技术领域
[0001] 本
发明涉及一种等离子体共振生化分析仪，属于聚合酶链式反应(PCR)技术领域；尤其涉及一种集成核酸扩增反应的
表面等离子体共振生化分析仪，本发明能够同时进行PCR反应和表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)反应，也能够单独进行PCR或者SPR。应用场景能够研究
生物分子间作用
力,如分子识别、免疫调节、
免疫测定、毒素和抗生素快速检测、核酸检测、
蛋白质组学药物和筛选及相关药物动力学实时检测等。
背景技术
[0002] SPR技术是近年发展起来的一种现代的、先进的、通用的免标记生化检测技术，这种技术是基于物理光学现象的生化检测技术，以一种特殊的消逝波(SPW)为探针，探测传感媒质光学参数的变化过程。当一束P偏振光在一定的
角度范围内入射到棱镜端面，在棱镜与金属
薄膜(Au或Ag)的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由
电子产生共振，即
表面等离子共振。分析时，先在传感芯片表面固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过芯片表面，若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子，会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过检测SPR角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息。
[0003] 该方法特别适合研究生物分子间的相互作用，如检测
抗原-
抗体的相互反应，研究DNA的杂交
吸附，识别脂质双分子膜等。该方法避免了传统方法需要标记、操作复杂、检测时间长等缺点，正成为分子分析领域的研究热点。采用柱面棱镜的方法检测SPR现象需要连续的改变入射光的角度，使其产生SPR现象，同时由于光路的对称原理需要实时的改变反射光检测单元的角度，从而测定SPR现象。传统的方法在入射光扫描与反射光检测各使用一
电机用于控制，机械结构复杂，
精度低，扫描角度受限，体积大。
[0004] 聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA
片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加，提高检测灵敏度。此外，一些等温扩增的方法如环介导等温扩增和滚环扩增等，也被尝试着应用在核酸检测中，等温扩增反应始终维持在恒定
温度下，对温控装置的要求降低，但是对于酶和引物的设计要求更高。
[0005] 聚合酶链式反应(PCR)也是一种体外迅速扩增DNA片段的分子生物学技术。热循环是PCR过程重要组成部分，每个循环包括变性(90℃～93℃)、
退火(50℃～55℃)和延伸(71℃～73℃)三个恒温过程，能够将目标DNA的数目在一个循环内扩增近一倍，经过30个循环可使目标DNA扩增到数亿倍，从而实现核酸分子的富集，便于进一步的分析和实验。为此，该技术目前已广泛应用于
微生物学、医学、考古学等领域。
[0006] 等温扩增技术也是一种核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和他们各自特异性引物(或不加)来达到快速核酸扩增的目的。相比于PCR技术等温扩增有特异性高、分析速度快、成本低、不需要升温降温过程危险性小等优势，但是目前国内对等温扩增技术还不是很成熟，需要进一步的发展。
[0007] 无论是传统的PCR扩增方法还是新兴的等温扩增或其它扩增方法，对应扩增产物的检测通常采用的凝胶
电泳检测或者是
荧光定量检测的方法，这些传统的检测方法通常需要对待检测样品进行标记，存在操作复杂、易污染和
费用高等问题。
[0008] 与
现有技术相比，本发明只采用一个电机驱动，实现SPR角度
自动调节功能，可以使入射光与接收光装置角度能在21.5°～75.5°之间同时变化，并能实现角度范围的进一步扩展。此外，本发明将棱镜耦合式SPR技术与核酸PCR扩增或等温扩增或其他扩增技术结合，具有如下特点：(1)在一个传感芯片上实现核酸扩增与SPR检测的两种功能。(2)PCR扩增温控装置与SPR棱镜耦合光学检测装置集成。(3)传感芯片与流通系统的微流控流通池采用可分离式设计，可以实现线下与线上两种方法在芯片上固定生物分子。(4)对应核酸扩增的产物，采用棱镜耦合式SPR光学系统进行检测，无需扩增产物标记荧光。(5)由于SPR检测方法的灵敏度高，可以缩短核酸分子扩增的周期，减少传统核酸扩增的时间，检测速度快。
发明内容
[0009] 本发明提出一种表面等离子体共振仪，其特征在于，该仪器包括嵌入式控制通信子系统、机械传动子系统、光学设计子系统和
温度控制子系统。如图1，嵌入式控制通信子系统分别和机械传动子系统、温度控制子系统连接，机械传动子系统和温度控制子系统均与光学设计子系统连接；机械传动子系统和温度控制子系统均被嵌入式控制通信子系统控制，光学设计子系统由机械传动子系统和温度控制子系统控制。
[0010] 机械传动子系统、光学设计子系统相互配合完成入射光角度与光电感应器件角度对称控制，光学设计子系统入射光光路角度与出射光光路角度一致。通过光学设计子系统中的传感芯片导入待检测
试剂样本配合光路产生表面等离子体共振现象。实验时通过嵌入式控制通信子系统控制机械子系统的竖直运动部分的滑轨
丝杆(3)和滑
块(2)做竖直运动，从而改变光轴(7)
位置(即上文表述的对称扫描
顶点)使表面等离子体共振仪入射角能产生21.5°至75.5°范围内的角度变化，能够实现气相到液相的检测。配合仪器整体避光设计，使仪器能连续的高效运行。温度控制子系统能够控制流通池的温度，确保实验时的温度条件不发生变化进行恒温控制，或者可以进行PCR扩增温度控制或等温扩增温度控制。
[0011] 本发明具备检测PCR/等温扩增产物的功能，也具备单独的SPR检测功能，其中温控子系统能够实现恒温下的SPR检测，减小温控子系统噪声，使温控子系统具有更高的灵敏度和
稳定性。控制与通信子系统控制电机运动与
信号检测，并把运动与检测信号的数据传输到嵌入式控制通信子系统中。
[0012] 机械传动子系统可以分为竖直运动部分和
水平运动部分，其中竖直运动部分如图2所示由滑轨丝杆(3)、滑块(2)、光轴(7)、轴套(8)、光轴固定下(6)、光轴固定上(9)和棱镜固定(14)组成。滑轨丝杆(3)固定在
固定板(1)上固定时使用销钉
定位保证其固定位置精确，滑块(2)一侧和滑轨丝杆(3)固定在一起，滑块(2)另一侧与光轴固定下(6)通过螺钉固定，轴套(8)套在光轴(7)外起到保护光轴(7)的作用，同时与光轴(7)一起卡在光轴固定下(6)和棱镜固定(14)之间，光轴固定上(9)先通过销钉来定位光轴固定下(6)和棱镜固定(14)然后再用螺钉将它们紧固，从而起到压紧光轴(7)的作用。
[0013] 如图3所示，机械传动子系统中的水平运动部分由固定板(1)、
导轨(18)、左
连杆(17)、右连杆(19)、左运动滑块(22)、右运动滑块(23)、左连接件(21)和右连接件(24)组成。导轨(18)固定在固定板(1)上，在固定过程中使用销钉定位保证导轨(18)的固定位置准确，左运动滑块(22)和右运动滑块(23)的下部固定在导轨(18)上并能够在导轨(18)上滑动，左连接件(21)的上部与左连杆(17)紧固连接，左连接件(21)的下部与左运动滑块(22)紧固连接；右连接件(24)的上部与右连杆(19)紧固连接，右连接件(24)的下部与右运动滑块(23)紧固连接。左连杆(17)和右连杆(19)顶部中间有直径大于轴套(8)外径的圆孔，光轴(7)和轴套(8)通过左连杆(17)和右连杆(19)顶部圆孔将两个连杆和竖直运动部分结合在一起。
[0014] 当控制系统发送指令使得电机(4)转动带动滑轨丝杆(3)以及滑块(2)运动时，竖直运动部分会随着滑块(2)沿着竖直方向运动，同时通过光轴(7)带动左连杆(17)和右连杆(19)运动，然后带动左连接件(21)和右连接件(24)以及左运动滑块(22)和右运动滑块(23)在导轨(18)上水平运动。
[0015] 光学设计子系统分为传感芯片和三角形光路部分，其中传感芯片由棱镜固定(14)、棱镜(13)、芯片(12)和流通池(11)组成，其中棱镜(13)与棱镜固定(14)紧固，芯片(12)放置在棱镜(13)上表面，流通池(11)放置在芯片(12)表面，棱镜固定(14)左侧和光轴固定下(6)右侧均有一略大于光轴(7)直径的圆柱形槽，能够将光轴(7)卡在棱镜固定(14)和光轴固定下(6)之间，然后光轴固定上(9)通过螺钉分别和光轴固定下(6)和棱镜固定(14)紧固在一起，由此传感芯片和机械子系统结合在一起。当机械子系统中的竖直运动部分做竖直运动时，传感芯片随之做竖直运动。
[0016] 如图4所示，流通池(11)和芯片(12)结合在一起形成一个密闭有
沟道的空间，这个空间可以分为左侧和右侧两部分，左侧为PCR扩增反应区(25)，PCR区(25)下方为温度控制子系统(10)用以提供PCR反应需要的温度环境；右侧为SPR区(27)，为实验需要其中带
颜色部分为金属(优先为金)。实验待测样品由流通池入口(26)导入，先进行PCR或等温扩增反应，反应产物再进入SPR区(27)检测，然后经流通池出口(28)导出。基于此本发明的待测样品不用荧
光标记，并且能够实现PCR/等温扩增和检测在同一系统上完成。
[0017] 三角形光路部分由左连杆(17)、左运动滑块(22)、左连接件(21)、右连杆(19)、右运动滑块(23)、右连接件(24)、入射
光源固定(15)、入射光源(20)、接收光装置(16)和棱镜(13)组成。入射光源(20)能够使用普通的激光笔也能够使用一些特殊的光源(拉曼/荧
光激发光源等)，入射光源(20)通过入射光源固定(15)安装在左连杆(17)上，能够跟随左连杆(17)运动；接收光装置(16)可以用光电
二极管等光强
传感器，也可以使用CCD相机采集图像信息，在
光电二极管外设计了一个
铝制的
外壳里面有卡槽将光电二极管和它配套的小型
电路板固定在外壳里面，从而起到遮光和
电磁屏蔽的作用。接收光装置(16)固定在右连杆(19)上，也能够跟随右连杆(19)运动。如上所述，棱镜(13)固定在棱镜固定(14)上面，左运动滑块(22)、左连接件(21)和左连杆(17)紧固在一起能够同时运动；右运动滑块(23)、右连接件(24)和右连杆(19)紧固在一起能够同时运动。
[0018] 棱镜(13)、流通池(11)、入射光源固定(15)以及入射光源(20)和接收光装置(17)相对位置不变，当机械子系统中竖直运动部分竖直运动时，机械子系统中水平运动部分同时水平运动，此时三角形光路部分也随之运动，可以使光路角度在21.5°～75.5°之间变化。如上所述，左连杆(17)和右连杆(19)通过光轴(7)和竖直运动部分连接在一起并且左连杆(17)和右连杆(19)的长度固定不变。当机械子系统中的竖直运动部分运动时，左连杆(17)和右连杆(19)上与光轴(7)相连的顶端也随之做竖直运动，而左连杆(17)和右连杆(19)长度不变就会导致左连杆(17)和右连杆(19)的另一端(即与左连杆(17)相连的左运动滑块(22)，与右连杆(19)相连的右运动滑块(23))沿着水平方向运动，进而改变由入射光源(20)、棱镜(13)和接收光装置(16)形成的三角形光路部分的入射光和接受光角度，从而实现入射光和接收光的角度同步变化。上述对称三角形光路结构只采用一个电机驱动，光源、棱镜和接收装置在竖直、水平运动分和三角形光路部分的配合下同时改变入射角和反射角，并保证光路轴心不变，本发明具有角度自动调节功能，使光路角度在21.5°～75.5°之间变化。
[0019] 如图5所示，温度控制子系统(10)由
半导体制冷器(30)、
铜管
散热片(31)、金属加热器(29)、温度传感器(33)、散热
风扇(32)和弹性压片(34)组成。半导体制冷器(30)(Thermoelectric cooler)是一种即能加热也能制冷的电子元件(工作时温差可达60-90摄氏度)，半导体制冷器(30)一面加热，另一面则制冷。需要快速散去另一面的热量。半导体制冷器(30)上侧放置金属加热器(29)，下侧放置铜管
散热片(31)，金属加热器(29)与铜管散热片(31)之间用塑料螺丝固定，金属加热器(29)与铜管散热片(31)之间使用空气
隔热；铜管散热片(31)、金属加热器(29)和半导体制冷器(30)之间
接触面光滑，且接触面涂上导热
硅脂，使半导体制冷器(30)能够快速将热量导出；金属加热器(29)内埋藏一温度传感器(33)，将当前温度信号实时传输给嵌入式控制通信系统，芯片(12)一侧放置在流通池(11)下方，另一侧放置在金属加热器(29)上，金属加热器(29)两端均固定有一弹性压片(34)，当放置上芯片(12)时弹性压片(34)压住芯片(12)的两端，使得加热温度传导均匀。铜管散热片(31)中的铜管将半导体制冷器(30)下部的热量导入铜管散热片(31)两边末端的多孔金属网，此多孔金属网靠近仪器外壳，由散热风扇(32)将多孔金属网的热量快速吹出仪器，从而快速散去铜管散热片(31)的热量。
[0020] 当芯片(12)进行PCR核酸扩增反应时，由于需要控
制芯片温度在65℃与95℃之间快速变化，在一定时间内达到更多
地热循环。散热风扇(32)全速工作，以适应散热需求。而在进行等温扩增反应时金属加热器(29)
工作温度恒定且与室温温差小，散热风扇(32)处于低功耗状态工作。同时散热风扇(32)有两个对称放置，从仪器内部吸风，将仪器内部的热量也导出至外界。仪器从底部
通风口进风，侧后方较高处出风，保证风道流遍仪器内部，发热量大的电子元件靠近风扇，以降低整体仪器温度。通风口位置的设定照顾了美观和光学检测避光的要求。
[0021] 嵌入式控制通信子系统由电机(4)、
编码器(5)、
电路板和计算机等组成。电路板通过螺钉固定在固定板(1)上，电机(4)和编码器(5)通过
联轴器和滑轨丝杆(2)连接，同时电路板、电机(4)、编码器(5)和计算机之间依靠
导线来实现信息传递。嵌入式控制通信子系统通过电路板来控制电机(4)完成机械扫描运动和液体的自动进样，温度控制子系统的温度控制，给入射光源供电，并对出射光进行光
电信号采集、处理，并把数据传输到计算机上。
[0022] 与现有技术相比较，本发明提出了一种扫描结构极大的简化了机械结构，同时由于部件少，机械之间传动部件精度高，提高了扫描精度。同时机械结构简单，易于仪器小型化，低成本化。也易于仪器升级和改装。本发明机械结构原理如图6所示，单臂原理：固定三角形斜面长度，斜边通过类似墙面上的梯子一样往下运动进行扫描，此结构将角度扫描的圆周运动转化为直线运动，这种转化方式节省体积简单高效；对称扫描将顶点作为光路的交汇点，同时顶点作为扫描的驱动点，通过较短形成的上下运动即能完成大角度的扫描运动。同时底边2个点分别固定在同一精密滑轨上。
附图说明
[0024] 图2为机械结构侧视图。
[0025] 图3为机械结构正视图。
[0026] 图4为PCR和SPR区俯视图。
[0027] 图5为温度控制子系统侧视图。
[0028] 图6为机械结构原理图，a为单臂原理，b为对称扫描。
具体实施方式
[0029] 下面将结合本发明中图1至图5，对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030] 除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
[0031] 同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。
[0032] 对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权
说明书的一部分。
[0033] 在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
[0034] 本发明可以同时进行PCR反应和SPR反应，也可以单独进行PCR或SPR。首先用户打开芯片
包装取出芯片(12)，将其正确的放置在金属加热器(29)上利用弹性压片(34)将其固定，然后将流通池(11)放在芯片(12)上面并通过螺钉将其紧固，使得流通池(11)和芯片(12)都被压紧固定。固定好流通池(11)和芯片(12)之后，点击上位机进样按钮，然后通过嵌入式控制通信子系统将含有待测DNA片段的液体
泵入PCR区和SPR区。液体进入后，一方面通过上位机下达指令通过嵌入式控制通信子系统来控制温度控制子系统(10)中的半导体制冷器(30)来升温以达到PCR反应中变性所需要的温度，待变性结束后(达到94℃后20-30s)通过铜管散热片(31)将半导体制冷器(30)的热量导出到两端的多孔金属网，然后利用散热风扇(32)迅速将热量导出以达到降温的目的，接着再通过嵌入式控制通信模块改变温度以进行PCR反应中的延伸，之后循环多次以达到将溶液中的DNA片段扩增到我们需要的浓度(这里只介绍变温PCR的温度控制方法，等温PCR等其他PCR技术可以采用相同的温度控制方法以达到目的)；另一方面，通过上位机下达指令控制嵌入式控制通信子系统的电机(4)，使其转动从而带动机械传动子系统中的竖直运动部分的滑轨丝杆(3)和滑块(2)一起做竖直运动，同时光轴固定下(6)、光轴固定上(9)、光轴(7)、轴套(8)、棱镜固定(14)、流通池(11)、芯片(12)和温度控制子系统(10)也一起做竖直运动，然后通过光轴(7)带动左连杆(17)和右连杆(19)的顶端做竖直运动，由于左连杆(17)和右连杆(19)长度不变，其下端带动左连接件(21)、左运动滑块(22)、右连接件(24)和右运动滑块(23)沿着导轨(18)做水平运动，入射光源固定(15)、入射光源(20)和接收光装置(16)也随之运动并且它们之间的相对位置不变，此时表面等离子体共振仪入射角可以从21.5°～75.5°变化，同时接受光装置(16)实时将接收到的光强信息通过嵌入式控制通信子系统传输到计算机当中，然后计算机对这些数据进行存储和处理并绘制一幅PCR扩增之前的液体的SPR曲线，然后把入射光的角度固定在SPR吸收峰附近的位置，进行SPR的光强调制检测。在PCR反应过程中可以通过SPR信号实时监测PCR产物的变化，且不需要标记。待PCR反应结束后，通过嵌入式控制通信子系统将PCR之后的液体泵入SPR区，然后通过上位机控制机械传动子系统重复上面的运动部分，并通过计算机将收集到的PCR之后的液体的SPR信息绘制一幅曲线，以此和之前没有PCR的液体SPR曲线进行对比分析，此为SPR角度调制检测信号。最后将流通池(11)和芯片(12)从装置中取出保存好，至此实验结束。
[0035] 本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分步骤可以通过
硬件来完成，也可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，上述提到的存储介质可以是只读
存储器，磁盘或光盘等。
[0036] 本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多
修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
