP， 和UTP核苷56|关合物的适体。优选实施方案中，本发明才是供了 包4舌所有或充分所有2'- OMe修饰的ATP， GTP， CTP, TTP， 和/或UTP核苷的适体。本发明的2'-修饰适体可以使用修饰聚合酶选择，例如，修 饰的T7聚合酶，其对在呋喃糖2'位点大量替换的修饰核苦的整 合速度高于野生型聚合酶。例如，639位点的酪氨酸残基改变为 苯丙氨酸（Y639F)的突变T7聚合酶可以利用（整合）2'脱氧， 2'氨-,和2'氟-三石岸酸核苦（NTPs)， ^旦不是大容量2'一^换， 如2' - OMe或2'-叠氮（2' - N3)替换的NTPs。为整合大容量2 '替换，除了 Y639F突变，在784位点的组氨酸变为丙氨酸残基 的突变T7聚合酶（Y639F/H784A )已经在有限条件下用于整合 ^f奮饰的嘧卩定NTPs。见Padilla, R.和Sousa, R， Nucleic Acids R es, 2002, 30 ( 24): 138。 639位点的酪氨酸残基改变为苯丙氨 酸，784位点的组氨酸变为丙氨酸残基，378位点的赖氨酸改变 为精氨酸的突变T7 RNA聚合酶（Y639F/H784A/K378R)已经 在有限条件下用于整合修饰的噤呤和嘧咬NTPs,例如，2'-OMe NTPs，但需要2'-OH GTP用于转录。见Burmeister等，（200 5) Chemistry and Biology, 12: 25 — 33。虽然并不期望受卩艮于 理论，K378R突变不靠近聚合酶的活性位点，从而被认为是沉默 突变，对于2' - OMe 1^饰NTPs的整合没有效应。位点784的组 氨酸改变为丙氨酸（H784A)的突变T7聚合酶已被描述。Padill a等，Nucleic Acid Research, 2002， 30: 138。 Y639F/H784A突 变和H784A突变T7聚合酶中，改变为小氨基酸残基如丙氨酸可 以促使大量核酸底物的整合，例如，2'-OMe替换核苦。见Che lliserry， K.和Ellington, A.D., (2004) Nature Biotech, 9: 115 5 - 60。更多的在其活性位点带有突变的T7 RNA聚合酶已经祐: 描述，其更易于整合大量2'-修饰底物，例如，639位点酪氨酸 改变为亮氨酸（Y639L)的T7 RNA聚合酶。
通常，已经发现在这里描述的条件下，Y693F突变可以用于 整合除了 GTP之外的所有2' - OMe替换的NTPs,而Y639F/H7 84A， Y639F/H784A/K378R, Y639L/H784A， Y639L/H784A/K378R, Y639L， Y639L/K378R， P266L/Y639L/H784A或P266L/Y6 39L/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合酶可以在这里描述的条 件下4吏用以整合包括2' - OMe GTP的所有2' - OMEe替换NTP
So
2'-》务饰的寡核苦酸可以完全由 <多饰的核苦，或<奮饰的冲玄苦 亚组合成。修饰可以是相同或不同的。 一些或所有核香可以^皮Y务 饰，而那些被Y务饰的可以包4舌相同的修饰。 一些或所有一亥香可以 被修饰，而那些#皮修饰的可以包括不同的修饰。例如，包4舌相同 石成基的所有核苷可以具有一种类型的》务饰，而包纟舌其他石咸基的核 苷可以具有不同类型的 <多饰。所有嘌，冷核普可以具有 一种类型的 修饰（或不修饰），而所有嘧啶核普具有另一种不同类型的修饰 (或不修饰）。这种情况下，使用任何修饰的联合制备转录物，或 转录物的集合，包括，例如，核糖核苷酸（2'-OH),脱氧核糖 核苷酸（2'-脱氧），2'-氨基核香（2'-NH2)， 2'-氟核香（2'
一F),和2'-0-曱基（2'-OMe) 4玄苷。包才舌2'- OH A禾口 G 和2'-F C和U的转录混合物称为"rRfY"混合物，而由此选择的 适体为"rRfY"适体。包括2' - OMe C和U和2' _ OH A和G的 转录混合物称为"rRmY"混合物，而由此选择的适体称为"rRmY" 适体。包括脱氧A和G和2'- OMe U和C的转录混合物称为"d RmY"混合物，由此选4奪的适体称为"dRmY"适体。包括2'- OMe
A， C，和U，和2'-OH G的转录混合物称为"rGmH"混合物， 由此选择的适体称为"rGmH"适体。选4奪性的包4舌2' - OMe A, C, U和G和2' - OMe A, U和C和2'-F G的转录混合物称为"选 l奪性混合，，'由此选l奪的适体指"选择性混合物"适体。包4舌2'-0 Me A， U, C，和G,其中10%的G's是核糖核苦酸的转录混合 物称为"r/mGmH"混合物，由此选择的适体称为"r/mGmH"适体。 包4舌2'-OMe A, U，和C,和2'- F G的转录混合物称为"fGm H"混合物，由此选择的适体称为"fGmH"适体。包括2'-OMe A,
70U,和C,和脱氧G的转录混合物称为"dGmH"混合物，由此选 择的适体称为"dGmH"适体。包括脱氧A,和2'-OMeC, G和U 的转录混合物称为"dAmB"混合物，由此选择的适体称为"dAmB" 适体，包括所有2'-OH核苷的转录混合物称为"rN"混合物，由 此选择的适体称为"rN，，，"rRrY"或"RNA"适体。包括2'- OH三磷 酸腺苦和三^粦酸鸟苦和脱氧三-粦酸"包嘧，定和三-粦酸胸^泉嘧。定的 转录混合物称为rRdY混合物，由此选择的适体称为"rRdY"适体。 'mRmY"也称为"MNA"适体，其除了起始核苷为2' - OH鸟苷或任 ^f可野生型鸟香外，^又包^舌2'-O-曱基核苷，并可以通过后-SE LEX顶将2' - OH Gs替换为2' - OMe Gs,从r/mGmH寡核苷酸 派生出。可选的，mRmY适体可以通过mRmY SELEX，鉴定。
一种优选实施方案包括任何2' - OH， 2'-脱氧和2' - OMe核 香的联合。更优选的实施方案包括任何2'-脱氧和2' - OMe核苷 的联合。甚至更优选的实施方案是任何2'-脱氧和2' - OMe核苷 的耳关合，其中嘧咬是2' - OMe (如dRmY， mRmY或dGmH )。
在选择过程前（-预先）将修饰核苷整合进入本发明的适体 (例如，前-SELEXTM过程修饰）。可选地，本发明通过前-SEL EXTM过程i'务饰整合了《务饰核苷的适体也可以进一步通过后_ SE LEXTM过程修饰（例如，SELEXTM之后的后-SELEX™过程修 饰）。前-SELEXTM过程修饰产生SELEX™目标特异的修饰核酸 配基并提高体内稳定性。后_ SELEXTM过程修饰，例如，修饰（例 如，对具有经前-SELEX™过程修饰整合核酸的，先前鉴定的配 基进行切断，删除，替换或增加核苦）可以进一步提高体内稳定 性，而不明显影响具有前-SELEX™过程修饰整合核苷的核酸配 基的结合能力。
为在聚合酶接受2'-修饰的NTPs的条件下制备2'-修饰的 (例如，2'-OMe) RNA转录物，可以使用Y693F, Y693F/K378R, Y693F/H784A， Y693F/H784A/K378R， Y639L， Y639L/K378 R,P266L/Y639L/H784A和P266L/Y639L/H784A/K378R突变的T 7 RNA聚合酶。其他T7 RNA聚合酶，特别是显示对大量2'-替换高耐受性的聚合酶，也可以用于本发明中。当在这里描述的 条件下^f吏用才莫板-控制的聚合时，Y693F/H784A, Y693F/H784A /K378R, P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突 变的T7 RNA聚合酶可以用于整合所有2' - OMe NTPs,包括2' -OMe GTP,并且获得比使用Y693F, Y693F/K378R， Y693F/ H784A， Y693F/H784A/K378R， Y639L, Y639L/K378R突变的T 7 RNA聚合酶更好的转录产量。Y693F/H784A, Y693F/H784A/ K378R, P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突 变的T7 RNA聚合酶可以与2' - OH GTP共同4吏用，^f旦其不是必 需的，以获得高产量的2'-^f奮饰的，例如，包括2'-OMe的寡核 苷酸。
其他聚合酶，特别是那些显示了对于大量2'-替换具有高耐 受性的，也可以用于本发明。在这里描述的转录条件下通过测试 其整合修饰核苷的能力筛选这些聚合酶。
许多因素已经:故确定对于这里描述的方法中4吏用的转录条
件是重要的。例如，DNA转录模板5'末端固定序列上整合的引 导序列乂于于增加《奮饰專争录产物的产量是重要的，其中Y693F/K37 8R或Y693F/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合物净皮用于转录， 例如，在以下描述的dRmY或r/mGmH转录条件下。此夕卜，引导 序列可以用于帮助增加i务饰转录产物的产量，〗旦不是必需的，其 中使用Y693F/H784A或Y693F/H784A/K378R突变T7 RNA聚 合酶用于转录，例如，在以下描述的mRmY 4争录条件下。引导 序列典型i也为6- 15核苷长度，并可以包4舌所有嘌，令，或噤p令和 嘧，定核苦的混合物。200780016834.X物的重要因素是2' - O H鸟嘌呤核苦的存在或浓度（例如，GMP， GTP，或其他非-2'
- OMe非-三石粦酸盐）。转录产物可以分为两个阶H第一种阶 段是初始化，期间NTP加入GTP的3'-羟基末端（或GMP，或 其他非-2' - OMe非-三^粦酸盐）以制备二核苦酸，随后扩展为 约10-12个核香；第二阶^爻是延伸，期间在初始的10- 12核苷 上进行转录过程。已经发现加入小量2'- OH GTP(或GMP,或 其他非-2' - OMe非-三磷酸盐）至含有过剩2' - OME GTP的 專争录混合物可以有,支增强聚合酶4吏用2'-OH GTP(或GMP,鸟 苷，或其他非-2'-OMe非-三磷酸盐）的初始转录能力。这样， 例如， 一种dRmY寿i录混合物（包4舌脱氧嘌呤和2'OMe嘧咬） 需要额外加入小量的GMP以增强聚合酶的初始转录，而在r/mG mH转录混合物中（包括10%2'-OH GTP)，小量的GMP可以 加入至转录混合物中，但由于2'-OH GTP基因存在于转录混合 物中，所以其不是增强聚合酶初始转录所必需的。 一旦寿争录进入 延伸阶,爻，在2'-OMe和2'-OH GTP之间差别的减少，及2'
- OMe GTP多于2' - OH GTP, ^f吏得整合主要为2' - OMe GTP。
如上所述，最初的带有2'-OH鸟苦的4争录（例3。， GMP， GTP或其他非-2， - OMe非-三磷酸盐）是重要的。此结果受聚 合酶对于初始核普的特异性影响。作为结果，任何此方法制备的 4壬4可转录产物的5'-末端核苷可能为2'-OH G。GMP的^尤选浓 度是0.5 mM，更优选地为1 mM。已经发现转录反应中包括PE G,优选地为PEG- 8000,可以使修饰核香的整合最大化。
整合2'-OMe ^,换核苷进入转录产物的另一重要因素是在 转录混合物中使用二价镁和锰。不同浓度的氯化4美和氯化锰的组 合已经发现可以影响2'-O-甲基化转录产物的产量，氯化4美和 氯化锰的最佳浓度依赖于转录反应混合物中复合二价金属离子
73的NTPs的浓度。为获得所有2'-0 -曱基化转录产物（例如， 所有的2'-OMe A, C,和U及约90。/。G核苷）的最大产量，在 每种NTP浓度为0.5mM时氯化镁和氯化锰的最佳浓度是约5mM 和1.5mM。当每种NTP的浓度是l.OmM时，氯化4美和氯化锰的 合适浓度是6.5mM和2.0mM。当每种NTP的浓度是2.0mM时， 氯化镁和氯化锰的合适浓度是9.6mM和2.9mM。任何情况下， 两倍浓度的偏离仍可得到显著数量的修饰转录产物。
一些实施方案中，适合在初始转录中4吏用GMP或鸟苷。此 结果受聚合酶对于初始核苷的特异性影响。作为结果，任何此方 法制备的^f壬^T转录产物的5'-末端核苷可能为2'-OH G。 GMP 的优选浓度是0.5 mM，更优选地为1 mM。已经发现转录反应 中包括PEG，优选地为PEG- 8000，可以使修饰核苦的整合最大 化。
为使2' - OMe ATP ( 100% )， UTP ( 100% ), CTP ( 100% ) 和GTP ( ~ 90% ) fr/mgmH )的整合最大化，以下条件是合适的： HEPES纟爰冲液200mM, DTT 40mM,亚4青胺2mM, PEG - 800 0 10% (w/v)， Triton X— 100 0.01% (w/v)， MgCl2 5mM (当 每种2'-OMe NTP ;农度为1.0 mM时其为6.5 mM)，MnCl 1.5 mM (当每种2'-OMe NTP浓度为1.0 mM时其为2.0 mM ), 2 '一OMe NTP (每种）500 (iM (更合适i也为1.0 mM)， 2'- OH GTP 30 ,， 2'-OH GMP 500 (iM， pH7.5， Y639F/H784A T7 RNA聚合酶15单位/ml,无一几焦磷酸酯酶5单位/ml,和一种至 少为8个核苷长度的全噤呤引导序列。这里4吏用的， 一单位的Y 639F/H784A突变T7 RNA聚合酶（或任何其他突变T7 RNA聚 合物）净皮定义为在r/mGmH条件下，整合1 nmole 2' - OMe NT Ps入转录产物所需要的酶tt量。这里4吏用的， 一单位的无4几焦石粦酸酯酶定义为在pH7.2和25度下，每分钟释》文1.0 mole无冲几正
磷酸盐所需的酶数量。
为<吏2' - OH GTP和2' - OMe ATP, UTP和CTP (f'rGmH，） 在转录产物中的整合最大化（100%),以下条件是优选的：HEP ES緩冲液200mM, DTT 40mM,亚精胺2mM， PEG - 8000 10 % ( w/v )， Triton X - 100 0.01% ( w/v )， MgCl2 5mM (当每种N TP浓度为2.0 mM时其为9.6 mM ), MnCl2 1.5mM (当每种NT P浓度为2.0 mM时其为2.9 mM ), NTP (每种）500 (更合 适i也为2.0 mM), 2'— OH GMP 1 mM, pH7.5, Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200 nM,无才几焦-粦酸酯酶5单位/ml，和一种至 少为8个核苷长度的全噤呤引导序列。
为使2'-OMe ATP (100% )， 2'- OMe UTP (100% ), 2' -OMe CTP ( 100 % )，和2' - OMe GTP ( 100 % ) e'mRmY，，或"M NA")在转录产物中的整合最大化，以下条件是优选的：HEPES 緩沖液200mM, DTT 40mM，亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X- 100 0.01% (w/v )， MgCl2 8mM, MnCl2 2.5 mM, 2'-OMe NTP (每种）1.5 mM, 2'- OH GMP 1 mM, p H7.5, Y639F/H784A/K378R T7 RNA聚合酶200 nM,无才几焦石岸 酸酯酶5单位/ml，和一种在转录条件下增加转录产量的可选引 导序列。 一些实施方案中，可选引导序列是一个全嘌呤引导序列。 另一实施方案中，可选引导序列是噤P令和嘧t定的混合。
为Y吏2' - OH ATP和GTP,和2' - OMe UTP和CTP frRm Y，〉在转录产物中的整合最大化（100%)，以下条件是优选的：H EPES緩沖液200mM， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X- 100 0.01% (w/v), MgCl2 5mM (当每 种NTP浓度为2.0 mM时其为9.6 mM ), MnCl2 1.5mM (当每 种NTP浓度为2.0 mM时其为2.9 mM ), NTP (每种）500 (liM(更合适地为2.0 mM), 2，-OH GMP 1 mM， pH7.5， Y639F/H 784A/K378R T7 RNA聚合酶200 nM，无机焦磷酸酯酶5单位/ ml,和一种至少为8个核苦长度的全嘌呤引导序列。
为4吏2' - OMe ATP, UTP和CTP CrGmH，）在转录产物中的 整合最大化（100%)，以下条件是优选的：HEPES緩沖液200m M， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v )， Trito n X — 100 0.01% (w/v)， MgCl2 5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时其为9.6 mM), MnCl2 1.5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时其为2.9 mM), NTP (每种）500 pM (更合适》也为2.0 mM)， 2'-OH GMP 1 mM， pH7.5， Y639F T7 RNA聚合酶1. 5单位/ml,无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核香 长度的全噤呤引导序列。
为4吏2' - OMe UTP和CTP ('rRmY，）在转录产物中的整合最 大化（100%),以下条件是优选的：HEPES緩冲液200mM, DT T 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% ( w/v ), Triton X- 1 00 0.01% ( w/v), MgCl2 5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时 其为9.6 mM)， MnCl2 1.5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时 其为2.9 mM), NTP (每种）500 (更合适地为2.0 mM ), 2 '-OH GMP 1 mM, pH7.5， Y639F/H784A T7 RNA聚合酶1.5 单位/ml,无机焦磷酸酯酶5单位/ml,和一种至少为8个核苦长 度的全嘌呤引导序列。
为使脱氧ATP和GTP和2' - OMe UTP和CTP e'dRmY，）在 转录产物中的整合最大化（100%),以下条件是优选的：HEPES 緩冲液200mM， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X- 100 0.01% ( w/v )， MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2. 9 mM, NTP (每种）2.0 mM， 2'— OH GMP 1 mM， pH7.5, Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml，无机焦磷酸酯酶5单位 /ml,和一种至少为8个核香长度的全噤呤引导序列。
为4吏2' - OMe ATP, UTP和CTP和2' - F GTP和〖'fRmH，) 在转录产物中的整合最大化（100%),以下条件是优选的：HEP ES緩沖液200mM， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10 % (w/v), Triton X- 100 0.01% (w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl 2 2.9 mM， 2'-OMe NTP (每种）2.0 mM, 2'- OH GMP 1 m M, pH7.5, Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml,无才几焦石粦 酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苦长度的全嘌P令引导序 列。
为使脱氧ATP和2' - OMe UTP， GTP和CTP fdAmB，）在 转录产物中的整合最大化（100%)，以下条件是优选的：HEPES 緩冲液200mM, DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X— 100 0.01% (w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2. 9 mM， NTP (每种）2.0 mM， 2'- OH GMP 1 mM, pH7.5, Y 639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml,无才几焦磷酸酯酶5单位 /ml，和一种至少为8个核苷长度的全噤呤引导序列。
上述的每个转录过程优选地在（a)约20度至50度进行， 优选地在30度至45度，更优选地为37度，至少2小时，（b) 使用50- 300 nM双链DNA转录模板（循环1中使用200 nM 模板（dRmY转录中使用300 nM模板）），随后循环中使用约50 nM, 1/10稀释的最佳PCR反应液， -使用这里描述的条件）。以 下描述的优选的DNA转录模板（其中ARC254和ARC256在所 有2' - OMe条件下转录，而ARC255在rRmY条件下转录）。
ARC254系列号：99formula see original document page 78 ,
ARC 255系列号：100
formula see original document page 78 ,
ARC 256系列号：101
formula see original document page 78
在rN转录条件下，转录混合物包括2' - OH三磷酸腺苷（A TP), 2'-OH三磷酸鸟苦（GTP), 2'- OH三磷酸胞苷（CTP ), 和2' - OH三石寿酸尿苦（UTP )。用本发明的rN转录混合物制备 的{奮饰寡核苷酸充分地包括所有2' - OH &泉苷，2' - OH鸟苷，2' -OH胞苷，2'-OH尿苷。优选的rN转录实施方案中，最后的 寡核苷酸包括的序列中至少80。/。的腺苷是2'-OH腺苷，至少8 0%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少80%的胞苷是2'-OH胞苷，至 少80。/。的尿苦是2'-OH尿苷。更优选的rN转录实施方案中， 最后的寡核苷酸包括的序列中至少90 %的腺苷是2' - OH腺苷， 至少90%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少90%的胞苷是2'-OH胞 苦，至少90%的尿香是2'-OH尿苷。最优选的rN转录实施方 案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少100%的腺苷是2'-OH 腺苷，至少100%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少100%的胞苷是2 '-OH胞苷，至少100。/。的尿苷是2'-OH尿苷。
rRmY转录条件下，转录反应混合物包4舌2'- OH三-粦酸腺 苦，2'-OH三石粦酸鸟苦，2'— OMe三石粦酸月包普，和2'— OMe三 磷酸尿苷。用本发明的rRmY转录混合物制备的修饰寡核苷酸充 分;也包4舌所有2'-OHI^苦，2'-OH鸟苷，2'-OMe月包苷，2'-OMe尿苷。优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至 少8(T/。的腺苷是2'-OH腺苷，至少8(T/。的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少80。/。的胞苦是2'-OMe胞苦，至少80。/。的尿苦是2'-OMe 尿苷。更优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少 90%的腺苦是2'-OH腺苦，至少90%的鸟苦是2'-OH鸟苷， 至少9(T/。的胞苷是2'-OMe胞苦，至少90 %的尿普是2'- OMe 尿苷。最优选的实施方案中，最后的寡核苦酸包括的序列中至少 10(T/。的腺香是2'-OH腺苦，至少100%的鸟普是2'-OH鸟普， 至少100%的胞芬是2'-OMe胞香，至少100%的尿香是2'-0 Me尿苷。
dRmY转录条件下，转录反应混合物包括2'-脱氧三》粦酸腺 苷，2'-脱氧三石粦酸鸟苷，2'-O-曱基三石粦酸月包苦，和2'-O-曱基三磷酸尿苷。用本发明的dRmY转录混合物制备的修饰寡核 苷酉臾充分i也包4舌所有2'-脱氧^_苷，2'-脱氧鸟苦，2'-0-曱基 月包苷，2'-O-曱基尿苦。优选的实施方案中，最后的寡核苦酸 包括的序列中至少80%的腺苷是2'-脱氧腺香，至少80%的鸟 苷是2'-脱氧鸟苷，至少80%的胞苦是2'-0_曱基胞香，至少 80%的尿苷是2'-O-曱基尿苷。更优选的实施方案中，最后的 寡核苷酸包括的序列中至少90%的腺苷是2'-脱氧腺苷，至少9 0%的鸟苷是2'-脱氧鸟苷，至少90%的胞苷是2'-0-曱基胞 苷，至少90%的尿苷是2'-O-曱基尿苷。最优选的实施方案中， 最后的寡核苷酸包括的序列中至少100%的^泉苷是2'-脱氧腙_ 苷，至少100%的鸟苷是2'-脱氧鸟苦，至少100%的胞苷是2' -O-曱基胞苷，至少100%的尿苷是2'-0-甲基尿苷。
rGmY转录条件下，转录反应混合物包括2'- OH三磷酸鸟 苦，2'-OMe三石岸酸J包苷，2'-OMe三磷酸尿苷，和2'- OMe 三磷酸腺苷。用本发明的rGmY转录混合物制备的修饰寡核苷酸 充分i也包4舌所有2'-OH鸟苦，2'-OMe月包普，2'-OMe尿苦， 和2'-OMe腺苷。优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序
79列中至少80。/。的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少80%的胞香是2'-0 Me胞苷，至少80。/。的尿苦是2'-OMe尿香，至少80%的腺普是 2'-OMe腺苷。更优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序 列中至少90 0/。的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少90%的胞普是2'-O Me胞苦，至少90%的尿苷是2'-OMe尿苦，至少90%的腺苷是 2'-OMe腺苷。最优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序 列中至少100%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少100%的胞苷是2' -OMe胞苦，至少100%的尿芬是2'-OMe尿苷，至少100%的 腺苦是2'-O-曱基腺普。
r/mGmH转录条件下，转录反应混合物包括2' - O -曱基三 磷酸腺苷，2'-0-甲基三磷酸胞苷，2'-0-甲基三磷酸鸟苷，2 '-O -甲基三磷酸尿苷和2' - OH三磷酸鸟苷。用本发明的r/mG mH转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2'-0 -甲 基腺苷，2'-0 -曱基胞苷，2'-0-甲基鸟苷，2'-O-曱基尿苦， 其中鸟苷中2'-OH鸟苷数量最大为10%。优选实施方案中，本 发明中结果的r/mGmH修饰寡核苦酸包括的序列中至少80 %的 腺苷是2'-O-甲基腺苷，至少80%的胞苷是2'-O-甲基胞苷， 至少80%的鸟苷是2'-0 -曱基鸟苷，至少80%的尿苦是2'-0 -甲基尿苷，并且不超过10%的鸟普是2'-OH鸟苷。更优选的 实施方案中，结果修饰寡核苷酸包括的序列中至少90%的腺苦是 2'-O-甲基腺苦，至少90%的胞苷是2'-O-甲基胞苷，至少9 0%的鸟苷是2'-O-曱基鸟苷，至少90%的尿苦是2'-0 -曱基 尿苷，并且不超过10%的鸟苷是2'-OH鸟苷。最优选的实施方 案中，结果修饰寡核普酸包括的序列中至少100%的腺普是2'-O-曱基腺苷，至少100%的胞苷是2'-0-甲基胞苦，至少90 %的鸟苷是2'-O-曱基鸟苦，至少100%的尿普是2'-0 -甲基 尿苷，并且不超过10%的鸟普是2'-OH鸟苷。mRmY转录条件下（这里也指MNA),转录混合物只包括2 ，-O-甲基三磷酸腺苷，2，-0-甲基三磷酸胞苷，2，-0-甲基 三磷酸鸟苷，2'-0-甲基三石岸酸尿苷。4吏用本发明的mRmY转 录混合物制备的结果修饰寡核苷酸包括的序列中100%的腺苷是 2'-O-甲基腺苷，100%的胞苷是2'-O-曱基胞苷，100%的鸟 苷是2'-O-曱基鸟苷（除了寡核苦酸的第一个鸟苦），100%的 尿苷是2'-O-甲基尿苷。
fGmH转录条件下，转录反应混合物包括2' - O -曱基三磷酸 腺苷，2'-O-曱基三磷酸尿苷，2'-O-甲基三磷酸胞香，2'-F 三磷酸鸟苦。用本发明的fGmH转录混合物制备的修饰寡核香酸 充分地包括所有2'-0-甲基腺苷，2'-O-曱基尿苷，2'-O-甲基胞苷，2'-F鸟苷。优选实施方案中，本发明中结果的修饰 寡核苷酸包括的序列中至少80%的腺苦是2'-O-曱基腺苷，至 少80%的尿苷是2'-O-甲基尿苷，至少80%的胞苦是2'-O-甲基胞苷，至少80。/。的鸟苷是2'-F鸟苷。更优选的实施方案中， 本发明中结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少90%的腺苷是2 '-O-曱基腺苷，至少90%的尿苷是2'-O-甲基尿苷，至少90 %的胞苷是2'-O-甲基胞苷，至少90乂的鸟苷是2'-F鸟苷。 最优选的实施方案中，本发明中结果的修饰寡核苷酸包括的序列 中至少100%的腺苷是2'-O-甲基腺苷，至少100%的尿苷是2 '-O-甲基尿苷，至少100%的胞苷是2'-0-曱基胞苷，至少1 0(T/。的鸟苷是2'-F鸟普。
dAmB转录条件下，磷酸盐，2'-0-曱基三磷酸胞苷，2'-O-甲基三磷酸鸟苷，2'-0-甲基三磷酸尿苷。使用本发明的d AmB转录混合物制备的修饰寡核苦酸充分地包括所有2'-脱氧 腺苷，2'-0-甲基胞苷，2'-O-曱基鸟苷，和2'-0-甲基尿 苷。优选实施方案中，结果的^f多饰寡核苷酸包括的序列中至少80%的腺苷是2'-脱氧腺苷，至少80%的胞苷是2'-O-甲基胞苷， 至少80%的鸟苷是2'-0-曱基鸟苷，至少80%的尿苷是2'-O
-甲基尿苷。更优选实施方案中，结果的修饰寡核苷酸包括的序 列中至少90%的腺苦是2'-脱氧腺苷，至少90%的胞苷是2' - O
-甲基胞苷，至少90%的鸟苷是2'-0-甲基鸟苷，至少90%的 尿苷是2'-0-曱基尿苷。最优选实施方案中，结果的修饰寡核 苦酸包括的序列中至少100%的腺苷是2'-脱氧腺苷，至少100 %的胞苷是2'-O-甲基胞苷，至少100%的鸟苷是2'-0-甲基 鸟苷，至少100%的尿苷是2'-0-甲基尿苷。
每种情况下，转录产物可以作为SELEX™过程中的文库来
。结果序列已经是稳定的，乂人过程中消除该步骤以获得稳、定的 适体序列并作为结果，^合予更稳定的适体。2'-OMe SELEXTM 过程的另一优势是结果序列具有更少的序列所需的2'-OH核 苷，也可能不包括。剩余2'OH核苷可以通过后-SELEX修饰去除。
如下所述，更低的但是有作用的完全整合2'替换核苷的转录 产物可以在除了上述最优条件之外的条件下获得。例如，上述专 利条件的变化包括：
HEPES緩沖液浓度可以为0至1M。本发明也试用其他pKa 值在5和IO之间的緩沖液，例如，Tris (羟甲基）氨基甲烷。
DTT浓度范围可以为0至400mM。本发明的方法也4是供了 试用其他还原试剂，例如，巯基乙醇。
亚精胺和/或精胺浓度范围可以为0至20mM。
82PEG- 8000浓度范围可以为0至50% ( w/v)。本发明的方法 也才是供了使用其他亲水聚合物，包括，例如，其他分子量的PE G或其4也聚乙二醇。
Triton X- 100浓度范围可以为0至0.1% ( w/v )。本发明的 方法也提供了使用其他非-离子去垢剂，包括，例如，其他去垢 剂，包括其他Triton-X去垢剂。
MgCl2浓度范围可以为0.5mM至50mM。 MnCl2浓度范围可 以为0.15mM至15mM。 MgCl2和MnCl2的浓度必须在所述范围 内，优选实施方案中MgCl2: MnCl2为10至3,优选地，为3 - 5: 1,更4尤选地，比例约为3-4: 1。
2' - OMe NTP的浓度（每种NTP )范围为5jaM至5mM。
2'-OH GTP ;农度范围可以0jiM至300mM。 一些实施方案 中，转录可以在缺失2'-OH GTP (OpM)时进行。
2'-OH GMP,鸟苷或其他除了 2'糖基位点的2'-OH G替 才灸的浓度范围可以为0至5mM,其中， 一些实施方案中，2'-O H GTP不包4舌在反应中，2'-OH GMP是需要的并其范围为5|i M至5mM。
DNA才莫4反浓度范围为5nM至5|aM。
突变聚合酶浓度范围为2nM至20pM。
无才几焦石粦酸酶范围为0至100单^f立/ml。
pH范围为pH6至pH9。本发明的方法可以在最多数聚合酶 整合》务饰核苦的活性pH范围内实施。转录反应时间可以为l小时至数周，优选地为l至24小时。
以下实施例中描述的生物方法显示的，具有最高亲和力和结 合特异性的所选择的适体适合于治疗C5补体蛋白相关的疾病的治疗。
适体药物^匕学
一旦结合期望目标的适体^皮鉴定，可以扭J于几种4支术进一步 增强所鉴定的适体序列的结合和/或功能特征。通过SELEXTM过 程（包括2'-修饰SELEXTM )鉴定的结合期望目标的适体可以任 意地平末端化以获得具有期望结合和/或功能特征的最小化适体 序列（这里也指"最小化结构"。使用折叠方法和序列分析（例如， 对来源于选择的克隆序列结果进行校准以寻找保守模体和/或协 变）以获知最小化构造的设计。生化探针时间也可以测定适体序 列的5'和3'边界，以获知最小化构造的设计。最小化结构可以被 化学合成并测定其相比于起源的非-最小化序列的结合和功能 特征。包括一系列5'， 3'和/或内部删除的适体序列的变体也可以 直接通过化学合成并测试其相比于其起源的非-最小化序列的 结合和/或功能特征。
此外，纟参杂重选可以用于研究单一活性适体序列（例如，通 过SELEX™过程鉴定的结合期望目标的适体，（包括2'-修饰S ELEXTM)，或一种单一最小化适体序列）的序列需要。使用合成 的，已经基于期望的单一序列设计的简并集合进行掺杂重选。简 并7K平通常为里f生型4亥苷的70%至85%间变化，例jo，期望的单 一序列。通常，通过掺杂重选过程鉴定带有中立突变的序列，但 一些情况下序列改变可以获得增强亲和力的结果。来源于使用掺 杂重选鉴定克隆的合成序列信息可以用于鉴定最小结合模体并 有助于荻得最优效果。使用SELEXTM过程鉴定的适体序列（包括2'-修饰SELEX 和掺杂重选）和/或最小化的适体序列也可以在SELEXTM之后使 用Aptamer Medicinal Chemistry进4亍最l尤4b处理，进4亍随才几或直 接序列突变以增加结合亲和力和/或功能特征，或测定序列中对于 结合活性和/或功能特征所必要的位点。
适体药物化学是一种适体改良技术，其中各组变体数据通过 化学合成。这些变体典型地与母体适体不同，其引入了单一替换， 并由于替才臭位点的不同相互区别。这些变体之间及与母体之间进 行相互比4支。特征上的改良可以是意义深远的，其包括的单一替 换可以是获得特定治疗标准所必要的。
可选地，乂人单一变体组中获得的信息可以用于设计增加的变 体组，其中超过一种替换被同时引入。 一种设计策略中，所有单 一替换变体被归类，选择前4种，并且这4中单一替换变体的所 有可能的双（6)，三（4)和四（1)重联合被合成和分析。第二 种设计策略中，最佳的单一替换变体被作为新的母本，包括最高 -级别单一替换变体的所有可能的双替换变体被合成和分析。其 他策略也可以被使用，并且这些策略可以重复使用使得替换的数 量逐渐增加，连续鉴定增加-改善的变体。
适体药物化学可以特定i也作为 一种方法对局部引入的替4灸， 而非整体，进行研究。由于适体是在通过转录制备的文库中选择 的，在SELEX™过程中引入的替换必须是整体引入的。例如， 如果期望在核苷间引入硫代磷酸酯交联，其只能在每个A (或每 个G， C, T， U等）中引入（整体替换）。在一些A (或一些G, C, T, U等）中需要硫代磷酸酯（局部替换）而在其他A中无 耐受性的适体不能通过此方法发现。
85适体药物化学方法使用的替换类型仅受固相合成试剂制备 并引导其进入聚合物合成方案的能力的限制。方法不单独受限于 核*。适体药物化学方法包括的替换可以引入空间，疏水性，亲 水性，亲脂性，疏脂性，阳离子，影子里，中性离子，两性离子， 极化性，核酸酶-抗性，构象硬度，构象柔韧性，蛋白-结合特 性，质量等。适体药物化学方法可以引入碱基-修饰，糖基-修 饰或》粦酸二酯交胃关_ <多饰。
当考虑可以有利于治疗适体的替换的类型，则期望引入具有 以下 一 种或两种特性的才奐。
(1) 已经在身体中存在的替换，例如，2，-脱氧，2，-核 糖，2'-0-曱基噤呤或嘧啶或5-甲基胞苷。
(2) 已经是所提供的治疗剂的一部分的替换，例如，硫 代磷酸酯-交耳关的寡核苷酸。
(3) 水解或降解至上述两种特性中的一种的4^换，例如， 曱基;粦酸酯-交耳关的寡核苷酸。
本发明的适体包括由此所述的适体药物化学方法制备的适体。
本发明的适体的目标结合亲和力可以通过一系列适体和目 标（例如， 一种蛋白质）之间的结合反应而测定，其中"P-标 记的适体与緩沖液重的系列稀释目标共孵育，并使用真空过滤集 合管通过硝酸纤维素膜过滤分析。这里所指的斑点印记方法，使 用三层（由上到下）由硝酸纤维素，尼龙膜，和凝胶斑点纸组成 的膜介质。与目标结合的RNA被纤维素过滤膜捕获，而非-目 标结合RNA在尼龙过滤膜上被捕获。凝胶斑点纸作为其他过滤膜的支持介质。随着过滤进行，过滤层被分离，干燥并暴露于荧 光屏并使用荧光显示系统对齐进行定量。量化结果可以用于生成
适体结合曲线，其中可以计算分离常凄t (Kd)。 一个优选实施方 案中，用于进4亍结合反应的ll沖液介质是加有0.1mg/ml BSA的 l*Dulbecco，s PBS (带有Ca十+和Mg++)。
通常，适体调节目标功能活性的能力，例如，适体的功能， 可以z使用体外和体内才莫型分析，并且其才艮据目标的生物学功能而 变化。 一些实施方案中，本发明的适体可以抑制目标的已知生物 学功能，而其他实施方案中，本发明的适体可以刺激目标的已知 生物学功能。本发明的适体的功能活性可以^吏用测定补体成分目 标已知功能的体外和体内才莫型进行分析。
术，可以常规地适用于诊断目的。诊断应用可以包括体内或体外 诊断应用。诊断试剂仅需要可以用于鉴定特定区域或浓度中给定 目标的存在。筒单地，与目标形成结合对的能力可以有效引发诊 断目的的阳性信号。本领域中的技术人员也可以通过本领域已知 的方法对适体改造，引入一个标记标签以定位这些配基的存在。 这些标签可以在多种诊断方法中^吏用。
适体治疗剂的药代动力学和生物分布调节
包括适体的所有基于-寡核苦酸的治疗药物，其药代动力学 特性与药物应用i殳计充分匹配是非常重要的。然而直4妾针对细月包 外目标的适体并不耐受细胞内输送相关的困难（如反义和基于-RNAi的治疗情况），这些适体必须能够分布于目标器官和组织， 并且与期望剂量方案相符，在体内维持段一时间（无变化）。这样，本发明提供了印象字体组合物的药代动力学的材料和 方法，并且，特别是，转变适体药代动力学的能力。适体药代动 力学的转变能力（例如，调节能力）是通过修饰配基（例如，P
EG聚合物）与适体的结合和/或引入《奮饰核苷（例如，2，-氟或 2'-0-曱基）以转变核酸的化学组成而达到的。转变适体药代^ 动力学的能力被应用于改良已有的治疗应用，或可选地，发展新 的治疗应用。例如， 一些治疗应用中，例如，抗-肿瘤或急性治 疗中期望药物的快速清除或失效，则期望减少适体在循环中的残 留时间。可选地，其他治疗应用中，例如，在维持治疗中期望维 持治疗的系统4盾环时，可以期望增力口适体在4盾环中的残留时间。
此外，适体药代动力学的转变能力被应用于修饰主体中的适 体治疗剂的生物分布。例如， 一些治疗应用中，在定位于特定组 织类型或特定器官（或一组器官）的应用中，可以期望改变适体 治疗剂的生物分布。在这些应用中，适体治疗优先刺^敫特定的组 织或器官。其4也治疗应用中，期望目标组织显示细月包标记或一种 给定疾病相关的症状，细胞损害或其他非正常病理，从而^f吏适体 治疗在受影响的组织中优先积累。例如，如描述于美国临时申请 序歹'J号60/550790, 2004年3月5曰！J3;f当，题目为"适体》、台疗6勺药 代动力学和生物分布的受控调节，,，和美国非-临时申请系列号1 1/075648, 2005年3月7号归档，题目为"适体治疗的药代动力 学和生物分布的受控调节'，，适体治疗的PEG化（例如，20 kDa PEG聚合物的PEG化）被用于定位炎症组织，从而4吏PEG化适 体治疗剂优先在炎症组织中聚集。
为测定适体治疗剂（例如，适体共Y介物或具有改变化学性的 适体，如修饰的核苦）的药代动力学和生物分布特性，需监控各 种参数。这些参数包括，例如，半衰期（W2)，血浆清除率（C1)， 分布体机（Vss)，浓度-时间曲线下的面积（AUC)，最大血清或血浆浓度（Qnax),和适体组合物的平均残留时间（MRT)。这
里使用的术语"AUC"指适体治疗剂的血浆浓度相对于适体治疗
后时间的曲线下的面积。AUC Y直用于评估生物利用度（例如，
适体纟会药后在循环中的适体治疗剂的百分率）和/或纟合定适体治疗
剂的全部清除率（C1 )(例如，适体治疗剂乂人循环中清楚的速率）。 分布体积与试剂治疗剂的血浆浓度和身体中适体的存在凄史量相
关。Vss越大，血浆外发现的适体越多（例如，更多外;参）。
本发明提供了通过将适体与调节配基相结合，如一种小分 子，多肽，或聚合末端基团，或通过在适体中引入修饰核苦，在 受控模式中调节稳定的适体组合物的体内药代动力学和生物分 布的的材料和方法。如此所述，与修饰配基的结合和/或核苷化学 组合物的改变可以改变适体循环残留时间和组织分布的基本方 面。
除了核酸酶的清除作用，核苷治疗剂还受限于肾过滤排除功 能。因此，通过静月永内症会药的抗-核酸酶的寡核香酸的体内半衰 期小于10分钟，除非过滤功能可以〗皮抑制。可以通过促进从血 流进入组织的快速分布速度或增加寡核苷酸的适体分子量，使其 超过肾小球的截止大小而完成。小治疗剂与PEG聚合物的结合 (PEG化），如下所述，可以显著地增长适体在循环中的残留时间， 乂人而减少^会药频率并增强4十对血管目标的效力。
进一步，眼部组织的适体过滤也可以被调整，特别是^皮抑制， 通过与PEG聚合物结合增加本发明的适体的表观分子量。
适体可以与各种修饰配基结合，如高分子量聚合物，例如， PEG;多肽，例如，Tat (HIV Tat蛋白的13个氨基酸片段（Viv es,等（1997)， J. Biol. Chem. 272 (25 ): 16010- 7)), Ant (来 源于果蝇触角同源蛋白第三螺:旋的16-氨基酸序列（Pietersz，等（2001 ), Vaccine 19 ( 11 - 12 ): 1397 - 405 ))和Arg7 ( —种 短的，聚合精氨酸组成的正电荷细胞-渗透多肽（Arg7 ) ( Rothb ard，等（2000)， Nat. Med. 6 ( 11 ): 1253 — 7; Rothbard， J等 (2002), J. Med. Chem. 45 ( 17): 3612 - 8 ));和小分子，侈寸^口， 亲脂性化合物如胆固醇。这里所述的各种结合中，与PEG基团 的结合最明显地影响适体的体内特性。例如，上述的非-临时申 请（美国系列号，11/075648， 2005年3月7日归档，题目为"适 体治疗剂药代动力学和生物分布的受控调节，)，适体与20 kDa P EG聚合物的结合阻抑的肾过滤并促进适体在健康和炎症组织中 的分布。jJ:匕夕卜，20kDa PEG —多狀聚合4勿与40 dDa PEG聚合4勿 对适体的肾过滤阻抑效果类似。虽然PEG化的一种效应是适体 清除，20 kDa配基提供的延长的系统暴露时间有助于适体在组 织中的分布，特別是那些高度灌注的器官和炎症部位。适体-20 kDa PEG聚合结合物使适体直接定位于炎症部位，使得PEG化 适体优先在炎症组织中聚集。 一些情况中，20 kDa PEG4b适体 结合物可以4妾近细月包内部，例如，肾细月包。
综上所述，^f氐分子量配基，包括胆固醇和细胞渗透多肽对适 体药代动力学和组合分布的影响明显小于P E G化或核苷修饰（例 如，化学成分的改变）造成的影响。然而，不期望受限于理i仑， 具显示胆固醇-介导的与血浆脂蛋白的结合，假设其发生在反义 结合状态下，被排除在特的别适体-胆固醇结合折叠结构之外， 并且/或者与胆固醇基团的亲脂性相关。与胆固醇类似，相对于4 8小时时肾脏中高水平的结合物，Tat多肽标签促进适体从血流中 的清除。本文中已报导的介导大分子在体外通过细胞膜的其他多 肽（例如，Ant, Arg7)，不促进适体在循环中的清除。然而，相 似于Tat,相对于其他适体，Ant结合物显著地在肾脏中聚集。然 而，不期望受限于理论，Ant和Arg7多肽修饰配基可能对适体的体内三维折叠产生不利影响，削弱这些多肽影响适体转运特性的 能力。
^修饰核苷也可以用于调整适体的血浆清除。例如，非结合的
适体与例如，2'-氟，2'-OMe,和/或稳、定其化学性的碌"A^岸酸 酯的整合，其在目前制备的显示高水平体外和体内核酸酶稳定性 的适体中具有典型性，与非修饰合适相比，显示了血浆中的快速 清除（例如，快速血浆清除率）和组织中的快速分布，主要分布 于肾脏中。
PAG-》泉生的一亥fr支
如上所述，高分子量非免疫原性的核酸派生物具有改变核酸 药代动力学和药效学特性的潜力，使其称为更有效的治疗药物。 活性的有力改变可以包括增加对核酸的抗性，减少肾过滤，减少 免疫系统的暴露，并改变治疗剂在身体中的分布。
本发明的适体组合物可以由聚烷撑二醇（"PAG，）配基派生。 PAG-派生的核酸的实施例见美国专利申请系列号10/718833, 2 003年11月21日归档，其通过在此引述全部合并与本文。本发 明中使用的典型的聚合物包括聚（乙二醇）（"PEG:"),聚（乙 撑氧）（"PEO，）和聚丙烯醇（包括聚异丙烯醇）。此外，不同的 烯氧化物（例如，乙烯氧4b物和丙烯氧化物）可以在i午多应用中 使用。其最常用的形式，聚乙二醇，如PEG，是一种在每一个末 端具有羟基基团：HO-CH2CH20- ( CH2CH20 ) n - CH2CH2 - O H的线性聚合物。该聚合物，alha- ， omega- 二羟基聚（乙二醇）， 也可以由HO-PEG-OH表示，其被理解为-PEG-符号表示以 下结构单元：-CH2CH20- ( CH2CH20 ) n - CH2CH2 -,其中n 典型的范围为4至10000。适合于治疗的PAG聚合物典型地具有在水中和许多有才几溶 剂中的可溶性，无毒性，并无免疫原性的特征。我们使用的PAG 将聚合物与非水溶性分子共价结合，使得PAG -分子"结合物"具 可溶性。例如，具显示非水溶性药物紫杉醇，当与PEG结合时， 变4寻具有水溶性。Greenwald，等，J.Org.Chem.， 60: 331 - 336 (1995 )。 PAG结合物通常不仅仅用于增强可溶性和稳定性，也可 以延长分子的血液循环半衰期。
PAG》派生物，例^。， PAG结合物，改变治疗剂的生物分布的 能力与"i午多因素相关，包括结合物的外只见大小（例如，以水力半 径测定的）。已知更大的结合物（〉10kDa)更有效地抑制肾过滤， 并且从而增加小的高分子（例如，多肽，反义寡核苷酸）的血清 半衰期。具显示，PEG结合物抑制过滤的能力将随PEG的大小 增高至50kDa而增大（由于半衰期将由巨噬细胞-介导的代谢而 非肾过滤一皮定义，^使得进一步的增加具有^艮小的效应。）
本发明的PAG派生的化合物大小典型地为5至80kDa之间， 然而4壬<可大小都可以纟皮>使用，该选纟奪依赖于适体和其应用。其4也 本发明的PAG派生的化合物大小为10至80kDa之间。而其他他 本发明的PAG派生的化合物大小为10至60kDa之间。本发明的 组合物的PAG配基大小范围为10， 20, 30， 40, 50， 60，或80 kDa。以下实施方案中，PEG是线性PEG，而其他实施方案中， PEG是分支PEG。其他实施方案中PEG是图4中描述的40kDa 分支PEG。 一些实施方案中，如图5所示，40kDa分支PEG与 适体的5'末端连"t妄。
本发明提供了合成高分子PEG-核酸（优选地，适体）结合 物，包括多重PEG化核酸的经济方法。本发明也包括PEG-连 才妄的多体寡核苦酸，例如，二聚适体。在生物-表达的蛋白治疗 剂中，核酸治疗剂典型地从活性单体核芬化学合成。PEG-核酸结合物可以通过运用相同的重复单体合成整合PEG而制备。例 如，通过转变为亚石粦酰胺形式;敫活的PEG可以整合入固相寡核 苦酸合成。可选地，可以通过位点-特异整合入PEG结合反应 位点而完成寡核苦酸的合成。
活寸生PEG
高分子量的PEG (>10kDa)的制备可能是困难的，低效的， 并且昂贵的。在合成高分子量PEG-核酸结合物的过程中，先前 的工作关注于制备高分子量的活性PEG。自闭这些分支的方法包 括制备线性活性PEG,或分支活性PEG,其中两个或多个PEG 与带有活性基团的中心结合。这些高分子量PEG分支的末端部 分，例3口，牙目关的非-反应羟基（-OH)基团，可以3皮^敫活， 或转变为功能基团，以4吏一种或多种PEG与其他化合物通过反 应位点相连接。分支的活性PEG将具有超过两个末端，在两个 或更多末端^^皮激活的情况下，这些活性高分子量PEG分支在此 称为多重-活性PEG。 一些情况中，分支PEG分子中不是所有 末端都祐:激活。分支PEG分子的4壬<可两个末端祐:激活的情况中， 该PEG分子指双-活性PEG。分支PEG分子的任^T两个末端4皮 激活的情况中，该PEG分子指双-活性PEG。分支PEG分子的 一个末端被激活的情况中，该PEG分子指单-活性。作为该途 径的一个实施例，描述了通过将两个单甲氧基PEG与随后被激 活的赖氨酸中心连4妾制备活性PEG的方法（Harris等，Nature， vol.2: 214 - 221, 2003 )。
如图6所示，线性PEG分子是双-功能的，并有时称为"PE G二醇'。，PEG分子的末端部分是相对的非-反应羟基基团，-O H基团，其可以被激活，或转变为功能基团，使PEG与其他化 合物通过反应位点连^妄。这些活性PEG 二醇在此指双-活性PE G。例如，可以通过将相对非-反应羟基基团，-OH，替换为来源于N-羟基琥珀酰亚胺的琥珀酰亚胺活性酯基团，4吏PEG 二 醇的末端配基成为具有与氨基基团进行选择反应的活性碳酸酯 而功能化。可选地，PEG二醇可以由许多基团激活，包括4旦不限 制于a-囟代乙酸，epihalohydrines,马来酸，酒石酸和石友酸，其 在适当的操作后可以制备结合的活性羰基或类似物。其他激活P EG的方法描述于Roberts等，（2002 ) Advanced Drug Deliver R eviews 54: 549-476,通过在此引述全部合并于本文。4吏用 一种 前述方法纟敫活PEG之外，PEG分子的一个或两个末端的乙醇功 能团可以^皮^修饰以结合不同类型的核酸。例如，将末端乙醇功能 团转变为氨基，或辟u醇，可以结合尿素和碌"戈尿烷。
许多应用中，期望于将PEG分子的一个末端用充分非-反应 基团封闭，使PEG分子称为单-功能（或单-活性的）。在通常 显示多重活性PEG活性位点的蛋白质治疗剂中，双-功能活性P EG导致额外的交联，产生低活性聚集。为制备单-活性PEG， P EG 二醇分子末端的一个羟基典型地替换为非-活性曱氧基末端 基团，-OCH3-。而另一个非-封闭的PEG分子末端典型地转 变为反应末端基团，其可以被激活，与一种表面或分子，如蛋白 质的反应位点连接。
连接一个或更多PEG的适体
最常见地，通过在5'-末端增加自由伯胺（在固相合成的最 后偶联步骤使用修饰亚磷酰胺整合）合成高分子量PAG -核酸结 合物。 -使用该方法，反应PEG(例如，其一皮激活以与氨基反应和 形成交联）与纯化的寡核苷酸结合并且在溶液中进行交联反应。
此外，高分子量PAG -核酸-PAG结合物可以通过将单功能 活性PEG与包括超过一个反应位点的核酸反应制备。 一个实施 方案中，核酸是双-反应活性的，并且包括两个反应位点：通过常规亚磷酰胺合成并且以3'-氨基固相支持起始，将5'-氨基 基团和3'-氨基基团整合入寡核苷酸，例如：图6中描述的3'-5'-双-PEG化。可选的实施方案中，反映位点可以在内部位点 引入，4吏用嘧咬的5-位点，噪呤的8-位点，或核糖的2'-位 点作为连接伯胺的位点。该实施方案中，核酸可以具有几个活性 或反应^f立点并且是多重活'l"生的。
为制备核酸-PEG-核酸结合物，核酸被首先合成，从而其 具有单活性位点（例如，其是单-活性的）。优选实施方案中， 反应位点是通过在寡核苦酸固相合成最后步骤中增加-修饰亚石粦 酰胺，在5'-末端整合入的一个氨基基团。另一优选实施方案中， 使用3'-氨基修饰物，加上在5'-末端引入氨基完成合成，产生 3', 5'-双-氨基寡核苷酸。通过对修饰的寡核苷酸去蛋白和纯 化，其在溶液中以高浓度再生，使活性PEG的自然水解最小化。 优选实施方案中，寡核苦酸的浓度是lmM,再生溶液包括200' mM NaHC03-緩冲液，pH8.3。连接物的合成是通过緩慢的，逐 步地增加高纯度的活性PEG起始的。优选实施方案中，PEG被 激活为p-硝基苯基碳酸盐。随着反应进行，PEG-核酸结合物 通过凝月交电泳或液相色语纯化以分离完全的-，部分-,和非-结合物质。
结合一个PEG的多重适体
本发明也包括高分子量适体组合物，其中两个或多个核酸配 基共价结合至少一个聚烷撑二醇基团。聚烷撑二醇基团作为一种 稳定基团。稳定基团是一种分子，或分子的一部分，其可以改善 本发明的高分子量适体组合物的药代动力学和药效学特性。 一些 情况中，稳定基团是一种分子或分子的一部分，其可以使两个或 更多适体，或适体区域接近，或提供本发明的高分子量适体组合 物的减少的整体转动自由度。稳定基团可以是聚烷撑二醇，如聚
95乙二醇，其可以是线性或分支的，单聚物或杂聚物。其他稳定基
团包括多肽核酸（PNA)等聚合物。寡核苷酸也可以是一种稳定 基团；这些寡核苷酸可以包4^修饰核苷，和/或》务饰联4妄；如好"< 磷酸酯。
稳定基团可以是适体组合物的内部部分，例如，其与适体共 价结合。在一种聚烷撑二醇共价结合适体任一末端的组合物中， 如聚烷撑二醇与核酸基团共同连接在一个分子中，该聚烷撑二醇 称为连接基团。这些组合物中，联接分子的最初结构包括线性排 列的核酸-PAG-核酸。在一种组合物的实施例中，其中PEG稳 定基团作为适体的分离不同部分的联^妄，是一种PEG与单适体 序列连接的组合物，从而高分子量适体组合物的线性排列是，例 如，核酸—PEG-斗亥酸（—PEG —才亥卧臾）n,其中n大于等于l。
为制备核酸-PEG - 4亥酸结合物，核酸^皮最初合成乂人而其带 有一个单一反应位点（例如，其是单-活性的）。优选实施方案
中，反应位点是一种通过寡核普酸的固相合成最后步骤中引入额 外的修饰硫代磷酸酯，在5'-末端引入的一个氨基基团。将修饰 核苷去蛋白和纯化后，其在溶液中以高浓度再生， <吏活性PEG 的自然水解最小化。优选实施方案中，寡核苷酸的浓度是lmM, 再生溶液包4舌200 mM NaHC03-緩沖液，pH8.3。连4妄物的合 成是通过緩'l"曼的，逐步地增加高纯度的双-功能PEG起始的。 优选实施方案中，通过衍生为硝苯基碳酸酯，PEG二醇的两个末 端都^皮激活（双-活性）。随反应进4于，PEG-核酸结合物通过 省是月交电泳或液相色i普纯化以分离完全的-，部分的-,和非-结 合的物质。多重PAG分子连接（例如，随机或才莫块聚合物）或 更小的PAG链可以相连接以获得不同长度（或分子量）。非-P AG连接可以在不同长度的PAG链之间使用。连接区域可以具有 一个或多个与其相连的聚烷撑二醇基团。
这些PAG可以是不同长度并以适当的组合使用以获得组合物的 期望分子量。
特定连接物的效果可以受其化学组成和长度影响。太长，或 太短，或形成不宜的空间排列的连接物和/或与补体成分目标的离 子交互作用将影响适体和补体成分目标间复合物的形成。 一种连 接物，其长于核酸间跨度所需，将通过减少联接的效应浓度减弱 结合稳定性。这样，有必要经常对联接组合物和其长度进行优化 以4吏适体对目标的亲和力达到最大。
对补体系统蛋白C5具有结合亲和力的适体
一些实施方案中，本发明的材 一牛和方法包括 一 系列特异结合 补体蛋白C5并对其功能调节的15至60核苦长度的核酸适体， 例如，阻抑补体蛋白C5体内活性和/或细胞-基础的化验的活性。
本发明的一些实施方案中，描述了可以特异结合并调节补体 蛋白C5的适体。这些适体提供了低-毒性，安全性，和治疗有 效形态，改良和/或防止各种补体-相关的疾病或失调，例如，补 体-相关的心脏失调（例如，心肌损伤；冠状动脉搭桥术（CAB G)相关的C5介导的补体并发症如手术后出血，系统嗜中性细 月包和白细月包活性，增加心月几梗死危险，并增加i人知功能紊乱；再 狭窄；和经皮冠状动脉介入治疗相关的C5介导的补体并发症）， 缺血再灌注损伤（例如，心肌炎症，中风，冻伤），补体相关的
炎症失调（例如，译喘，关节炎，脓血症，和器官移植后排斥）， 和^卜体-坤目关的自身免疫失调（例唢口，重症月几无力，系纟充'性纟工王汪
狼疮（SLE))。其他期望的C5抑制症状包括，例如，肺部炎症 (Mulligan等，（1998 ) J. Clin. Invest. 98: 503 )，体夕卜^卜体;舌')"生 (Rinder等，（1995 ) J. Clin. Invest. 96: 1564),抗体—介导的补体活性（Biesecker等，（1989) J. Immunol. 142: 2654)，血 管J求性肾炎和其他肾病，眼部症状如C5介导的眼部组织损伤， 例如，糖尿病视网膜病，渗出性和/或非-渗出性年龄相关黄斑变 性（AMD),阵发性睡眠性血红蛋白尿症。这些适体也可以用于诊断。
一些实施方案中，本发明的^f氐毒性，安全，和有岁文调节的适 体可以在发明的方法中用于治疗，稳定和/或防止不同补体-相关 眼部疾病或失调，包括，例如，急性或'f曼性炎症和/或免疫-介导 的眼部失调，炎症性结膜炎，包括过敏性巨乳头性结膜炎，黄斑 水肺，葡萄膜炎，眼内炎，角膜溃烂，干眼症，青光眼，糖尿病 一见网月莫病，角月莫移档^非斥，眼部手术相关的并发症，如人工晶体 才直入术和白内障手术相关的炎症，Behcet's疾病，免疫复合月永管 炎，Fuch's疾病，小柳原田病，亚视网膜纤维化，角膜炎，玻璃 体-视网膜炎，眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞 病毒^L网月莫炎e'AMD，)，非-渗出性（f'干性，）AMD，或眼部新生 血管化失调，包括糖尿病^L网膜炎或渗出性。显，）AMD。这些适 体也可以在眼部i貪断中^f吏用。
这些适体也可以包括这里描述的修饰，例如，与亲脂性或高 分子量化合物（例如，PEG)连接，整合帽子基团，整合修饰核 苷，并对磷酸骨架进行修饰。
本发明的一个实施方案中，提供了一个分离的，非-自然发 生的结合C5补体蛋白的适体。另一实施方案中，提供了在本发 明的方法中4吏用，以治疗，稳、定和/或预防补体-介导的眼部失调 的分离的，非-自然发生的结合C5补体蛋白的适体。 一些实施 方案中，分离的，非-自然发生的适体与C5补体蛋白的分离常 数〖'Kd，）小于IOOjiM,小于ljaM,小于500nM，小于100nM， 小于50nM,小于lnM,小于500pM,小于100pM，小于50pM。本发明的一些实施方案中，分离常数是以下列实施例1中描述的 斑点染色滴定方法测定的。
另一实施方案中，本发明中使用的适体调节C5补体蛋白的 功能，特别是抑制C5补体蛋白功能和/或C5补体蛋白变体功能。 这里使用的C5补体蛋白变体包括执行与C5补体蛋白充分类似 功能的变体。C5补体蛋白变体合适地充分包括相同的结构，并 且一些实施方案中与包括下列氨基酸序列的C5补体蛋白的氨基 酉吏序歹'J (系列号：102)(引用于Haviland等，J Immunol. 1991 年1月1日；146 ( 1 ): 362 — 8 )相比，包才舌至少80%的序列一 致性，更合适地包括至少90%序列一致性，更适合地包括至少9 5%序列一致性。
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本发明的一些实施方案中，与目标变体一致的序列是卩吏用下
述的BLAST测定的。两个或更多核酸或蛋白序列间的术语"序列 一致，,，指^f吏用以下一种序列比4交,呈序或通过目才企方法，与最高对应的排列相比，两种或更多序列或亚序列间具有相同的或特定百 分比相同的氨基酸残基或核苦。对于序列比4交，典型地， 一种序 列净皮作为参考序列，与另一测试序列比4交。当^f吏用序列比4交禾呈序 时，测试和参考序列被输入电脑，如有需要则指明亚序列同等物， 并i殳计序列算法程序常lt 。序列比4交程序随后4艮据i更计的禾呈序常 数计算测试序列与参考序列间的序列 一致百分比。可以执行以下
最佳的序列比4交程序，例如，定位同源算法，Smith&Waterman, Adv， Appl. Math. 2: 482 ( 1981 ),同源P车歹'J算:^， Needleman &Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 ( 1970),对目4以方法的研究，Pe arson&Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 ( 1998 ), 这些算法的计算才几处理（GAP, BESTFIT， PASTA,和Wisconsi n遗传软件包中的TFASTA,遗传计算才几组，575 Scinece Dr., Madison, Wis.)，或通过目检（通常见下列，Ausubel等）。
适合于测定序列一致百分比的算法是基础定位算法研究工 具中4吏用的算法（以下的"BLAST，)，见，例如，Altschul等，J Mol. Biol. 215: 403 - 410 ( 1990 )和Altschul等，Nucleic Acid s Res， 15: 3389- 3402 ( 1997)。执行BLAST分析的软件是通 过国家生物技术信息中心（以下的"NCBI，）公开获得。使用NCB I中软件，例如，BLASTN (核酸序歹ll )和BLASTP (氨基酸序 列）测定序列一致性的默认参数描述于McGinnis等，Nucleic A cids Res, 32: W20 - W25 (2004)。
本发明的另一实施方案中，提供了与包括下列任何一种适体 充分相同的结合C5补体蛋白的能力：系列号：1-2, 5-67， 7 5-81， 83或88 - 98。本发明的另一实施方案中，适体具有包括， 下列Y壬^可一种适体充分相同的结构和结合C5补体蛋白的能力： 系列号：1 - 2, 5 — 67, 75 - 81, 83或88 - 98。本发明的实施方 案中，本发明的适体具有的序列，包括任何化学修饰，对应于任《可系列号：1-2, 5-67， 75 - 81, 83或88 - 98。另一实施方案 中，本发明的适体作为药物组合物中的活性成分4吏用。另一实施 方案中，适体或包括本发明的适体的组合物用于治疗多种包括任 何从以下组中选择的补体-相关的疾病或失调：补体-相关心脏 失调（例如，心月几损伤；冠状动乐:M荅桥术（CABG)相关的C5 介导的并发症，如术后出血，嗜中性粒细l包和白细万包活性，增加 心肌梗死和认知紊乱的危险；在狭窄；和经皮冠状动月永介入治疗 相关的C5介导的补体并发症），缺血再灌注损伤（例如，心肌梗 死，中风，冻伤），补体-相关的炎症失调（例如，哮喘，关节 炎，脓血症，和器官移才直后排斥），和补体-相关的自身免疫失 调（例如，重症月几无力，系统性红斑《良瘙（SLE),肺炎，体夕卜补 体活性，抗体-介导的补体活性和补体相关的眼部疾病，如糖尿 病视网膜炎以及年龄-相关的黄斑变性（AMD)。
一种实施方案中，本发明的抗-C5适体包4^+2'-氟》务饰核 苷，2'-OMe ^修饰核苷- OMe，）和2'- OH "票呤残基的混合 物。修饰的抗C5适体的描述性序列（系列号：l)见下表l，其 结构见图3A。大多数噪呤和（A和G)具有2'-OMe，除了仅 有两个G残基仍为2'-OH (突出显示的残基）。带圈的残基表示 可以同时修饰为2'-H而不充分改变适体的抗C5活性的嘧啶组 群（见下表1中的ARC330 (系列号：2,图3B ))。图3A中下 划线显示的残基表示可以包括2'-氟和2' - H修饰（但不是2'-OMe)的嘌P令残基，而带才匡的残基表示可以包4舌2'-氟或2-O Me修饰（但不是2'-H)的嘧啶残基。带有箭头（ ）的残基 必须含有2'-氟修饰。带有箭头（ ）的残基如果不含有2'-氟修饰，将使适体的溶血活性显著减弱。优选实施方案中，本发 明的抗-C5适体包括对应于系列号：1中的核苷序列。才艮据本发明的抗-C5适体的实施例是ARC186(系列号：4 ), 其在图3C中显示并描述于美国专利系列号6395888，其通过在 此引述全部合并于本文。ARC186的所有21个嘧，定残基具有2' -氟修饰。主要的嘌呤（14个残基）具有2'-OMe修饰，除了 三个为2' - OH "票呤残基（图3C中突出显示）。本发明的抗-C5 适体也可以包括不同的2'-氟和2'-H〗务饰的混合。例如，本发 明的另一抗-C5适体是图3B中的ARC330 (系列号：2)。 ARC 330 (系列号：2)包括7个2'- H修饰（图3B中画圏表示），14 个带有2'-氟修饰的嘧咬残基，14个2'-OMe修饰的嘌呤残基， 和三个2'- OH噪呤残基（图3B中突出表示）。
下表1表述了其他的包括2'-氟修饰，2' - OMe修饰，2' - O H嘌呤残基，和连接非-免疫原性，不同大小的高分子量化合物 (例如，PEG)的适体的组合物，其每一个都来源于ARC186 (系 列号：4)。本发明包括下表1描述的适体。本发明也包括下列描 述的但缺失所需的3'帽子（例如，反向脱氧嘧啶帽）的适体和/ 或下列描述的包括3'帽子（例如，反向dT)的适体，其中该3' 帽子是非需要的。
本发明的一些实施方案中描述的方法中使用的抗-C5适体 可以是包括任何下列描述的适体：序列号NOS 1至69, 75， 76, 81, 91, 95和96。
除非另有说明，下表1中的核酸序列以5'至3'反向表示。对 于表1中的每个序列，所有2' - OMe噤，冷或嘧"定^修饰以相应核苷 前的"m"表示；所有2'-氟嘧啶修饰以相应核苷前的"f，表示；所 有嘌呤或嘧咬的脱氧修饰以相应核苷前的"d"表示；任何无"m，，' 'f,，或"d"显示的嘌呤或嘧咬表示2'-OH残基核香。进一步，"3T" 表示反向脱氧嘧啶，"NH"表示己胺连接，"NH2"表示己胺末端，"PEG"表示具有特定分子量的聚乙二醇基团，"biotin"表示5'具有生 物素连接的适体。
表1:
序歹'j号：1
其中：
Xi=fC或mC X2=^G或gy
Xi^iG或niG X5=fC或dC X6《或dT X7=fC或dC X8=rA政mA 5C9^rG或niG
X"-fC或dC Xi2^^fC或mC X'3==fU或mU Xl4=iG或mG Xi5=xA或mA Xi^iG或 Xl7=fU或dT X|8=fC^ dC XiiHU或dT X2o=rG或mG X2i=rA或mA X22=rG或mG Xza饰或dT Xm可A或mA
X25=fC或dC
XafiH(C或dC X27=ft^ dT X幼^或mG X29^tG或mG
ARC330 (序列号：2)
flCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAinGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfC迈G ARC185(序歹'J号：3)
GAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUflHCGfUfCARC186 (序歹'J号：'4)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAniGfUfC£UinGtaAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3，
ARC187(序歹'J号：5) 40kDaPEG-NH-
£CmGfCfCGfCmGmGfUK:fUfCmAmGmGfCGrcfUmGmAmGfUfCfUinGmAmG£UfUfUAfCfCfUmGfCmG-3"l Where the branched 40 kDa PEG is ,3-bis(mP£O-[20 kDa】)-propyl-2《4,-butamide)
ARC188 (序列号：6)
AGGAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAiCfCfUfUfCGfUfC ARC189 (序列号：7)
AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAniGmGfCGfCfU迈GniAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAiCfCfUinGfC迈C] ARC250 <序列号：8)
GGfCGfCfCGfCGGfUfCfUfCAGG忙GfCfUGAGfUfCfUGAGfUfUfUAiCfCfUGK:G ARC296 <序列号：9)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUraGmAmGTdCTmGmAinGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG-3T ARC297 (序列号：10)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTinGmAmGfUfUfUAdCdCfUinGmCinG-3T
ARC331 (序列号：11)
dCmGdCfCGfiCmGinGfUdCTdCmAniGinGdCGfCfUniGraAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGdCmG ARC332 (序列号：12)
dCmGfQECGfCmG迈GfUdCTdCmAniGmGdCGJECfU迈GmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAiCfCfUmGfCmG ARC333 (序列号：13)
fCmGdCfiCGfCniGinGfUdCTdCmAinG迈GdCGfCfUmGmAmGTdCTniGinAniGfUfUfUAfCfCfUniGfCmG ARC334 (序歹'J号：14)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUmGmAinGTdCTmGmAmGfUfUfUAiCfCfUnrf3dC迈G
ARC411 (序列号：15)
fCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAinGTdCTmGniAniGfUfUfUAflCfCfUniGfCmG ARC412 (序列号：16)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAnrf3niGdCGiCfU迈GmAmGTdCTmGmAinGfUfUfUAfCfCfUmGmCinG ARC413 (序列号：17)
mCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAinGmGdCGfCfUniGmAmGTdCTmGmAniGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC414(序列号：18)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUinG迈CinG AROH5(序列号：19)
fCmGfCdCGfCmGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC416(序列号：20)
fCmGfl^CGdCmGinGfUdCTdCmAmGmGdCCHCfU迈GmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGAROtn (序歹'J号：21)
fCmGfCdCGdCmOinGfUdCTdCmAinGmGdCGfCfU迈GmAmGTdCTmGinAmGfUfUfUAfCfCfUniOfCinG ARC418 (序歹'J表：22)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAniGmGdCGdCfUmGmAinGTdCTnaGmAniGfUfUfUAfCfCfU迈GfCmG ARC419 (序歹'J表：23>
fCmGfCfCGfCmGni。fUdCTdCmAmGmGdCGfCr迈GmAmGTdCTniGmAniGfUfUfUAfCfCfUraGfCmG
ARC420 (序列号：24)
*CmG£CfCGfCmGmGfUdCTdCmAniGmGdCGdCTmGniAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC421 (序列表：25)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTfUfUAfCfCfUinGiCmG ARC422 (序列号：26)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUTfUAfCfCfUmGfCmG ARC423(序歹'〗表：27)
fC边GfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUTAfCfCfUmGfl:naG ARC424 (序列表：28)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCinAmGmGdCGfCfUinGmAmGTdCTmGniAniGTTTAfDK;fUmGfCmG ARC425 (序列号：29)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCTmGKinG ARC426(序歹1〗表：30)
.tCmGfCfCGfCmGmG迈UdCTdCmAmGmGdCGfCfU迈GmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG
ARC427 (序列表：31)
fCmGiC迈CGfCinGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUmGinAmGTdCTinGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCinG ARC428 (序歹'j号：32)
fCmGfCfCGmCmGniGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAinGTdCTmGniAmGfUfUfUAfCfCfUniGfCmG
ARC429 (序列号：33)
fCmGeCmCOmCmGmGfUdCTdCmAmGinGdCGfCfUinGmAmGTdCTmGinAmGfUfUfUAfCfCfUniGfCmG ARC430 (序歹'〗号：34)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCfUmGmAmGfUdCfUniGmAmGfUfUfUAfCfCfUniGfCniG ARC431(序歹'J表：35)
fCniGfCfCGrcniGmGfUdCfUdCniAmGinGdCGfCniUniGmAniGfUdCfUniGmAniGfUfOfUAfCfCfUmGfCin ARC432(序列号：36)
fCinGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGniGdCGmCmUmGmAniGfUdCfU迈GmAinGfUfUfUAfCfCfUinGfCinG ARC433 (序列号：37)
fC迈GfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUinGmAniGTdCTmGmAmGmUfUfUAfCfCfUmGfCaiG ARC434(序列号：38)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAinGmGdCGKIfUniGmAmGTdCTmGmAmGfUinUfUAlCfCfUinGfCniGformula see original document page 106 ARC543 (序列号：54).
mGmC3fCmGfCfC<3fCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGinAmGTdCTmGmAinGfUfU£UAfCfCfUinGfCm GmCmC
ARC544(序:'列号：55〉
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUniCinUmCmAmGmGinCGfCfUniGmAmGfnUmCmUmGinAinOfUfUfUAfCfCfU mGfCmGmCraC
ARC550 (序列号：56)
fCmGfCfCGlCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUniGmAinGfUfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC551 (序列号：57)
fCmGfCiCGfCinGmGfUfCfUfCmAmGniGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC552 (序歹'J号：58)
1CmGfCfCGiCmGmGfUfCfUfl^nAmGmGiCGiCfUinGmAmGfUKaUmGniAmOTfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC553 (序歹'J号：59)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfOGniCmUmGmAinGfUfOfU迈GmAmGfUflJfUmAfCfCiUmGfCniG-3T
ARC554 (序列号：60)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGinCmUinGmAmGfUfCfUmGmAmGTfUfUinAfCiCfUinGfCmG-3T
ARC 657 (序歹'J号：61) 20kDaPEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUflJfUAiCfCfUmGfCmG-3T
ARC 658 (序列号：62) 30 kDa PEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGn3AmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfi:fUinGfC迈G-3T
ARC 672 (序列号：63) NH2-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGniGiCGK;fUniGmAmGfUfCfUmGmAmGiUfUfUAiCfCfUmGfCmG-3T
ARC706 (序歹'J.号：64) ■ WkDaPEG-NH-
K:mGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCniAmGmGfCGfCfUmGinAmGiUfCfU迈GinAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3TARC1537 (序列号：65) 40kDaPBG-NH-
fCmGfC£CGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGinAmGfUfUfUAfCfCfUinGfCmG-3T
ARC1730)(序歹'J号：66) PEG20K-NH-
fCmGfCfCGfCnaGmGfUfCfUfCmAmGmGfiCGfCfUniGmAmGfUfCfUmGmAinGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-NH-PEG20K
ARC1905 (序歹'J号：67) 40KPEG-NH—
fCmGfaCG*CmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUinGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCniG-3T Where the branched 40 kDa PEG is 2,3-bis(mPEG-[20 kDa】)-propyl小carfoamoyl
ARC243 (序列号：68)
GGfCGAfUfUAiCfUGGGAiCGGAfCfUft:GfCGAfUGfUGAGfC忙fCAGAfCGAfCfUfCGfCfC ARC244 (序歹'J号：69)
GGiCfUfUflCfUGAAGAfUfUAfUfUfUfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCfCAGAfCfCrcfC
本发明进一步包括下表2中的适体。表2中的适体以5'至3' 方向表示，并显示了以dRmY SELEXTM条件下选择的适体的核 糖序列。本发明中源于该选择的一些实施方案中（在所列的序列 中反应），噤呤（A和G)是脱氧的而嘧咬（U和C) 2'-OMe。 一些实施方案中适体包4舌一个帽子（例如，3'-反向dT)。 一些 实施方案中适体包4舌一种PEG。
表2/dRmY抗—C5适体
table see original document page 108本发明的结合补体蛋白C5的其他适体在下列实施例3中描
其他特;f正，对象和优点在这里的描述中是显而易见的。在i兌明中， 单数形式也可以包括复数，除非上下文中另有明确身见定。除非另 有定义，这里使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属的领 域中的普通技术人员所通常理解的相同意义。如有冲突，本说明 将受控。
抗-C5药物和眼部失调
目前的数据显示年龄相关黄斑变性（AMD)仍是一种补体活 性参与作用的炎症介导的疾病。年龄-相关黄斑变性e'AMD，）是 一种慢性和进程性眼病，并且其是美国，欧洲，和日本导致无法 挽回的视觉损害的引导性原因。AMD以视网膜中心区域黄斑的 进程性恶化。进程性AMD的最明显的指标物是玻璃疣的出现， 在视网膜下具有黄-白沉积物，其是来源于视网膜细胞新陈代谢 废物的斑块。玻璃疣的出现是两种形式AMD:渗出性（'湿，）和 非 -渗出性（f'干，）的重要组成。当新血管在视网膜下生长并通过 已知为Bruch's膜的膜结构侵染视网膜时发生湿型AMD。此异常 血管生长通常指血管生成或U永纟各膜）新血管生成。这些新血管 容易破裂并经常出血并渗出液体至黄斑，结果有时会造成突然和 通常严重的纟见觉损害。虽然新的治疗（例如，LucentisTM)可以 停止血管生成并逆转液体的聚集，甚至在少数病人中恢复一见力， 然而血管生成的损害经常导致纟见网力莫细力包的结疤和/或损害而导 致永久性的视觉损失。玻璃疣的发展通常超前于湿型AMD ,其 汇集并包括补体蛋白，包括补体因子H (CFH)。大量的，中等 至大的^皮璃疣与疾病后阶4殳发展巨大危险性相关，其以地理性萎 缩和/或新血管生成为特征。大多数湿型AMD在疾病其^皮诊断出 后数月至两年内在受影响的眼睛发生严重的视觉损失，虽然—见觉 损失也可以在数小时或数天内发生。干型AMD通常是更緩慢的，
50并在黄斑光-敏感细胞中发生緩慢萎缩，使受影响的眼睛中心视 力发生緩慢模糊。玻璃疣的形成和聚集，有时是视网膜的恶化， 导致视觉损失的加速，虽然不伴随异常的血管生成和出血。
导致AMD -相关的视觉损失的损伤中观察到的玻璃疣和炎 症细胞中具有补体成分和其他炎症介导物（Haines等（2005 ) Sc ience 308: 419-421 )。 AMD与补体调节途径中的遗传缺陷强烈 相关（Haines等，2005 )。编码补体因子H ( CFH )基因的变体 通过其对玻璃疣发展的影响，新血管生成的前体和AMD相关的 -现觉损失，似乎才及大地或完全i也导致增加AMD的危险（Edward s等，（2005 ) Science 308: 421 —424)。 CFH的氺刀i台功肯fe是通过 结合并失活C3b或刺激因子Bb从C3b分离，下调选择性级联转 化酶的活性。（Hageman等（2005 ) PNAS 102 (2): 7227- 723 2)。目前的基因数据显示湿型-AMD玻璃疣病人具有50- 70% 的可能性才有CFH等位基因，导致强烈的补体干涉和AMD治疗 的关耳关（Klein等（2005 ) Science 308: 385 — 389 )。 一种承卩弗'J其 活性的抗-C5适体，也可以在带有AMD相关的缺陷CFH基因 的病人中起作用。同样地， 一种抑制选择性级联目标，如因子B， 因子D，和备解素，普通级耳关成分，特别是C3,和膜攻击复合 物成分的适体，可以抑制活性，即使病人带有AMD相关的缺陷 CFH基因。 一些补体因子H (CFH)基因的单才莫标本已经经测定 为与病人发展黄斑变性的危险性相关。特别是，在染色体l上补 体因子H (CFH) 402位氨基酸的酪氨酸-组氨酸改变造成与疾 病易感强烈相关的CFH基因变体结果。序列的改变位于结合肝 磷脂和C -反应蛋白CFH区域。先天带有此CFH基因变体的人 更易发生AMD。CFH基因变体可能导致美国15000000黄斑变性 病例中的一半。老年人中若带有CFH基因变体，其发生黄斑变 性的可能性将增加2.5至5.5倍。CFH基因在调节炎症途径（选择性补体途径）中起作用。此 表面炎症在黄斑变性中也具有重要作用。炎症标记物C-反应蛋 白（CRP)的血液水平已经发现可以促进黄斑变性的发展。（Sci ence.2005年四月15曰'，308 ( 5720): 419- 21， Science.2005年 四月15曰；308 ( 5720): 421 - 4, Science.2005年四月15曰；3 08 ( 5720): 385 - 9)。基于其在肝磷脂和因子H的CRP结合区 i或的定4立位置，Y402H变体可以石皮坏蛋白聚冲唐和CRP介导的宿 主细胞表面H因子的召集，排除了因子H对堆积细月包的C3b的 下调能力。由于C5a和C5b-9未受控的释放，补体途径在宿主 组织中的未受抑制的扩大导致;视网月莫中的炎症发生和血管生成。 CFH阻止未受控的补体活性和炎症；因此CFH中的突变将加重 炎症和其后果。通过减少黄斑变性中的过多补体（炎症途径）活 性，我们也许可以减緩疾病的进程。此外，相对与目前，将来对 基因变体的测定可以用于耳关合成傳4支术以更早鉴定产生高危AM D的个体。（JAMA. 2005年4月20日；293 ( 15 ): 18410)
补体活性已经涉及其他眼部疾病，如净唐尿病4见网月莫病，并可 肯fe复合或起i台血管4员害（Zhang等，（2002) Diabetes51: 3499)。 增值性糖尿病视网膜病变（PDR)是一种由视网膜血管改变引起 的糖尿病并发症。当^L网月莫中的血管受损害时，其可能渗血并变 脆，出现刷子样分支和疤痕组织。这将使视网膜传输至大脑的图 像出现污点或扭曲。据估计25%的I型糖尿病人将忍受糖尿病视 网月莫病变，并在5年后上升为60%， 10- 15年后为80%。该疾 病以高血^f唐症，基底力莫增厚，外周细月包丟失，樣i血管动乐^瘤和^见
网膜前新生血管化为特征，其由于出血和^L网膜牵连的脱离导致 失明。非扩散性的糖尿病视网膜并以视网膜内微血管瘤，出血， 新-纤维-层梗塞，硬性渗出和樣t血管畸形。黄斑水胂是^L觉损 害的主要机制。这是黄斑（视网膜中心区域）毛细管微血管瘤静 月永渗漏的结果。渗漏可以加剧黄斑增厚，其与石更性渗出或嚢才羊改变相关，并导致不同程度的中心视力损失。增值性糖尿病视网膜 病变以视网膜新生血管化为特征。其根据视网膜新生血管的存 在，位置，严重性和相关的出血活性进行分级。其与严重的4见力 损失相关。糖尿病一见网膜病的病因可以归结于以下疾病阶,殳。循 环问题导致视网膜区域缺血或萎缩。新生血管化导致新血管开始 在玻璃体中生长以维持适当的氧水平。新生毛细血管的渗血和疤 痕组织的形成产生对视网膜的牵引并导致小裂缝形成。流泪并随
后在^L网膜层下或之间出现流液和脱离。由于出血，浮肿和疤痕 产生，病人S见力出现才莫糊，漂移，闪光及突然失明。
低水平的恒定补体活性通常发生在非-糖尿病人眼中，其在 非-糖尿病大鼠目艮中以MAC的存在和补体调节蛋白为特征，表 明^卜体的失i周发生在4唐尿病人中（Sohe等，（2000) IOVS 4k 3 492 )。此外，已经在糖尿病人志愿者的视网膜血管中测定到C5b -9的沉积，而在非lt尿病人中则无（Zhang等），在^唐尿病^L网 膜中发现CD55和CD59的表达减少（Zhang等），并且在糖尿病 人尿中发现存在糖基化CD59 (Acosta等，（2002) PNAS 97, 5 450 — 5455 )。 it匕夕卜，已^口^卜体牙口血管系纟克在类型I冲唐尿病中4皮5款 活。见，例如，Hansen, T.K,等，#唐尿病，53: 1570— 1576 ( 20 04)。 C5a通过免疫和补体系统激活内皮细月包。见，例如，Albre cht, E.A.等，Am J Pathology, 164: 849 — 859 (2004)。血管系 统在包括糖尿病3见网膜病的眼部疾病中一皮激活。见，例如，Gert, V.B.等，Invest Opthalmol Vis Sci， 43: 1104— 1108 (2002)。补 体系统在糖尿病^见网膜病中也被激活。见，例如，Gert， V.B.等， Invest Opthalmol Vis Sci， 43: 1104- 1108 (2002)和Badouin, C等，Am J Opthalmol, 105: 383 - 388 ( 1988 )。
葡萄膜炎表示眼色素层的炎症，色素血管层（或膜）位于巩 膜（纤维膜）和视网膜（视觉光敏感层）之间，以虹膜，纤毛体和脉络膜（滋养视网膜的血管和连接组织层）。由于眼色素层的 解剖复杂性，葡萄膜炎分许多类型，并且由于眼色素层与眼部其 他结构（例如，视网膜）的解剖关系，眼色素层通常与其他组织 的炎症关联（例如，视网膜炎）。葡萄膜炎通常分为前葡萄膜炎 (主要影响虹"寞和相关的纤毛体，虹力莫和角膜之间的前室和包含 的流液），中间葡萄膜炎（影响纤毛体后的睫状体平坦部和:f见网 膜前"缘，)，或后葡萄膜炎（影响虹膜后的后室，其充满透明凝月交 状玻璃质液体并与视网膜直接相连）。前葡萄膜炎是最常见的形 式并通常与自身免疫疾病如风湿性关节炎相关。中间葡萄膜炎是 较次常见的形式。后葡萄膜炎是最不常见的形式，可能通过系统 感染引起（例如，病毒性，细菌性，真菌性，或毒素）或与自身 免疫疾病相关。自身免疫葡萄"莫炎的发生也可以不包4舌系统影 响。葡萄膜炎也可以由外伤引起（例如，受伤，手术等）或未知
原因e'先天性"。不考虑病原学，任何影响葡萄膜的炎症都将造 成葡萄膜炎。
眼部组织和液体通常含有多种补体成分，如葡萄膜组织中的
因子B和C2， C4, C3, C5, C6,和C7 ( Brawman — Mintzer O, Invest Ophthalmol Vis Sci.1989年10月；30 ( 10): 2240 — 4)， 房7JC中的C1， C4, C3和C5 (Mondino BJ, Arch Ophthalmol。 1983年3月；101 ( 3 ): 465 — 8 )，和角膜中的Cl, C4， C2， C3, C5, C6和C7 ( Mondino BJ， Arch OphthalmoU981年8月；99 (8 ): 1430 - 3 )。这些补体成分和相关的补体调节蛋白在眼部组 织中净皮i人为起重要的正常免疫^f呆护作用。
补体活性在葡萄膜炎病原学中的一个重要作用已经由下列 事实所表明：相对于视网膜血管炎病人（对照），前葡萄膜炎病 人的C4 (C4B2)异型发生率升高（Wakefield D, Hum Immuno 1. 1988年3月；21 ( 4): 233 - 7 );先天葡萄膜炎并人中C3d和包括-补体的免疫复合物的血浆浓度升高（Vergani S， Br J Op hthalmol.1986年1月；70 ( 1 ): 60- 3 );系统炎症疾病和并发葡 萄膜炎病人泪腺流液（泪液）补体-介导的溶血活性和C3和C4 ?K平的升高；（Drozdova EA， Vestn Oftalmol.2004年7 — 8月；1 20 (4): 24- 6);和在葡萄膜炎中作为最初事件的葡萄膜区域免 疫复合物和补体的沉积（O'Connor GR, Tmas Ophthalmol Soc UK, 1981年9月；101(Pt3 )( 3 ): 297 - 300 ).补体活性已经 包括在许多带有葡萄膜炎眼病的炎症和/或自身免疫疾病，包括B ehcet's疾病（Cuchacovich M， Clin Exp Rheumatol.2005年7 - 8 月；23 (4 Suppl 38): S27 - 34, Bardak Y, Ocul Immunol Inf lamm.2004年3月；12 ( 1 ): 53 - 8 )， Fuch's异色性虹膜睫^1犬体 炎（La Hey E, Am J Ophthalmol. 1992年1月15; 113 ( 1 ): 7 5 - 80 )， Vogt—Koyanagi - Harada疾病（Sakamoto T, Ophthal mol。 1991年9月；109 ( 9): 1270-4)，和亚^见网月莫纤维4匕,口十曼 性葡萄膜炎（Palestine AG, Ophthalmology. 1985年6月；92 ( 6 ): 939-44)。
大量试验-引发葡萄膜炎动物模型已经显示补体活性是葡 萄膜炎中重要病原因素（Jha P, Invest Ophthalmol Vis Sci. 20 06年3月；47 ( 3 ): 1030- 8， Kasp E, Clin Exp Immunol. 19 92年5月；88 ( 2): 307- 12)，并且该补体活性^皮补体调节蛋白 紧密调节（Bardenstein DS, Immunology. 2001年12月；104( 4 ): 423 - 30， Sohn JH， Invest Ophthalmol Vis Sci.2000年10月•， 4 1 ( 11 ): 3492 - 502 )。这些补体-介导葡萄膜炎才莫型中，补体的 损耗，如用眼镜蛇毒因子（CVF )处理或作为补体活性途径（C3 ) 遗传损耗的重要因素，可以预防或显著减少诱导的葡萄膜炎的严 重性。共同地，凄史据显示补体成分和调节蛋白是眼部组织和葡萄 膜的重要正常成分，补体活性是自身免疫葡萄膜炎试验模型中葡 萄膜炎的成因，补体活性在人体中与葡萄膜炎相关。这样， 一些
实施方案中，本发明的方法中，在C5激活并产生C5a和C5b-9 (MAC)之前，使用阻止选择性和经典补体活性途径的适体以减 少葡萄膜炎的发生，持续事件和/或严重性。
青光眼指由于一见觉神经和—见网力莫损害造成的^L觉损失的一 类疾病，通常与眼压升高（"IOP，）相关。开角型青光眼是最常见 的形式，由于流体通道（例如，小梁网）的长期狭窄或闭塞导致 水状体的形成而增加iop。青光眼分为两种类型，开角和闭角型。 原初开角型青光眼发展时较緩慢并无痛，通常伴随数年内的无感 觉视觉损失。次生开角型青光眼由其他疾病引起（例如，葡萄膜 炎或其他炎症疾病，津唐尿病，肿瘤，白内障），4屯性损伤或特定 药物如类固醇。闭角型青光眼（也指狭窄角型青光眼或畸形青光 眼）是由于虹膜处的变化引起液体流的突然阻塞，导致IOP的突 然增加引起的。闭角型青光眼的症状为包括眼部疼痛和恶心的朝L 觉损失。在一些个体中发生的神经损伤不伴随IOP的增加；此类 型的青光眼为常压（正常压力或^f氐压力）青光眼。此类型青光眼 中神经的损伤原因还未知。
补体在青光眼病原学中的作用已经3皮显示：1)大鼠青光眼 模型中，IOP升高时伴随补体成分（Clq, Clr, Cls， C3 ) mRN As的一见网月莫表达（Ahmed, F, Brown, KM, Stephan， DA， Mo rrison, JC, Johnson, EC， Tomarev, SI (2004) IOVS 45， 124 7-54); 2)猕猴青光眼才莫型中补体成分（C4, B, Clq， C3 ) m RNAs在视网膜中的表达增力口 （Miyahara， T， Kikuchi, T， Aki moto， M, Kurokawa, T， Shibuki, H.Yoshimura, N ( 2003 ) IO VS 44, 4347- 56); 3)小鼠和浙尔f吳青光目艮才莫型中一见网月莫月交质细
56胞内Clq mRNA和蛋白表达的增力口 （ Stasi， K, Nagel， D, Yan g, X, Wang, R， Ren, L, Podos， SM, Mittag, T, Danias， J (2006) IOVS 47, 1024 — 29); 4 )人体月交原细月包中Clq纟田月包的 免疫组化染色（Stasi等，2006)。补体Clq在试验性绿内障小鼠 中的表达显示与IOP的持续增加和对视网膜中心细胞的损伤进 禾呈相关（Stasi等，2006)。 #元—4卜体适体的治疗，例:V, —种#元 -C5适体，可以对高或低-压力青光眼中的神经变性具保护作 用。
相应地，本发明的 一些实施方案提供了治疗补体介导的眼部 疾病的抗-C5药物。 一些实施方案中，单独使用本发明的抗-C 5药物，而其他实施方案中其与抗-VEGF和/或抗-PDGF药物 联合使用。
本发明的其他实施方案提供了治疗，稳定和/或预防补体-介 导的眼部失调的抗-补体适体。抗-补体适体可以根据SELEXT M方法制备。特别实施方案中，本发明包括〗吏用一种抗-补体适 体，例如， 一种方法中对主体施用一种减少，稳、定和/或予贞防眼部 失调中至少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性AMD的症状的抗-C5适体。
C5特异的适体
用于治疗，预防和/或减少补体-介导的眼部失调症状的C5 特异适体可以通过SELEXTM方法制备。特定实施方案中，本发 明包括在一种方法中对主体施用少，稳定和/或预防眼部失调中至 少一种症状，特别是糖尿病视网膜炎，渗出性和/或非-渗出性A MD的症^大的4元-C5适体药物。
57适体是一种核酸分子，其与分子的特定结合亲和力是不同于
Watson - Crick义威基对的交互作用。
适体，类似于通过噬菌体显示或单克隆抗体e'mAbs，）制备的 多肽，可以特定结合选择的目标并调节目标的活性，例如，通过 与适体的结合可以阻止其目标的功能。
从随机序列寡核苷酸文库中进行体外选择制备的适体超过1 OO种蛋白质，包括生长因子，转录因子，酶，免疫J求蛋白，和受 体。典型的适体为10- 15 kDa大小（30-45核苦），以亚-摩 尔亲和力结合其目标，并区分紧密向的目标（例如，适体典型地 不与来源于相关基因家族的其他蛋白结合）。 一系列结构研究已 经显示适体可以〗吏用相同的结合作用（例如，氢4建，经典互补， 疏水力，空间排阻），产生抗体-抗原复合物的亲和力和特异性。
适体具有许多期望的用于治疗和诊断的特征，包括高特异性 和亲和力，生物凌支应，和良好的药4戈动力学特性。
制备一种适体的首选方法，通常在图2中描述，是以"指凄丈 增长的配基系统演化，'SELEXTM，)。 SELEXTM过程， 一种体外汇 集高特异结合目标分子的核酸分子的方法，描述于，例如，U.S. 专利申i青系列号07/536， 428， 1990年6月11日归档，目前已废 弃，U.S.专利申请号5475096,题为"核酸配基，,，和U.S.专利申请 号5270163 (亦见WO 91/19813),题为"核酸配基'。，通过进行重 复的选择和扩增循环，SELEXTM可用于获得适体，在此也指具有 4壬4可期望的目标结合亲和力水平的"核酸配基'。，SELEXTM过程基于唯一的观察，即核酸具有形成二 -和三-维结构变体的能力，并具有作为任何化学化合物，无论是单体或 多聚体的配基的充分的单体化学多能性（例如，形成特定结合 对）。任何大小或成分的分子都可作为目标。
SELEX™过程基于结合目标的能力。通过SELEX™过程获 得的适体将具有目标金额和特性。然而，SELEXTM过程不同选裤， 适体或目标的其他特性，因此不能期望SELEX™过程制备的适 体具有除了结合期望目标的任何其他特性，虽然可以期望获得的 适体将具有其他特性。这样，虽然期望一种适体将具有特异结合 目标的能力，除了结合目标之外， 一种给定的适体可以没有，或 可以具有多种凌文应。例如，当目标是一种与多细月包表面受体作用 的蛋白质， 一种适体可以阻止或增强蛋白质和一种或多种该受体 的结合，或其可以对〈壬^可交互作用不具有效应。另一实施例中， 目标可以是一种接触反应类物质，而适体可以抑制或增强接触反 应功能的效果，或对4妄触反应功能无作用。然而，在合适的方法 试-险之前，4支术人员不能预测一种纟会定的适体具有的特性。事实 上，单纯的目标结合对于功能效应并不提供信息，而其在适体结 合的作用下可以外露。
目标分子特性的改变需要适体结合目标的特定位点，以对目 标特性的改变产生效应。理论上，SELEXTM过程可以鉴定大量适 体，其中每个适体结合目标的不同位点。实践中，适体-目标结 合作用通常发生在一个或少量适合的目标结合位点，其^是供了对 于交互作用的稳、定的和易达到的结构影响。此外，当对生理目标 分子使用SELEXTM过程时，」技术人员通常不能控制适体对于目 标的定位。因此，适体在目标上的结合位点可以位于，或不可以 位于，或接近于，可导致期望效应的潜在结合位点之一，或可以 对目标分子无任何效应。甚至当一种适体，由于其结合目标的能力，被发现具有一种 效应，而酶哟方法预测此效应的存在，或预先知道该效应的类型。
进行SELEX™试-验时，技术人员只能知道一种适体， 一种针对 目标点适体，将具有目标结合特性。可以进4亍SELEXTM试-睑， 期望一些纟皮鉴定的适体可以具有除了结合目标之外的效应， <旦这 是不确定的。
SELEX™方法作为包括随机序列的单链寡核苷酸文库或集 合的起始。寡核苷酸可以是^f务饰的或未修饰的DNA， RNA，或D NA/RNA杂交。 一些实施例中，集合包括100%随才几或部分随才几 寡核苷酸。其他实施例中，集合包括的随4几或部分随^几寡核香酸 包括至少 一种与随才几序列整合的固定序列和/或 <呆守序列。其他实 施例中，集合包4舌的随4几或部分随才凡寡核苷酸包4舌至少一种5' 和/或3'端固定序列和/或^f呆守序列，其可以包3舌寡核芬酸集合中 所有分子共享的序列。固定序列是集合中寡核苷酸的共同序列， 其出于预选4奪目的而被包括，如下文描述的CpG模体，PCR引 物的杂交位点，RNA聚合酶启动子位点（例如，T3, T4, T7, 和SP6)，限制性位点，或均聚序列，如聚A或聚T区域，催化 核心，选择结合亲和柱的位点，和其他有助于期望的寡核苷酸的 克隆和/或测序。保守序列是不同于前述的固定序列，由多种适体 共享并结合相同目标的序列。
寡核苷酸集合合适地包括有效扩增需要的随机序列部分和 固定序列。典型地，寡核苷酸的起始集合包括固定的5'和3'末端 序列，其在侧面具有30- 50个随机核苦的插入区域。随机核普 可以由多种方法制备，包括和血合成和从随机裂解的细胞核酸中 进行大小选择。选择/扩增循环前或过程中可以通过突变引入或增 加试-验核酸中的序列变体。寡核苷酸的随才几序列部分可以为{壬<可长度并可以包4舌核泮唐 核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并可以包4t修饰的或非-自然核苷
或核苦类似物。见，例如，美国专利号5958691;美国专利号56 60985;美国专利号5958691;美国专利号5698687;美国专利号 5817635;美国专利号5672695,和PCT公开WO 92/07065。随
才几寡核苷酸可以由本领域中抑制的固相寡核普酸合成才支术以磷:
酸二酯-交联核苷合成。见，例如，Froehler等，Nucl. Acid Re s. 14: 5399 - 5467 ( 1986 )和Froehler等，Tet丄ett.27: 5575 -5 578 ( 1986 )。随4凡寡核苷酸可以4吏用液相方法合成，如三酯合成 方法。见，例:^， Sood等，Nucl.Acid Res. 4: 2557 ( 1977)和 Hirose等，Tet.Lett， 28: 2449 ( 1987)。典型的合成是在自动D NA合成仪上进行，产生对于大多数SELEXTM试验足够的1014 -1016的单独分子。在序列-i殳计中，充分大范围的随才几序列增加 了每个合成分子代表一个唯一序列的可能性。
寡核苷酸的起始文库可以由DNA合成仪通过自动化学合成 制备。为合成随4几序列，在合成过程中每个核苷增加步-骤加入所 有四种核苷，使得核苦随机整合。如上所述， 一个实施方案中， 随才几寡核苦酸包4舌完全瑞即序列；然而，其j也实施方案中，随才几 序列可以包括一^殳非随才几或部分随才几序列。部分随才几序列可以通 过在每一核苦增加步艰《以不同摩尔比例加入四种核苦。
寡核苷酸起始文库可以是RNA, DNA，替换的RNA或DN A或其组合。该情况下当使用RNA文库作为起始文库时，其典 型地通过合成一个DNA文库，经合适的PCR扩增，使用T7 R NA聚合酶或^f务饰的T7 RNA聚合酶体外转录DNA文库，并纯 化转录的文库而制备。核酸文库在适合于结合的条件下与目标混 合并对结合进行逐步回归重复，分离并扩增，使用相同的常规选 择方案，以获得任何实际的集合亲和力和选择特性。更特别地，以包括核酸起始集合的混合物开始，SELEXTM方法包4舌以下步 骤：（a)在适合结合的条件下将混合物与目标接触；（b)将未结 合的核酸从已经特异结合目标分子的核酸上分离下来；（c)解离 核酸-目标复合物；（d)对乂人核酸-目标复合物中分离下的核酸 进行扩增以制备富含配基的核酸混合物；并（e)通过错综循环 重复结合，分离，解离和扩增步骤以制备对于目标分子高特异性， 高亲和力的核酸配基。这些情况下，当RNA适体被选才奪时，SE LEXTM方法进一步包括以下步骤：（i)在扩增步骤（d)进行前 将从核酸-目标复合物中解离的核酸进行反转录；并且（ii)重 新开始过程前对来源于步骤（d)的扩增的核酸进行转录。
在包括大量可能的序列和结构的核酸混合物中，对于 一 个夕合 定的目标具有大范围的结合亲和力。这些对于目标具有高亲和力 (更低解离常数）的核酸更趋向结合目标。分离，解离和扩增后， 产生了具有更高结合亲和力候选物的第二种核酸混合物。额外的 选捧循环有助于获得最佳的配基，直至最后的核酸混合物主要有 一种或几种序列构成。其可以,皮克隆，测序并单独作为配基或适 体测定l)目标结合亲和力；和2)影响目标功能的能力。
重复进行选4奪和扩增循环直至获得期望的结果。多^:情况 下，持续进行选择/扩增直至重复循环时结合力信号不再增强。该 方法典型地习惯于采用IO"不同核酸，^旦也可以耳又样多至1018 种不同核酸。通常，核酸适体分子经过15至20个循环过#呈#:选 择。 一个实施方案中，异质成分仅在开始选择阶段加入，并在重 复过程中不出现。
SELEXTM方法的 一个实施方案中，选4奪过程对于强力结合#皮 选目标的核酸是高效的，〗义需要一步选4奪和扩增循环。这些有岁丈 的选择可以发生于，例如，色谱-类型过程，其中核酸与柱结合
62目标的相互关系以一种方式进4亍，其中柱子可以高效地分离最高 亲和力的4亥酸配基。
许多情况下，不需要进行重复的SELEX™步骤以鉴定单个 核酸配基。目标-特异的核酸配基溶液可以包4舌核酸结构或才莫体 家族，其具有大量保守序列和大量经替换或增加后不显著影响核 酸配基对目标的亲和力的序列。在完成之前纟冬止SELEXTM步驶《， 可以测定许多核酸配基家族成员的序列。
已知存在大量核S吏一级，二级和三纟及结构。这些通常包4舌于 非- Watson - Crick型作用的模体结构指发夹环，对称或不对称 凸起，伪结和多重重复。几乎这些模体的所有已知情况显示其可 以形成不超过30个核苷的核酸序列。出于此原因，通常更优选 带有包括20至50个核苷的相邻随机片^殳的SELEXTM过程，一 些实施方案中，为30至40个4亥苷。 一个实施例中，5'-固定： 随机：3'固定序列包括了约30至约50个核苦的随机序列。
核心SELEXTM方法已经;故调整以获得许多特定的目标。例 如，美国专利号5707796描述了联合凝胶电泳使用SELEXTM方 法选4奪特别结构特4正的核酸分子，如bent DNA。美国专利号47 63177描述了基于SELEX™方法选择包括磷反应基团的核酸配 基，可以结合和/或磷-交联和/或磷失活目标分子。美国专利号 5567588和美国专利号5861254描述了基于SELEX™方法高效分 离对目标分子具有高亲和力和j氐亲和力的寡核苷酸。美国专利号
5496938描述了在进行SELEX™方法之后获得改善的核酸配基 的方法。美国专利号5705337描述了配基共〗介交联其目标的方法。
SELEX™方法也可以用于获得结合超过一种目标分子位点 的核酸配基，并获得包括非一核酸物质的结合目标特定位点的核 酸配基。SELEXTM方法提供了结合任何预想目标的核酸配基，包，括大的和小的生物分子，如核酸-结合蛋白和不知其功能的一部 分，是否结合核酸的蛋白质，以及辅因子和其他小分子。例如，
美国专利号5580737描述了通过SELEXTM方法筌定的核酸序列， 其可以高亲和力结合咖啡因和类4以物，茶碱。
反向-SELEXTM方法是一种通过评估核酸配基序列与一种 或多种非-目标分子的交联-反应，提高核酸配基对目标分子的 特异性的方法。反向-SELEXTM方法包括以下步骤：（a)制备核 酸混合候选物；（b)将候选混合物与目标接触，其中相对于候选 混合物对目标具有高亲和力的核酸可以乂人4矣选混合物中分离； (c)从剩余的候选混合物中分离增加亲和力的核酸；（d)从目标 上解离增加亲和力的核酸；（e) 将增加亲和力的核酸与一种或 多种非-目标分子4姿触，4吏得与非-目标分子具有亲和力的核酸 配基被除去；（f)将仅对目标分子具有特定亲和力的核酸进4亍扩 增，以制备可以测序的足量的核酸混合物，其具有相对更高的亲 和力并特定结合目标分子。如上SELEXTM方法所述，根据需要 重复选择和扩增循环直至获得期望的目标。
使用核酸作为治疗，诊断药物，和疫苗的潜在问题是，磷酸 二酯形式的寡核苷酸在其期望的效应出现之前将在体液内^皮月包 内和胞外酶，如核酸内切酶和核酸外切酶快速降解。SELEXTM 方法包括鉴定包括修饰的核普的高亲和力核酸配基，其提供配基 改善的特性，如提高体内稳定性或提高递呈特征。这些修饰的实 施例包括糖和/或磷和/或》咸基位置的化学替换。SELEX™方法-鉴定的核酸配基包括的修饰核香描述于，例如，美国专利号566 0985，其描述了在核糖2'位点，嘧吱的5位点，和嘌呤的8位点 被化学修饰的寡核苷酸，美国专利号5756703描述了包括不同2' -修饰嘧啶的寡核苷酸，美国专利号5580737描述了包括一种或多种2'-氨（2' - NH2 ), 2'-氟（2' - F )，和/或2' - O -曱基（2' -OMe) ^齐换的^f奮饰核普的高亲和力核酸配基。
本发明中预期的核酸配基的修饰包括，但不局限于，提供其 他化学基团，其为核酸配基碱基或核酸配基整合额外电荷，极化 性，疏水性，水键，静电力，和立体易变性。抗核酸酶的常身见寡 核苦酸的修饰包括一种或多种^辜换核香内交耳关，糖改变，石咸基改 变，或其组合。这些修饰包括，但不局限于，2'-位点糖修饰，5 - <立点。密"定^修饰，8 - 4立点噤p令^务饰，环外胺的 <务饰，4 -碌b尿。密 咬核苷核芬，5-溴或5_碘-尿嘧咬；骨架修饰，硫逐磷酸酯或 烷基磷修饰，曱基化，和不常见碱基-对的联合，如异碱基、异 月包嘧口定和异鸟嘌口令。》务饰也可以包4舌3'和54奮饰，如力。帽子，例 如，增加3'-3'dT帽子以增加外切核酸酶抗性（见，例如，美国 专禾'J号5674685; 5668264; 6207816;牙口 6229002，其中每个通 过引述在此全部合并于本文）。
一个实施方案中，提供的寡核苷酸其P (O) O基团被P (o) S ("石克代，)，P ( S ) S (f'二石危代，)，P ( O ) NR2 C酰胺化，)，P ( O ) R, P ( O ) OR; CO或CH2 e'formacetal，）或3'-胺（-NH - CH 2-CH2-),其中每个R或R'是独立的H或替换或非替换烷基。 交联基团可以通过-O-, -N-,或-S -交耳关与相邻核苷连4妄。 寡核苷酸中的所有连4妄不要求都相同。
额外实施方案中，寡核苷酸包4t修饰的津唐基，例如， 一种或 多种羟基被囟素，脂肪族基团替换，或作为酯或胺的功能。 一个 实施方案中，呋喃残基的2'-位点-故O-甲基，O-烷基，O-稀丙基，S-烷基，S-稀丙基，或卣化基团。合成2'-修饰糖的 方法描述于，例^口， Sproat，等，Nucl.Acid Res.l9: 733 - 738 (1 991); Cotten，等，Nucl.Acid Res. 19: 2629- 2635 ( 1991 );和 Hobbs,等，Biochemistry 12: 5138 - 5145 ( 1973 )。其他修饰是
65本领域中普通才支术人员已知的。这些々务饰可以是前-SELEXTM 过程修饰或后-SELEX™过程修饰（对先前鉴定的未修饰配基进 行修饰）或整合入SELEX™过程。
前-SELEX™过程修饰或那些由整合入SELEX™过程制备 的核酸配基具有对于SELEX™目标的特异性和提高的稳定性， 例如，体内稳定性。对核酸配基的后-SELEX™过程修饰可以提 高稳定性，例如，体内稳定性而不相反地影响核酸配基的结合能 力。
SELEXTM方法包括将选择的寡核苷酸与其他选择的寡核苷 酸和非-寡核苷酸功能单元耳关合，如美国专利号5637459和美国 专利号5683867中所描述。SELEX™方法进一步包括将选择的寡 核苷酸配基与亲脂性或非-免疫原性高分子量化合物在^t断或 治疗复合物中联合，描述于美国专利号6011020，美国专利号60 51698,和PCT^^开号WO 98/18480。这些专利和申请描述了大 量的形态和其他特性的联合，其带有寡核苷酸有效扩增和复制特 征，和其他分子的期望特征。
通过SELEXTM方法对小的，柔韧性多肽的核酸配基也进行 了鉴定。小多肽具有柔韧性并通常以多重均匀平衡性存在于i^液 中，因此其最初^皮i人为可以通过结合柔韧性多肽导致构象熵损失 而限制结合亲和力。然而，鉴定溶液中小多肽的核酸配基的可行 性在美国专利号5648214中已有描述。该专利中，鉴定了对于物 质P, —种11氨基酸多肽的高亲和RNA核酸配基。
如此所述，本发明通过SELEXTM方法选4奪对于补体目标具 有特异性和结合亲和力的适体。此夕卜，选4奪过程可以整合修饰核 苷以增加适体分子对于体内降解的稳定性。2'修饰SELEX™
为使适体适合于治疗或诊断使用，在体内安全，稳定地合成 是合适的和偏移的。野生型RNA和DNA适体由于其对于核酸酶 的降解壽丈感，在体内不稳定。可以通过整合入2'-位点l奮饰的基 团增加对核酸酶降解的抗性。
2'-氟和2'-胺基团已经成功地整合入选择适体的寡核苷酸 集合。然而，这些修饰极大地增加了合成最终适体的费用，并可 能在某种情况下，由于通过〗奮饰寡核香酸的降解进而〗吏用这些核 苷作为DNA合成的材冲牛，而H修饰的核苦循环进入宿主DNA造 成安全问题。
包括2'-O-曱基f2'-OMe，）核苷的适体，如前所述，克 服了许多这些缺点。包括2'- OMe核香的寡核香酸是抗-核酸酶 的并且合成较便宜。虽然2'-OMe核芬在生物系统中是到处存在 的，生理条件下自然的聚合酶不4妻受2'-OMe NTPs作为底物， 这样就不存在2' - OMe核苷进入宿主DNA的安全问题。制备2' -j多饰适体的SELEXTM方法见描述于，例如，美国临时专利申 ^青系歹']号60/430761, 2002年12月归档，美国临时专利申i青系列 号60/487474， 2003年7月15日归档，美国临时专利申if系列号 60/417039, 2003年11月4曰归冲当，美国专矛J申"i青号10/729581， 2003年12月3日归档，美国专利申请号10/873856, 2004年6 月21日归档，题目为"体外选择2'-O-甲基替换核酸的方法，，' 美国临时专利申请系列号60/696292, 2005年6月30曰归档，题 目为"制备全部2'-修饰的核酸转录的改良材料和方法"和美国专 利申请号11/480188， 2006年6月30日归档，题目为"制备全部 2'-纟务饰的核酸转录的材津+和方法',，其每一个在此通过引述全部 合并入本文。本发明包括结合并调节补体目标功能的适体，其包括修饰的
核苷（例如，在2'-位点修饰的核苷）使寡核苷酸比未》务饰的寡 核苷酸对于酶和化学降解以及热和无力降解更稳定。优选实施方 案中，所述的补体木笔哦啊是补体蛋白C5。文献中有几种包括2 '-OMe的适体的实施例（见，例如，Green等，Current Biology 2， 683 - 695, 1995 ),其通过体外选择修饰的转录物文库制备， 其中C和U残基是2'-氟（2' - F )替换而A和G残基是2' - O H。 一旦功能序列被鉴定，测试每个A和G残基对于2'-OMe ^,换的耐受性，所有A和G残基都具有2' - OMe ^^纟灸耐受性的 适体被重新合成。大多数以该两步法制备的适体的A和G残基 对于2'-OMe替换具有耐受性，虽然，平均有20%并无该特性。 因此，该方法制备的适体趋向于包括从2个至4个2' - OH残基， 并且最后得到折衷的稳定性和合成费用。通过在转录反应中整合 修饰核苷制备寡核苷酸集合中使用的稳定的寡核苷酸，通过SEL EXTM方法（和/或4壬4可其改变和改良，包i舌这里所述的）选择和 富集适体，本发明的方法评估了稳定选择的适体寡核香酸的需要 (例如，通过修饰核苦重新合成适体寡核香酸）。
一个实施方案中，本发明提供了包括2'-OH, 2'-F, 2'-脱 氧，和2'-OMe》务饰的ATP, GTP, CTP， TTP,和UTP核普联 合物的适体。其他实施方案中，本发明提供了包括2'-OH， 2' -F， 2'-脱氧，和2'-OMe, 2'- NH2和2'-甲氧基乙基修饰的 ATP, GTP， CTP, TTP,和UTP核苷联合物的适体。另一实施 方案中，本发明提供了包括2'-OH, 2'-F, 2'-脱氧，和2'-0 Me， 2'-NH2和2'-甲氧基乙基l务饰的ATP， GTP, CTP, TTP， 和UTP核苷56|关合物的适体。优选实施方案中，本发明才是供了 包4舌所有或充分所有2'- OMe修饰的ATP， GTP， CTP, TTP， 和/或UTP核苷的适体。本发明的2'-修饰适体可以使用修饰聚合酶选择，例如，修 饰的T7聚合酶，其对在呋喃糖2'位点大量替换的修饰核苦的整 合速度高于野生型聚合酶。例如，639位点的酪氨酸残基改变为 苯丙氨酸（Y639F)的突变T7聚合酶可以利用（整合）2'脱氧， 2'氨-,和2'氟-三石岸酸核苦（NTPs)， ^旦不是大容量2'一^换， 如2' - OMe或2'-叠氮（2' - N3)替换的NTPs。为整合大容量2 '替换，除了 Y639F突变，在784位点的组氨酸变为丙氨酸残基 的突变T7聚合酶（Y639F/H784A )已经在有限条件下用于整合 ^f奮饰的嘧卩定NTPs。见Padilla, R.和Sousa, R， Nucleic Acids R es, 2002, 30 ( 24): 138。 639位点的酪氨酸残基改变为苯丙氨 酸，784位点的组氨酸变为丙氨酸残基，378位点的赖氨酸改变 为精氨酸的突变T7 RNA聚合酶（Y639F/H784A/K378R)已经 在有限条件下用于整合修饰的噤呤和嘧咬NTPs,例如，2'-OMe NTPs，但需要2'-OH GTP用于转录。见Burmeister等，（200 5) Chemistry and Biology, 12: 25 — 33。虽然并不期望受卩艮于 理论，K378R突变不靠近聚合酶的活性位点，从而被认为是沉默 突变，对于2' - OMe 1^饰NTPs的整合没有效应。位点784的组 氨酸改变为丙氨酸（H784A)的突变T7聚合酶已被描述。Padill a等，Nucleic Acid Research, 2002， 30: 138。 Y639F/H784A突 变和H784A突变T7聚合酶中，改变为小氨基酸残基如丙氨酸可 以促使大量核酸底物的整合，例如，2'-OMe替换核苦。见Che lliserry， K.和Ellington, A.D., (2004) Nature Biotech, 9: 115 5 - 60。更多的在其活性位点带有突变的T7 RNA聚合酶已经祐: 描述，其更易于整合大量2'-修饰底物，例如，639位点酪氨酸 改变为亮氨酸（Y639L)的T7 RNA聚合酶。
通常，已经发现在这里描述的条件下，Y693F突变可以用于 整合除了 GTP之外的所有2' - OMe替换的NTPs,而Y639F/H7 84A， Y639F/H784A/K378R, Y639L/H784A， Y639L/H784A/K378R, Y639L， Y639L/K378R， P266L/Y639L/H784A或P266L/Y6 39L/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合酶可以在这里描述的条 件下4吏用以整合包括2' - OMe GTP的所有2' - OMEe替换NTP
So
2'-》务饰的寡核苦酸可以完全由 <多饰的核苦，或<奮饰的冲玄苦 亚组合成。修饰可以是相同或不同的。 一些或所有核香可以^皮Y务 饰，而那些被Y务饰的可以包4舌相同的修饰。 一些或所有一亥香可以 被修饰，而那些#皮修饰的可以包括不同的修饰。例如，包4舌相同 石成基的所有核苷可以具有一种类型的》务饰，而包纟舌其他石咸基的核 苷可以具有不同类型的 <多饰。所有嘌，冷核普可以具有 一种类型的 修饰（或不修饰），而所有嘧啶核普具有另一种不同类型的修饰 (或不修饰）。这种情况下，使用任何修饰的联合制备转录物，或 转录物的集合，包括，例如，核糖核苷酸（2'-OH),脱氧核糖 核苷酸（2'-脱氧），2'-氨基核香（2'-NH2)， 2'-氟核香（2'
一F),和2'-0-曱基（2'-OMe) 4玄苷。包才舌2'- OH A禾口 G 和2'-F C和U的转录混合物称为"rRfY"混合物，而由此选择的 适体为"rRfY"适体。包括2' - OMe C和U和2' _ OH A和G的 转录混合物称为"rRmY"混合物，而由此选择的适体称为"rRmY" 适体。包括脱氧A和G和2'- OMe U和C的转录混合物称为"d RmY"混合物，由此选4奪的适体称为"dRmY"适体。包括2'- OMe
A， C，和U，和2'-OH G的转录混合物称为"rGmH"混合物， 由此选择的适体称为"rGmH"适体。选4奪性的包4舌2' - OMe A, C, U和G和2' - OMe A, U和C和2'-F G的转录混合物称为"选 l奪性混合，，'由此选l奪的适体指"选择性混合物"适体。包4舌2'-0 Me A， U, C，和G,其中10%的G's是核糖核苦酸的转录混合 物称为"r/mGmH"混合物，由此选择的适体称为"r/mGmH"适体。 包4舌2'-OMe A, U，和C,和2'- F G的转录混合物称为"fGm H"混合物，由此选择的适体称为"fGmH"适体。包括2'-OMe A,
70U,和C,和脱氧G的转录混合物称为"dGmH"混合物，由此选 择的适体称为"dGmH"适体。包括脱氧A,和2'-OMeC, G和U 的转录混合物称为"dAmB"混合物，由此选择的适体称为"dAmB" 适体，包括所有2'-OH核苷的转录混合物称为"rN"混合物，由 此选择的适体称为"rN，，，"rRrY"或"RNA"适体。包括2'- OH三磷 酸腺苦和三^粦酸鸟苦和脱氧三-粦酸"包嘧，定和三-粦酸胸^泉嘧。定的 转录混合物称为rRdY混合物，由此选择的适体称为"rRdY"适体。 'mRmY"也称为"MNA"适体，其除了起始核苷为2' - OH鸟苷或任 ^f可野生型鸟香外，^又包^舌2'-O-曱基核苷，并可以通过后-SE LEX顶将2' - OH Gs替换为2' - OMe Gs,从r/mGmH寡核苷酸 派生出。可选的，mRmY适体可以通过mRmY SELEX，鉴定。
一种优选实施方案包括任何2' - OH， 2'-脱氧和2' - OMe核 香的联合。更优选的实施方案包括任何2'-脱氧和2' - OMe核苷 的联合。甚至更优选的实施方案是任何2'-脱氧和2' - OMe核苷 的耳关合，其中嘧咬是2' - OMe (如dRmY， mRmY或dGmH )。
在选择过程前（-预先）将修饰核苷整合进入本发明的适体 (例如，前-SELEXTM过程修饰）。可选地，本发明通过前-SEL EXTM过程i'务饰整合了《务饰核苷的适体也可以进一步通过后_ SE LEXTM过程修饰（例如，SELEXTM之后的后-SELEX™过程修 饰）。前-SELEXTM过程修饰产生SELEX™目标特异的修饰核酸 配基并提高体内稳定性。后_ SELEXTM过程修饰，例如，修饰（例 如，对具有经前-SELEX™过程修饰整合核酸的，先前鉴定的配 基进行切断，删除，替换或增加核苦）可以进一步提高体内稳定 性，而不明显影响具有前-SELEX™过程修饰整合核苷的核酸配 基的结合能力。
为在聚合酶接受2'-修饰的NTPs的条件下制备2'-修饰的 (例如，2'-OMe) RNA转录物，可以使用Y693F, Y693F/K378R, Y693F/H784A， Y693F/H784A/K378R， Y639L， Y639L/K378 R,P266L/Y639L/H784A和P266L/Y639L/H784A/K378R突变的T 7 RNA聚合酶。其他T7 RNA聚合酶，特别是显示对大量2'-替换高耐受性的聚合酶，也可以用于本发明中。当在这里描述的 条件下^f吏用才莫板-控制的聚合时，Y693F/H784A, Y693F/H784A /K378R, P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突 变的T7 RNA聚合酶可以用于整合所有2' - OMe NTPs,包括2' -OMe GTP,并且获得比使用Y693F, Y693F/K378R， Y693F/ H784A， Y693F/H784A/K378R， Y639L, Y639L/K378R突变的T 7 RNA聚合酶更好的转录产量。Y693F/H784A, Y693F/H784A/ K378R, P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突 变的T7 RNA聚合酶可以与2' - OH GTP共同4吏用，^f旦其不是必 需的，以获得高产量的2'-^f奮饰的，例如，包括2'-OMe的寡核 苷酸。
其他聚合酶，特别是那些显示了对于大量2'-替换具有高耐 受性的，也可以用于本发明。在这里描述的转录条件下通过测试 其整合修饰核苷的能力筛选这些聚合酶。
许多因素已经:故确定对于这里描述的方法中4吏用的转录条
件是重要的。例如，DNA转录模板5'末端固定序列上整合的引 导序列乂于于增加《奮饰專争录产物的产量是重要的，其中Y693F/K37 8R或Y693F/H784A/K378R突变的T7 RNA聚合物净皮用于转录， 例如，在以下描述的dRmY或r/mGmH转录条件下。此夕卜，引导 序列可以用于帮助增加i务饰转录产物的产量，〗旦不是必需的，其 中使用Y693F/H784A或Y693F/H784A/K378R突变T7 RNA聚 合酶用于转录，例如，在以下描述的mRmY 4争录条件下。引导 序列典型i也为6- 15核苷长度，并可以包4舌所有嘌，令，或噤p令和 嘧，定核苦的混合物。200780016834.X物的重要因素是2' - O H鸟嘌呤核苦的存在或浓度（例如，GMP， GTP，或其他非-2'
- OMe非-三石粦酸盐）。转录产物可以分为两个阶H第一种阶 段是初始化，期间NTP加入GTP的3'-羟基末端（或GMP，或 其他非-2' - OMe非-三^粦酸盐）以制备二核苦酸，随后扩展为 约10-12个核香；第二阶^爻是延伸，期间在初始的10- 12核苷 上进行转录过程。已经发现加入小量2'- OH GTP(或GMP,或 其他非-2' - OMe非-三磷酸盐）至含有过剩2' - OME GTP的 專争录混合物可以有,支增强聚合酶4吏用2'-OH GTP(或GMP,鸟 苷，或其他非-2'-OMe非-三磷酸盐）的初始转录能力。这样， 例如， 一种dRmY寿i录混合物（包4舌脱氧嘌呤和2'OMe嘧咬） 需要额外加入小量的GMP以增强聚合酶的初始转录，而在r/mG mH转录混合物中（包括10%2'-OH GTP)，小量的GMP可以 加入至转录混合物中，但由于2'-OH GTP基因存在于转录混合 物中，所以其不是增强聚合酶初始转录所必需的。 一旦寿争录进入 延伸阶,爻，在2'-OMe和2'-OH GTP之间差别的减少，及2'
- OMe GTP多于2' - OH GTP, ^f吏得整合主要为2' - OMe GTP。
如上所述，最初的带有2'-OH鸟苦的4争录（例3。， GMP， GTP或其他非-2， - OMe非-三磷酸盐）是重要的。此结果受聚 合酶对于初始核普的特异性影响。作为结果，任何此方法制备的 4壬4可转录产物的5'-末端核苷可能为2'-OH G。GMP的^尤选浓 度是0.5 mM，更优选地为1 mM。已经发现转录反应中包括PE G,优选地为PEG- 8000,可以使修饰核香的整合最大化。
整合2'-OMe ^,换核苷进入转录产物的另一重要因素是在 转录混合物中使用二价镁和锰。不同浓度的氯化4美和氯化锰的组 合已经发现可以影响2'-O-甲基化转录产物的产量，氯化4美和 氯化锰的最佳浓度依赖于转录反应混合物中复合二价金属离子
73的NTPs的浓度。为获得所有2'-0 -曱基化转录产物（例如， 所有的2'-OMe A, C,和U及约90。/。G核苷）的最大产量，在 每种NTP浓度为0.5mM时氯化镁和氯化锰的最佳浓度是约5mM 和1.5mM。当每种NTP的浓度是l.OmM时，氯化4美和氯化锰的 合适浓度是6.5mM和2.0mM。当每种NTP的浓度是2.0mM时， 氯化镁和氯化锰的合适浓度是9.6mM和2.9mM。任何情况下， 两倍浓度的偏离仍可得到显著数量的修饰转录产物。
一些实施方案中，适合在初始转录中4吏用GMP或鸟苷。此 结果受聚合酶对于初始核苷的特异性影响。作为结果，任何此方 法制备的^f壬^T转录产物的5'-末端核苷可能为2'-OH G。 GMP 的优选浓度是0.5 mM，更优选地为1 mM。已经发现转录反应 中包括PEG，优选地为PEG- 8000，可以使修饰核苦的整合最大 化。
为使2' - OMe ATP ( 100% )， UTP ( 100% ), CTP ( 100% ) 和GTP ( ~ 90% ) fr/mgmH )的整合最大化，以下条件是合适的： HEPES纟爰冲液200mM, DTT 40mM,亚4青胺2mM, PEG - 800 0 10% (w/v)， Triton X— 100 0.01% (w/v)， MgCl2 5mM (当 每种2'-OMe NTP ;农度为1.0 mM时其为6.5 mM)，MnCl 1.5 mM (当每种2'-OMe NTP浓度为1.0 mM时其为2.0 mM ), 2 '一OMe NTP (每种）500 (iM (更合适i也为1.0 mM)， 2'- OH GTP 30 ,， 2'-OH GMP 500 (iM， pH7.5， Y639F/H784A T7 RNA聚合酶15单位/ml,无一几焦磷酸酯酶5单位/ml,和一种至 少为8个核苷长度的全噤呤引导序列。这里4吏用的， 一单位的Y 639F/H784A突变T7 RNA聚合酶（或任何其他突变T7 RNA聚 合物）净皮定义为在r/mGmH条件下，整合1 nmole 2' - OMe NT Ps入转录产物所需要的酶tt量。这里4吏用的， 一单位的无4几焦石粦酸酯酶定义为在pH7.2和25度下，每分钟释》文1.0 mole无冲几正
磷酸盐所需的酶数量。
为<吏2' - OH GTP和2' - OMe ATP, UTP和CTP (f'rGmH，） 在转录产物中的整合最大化（100%),以下条件是优选的：HEP ES緩冲液200mM, DTT 40mM,亚精胺2mM， PEG - 8000 10 % ( w/v )， Triton X - 100 0.01% ( w/v )， MgCl2 5mM (当每种N TP浓度为2.0 mM时其为9.6 mM ), MnCl2 1.5mM (当每种NT P浓度为2.0 mM时其为2.9 mM ), NTP (每种）500 (更合 适i也为2.0 mM), 2'— OH GMP 1 mM, pH7.5, Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200 nM,无才几焦-粦酸酯酶5单位/ml，和一种至 少为8个核苷长度的全噤呤引导序列。
为使2'-OMe ATP (100% )， 2'- OMe UTP (100% ), 2' -OMe CTP ( 100 % )，和2' - OMe GTP ( 100 % ) e'mRmY，，或"M NA")在转录产物中的整合最大化，以下条件是优选的：HEPES 緩沖液200mM, DTT 40mM，亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X- 100 0.01% (w/v )， MgCl2 8mM, MnCl2 2.5 mM, 2'-OMe NTP (每种）1.5 mM, 2'- OH GMP 1 mM, p H7.5, Y639F/H784A/K378R T7 RNA聚合酶200 nM,无才几焦石岸 酸酯酶5单位/ml，和一种在转录条件下增加转录产量的可选引 导序列。 一些实施方案中，可选引导序列是一个全嘌呤引导序列。 另一实施方案中，可选引导序列是噤P令和嘧t定的混合。
为Y吏2' - OH ATP和GTP,和2' - OMe UTP和CTP frRm Y，〉在转录产物中的整合最大化（100%)，以下条件是优选的：H EPES緩沖液200mM， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X- 100 0.01% (w/v), MgCl2 5mM (当每 种NTP浓度为2.0 mM时其为9.6 mM ), MnCl2 1.5mM (当每 种NTP浓度为2.0 mM时其为2.9 mM ), NTP (每种）500 (liM(更合适地为2.0 mM), 2，-OH GMP 1 mM， pH7.5， Y639F/H 784A/K378R T7 RNA聚合酶200 nM，无机焦磷酸酯酶5单位/ ml,和一种至少为8个核苦长度的全嘌呤引导序列。
为4吏2' - OMe ATP, UTP和CTP CrGmH，）在转录产物中的 整合最大化（100%)，以下条件是优选的：HEPES緩沖液200m M， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v )， Trito n X — 100 0.01% (w/v)， MgCl2 5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时其为9.6 mM), MnCl2 1.5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时其为2.9 mM), NTP (每种）500 pM (更合适》也为2.0 mM)， 2'-OH GMP 1 mM， pH7.5， Y639F T7 RNA聚合酶1. 5单位/ml,无机焦磷酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核香 长度的全噤呤引导序列。
为4吏2' - OMe UTP和CTP ('rRmY，）在转录产物中的整合最 大化（100%),以下条件是优选的：HEPES緩冲液200mM, DT T 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% ( w/v ), Triton X- 1 00 0.01% ( w/v), MgCl2 5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时 其为9.6 mM)， MnCl2 1.5mM (当每种NTP浓度为2.0 mM时 其为2.9 mM), NTP (每种）500 (更合适地为2.0 mM ), 2 '-OH GMP 1 mM, pH7.5， Y639F/H784A T7 RNA聚合酶1.5 单位/ml,无机焦磷酸酯酶5单位/ml,和一种至少为8个核苦长 度的全嘌呤引导序列。
为使脱氧ATP和GTP和2' - OMe UTP和CTP e'dRmY，）在 转录产物中的整合最大化（100%),以下条件是优选的：HEPES 緩冲液200mM， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X- 100 0.01% ( w/v )， MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2. 9 mM, NTP (每种）2.0 mM， 2'— OH GMP 1 mM， pH7.5, Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml，无机焦磷酸酯酶5单位 /ml,和一种至少为8个核香长度的全噤呤引导序列。
为4吏2' - OMe ATP, UTP和CTP和2' - F GTP和〖'fRmH，) 在转录产物中的整合最大化（100%),以下条件是优选的：HEP ES緩沖液200mM， DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10 % (w/v), Triton X- 100 0.01% (w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl 2 2.9 mM， 2'-OMe NTP (每种）2.0 mM, 2'- OH GMP 1 m M, pH7.5, Y639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml,无才几焦石粦 酸酯酶5单位/ml，和一种至少为8个核苦长度的全嘌P令引导序 列。
为使脱氧ATP和2' - OMe UTP， GTP和CTP fdAmB，）在 转录产物中的整合最大化（100%)，以下条件是优选的：HEPES 緩冲液200mM, DTT 40mM,亚精胺2mM, PEG - 8000 10% (w/v), Triton X— 100 0.01% (w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2. 9 mM， NTP (每种）2.0 mM， 2'- OH GMP 1 mM, pH7.5, Y 639F/K378R T7 RNA聚合酶200nM/ml,无才几焦磷酸酯酶5单位 /ml，和一种至少为8个核苷长度的全噤呤引导序列。
上述的每个转录过程优选地在（a)约20度至50度进行， 优选地在30度至45度，更优选地为37度，至少2小时，（b) 使用50- 300 nM双链DNA转录模板（循环1中使用200 nM 模板（dRmY转录中使用300 nM模板）），随后循环中使用约50 nM, 1/10稀释的最佳PCR反应液， -使用这里描述的条件）。以 下描述的优选的DNA转录模板（其中ARC254和ARC256在所 有2' - OMe条件下转录，而ARC255在rRmY条件下转录）。
ARC254系列号：99
ARC 255系列号：100
ARC 256系列号：101
在rN转录条件下，转录混合物包括2' - OH三磷酸腺苷（A TP), 2'-OH三磷酸鸟苦（GTP), 2'- OH三磷酸胞苷（CTP ), 和2' - OH三石寿酸尿苦（UTP )。用本发明的rN转录混合物制备 的{奮饰寡核苷酸充分地包括所有2' - OH &泉苷，2' - OH鸟苷，2' -OH胞苷，2'-OH尿苷。优选的rN转录实施方案中，最后的 寡核苷酸包括的序列中至少80。/。的腺苷是2'-OH腺苷，至少8 0%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少80%的胞苷是2'-OH胞苷，至 少80。/。的尿苦是2'-OH尿苷。更优选的rN转录实施方案中， 最后的寡核苷酸包括的序列中至少90 %的腺苷是2' - OH腺苷， 至少90%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少90%的胞苷是2'-OH胞 苦，至少90%的尿香是2'-OH尿苷。最优选的rN转录实施方 案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少100%的腺苷是2'-OH 腺苷，至少100%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少100%的胞苷是2 '-OH胞苷，至少100。/。的尿苷是2'-OH尿苷。
rRmY转录条件下，转录反应混合物包4舌2'- OH三-粦酸腺 苦，2'-OH三石粦酸鸟苦，2'— OMe三石粦酸月包普，和2'— OMe三 磷酸尿苷。用本发明的rRmY转录混合物制备的修饰寡核苷酸充 分;也包4舌所有2'-OHI^苦，2'-OH鸟苷，2'-OMe月包苷，2'-OMe尿苷。优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至 少8(T/。的腺苷是2'-OH腺苷，至少8(T/。的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少80。/。的胞苦是2'-OMe胞苦，至少80。/。的尿苦是2'-OMe 尿苷。更优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序列中至少 90%的腺苦是2'-OH腺苦，至少90%的鸟苦是2'-OH鸟苷， 至少9(T/。的胞苷是2'-OMe胞苦，至少90 %的尿普是2'- OMe 尿苷。最优选的实施方案中，最后的寡核苦酸包括的序列中至少 10(T/。的腺香是2'-OH腺苦，至少100%的鸟普是2'-OH鸟普， 至少100%的胞芬是2'-OMe胞香，至少100%的尿香是2'-0 Me尿苷。
dRmY转录条件下，转录反应混合物包括2'-脱氧三》粦酸腺 苷，2'-脱氧三石粦酸鸟苷，2'-O-曱基三石粦酸月包苦，和2'-O-曱基三磷酸尿苷。用本发明的dRmY转录混合物制备的修饰寡核 苷酉臾充分i也包4舌所有2'-脱氧^_苷，2'-脱氧鸟苦，2'-0-曱基 月包苷，2'-O-曱基尿苦。优选的实施方案中，最后的寡核苦酸 包括的序列中至少80%的腺苷是2'-脱氧腺香，至少80%的鸟 苷是2'-脱氧鸟苷，至少80%的胞苦是2'-0_曱基胞香，至少 80%的尿苷是2'-O-曱基尿苷。更优选的实施方案中，最后的 寡核苷酸包括的序列中至少90%的腺苷是2'-脱氧腺苷，至少9 0%的鸟苷是2'-脱氧鸟苷，至少90%的胞苷是2'-0-曱基胞 苷，至少90%的尿苷是2'-O-曱基尿苷。最优选的实施方案中， 最后的寡核苷酸包括的序列中至少100%的^泉苷是2'-脱氧腙_ 苷，至少100%的鸟苷是2'-脱氧鸟苦，至少100%的胞苷是2' -O-曱基胞苷，至少100%的尿苷是2'-0-甲基尿苷。
rGmY转录条件下，转录反应混合物包括2'- OH三磷酸鸟 苦，2'-OMe三石岸酸J包苷，2'-OMe三磷酸尿苷，和2'- OMe 三磷酸腺苷。用本发明的rGmY转录混合物制备的修饰寡核苷酸 充分i也包4舌所有2'-OH鸟苦，2'-OMe月包普，2'-OMe尿苦， 和2'-OMe腺苷。优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序
79列中至少80。/。的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少80%的胞香是2'-0 Me胞苷，至少80。/。的尿苦是2'-OMe尿香，至少80%的腺普是 2'-OMe腺苷。更优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序 列中至少90 0/。的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少90%的胞普是2'-O Me胞苦，至少90%的尿苷是2'-OMe尿苦，至少90%的腺苷是 2'-OMe腺苷。最优选的实施方案中，最后的寡核苷酸包括的序 列中至少100%的鸟苷是2'-OH鸟苷，至少100%的胞苷是2' -OMe胞苦，至少100%的尿芬是2'-OMe尿苷，至少100%的 腺苦是2'-O-曱基腺普。
r/mGmH转录条件下，转录反应混合物包括2' - O -曱基三 磷酸腺苷，2'-0-甲基三磷酸胞苷，2'-0-甲基三磷酸鸟苷，2 '-O -甲基三磷酸尿苷和2' - OH三磷酸鸟苷。用本发明的r/mG mH转录混合物制备的修饰寡核苷酸充分地包括所有2'-0 -甲 基腺苷，2'-0 -曱基胞苷，2'-0-甲基鸟苷，2'-O-曱基尿苦， 其中鸟苷中2'-OH鸟苷数量最大为10%。优选实施方案中，本 发明中结果的r/mGmH修饰寡核苦酸包括的序列中至少80 %的 腺苷是2'-O-甲基腺苷，至少80%的胞苷是2'-O-甲基胞苷， 至少80%的鸟苷是2'-0 -曱基鸟苷，至少80%的尿苦是2'-0 -甲基尿苷，并且不超过10%的鸟普是2'-OH鸟苷。更优选的 实施方案中，结果修饰寡核苷酸包括的序列中至少90%的腺苦是 2'-O-甲基腺苦，至少90%的胞苷是2'-O-甲基胞苷，至少9 0%的鸟苷是2'-O-曱基鸟苷，至少90%的尿苦是2'-0 -曱基 尿苷，并且不超过10%的鸟苷是2'-OH鸟苷。最优选的实施方 案中，结果修饰寡核普酸包括的序列中至少100%的腺普是2'-O-曱基腺苷，至少100%的胞苷是2'-0-甲基胞苦，至少90 %的鸟苷是2'-O-曱基鸟苦，至少100%的尿普是2'-0 -甲基 尿苷，并且不超过10%的鸟普是2'-OH鸟苷。mRmY转录条件下（这里也指MNA),转录混合物只包括2 ，-O-甲基三磷酸腺苷，2，-0-甲基三磷酸胞苷，2，-0-甲基 三磷酸鸟苷，2'-0-甲基三石岸酸尿苷。4吏用本发明的mRmY转 录混合物制备的结果修饰寡核苷酸包括的序列中100%的腺苷是 2'-O-甲基腺苷，100%的胞苷是2'-O-曱基胞苷，100%的鸟 苷是2'-O-曱基鸟苷（除了寡核苦酸的第一个鸟苦），100%的 尿苷是2'-O-甲基尿苷。
fGmH转录条件下，转录反应混合物包括2' - O -曱基三磷酸 腺苷，2'-O-曱基三磷酸尿苷，2'-O-甲基三磷酸胞香，2'-F 三磷酸鸟苦。用本发明的fGmH转录混合物制备的修饰寡核香酸 充分地包括所有2'-0-甲基腺苷，2'-O-曱基尿苷，2'-O-甲基胞苷，2'-F鸟苷。优选实施方案中，本发明中结果的修饰 寡核苷酸包括的序列中至少80%的腺苦是2'-O-曱基腺苷，至 少80%的尿苷是2'-O-甲基尿苷，至少80%的胞苦是2'-O-甲基胞苷，至少80。/。的鸟苷是2'-F鸟苷。更优选的实施方案中， 本发明中结果的修饰寡核苷酸包括的序列中至少90%的腺苷是2 '-O-曱基腺苷，至少90%的尿苷是2'-O-甲基尿苷，至少90 %的胞苷是2'-O-甲基胞苷，至少90乂的鸟苷是2'-F鸟苷。 最优选的实施方案中，本发明中结果的修饰寡核苷酸包括的序列 中至少100%的腺苷是2'-O-甲基腺苷，至少100%的尿苷是2 '-O-甲基尿苷，至少100%的胞苷是2'-0-曱基胞苷，至少1 0(T/。的鸟苷是2'-F鸟普。
dAmB转录条件下，磷酸盐，2'-0-曱基三磷酸胞苷，2'-O-甲基三磷酸鸟苷，2'-0-甲基三磷酸尿苷。使用本发明的d AmB转录混合物制备的修饰寡核苦酸充分地包括所有2'-脱氧 腺苷，2'-0-甲基胞苷，2'-O-曱基鸟苷，和2'-0-甲基尿 苷。优选实施方案中，结果的^f多饰寡核苷酸包括的序列中至少80%的腺苷是2'-脱氧腺苷，至少80%的胞苷是2'-O-甲基胞苷， 至少80%的鸟苷是2'-0-曱基鸟苷，至少80%的尿苷是2'-O
-甲基尿苷。更优选实施方案中，结果的修饰寡核苷酸包括的序 列中至少90%的腺苦是2'-脱氧腺苷，至少90%的胞苷是2' - O
-甲基胞苷，至少90%的鸟苷是2'-0-甲基鸟苷，至少90%的 尿苷是2'-0-曱基尿苷。最优选实施方案中，结果的修饰寡核 苦酸包括的序列中至少100%的腺苷是2'-脱氧腺苷，至少100 %的胞苷是2'-O-甲基胞苷，至少100%的鸟苷是2'-0-甲基 鸟苷，至少100%的尿苷是2'-0-甲基尿苷。
每种情况下，转录产物可以作为SELEX™过程中的文库来
。结果序列已经是稳定的，乂人过程中消除该步骤以获得稳、定的 适体序列并作为结果，^合予更稳定的适体。2'-OMe SELEXTM 过程的另一优势是结果序列具有更少的序列所需的2'-OH核 苷，也可能不包括。剩余2'OH核苷可以通过后-SELEX修饰去除。
如下所述，更低的但是有作用的完全整合2'替换核苷的转录 产物可以在除了上述最优条件之外的条件下获得。例如，上述专 利条件的变化包括：
HEPES緩沖液浓度可以为0至1M。本发明也试用其他pKa 值在5和IO之间的緩沖液，例如，Tris (羟甲基）氨基甲烷。
DTT浓度范围可以为0至400mM。本发明的方法也4是供了 试用其他还原试剂，例如，巯基乙醇。
亚精胺和/或精胺浓度范围可以为0至20mM。
82PEG- 8000浓度范围可以为0至50% ( w/v)。本发明的方法 也才是供了使用其他亲水聚合物，包括，例如，其他分子量的PE G或其4也聚乙二醇。
Triton X- 100浓度范围可以为0至0.1% ( w/v )。本发明的 方法也提供了使用其他非-离子去垢剂，包括，例如，其他去垢 剂，包括其他Triton-X去垢剂。
MgCl2浓度范围可以为0.5mM至50mM。 MnCl2浓度范围可 以为0.15mM至15mM。 MgCl2和MnCl2的浓度必须在所述范围 内，优选实施方案中MgCl2: MnCl2为10至3,优选地，为3 - 5: 1,更4尤选地，比例约为3-4: 1。
2' - OMe NTP的浓度（每种NTP )范围为5jaM至5mM。
2'-OH GTP ;农度范围可以0jiM至300mM。 一些实施方案 中，转录可以在缺失2'-OH GTP (OpM)时进行。
2'-OH GMP,鸟苷或其他除了 2'糖基位点的2'-OH G替 才灸的浓度范围可以为0至5mM,其中， 一些实施方案中，2'-O H GTP不包4舌在反应中，2'-OH GMP是需要的并其范围为5|i M至5mM。
DNA才莫4反浓度范围为5nM至5|aM。
突变聚合酶浓度范围为2nM至20pM。
无才几焦石粦酸酶范围为0至100单^f立/ml。
pH范围为pH6至pH9。本发明的方法可以在最多数聚合酶 整合》务饰核苦的活性pH范围内实施。转录反应时间可以为l小时至数周，优选地为l至24小时。
以下实施例中描述的生物方法显示的，具有最高亲和力和结 合特异性的所选择的适体适合于治疗C5补体蛋白相关的疾病的治疗。
适体药物^匕学
一旦结合期望目标的适体^皮鉴定，可以扭J于几种4支术进一步 增强所鉴定的适体序列的结合和/或功能特征。通过SELEXTM过 程（包括2'-修饰SELEXTM )鉴定的结合期望目标的适体可以任 意地平末端化以获得具有期望结合和/或功能特征的最小化适体 序列（这里也指"最小化结构"。使用折叠方法和序列分析（例如， 对来源于选择的克隆序列结果进行校准以寻找保守模体和/或协 变）以获知最小化构造的设计。生化探针时间也可以测定适体序 列的5'和3'边界，以获知最小化构造的设计。最小化结构可以被 化学合成并测定其相比于起源的非-最小化序列的结合和功能 特征。包括一系列5'， 3'和/或内部删除的适体序列的变体也可以 直接通过化学合成并测试其相比于其起源的非-最小化序列的 结合和/或功能特征。
此外，纟参杂重选可以用于研究单一活性适体序列（例如，通 过SELEX™过程鉴定的结合期望目标的适体，（包括2'-修饰S ELEXTM)，或一种单一最小化适体序列）的序列需要。使用合成 的，已经基于期望的单一序列设计的简并集合进行掺杂重选。简 并7K平通常为里f生型4亥苷的70%至85%间变化，例jo，期望的单 一序列。通常，通过掺杂重选过程鉴定带有中立突变的序列，但 一些情况下序列改变可以获得增强亲和力的结果。来源于使用掺 杂重选鉴定克隆的合成序列信息可以用于鉴定最小结合模体并 有助于荻得最优效果。使用SELEXTM过程鉴定的适体序列（包括2'-修饰SELEX 和掺杂重选）和/或最小化的适体序列也可以在SELEXTM之后使 用Aptamer Medicinal Chemistry进4亍最l尤4b处理，进4亍随才几或直 接序列突变以增加结合亲和力和/或功能特征，或测定序列中对于 结合活性和/或功能特征所必要的位点。
适体药物化学是一种适体改良技术，其中各组变体数据通过 化学合成。这些变体典型地与母体适体不同，其引入了单一替换， 并由于替才臭位点的不同相互区别。这些变体之间及与母体之间进 行相互比4支。特征上的改良可以是意义深远的，其包括的单一替 换可以是获得特定治疗标准所必要的。
可选地，乂人单一变体组中获得的信息可以用于设计增加的变 体组，其中超过一种替换被同时引入。 一种设计策略中，所有单 一替换变体被归类，选择前4种，并且这4中单一替换变体的所 有可能的双（6)，三（4)和四（1)重联合被合成和分析。第二 种设计策略中，最佳的单一替换变体被作为新的母本，包括最高 -级别单一替换变体的所有可能的双替换变体被合成和分析。其 他策略也可以被使用，并且这些策略可以重复使用使得替换的数 量逐渐增加，连续鉴定增加-改善的变体。
适体药物化学可以特定i也作为 一种方法对局部引入的替4灸， 而非整体，进行研究。由于适体是在通过转录制备的文库中选择 的，在SELEX™过程中引入的替换必须是整体引入的。例如， 如果期望在核苷间引入硫代磷酸酯交联，其只能在每个A (或每 个G， C, T， U等）中引入（整体替换）。在一些A (或一些G, C, T, U等）中需要硫代磷酸酯（局部替换）而在其他A中无 耐受性的适体不能通过此方法发现。
85适体药物化学方法使用的替换类型仅受固相合成试剂制备 并引导其进入聚合物合成方案的能力的限制。方法不单独受限于 核*。适体药物化学方法包括的替换可以引入空间，疏水性，亲 水性，亲脂性，疏脂性，阳离子，影子里，中性离子，两性离子， 极化性，核酸酶-抗性，构象硬度，构象柔韧性，蛋白-结合特 性，质量等。适体药物化学方法可以引入碱基-修饰，糖基-修 饰或》粦酸二酯交胃关_ <多饰。
当考虑可以有利于治疗适体的替换的类型，则期望引入具有 以下 一 种或两种特性的才奐。
(1) 已经在身体中存在的替换，例如，2，-脱氧，2，-核 糖，2'-0-曱基噤呤或嘧啶或5-甲基胞苷。
(2) 已经是所提供的治疗剂的一部分的替换，例如，硫 代磷酸酯-交耳关的寡核苷酸。
(3) 水解或降解至上述两种特性中的一种的4^换，例如， 曱基;粦酸酯-交耳关的寡核苷酸。
本发明的适体包括由此所述的适体药物化学方法制备的适体。
本发明的适体的目标结合亲和力可以通过一系列适体和目 标（例如， 一种蛋白质）之间的结合反应而测定，其中"P-标 记的适体与緩沖液重的系列稀释目标共孵育，并使用真空过滤集 合管通过硝酸纤维素膜过滤分析。这里所指的斑点印记方法，使 用三层（由上到下）由硝酸纤维素，尼龙膜，和凝胶斑点纸组成 的膜介质。与目标结合的RNA被纤维素过滤膜捕获，而非-目 标结合RNA在尼龙过滤膜上被捕获。凝胶斑点纸作为其他过滤膜的支持介质。随着过滤进行，过滤层被分离，干燥并暴露于荧 光屏并使用荧光显示系统对齐进行定量。量化结果可以用于生成
适体结合曲线，其中可以计算分离常凄t (Kd)。 一个优选实施方 案中，用于进4亍结合反应的ll沖液介质是加有0.1mg/ml BSA的 l*Dulbecco，s PBS (带有Ca十+和Mg++)。
通常，适体调节目标功能活性的能力，例如，适体的功能， 可以z使用体外和体内才莫型分析，并且其才艮据目标的生物学功能而 变化。 一些实施方案中，本发明的适体可以抑制目标的已知生物 学功能，而其他实施方案中，本发明的适体可以刺激目标的已知 生物学功能。本发明的适体的功能活性可以^吏用测定补体成分目 标已知功能的体外和体内才莫型进行分析。
术，可以常规地适用于诊断目的。诊断应用可以包括体内或体外 诊断应用。诊断试剂仅需要可以用于鉴定特定区域或浓度中给定 目标的存在。筒单地，与目标形成结合对的能力可以有效引发诊 断目的的阳性信号。本领域中的技术人员也可以通过本领域已知 的方法对适体改造，引入一个标记标签以定位这些配基的存在。 这些标签可以在多种诊断方法中^吏用。
适体治疗剂的药代动力学和生物分布调节
包括适体的所有基于-寡核苦酸的治疗药物，其药代动力学 特性与药物应用i殳计充分匹配是非常重要的。然而直4妾针对细月包 外目标的适体并不耐受细胞内输送相关的困难（如反义和基于-RNAi的治疗情况），这些适体必须能够分布于目标器官和组织， 并且与期望剂量方案相符，在体内维持段一时间（无变化）。这样，本发明提供了印象字体组合物的药代动力学的材料和 方法，并且，特别是，转变适体药代动力学的能力。适体药代动 力学的转变能力（例如，调节能力）是通过修饰配基（例如，P
EG聚合物）与适体的结合和/或引入《奮饰核苷（例如，2，-氟或 2'-0-曱基）以转变核酸的化学组成而达到的。转变适体药代^ 动力学的能力被应用于改良已有的治疗应用，或可选地，发展新 的治疗应用。例如， 一些治疗应用中，例如，抗-肿瘤或急性治 疗中期望药物的快速清除或失效，则期望减少适体在循环中的残 留时间。可选地，其他治疗应用中，例如，在维持治疗中期望维 持治疗的系统4盾环时，可以期望增力口适体在4盾环中的残留时间。
此外，适体药代动力学的转变能力被应用于修饰主体中的适 体治疗剂的生物分布。例如， 一些治疗应用中，在定位于特定组 织类型或特定器官（或一组器官）的应用中，可以期望改变适体 治疗剂的生物分布。在这些应用中，适体治疗优先刺^敫特定的组 织或器官。其4也治疗应用中，期望目标组织显示细月包标记或一种 给定疾病相关的症状，细胞损害或其他非正常病理，从而^f吏适体 治疗在受影响的组织中优先积累。例如，如描述于美国临时申请 序歹'J号60/550790, 2004年3月5曰！J3;f当，题目为"适体》、台疗6勺药 代动力学和生物分布的受控调节，,，和美国非-临时申请系列号1 1/075648, 2005年3月7号归档，题目为"适体治疗的药代动力 学和生物分布的受控调节'，，适体治疗的PEG化（例如，20 kDa PEG聚合物的PEG化）被用于定位炎症组织，从而4吏PEG化适 体治疗剂优先在炎症组织中聚集。
为测定适体治疗剂（例如，适体共Y介物或具有改变化学性的 适体，如修饰的核苦）的药代动力学和生物分布特性，需监控各 种参数。这些参数包括，例如，半衰期（W2)，血浆清除率（C1)， 分布体机（Vss)，浓度-时间曲线下的面积（AUC)，最大血清或血浆浓度（Qnax),和适体组合物的平均残留时间（MRT)。这
里使用的术语"AUC"指适体治疗剂的血浆浓度相对于适体治疗
后时间的曲线下的面积。AUC Y直用于评估生物利用度（例如，
适体纟会药后在循环中的适体治疗剂的百分率）和/或纟合定适体治疗
剂的全部清除率（C1 )(例如，适体治疗剂乂人循环中清楚的速率）。 分布体积与试剂治疗剂的血浆浓度和身体中适体的存在凄史量相
关。Vss越大，血浆外发现的适体越多（例如，更多外;参）。
本发明提供了通过将适体与调节配基相结合，如一种小分 子，多肽，或聚合末端基团，或通过在适体中引入修饰核苦，在 受控模式中调节稳定的适体组合物的体内药代动力学和生物分 布的的材料和方法。如此所述，与修饰配基的结合和/或核苷化学 组合物的改变可以改变适体循环残留时间和组织分布的基本方 面。
除了核酸酶的清除作用，核苷治疗剂还受限于肾过滤排除功 能。因此，通过静月永内症会药的抗-核酸酶的寡核香酸的体内半衰 期小于10分钟，除非过滤功能可以〗皮抑制。可以通过促进从血 流进入组织的快速分布速度或增加寡核苷酸的适体分子量，使其 超过肾小球的截止大小而完成。小治疗剂与PEG聚合物的结合 (PEG化），如下所述，可以显著地增长适体在循环中的残留时间， 乂人而减少^会药频率并增强4十对血管目标的效力。
进一步，眼部组织的适体过滤也可以被调整，特别是^皮抑制， 通过与PEG聚合物结合增加本发明的适体的表观分子量。
适体可以与各种修饰配基结合，如高分子量聚合物，例如， PEG;多肽，例如，Tat (HIV Tat蛋白的13个氨基酸片段（Viv es,等（1997)， J. Biol. Chem. 272 (25 ): 16010- 7)), Ant (来 源于果蝇触角同源蛋白第三螺:旋的16-氨基酸序列（Pietersz，等（2001 ), Vaccine 19 ( 11 - 12 ): 1397 - 405 ))和Arg7 ( —种 短的，聚合精氨酸组成的正电荷细胞-渗透多肽（Arg7 ) ( Rothb ard，等（2000)， Nat. Med. 6 ( 11 ): 1253 — 7; Rothbard， J等 (2002), J. Med. Chem. 45 ( 17): 3612 - 8 ));和小分子，侈寸^口， 亲脂性化合物如胆固醇。这里所述的各种结合中，与PEG基团 的结合最明显地影响适体的体内特性。例如，上述的非-临时申 请（美国系列号，11/075648， 2005年3月7日归档，题目为"适 体治疗剂药代动力学和生物分布的受控调节，)，适体与20 kDa P EG聚合物的结合阻抑的肾过滤并促进适体在健康和炎症组织中 的分布。jJ:匕夕卜，20kDa PEG —多狀聚合4勿与40 dDa PEG聚合4勿 对适体的肾过滤阻抑效果类似。虽然PEG化的一种效应是适体 清除，20 kDa配基提供的延长的系统暴露时间有助于适体在组 织中的分布，特別是那些高度灌注的器官和炎症部位。适体-20 kDa PEG聚合结合物使适体直接定位于炎症部位，使得PEG化 适体优先在炎症组织中聚集。 一些情况中，20 kDa PEG4b适体 结合物可以4妾近细月包内部，例如，肾细月包。
综上所述，^f氐分子量配基，包括胆固醇和细胞渗透多肽对适 体药代动力学和组合分布的影响明显小于P E G化或核苷修饰（例 如，化学成分的改变）造成的影响。然而，不期望受限于理i仑， 具显示胆固醇-介导的与血浆脂蛋白的结合，假设其发生在反义 结合状态下，被排除在特的别适体-胆固醇结合折叠结构之外， 并且/或者与胆固醇基团的亲脂性相关。与胆固醇类似，相对于4 8小时时肾脏中高水平的结合物，Tat多肽标签促进适体从血流中 的清除。本文中已报导的介导大分子在体外通过细胞膜的其他多 肽（例如，Ant, Arg7)，不促进适体在循环中的清除。然而，相 似于Tat,相对于其他适体，Ant结合物显著地在肾脏中聚集。然 而，不期望受限于理论，Ant和Arg7多肽修饰配基可能对适体的体内三维折叠产生不利影响，削弱这些多肽影响适体转运特性的 能力。
^修饰核苷也可以用于调整适体的血浆清除。例如，非结合的
适体与例如，2'-氟，2'-OMe,和/或稳、定其化学性的碌"A^岸酸 酯的整合，其在目前制备的显示高水平体外和体内核酸酶稳定性 的适体中具有典型性，与非修饰合适相比，显示了血浆中的快速 清除（例如，快速血浆清除率）和组织中的快速分布，主要分布 于肾脏中。
PAG-》泉生的一亥fr支
如上所述，高分子量非免疫原性的核酸派生物具有改变核酸 药代动力学和药效学特性的潜力，使其称为更有效的治疗药物。 活性的有力改变可以包括增加对核酸的抗性，减少肾过滤，减少 免疫系统的暴露，并改变治疗剂在身体中的分布。
本发明的适体组合物可以由聚烷撑二醇（"PAG，）配基派生。 PAG-派生的核酸的实施例见美国专利申请系列号10/718833, 2 003年11月21日归档，其通过在此引述全部合并与本文。本发 明中使用的典型的聚合物包括聚（乙二醇）（"PEG:"),聚（乙 撑氧）（"PEO，）和聚丙烯醇（包括聚异丙烯醇）。此外，不同的 烯氧化物（例如，乙烯氧4b物和丙烯氧化物）可以在i午多应用中 使用。其最常用的形式，聚乙二醇，如PEG，是一种在每一个末 端具有羟基基团：HO-CH2CH20- ( CH2CH20 ) n - CH2CH2 - O H的线性聚合物。该聚合物，alha- ， omega- 二羟基聚（乙二醇）， 也可以由HO-PEG-OH表示，其被理解为-PEG-符号表示以 下结构单元：-CH2CH20- ( CH2CH20 ) n - CH2CH2 -,其中n 典型的范围为4至10000。适合于治疗的PAG聚合物典型地具有在水中和许多有才几溶 剂中的可溶性，无毒性，并无免疫原性的特征。我们使用的PAG 将聚合物与非水溶性分子共价结合，使得PAG -分子"结合物"具 可溶性。例如，具显示非水溶性药物紫杉醇，当与PEG结合时， 变4寻具有水溶性。Greenwald，等，J.Org.Chem.， 60: 331 - 336 (1995 )。 PAG结合物通常不仅仅用于增强可溶性和稳定性，也可 以延长分子的血液循环半衰期。
PAG》派生物，例^。， PAG结合物，改变治疗剂的生物分布的 能力与"i午多因素相关，包括结合物的外只见大小（例如，以水力半 径测定的）。已知更大的结合物（〉10kDa)更有效地抑制肾过滤， 并且从而增加小的高分子（例如，多肽，反义寡核苷酸）的血清 半衰期。具显示，PEG结合物抑制过滤的能力将随PEG的大小 增高至50kDa而增大（由于半衰期将由巨噬细胞-介导的代谢而 非肾过滤一皮定义，^使得进一步的增加具有^艮小的效应。）
本发明的PAG派生的化合物大小典型地为5至80kDa之间， 然而4壬<可大小都可以纟皮>使用，该选纟奪依赖于适体和其应用。其4也 本发明的PAG派生的化合物大小为10至80kDa之间。而其他他 本发明的PAG派生的化合物大小为10至60kDa之间。本发明的 组合物的PAG配基大小范围为10， 20, 30， 40, 50， 60，或80 kDa。以下实施方案中，PEG是线性PEG，而其他实施方案中， PEG是分支PEG。其他实施方案中PEG是图4中描述的40kDa 分支PEG。 一些实施方案中，如图5所示，40kDa分支PEG与 适体的5'末端连"t妄。
本发明提供了合成高分子PEG-核酸（优选地，适体）结合 物，包括多重PEG化核酸的经济方法。本发明也包括PEG-连 才妄的多体寡核苦酸，例如，二聚适体。在生物-表达的蛋白治疗 剂中，核酸治疗剂典型地从活性单体核芬化学合成。PEG-核酸结合物可以通过运用相同的重复单体合成整合PEG而制备。例 如，通过转变为亚石粦酰胺形式;敫活的PEG可以整合入固相寡核 苦酸合成。可选地，可以通过位点-特异整合入PEG结合反应 位点而完成寡核苦酸的合成。
活寸生PEG
高分子量的PEG (>10kDa)的制备可能是困难的，低效的， 并且昂贵的。在合成高分子量PEG-核酸结合物的过程中，先前 的工作关注于制备高分子量的活性PEG。自闭这些分支的方法包 括制备线性活性PEG,或分支活性PEG,其中两个或多个PEG 与带有活性基团的中心结合。这些高分子量PEG分支的末端部 分，例3口，牙目关的非-反应羟基（-OH)基团，可以3皮^敫活， 或转变为功能基团，以4吏一种或多种PEG与其他化合物通过反 应位点相连接。分支的活性PEG将具有超过两个末端，在两个 或更多末端^^皮激活的情况下，这些活性高分子量PEG分支在此 称为多重-活性PEG。 一些情况中，分支PEG分子中不是所有 末端都祐:激活。分支PEG分子的4壬<可两个末端祐:激活的情况中， 该PEG分子指双-活性PEG。分支PEG分子的任^T两个末端4皮 激活的情况中，该PEG分子指双-活性PEG。分支PEG分子的 一个末端被激活的情况中，该PEG分子指单-活性。作为该途 径的一个实施例，描述了通过将两个单甲氧基PEG与随后被激 活的赖氨酸中心连4妾制备活性PEG的方法（Harris等，Nature， vol.2: 214 - 221, 2003 )。
如图6所示，线性PEG分子是双-功能的，并有时称为"PE G二醇'。，PEG分子的末端部分是相对的非-反应羟基基团，-O H基团，其可以被激活，或转变为功能基团，使PEG与其他化 合物通过反应位点连^妄。这些活性PEG 二醇在此指双-活性PE G。例如，可以通过将相对非-反应羟基基团，-OH，替换为来源于N-羟基琥珀酰亚胺的琥珀酰亚胺活性酯基团，4吏PEG 二 醇的末端配基成为具有与氨基基团进行选择反应的活性碳酸酯 而功能化。可选地，PEG二醇可以由许多基团激活，包括4旦不限 制于a-囟代乙酸，epihalohydrines,马来酸，酒石酸和石友酸，其 在适当的操作后可以制备结合的活性羰基或类似物。其他激活P EG的方法描述于Roberts等，（2002 ) Advanced Drug Deliver R eviews 54: 549-476,通过在此引述全部合并于本文。4吏用 一种 前述方法纟敫活PEG之外，PEG分子的一个或两个末端的乙醇功 能团可以^皮^修饰以结合不同类型的核酸。例如，将末端乙醇功能 团转变为氨基，或辟u醇，可以结合尿素和碌"戈尿烷。
许多应用中，期望于将PEG分子的一个末端用充分非-反应 基团封闭，使PEG分子称为单-功能（或单-活性的）。在通常 显示多重活性PEG活性位点的蛋白质治疗剂中，双-功能活性P EG导致额外的交联，产生低活性聚集。为制备单-活性PEG， P EG 二醇分子末端的一个羟基典型地替换为非-活性曱氧基末端 基团，-OCH3-。而另一个非-封闭的PEG分子末端典型地转 变为反应末端基团，其可以被激活，与一种表面或分子，如蛋白 质的反应位点连接。
连接一个或更多PEG的适体
最常见地，通过在5'-末端增加自由伯胺（在固相合成的最 后偶联步骤使用修饰亚磷酰胺整合）合成高分子量PAG -核酸结 合物。 -使用该方法，反应PEG(例如，其一皮激活以与氨基反应和 形成交联）与纯化的寡核苷酸结合并且在溶液中进行交联反应。
此外，高分子量PAG -核酸-PAG结合物可以通过将单功能 活性PEG与包括超过一个反应位点的核酸反应制备。 一个实施 方案中，核酸是双-反应活性的，并且包括两个反应位点：通过常规亚磷酰胺合成并且以3'-氨基固相支持起始，将5'-氨基 基团和3'-氨基基团整合入寡核苷酸，例如：图6中描述的3'-5'-双-PEG化。可选的实施方案中，反映位点可以在内部位点 引入，4吏用嘧咬的5-位点，噪呤的8-位点，或核糖的2'-位 点作为连接伯胺的位点。该实施方案中，核酸可以具有几个活性 或反应^f立点并且是多重活'l"生的。
为制备核酸-PEG-核酸结合物，核酸被首先合成，从而其 具有单活性位点（例如，其是单-活性的）。优选实施方案中， 反应位点是通过在寡核苦酸固相合成最后步骤中增加-修饰亚石粦 酰胺，在5'-末端整合入的一个氨基基团。另一优选实施方案中， 使用3'-氨基修饰物，加上在5'-末端引入氨基完成合成，产生 3', 5'-双-氨基寡核苷酸。通过对修饰的寡核苷酸去蛋白和纯 化，其在溶液中以高浓度再生，使活性PEG的自然水解最小化。 优选实施方案中，寡核苦酸的浓度是lmM,再生溶液包括200' mM NaHC03-緩冲液，pH8.3。连接物的合成是通过緩慢的，逐 步地增加高纯度的活性PEG起始的。优选实施方案中，PEG被 激活为p-硝基苯基碳酸盐。随着反应进行，PEG-核酸结合物 通过凝月交电泳或液相色语纯化以分离完全的-，部分-,和非-结合物质。
结合一个PEG的多重适体
本发明也包括高分子量适体组合物，其中两个或多个核酸配 基共价结合至少一个聚烷撑二醇基团。聚烷撑二醇基团作为一种 稳定基团。稳定基团是一种分子，或分子的一部分，其可以改善 本发明的高分子量适体组合物的药代动力学和药效学特性。 一些 情况中，稳定基团是一种分子或分子的一部分，其可以使两个或 更多适体，或适体区域接近，或提供本发明的高分子量适体组合 物的减少的整体转动自由度。稳定基团可以是聚烷撑二醇，如聚
95乙二醇，其可以是线性或分支的，单聚物或杂聚物。其他稳定基
团包括多肽核酸（PNA)等聚合物。寡核苷酸也可以是一种稳定 基团；这些寡核苷酸可以包4^修饰核苷，和/或》务饰联4妄；如好"< 磷酸酯。
稳定基团可以是适体组合物的内部部分，例如，其与适体共 价结合。在一种聚烷撑二醇共价结合适体任一末端的组合物中， 如聚烷撑二醇与核酸基团共同连接在一个分子中，该聚烷撑二醇 称为连接基团。这些组合物中，联接分子的最初结构包括线性排 列的核酸-PAG-核酸。在一种组合物的实施例中，其中PEG稳 定基团作为适体的分离不同部分的联^妄，是一种PEG与单适体 序列连接的组合物，从而高分子量适体组合物的线性排列是，例 如，核酸—PEG-斗亥酸（—PEG —才亥卧臾）n,其中n大于等于l。
为制备核酸-PEG - 4亥酸结合物，核酸^皮最初合成乂人而其带 有一个单一反应位点（例如，其是单-活性的）。优选实施方案
中，反应位点是一种通过寡核普酸的固相合成最后步骤中引入额 外的修饰硫代磷酸酯，在5'-末端引入的一个氨基基团。将修饰 核苷去蛋白和纯化后，其在溶液中以高浓度再生， <吏活性PEG 的自然水解最小化。优选实施方案中，寡核苷酸的浓度是lmM, 再生溶液包4舌200 mM NaHC03-緩沖液，pH8.3。连4妄物的合 成是通过緩'l"曼的，逐步地增加高纯度的双-功能PEG起始的。 优选实施方案中，通过衍生为硝苯基碳酸酯，PEG二醇的两个末 端都^皮激活（双-活性）。随反应进4于，PEG-核酸结合物通过 省是月交电泳或液相色i普纯化以分离完全的-，部分的-,和非-结 合的物质。多重PAG分子连接（例如，随机或才莫块聚合物）或 更小的PAG链可以相连接以获得不同长度（或分子量）。非-P AG连接可以在不同长度的PAG链之间使用。连接区域可以具有 一个或多个与其相连的聚烷撑二醇基团。
这些PAG可以是不同长度并以适当的组合使用以获得组合物的 期望分子量。
特定连接物的效果可以受其化学组成和长度影响。太长，或 太短，或形成不宜的空间排列的连接物和/或与补体成分目标的离 子交互作用将影响适体和补体成分目标间复合物的形成。 一种连 接物，其长于核酸间跨度所需，将通过减少联接的效应浓度减弱 结合稳定性。这样，有必要经常对联接组合物和其长度进行优化 以4吏适体对目标的亲和力达到最大。
对补体系统蛋白C5具有结合亲和力的适体
一些实施方案中，本发明的材 一牛和方法包括 一 系列特异结合 补体蛋白C5并对其功能调节的15至60核苦长度的核酸适体， 例如，阻抑补体蛋白C5体内活性和/或细胞-基础的化验的活性。
本发明的一些实施方案中，描述了可以特异结合并调节补体 蛋白C5的适体。这些适体提供了低-毒性，安全性，和治疗有 效形态，改良和/或防止各种补体-相关的疾病或失调，例如，补 体-相关的心脏失调（例如，心肌损伤；冠状动脉搭桥术（CAB G)相关的C5介导的补体并发症如手术后出血，系统嗜中性细 月包和白细月包活性，增加心月几梗死危险，并增加i人知功能紊乱；再 狭窄；和经皮冠状动脉介入治疗相关的C5介导的补体并发症）， 缺血再灌注损伤（例如，心肌炎症，中风，冻伤），补体相关的
炎症失调（例如，译喘，关节炎，脓血症，和器官移植后排斥）， 和^卜体-坤目关的自身免疫失调（例唢口，重症月几无力，系纟充'性纟工王汪
狼疮（SLE))。其他期望的C5抑制症状包括，例如，肺部炎症 (Mulligan等，（1998 ) J. Clin. Invest. 98: 503 )，体夕卜^卜体;舌')"生 (Rinder等，（1995 ) J. Clin. Invest. 96: 1564),抗体—介导的补体活性（Biesecker等，（1989) J. Immunol. 142: 2654)，血 管J求性肾炎和其他肾病，眼部症状如C5介导的眼部组织损伤， 例如，糖尿病视网膜病，渗出性和/或非-渗出性年龄相关黄斑变 性（AMD),阵发性睡眠性血红蛋白尿症。这些适体也可以用于诊断。
一些实施方案中，本发明的^f氐毒性，安全，和有岁文调节的适 体可以在发明的方法中用于治疗，稳定和/或防止不同补体-相关 眼部疾病或失调，包括，例如，急性或'f曼性炎症和/或免疫-介导 的眼部失调，炎症性结膜炎，包括过敏性巨乳头性结膜炎，黄斑 水肺，葡萄膜炎，眼内炎，角膜溃烂，干眼症，青光眼，糖尿病 一见网月莫病，角月莫移档^非斥，眼部手术相关的并发症，如人工晶体 才直入术和白内障手术相关的炎症，Behcet's疾病，免疫复合月永管 炎，Fuch's疾病，小柳原田病，亚视网膜纤维化，角膜炎，玻璃 体-视网膜炎，眼部寄生虫感染/转移，色网膜色素变性，巨细胞 病毒^L网月莫炎e'AMD，)，非-渗出性（f'干性，）AMD，或眼部新生 血管化失调，包括糖尿病^L网膜炎或渗出性。显，）AMD。这些适 体也可以在眼部i貪断中^f吏用。
这些适体也可以包括这里描述的修饰，例如，与亲脂性或高 分子量化合物（例如，PEG)连接，整合帽子基团，整合修饰核 苷，并对磷酸骨架进行修饰。
本发明的一个实施方案中，提供了一个分离的，非-自然发 生的结合C5补体蛋白的适体。另一实施方案中，提供了在本发 明的方法中4吏用，以治疗，稳、定和/或预防补体-介导的眼部失调 的分离的，非-自然发生的结合C5补体蛋白的适体。 一些实施 方案中，分离的，非-自然发生的适体与C5补体蛋白的分离常 数〖'Kd，）小于IOOjiM,小于ljaM,小于500nM，小于100nM， 小于50nM,小于lnM,小于500pM,小于100pM，小于50pM。本发明的一些实施方案中，分离常数是以下列实施例1中描述的 斑点染色滴定方法测定的。
另一实施方案中，本发明中使用的适体调节C5补体蛋白的 功能，特别是抑制C5补体蛋白功能和/或C5补体蛋白变体功能。 这里使用的C5补体蛋白变体包括执行与C5补体蛋白充分类似 功能的变体。C5补体蛋白变体合适地充分包括相同的结构，并 且一些实施方案中与包括下列氨基酸序列的C5补体蛋白的氨基 酉吏序歹'J (系列号：102)(引用于Haviland等，J Immunol. 1991 年1月1日；146 ( 1 ): 362 — 8 )相比，包才舌至少80%的序列一 致性，更合适地包括至少90%序列一致性，更适合地包括至少9 5%序列一致性。
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本发明的一些实施方案中，与目标变体一致的序列是卩吏用下
述的BLAST测定的。两个或更多核酸或蛋白序列间的术语"序列 一致，,，指^f吏用以下一种序列比4交,呈序或通过目才企方法，与最高对应的排列相比，两种或更多序列或亚序列间具有相同的或特定百 分比相同的氨基酸残基或核苦。对于序列比4交，典型地， 一种序 列净皮作为参考序列，与另一测试序列比4交。当^f吏用序列比4交禾呈序 时，测试和参考序列被输入电脑，如有需要则指明亚序列同等物， 并i殳计序列算法程序常lt 。序列比4交程序随后4艮据i更计的禾呈序常 数计算测试序列与参考序列间的序列 一致百分比。可以执行以下
最佳的序列比4交程序，例如，定位同源算法，Smith&Waterman, Adv， Appl. Math. 2: 482 ( 1981 ),同源P车歹'J算:^， Needleman &Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 ( 1970),对目4以方法的研究，Pe arson&Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 ( 1998 ), 这些算法的计算才几处理（GAP, BESTFIT， PASTA,和Wisconsi n遗传软件包中的TFASTA,遗传计算才几组，575 Scinece Dr., Madison, Wis.)，或通过目检（通常见下列，Ausubel等）。
适合于测定序列一致百分比的算法是基础定位算法研究工 具中4吏用的算法（以下的"BLAST，)，见，例如，Altschul等，J Mol. Biol. 215: 403 - 410 ( 1990 )和Altschul等，Nucleic Acid s Res， 15: 3389- 3402 ( 1997)。执行BLAST分析的软件是通 过国家生物技术信息中心（以下的"NCBI，）公开获得。使用NCB I中软件，例如，BLASTN (核酸序歹ll )和BLASTP (氨基酸序 列）测定序列一致性的默认参数描述于McGinnis等，Nucleic A cids Res, 32: W20 - W25 (2004)。
本发明的另一实施方案中，提供了与包括下列任何一种适体 充分相同的结合C5补体蛋白的能力：系列号：1-2, 5-67， 7 5-81， 83或88 - 98。本发明的另一实施方案中，适体具有包括， 下列Y壬^可一种适体充分相同的结构和结合C5补体蛋白的能力： 系列号：1 - 2, 5 — 67, 75 - 81, 83或88 - 98。本发明的实施方 案中，本发明的适体具有的序列，包括任何化学修饰，对应于任《可系列号：1-2, 5-67， 75 - 81, 83或88 - 98。另一实施方案 中，本发明的适体作为药物组合物中的活性成分4吏用。另一实施 方案中，适体或包括本发明的适体的组合物用于治疗多种包括任 何从以下组中选择的补体-相关的疾病或失调：补体-相关心脏 失调（例如，心月几损伤；冠状动乐:M荅桥术（CABG)相关的C5 介导的并发症，如术后出血，嗜中性粒细l包和白细万包活性，增加 心肌梗死和认知紊乱的危险；在狭窄；和经皮冠状动月永介入治疗 相关的C5介导的补体并发症），缺血再灌注损伤（例如，心肌梗 死，中风，冻伤），补体-相关的炎症失调（例如，哮喘，关节 炎，脓血症，和器官移才直后排斥），和补体-相关的自身免疫失 调（例如，重症月几无力，系统性红斑《良瘙（SLE),肺炎，体夕卜补 体活性，抗体-介导的补体活性和补体相关的眼部疾病，如糖尿 病视网膜炎以及年龄-相关的黄斑变性（AMD)。
一种实施方案中，本发明的抗-C5适体包4^+2'-氟》务饰核 苷，2'-OMe ^修饰核苷- OMe，）和2'- OH "票呤残基的混合 物。修饰的抗C5适体的描述性序列（系列号：l)见下表l，其 结构见图3A。大多数噪呤和（A和G)具有2'-OMe，除了仅 有两个G残基仍为2'-OH (突出显示的残基）。带圈的残基表示 可以同时修饰为2'-H而不充分改变适体的抗C5活性的嘧啶组 群（见下表1中的ARC330 (系列号：2,图3B ))。图3A中下 划线显示的残基表示可以包括2'-氟和2' - H修饰（但不是2'-OMe)的嘌P令残基，而带才匡的残基表示可以包4舌2'-氟或2-O Me修饰（但不是2'-H)的嘧啶残基。带有箭头（ ）的残基 必须含有2'-氟修饰。带有箭头（ ）的残基如果不含有2'-氟修饰，将使适体的溶血活性显著减弱。优选实施方案中，本发 明的抗-C5适体包括对应于系列号：1中的核苷序列。才艮据本发明的抗-C5适体的实施例是ARC186(系列号：4 ), 其在图3C中显示并描述于美国专利系列号6395888，其通过在 此引述全部合并于本文。ARC186的所有21个嘧，定残基具有2' -氟修饰。主要的嘌呤（14个残基）具有2'-OMe修饰，除了 三个为2' - OH "票呤残基（图3C中突出显示）。本发明的抗-C5 适体也可以包括不同的2'-氟和2'-H〗务饰的混合。例如，本发 明的另一抗-C5适体是图3B中的ARC330 (系列号：2)。 ARC 330 (系列号：2)包括7个2'- H修饰（图3B中画圏表示），14 个带有2'-氟修饰的嘧咬残基，14个2'-OMe修饰的嘌呤残基， 和三个2'- OH噪呤残基（图3B中突出表示）。
下表1表述了其他的包括2'-氟修饰，2' - OMe修饰，2' - O H嘌呤残基，和连接非-免疫原性，不同大小的高分子量化合物 (例如，PEG)的适体的组合物，其每一个都来源于ARC186 (系 列号：4)。本发明包括下表1描述的适体。本发明也包括下列描 述的但缺失所需的3'帽子（例如，反向脱氧嘧啶帽）的适体和/ 或下列描述的包括3'帽子（例如，反向dT)的适体，其中该3' 帽子是非需要的。
本发明的一些实施方案中描述的方法中使用的抗-C5适体 可以是包括任何下列描述的适体：序列号NOS 1至69, 75， 76, 81, 91, 95和96。
除非另有说明，下表1中的核酸序列以5'至3'反向表示。对 于表1中的每个序列，所有2' - OMe噤，冷或嘧"定^修饰以相应核苷 前的"m"表示；所有2'-氟嘧啶修饰以相应核苷前的"f，表示；所 有嘌呤或嘧咬的脱氧修饰以相应核苷前的"d"表示；任何无"m，，' 'f,，或"d"显示的嘌呤或嘧咬表示2'-OH残基核香。进一步，"3T" 表示反向脱氧嘧啶，"NH"表示己胺连接，"NH2"表示己胺末端，"PEG"表示具有特定分子量的聚乙二醇基团，"biotin"表示5'具有生 物素连接的适体。
表1:
序歹'j号：1
其中：
Xi=fC或mC X2=^G或gy
Xi^iG或niG X5=fC或dC X6《或dT X7=fC或dC X8=rA政mA 5C9^rG或niG
X"-fC或dC Xi2^^fC或mC X'3==fU或mU Xl4=iG或mG Xi5=xA或mA Xi^iG或 Xl7=fU或dT X|8=fC^ dC XiiHU或dT X2o=rG或mG X2i=rA或mA X22=rG或mG Xza饰或dT Xm可A或mA
X25=fC或dC
XafiH(C或dC X27=ft^ dT X幼^或mG X29^tG或mG
ARC330 (序列号：2)
flCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAinGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfC迈G ARC185(序歹'J号：3)
GAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUflHCGfUfCARC186 (序歹'J号：'4)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAniGfUfC£UinGtaAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3，
ARC187(序歹'J号：5) 40kDaPEG-NH-
£CmGfCfCGfCmGmGfUK:fUfCmAmGmGfCGrcfUmGmAmGfUfCfUinGmAmG£UfUfUAfCfCfUmGfCmG-3"l Where the branched 40 kDa PEG is ,3-bis(mP£O-[20 kDa】)-propyl-2《4,-butamide)
ARC188 (序列号：6)
AGGAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAiCfCfUfUfCGfUfC ARC189 (序列号：7)
AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAniGmGfCGfCfU迈GniAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAiCfCfUinGfC迈C] ARC250 <序列号：8)
GGfCGfCfCGfCGGfUfCfUfCAGG忙GfCfUGAGfUfCfUGAGfUfUfUAiCfCfUGK:G ARC296 <序列号：9)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUraGmAmGTdCTmGmAinGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG-3T ARC297 (序列号：10)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTinGmAmGfUfUfUAdCdCfUinGmCinG-3T
ARC331 (序列号：11)
dCmGdCfCGfiCmGinGfUdCTdCmAniGinGdCGfCfUniGraAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGdCmG ARC332 (序列号：12)
dCmGfQECGfCmG迈GfUdCTdCmAniGmGdCGJECfU迈GmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAiCfCfUmGfCmG ARC333 (序列号：13)
fCmGdCfiCGfCniGinGfUdCTdCmAinG迈GdCGfCfUmGmAmGTdCTniGinAniGfUfUfUAfCfCfUniGfCmG ARC334 (序歹'J号：14)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUmGmAinGTdCTmGmAmGfUfUfUAiCfCfUnrf3dC迈G
ARC411 (序列号：15)
fCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAinGTdCTmGniAniGfUfUfUAflCfCfUniGfCmG ARC412 (序列号：16)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAnrf3niGdCGiCfU迈GmAmGTdCTmGmAinGfUfUfUAfCfCfUmGmCinG ARC413 (序列号：17)
mCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAinGmGdCGfCfUniGmAmGTdCTmGmAniGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC414(序列号：18)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUinG迈CinG AROH5(序列号：19)
fCmGfCdCGfCmGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC416(序列号：20)
fCmGfl^CGdCmGinGfUdCTdCmAmGmGdCCHCfU迈GmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGAROtn (序歹'J号：21)
fCmGfCdCGdCmOinGfUdCTdCmAinGmGdCGfCfU迈GmAmGTdCTmGinAmGfUfUfUAfCfCfUniOfCinG ARC418 (序歹'J表：22)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAniGmGdCGdCfUmGmAinGTdCTnaGmAniGfUfUfUAfCfCfU迈GfCmG ARC419 (序歹'J表：23>
fCmGfCfCGfCmGni。fUdCTdCmAmGmGdCGfCr迈GmAmGTdCTniGmAniGfUfUfUAfCfCfUraGfCmG
ARC420 (序列号：24)
*CmG£CfCGfCmGmGfUdCTdCmAniGmGdCGdCTmGniAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC421 (序列表：25)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTfUfUAfCfCfUinGiCmG ARC422 (序列号：26)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUTfUAfCfCfUmGfCmG ARC423(序歹'〗表：27)
fC边GfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUTAfCfCfUmGfl:naG ARC424 (序列表：28)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCinAmGmGdCGfCfUinGmAmGTdCTmGniAniGTTTAfDK;fUmGfCmG ARC425 (序列号：29)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCTmGKinG ARC426(序歹1〗表：30)
.tCmGfCfCGfCmGmG迈UdCTdCmAmGmGdCGfCfU迈GmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG
ARC427 (序列表：31)
fCmGiC迈CGfCinGmGfUdCTdCmAmGniGdCGfCfUmGinAmGTdCTinGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCinG ARC428 (序歹'j号：32)
fCmGfCfCGmCmGniGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAinGTdCTmGniAmGfUfUfUAfCfCfUniGfCmG
ARC429 (序列号：33)
fCmGeCmCOmCmGmGfUdCTdCmAmGinGdCGfCfUinGmAmGTdCTmGinAmGfUfUfUAfCfCfUniGfCmG ARC430 (序歹'〗号：34)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCfUmGmAmGfUdCfUniGmAmGfUfUfUAfCfCfUniGfCniG ARC431(序歹'J表：35)
fCniGfCfCGrcniGmGfUdCfUdCniAmGinGdCGfCniUniGmAniGfUdCfUniGmAniGfUfOfUAfCfCfUmGfCin ARC432(序列号：36)
fCinGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGniGdCGmCmUmGmAniGfUdCfU迈GmAinGfUfUfUAfCfCfUinGfCinG ARC433 (序列号：37)
fC迈GfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUinGmAniGTdCTmGmAmGmUfUfUAfCfCfUmGfCaiG ARC434(序列号：38)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAinGmGdCGKIfUniGmAmGTdCTmGmAmGfUinUfUAlCfCfUinGfCniG
mGmC3fCmGfCfC<3fCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGinAmGTdCTmGmAinGfUfU£UAfCfCfUinGfCm GmCmC
ARC544(序:'列号：55〉
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUniCinUmCmAmGmGinCGfCfUniGmAmGfnUmCmUmGinAinOfUfUfUAfCfCfU mGfCmGmCraC
ARC550 (序列号：56)
fCmGfCfCGlCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUniGmAinGfUfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC551 (序列号：57)
fCmGfCiCGfCinGmGfUfCfUfCmAmGniGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC552 (序歹'J号：58)
1CmGfCfCGiCmGmGfUfCfUfl^nAmGmGiCGiCfUinGmAmGfUKaUmGniAmOTfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC553 (序歹'J号：59)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfOGniCmUmGmAinGfUfOfU迈GmAmGfUflJfUmAfCfCiUmGfCniG-3T
ARC554 (序列号：60)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGinCmUinGmAmGfUfCfUmGmAmGTfUfUinAfCiCfUinGfCmG-3T
ARC 657 (序歹'J号：61) 20kDaPEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUflJfUAiCfCfUmGfCmG-3T
ARC 658 (序列号：62) 30 kDa PEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGn3AmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfi:fUinGfC迈G-3T
ARC 672 (序列号：63) NH2-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGniGiCGK;fUniGmAmGfUfCfUmGmAmGiUfUfUAiCfCfUmGfCmG-3T
ARC706 (序歹'J.号：64) ■ WkDaPEG-NH-
K:mGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCniAmGmGfCGfCfUmGinAmGiUfCfU迈GinAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3TARC1537 (序列号：65) 40kDaPBG-NH-
fCmGfC£CGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGinAmGfUfUfUAfCfCfUinGfCmG-3T
ARC1730)(序歹'J号：66) PEG20K-NH-
fCmGfCfCGfCnaGmGfUfCfUfCmAmGmGfiCGfCfUniGmAmGfUfCfUmGmAinGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-NH-PEG20K
ARC1905 (序歹'J号：67) 40KPEG-NH—
fCmGfaCG*CmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUinGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCniG-3T Where the branched 40 kDa PEG is 2,3-bis(mPEG-[20 kDa】)-propyl小carfoamoyl
ARC243 (序列号：68)
GGfCGAfUfUAiCfUGGGAiCGGAfCfUft:GfCGAfUGfUGAGfC忙fCAGAfCGAfCfUfCGfCfC ARC244 (序歹'J号：69)
GGiCfUfUflCfUGAAGAfUfUAfUfUfUfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCfCAGAfCfCrcfC
本发明进一步包括下表2中的适体。表2中的适体以5'至3' 方向表示，并显示了以dRmY SELEXTM条件下选择的适体的核 糖序列。本发明中源于该选择的一些实施方案中（在所列的序列 中反应），噤呤（A和G)是脱氧的而嘧咬（U和C) 2'-OMe。 一些实施方案中适体包4舌一个帽子（例如，3'-反向dT)。 一些 实施方案中适体包4舌一种PEG。
表2/dRmY抗—C5适体
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