一种测量肉葡萄球菌表面展示EGFP荧光强度的方法
专利汇可以提供一种测量肉葡萄球菌表面展示EGFP荧光强度的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种通过液氮 研磨 破除肉葡萄球菌细胞壁的方法，进而测量溶于缓冲溶液PBS中的展示蛋白EGFP的 荧光 强度。其原理是肉葡萄球菌表面展示是由分选酶识别特异性序列LPXTG，使锚定序列与细胞壁交联桥以酰胺键的形式相连，以实现表面展示的作用。用液氮研磨破除细胞壁，融合蛋白从细胞壁上脱离，溶于缓冲溶液PBS中，用荧光分光光度计测量展示蛋白EGFP的荧光强度。，下面是一种测量肉葡萄球菌表面展示EGFP荧光强度的方法专利的具体信息内容。
1.一种用液氮研磨破壁释放具有活性的包含EGFP的嵌合体蛋白并使其溶于PBS缓冲液中，再使用荧光分光光度计测量其荧光强度，其结果可以说明成功展示在肉葡萄球菌细胞壁的蛋白具有活性，以此来观察细胞表面展示效率。其特征在于按如下步骤进行：
(1)构建锚定体系的质粒；
(2)用热激法将(1)中构建的质粒转入大肠杆菌DH5α宿主中培养；
(3)提取质粒，电转化法转入肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300宿主中培养；
(4)用正置荧光显微镜筛选正确的肉葡萄球菌转化子；
(5)培养正确表达的转化子，收集发酵液，离心，分别收集上清液和菌体；
(6)菌体放置-80℃冰箱保存，上清液可直接用荧光分光光度计测量荧光强度；
(7)将冰冻的菌体收集到研钵，用液氮将其研磨至粉末，用PBS缓冲液溶解粉末；
(8)离心，收集上清液；
(9)含有溶解蛋白的上清液稀释不同的倍数，用荧光分光光度计测量，得到一个最合适的稀释倍数，观察在不同锚定体系下表面展示蛋白的展示效率。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(1)中质粒构建方法为：以质粒pBT2-ET-EGFP为基础，合成表面展示所用的信号肽和原肽DNA序列(Signal-Pro-Peptide，SPP；或Pre-Pro-peptide)，替换原质粒的Tat信号肽。合成两种锚定DNA序列XM和Fibronectin Binding Protein(FnBPB)，并分别连接在EGFP基因之后，合成清蛋白结合蛋白Albumin-Binding Protein(ABP)基因，分别加在XM和FnBPB之前。构建成功分别含有4个不同锚定体系的质粒，测序确认开放阅读框正确。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将构建成功的4个质粒分别用热激法(化学转化法)转入大肠杆菌。取1μl质粒加入DH5α感受态，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s，再在冰上冰浴3min，将600μl LB培养基加入转化混合物中，在37℃、180rpm条件下孵育45min，取200μl孵育液涂在氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取转化子提质粒验证。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述步骤(3)中将上一步中验证成功的质粒电转进入肉葡萄球菌TM300感受态中。取5μl质粒加入感受态细胞中，在2mm间距电击杯中混匀，冰上预冷30min，使用美国BTX(ECM 399)电转仪在2500V条件下电转，加入1ml RM复苏液，在37℃、180rpm条件下孵育5h，取500μl孵育液涂在氯霉素(Cm)抗性的TSB培养基表面，
37℃过夜培养。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤(4)中挑取转化子，在37℃、180rpm条件下过夜培养，取800μl菌液离心，用PBS洗涤2次。在正置荧光显微镜下放大1000倍观察，发出绿色荧光的转化子即为正确转化子。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述步骤(5)中按10％(V/V)的接种量将正确转化子的菌液接种到发酵摇瓶中，并设置阳性阴性对照组。37℃、180rpm条件下培养20h。将发酵液放入50ml EP管中5500rpm、4℃条件下离心10min，收集上清液。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述步骤(6)中将离心后的菌体沉淀置于-80℃冰箱过夜保存，上清液可直接用于荧光分光光度计的测量。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述步骤(7)中将过夜放置的菌体收集到研钵中，将菌体用液氮研成粉末，收集约0.2g菌体粉末于5ml EP管中，加入PBS缓冲溶液4ml，使破碎后的菌体溶于缓冲液中。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述步骤(8)中将溶于PBS的菌体在4℃、
12000rpm条件下离心15min，收集上清液。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述步骤(9)中将细胞壁溶解液以原液、2倍、4倍、6倍比例稀释，使用荧光分光光度计(HITACHI F-7100)测定。测量参数设置：激发光谱
488nm，发射光谱500-600nm，激发光狭缝宽度5nm，发射光狭缝宽度10nm，FMT700。得出数据后，进行绘图比较EGFP荧光表达情况，得出最合适的稀释比例。
一种测量肉葡萄球菌表面展示EGFP荧光强度的方法
技术领域
背景技术
发明内容
图7表示本发明申请所构建的4种转化子的4倍稀释样品荧光强度
图8表示本发明申请所构建的4种转化子的6倍稀释样品荧光强度
具体实施方式
45min，孵育液全涂在Amp抗性的LB固体培养基中，37℃培养箱中过夜培养挑取转化子提质粒验证。合成的ABP序列分别插入在EGFP和XM和FnBPB之间，命名为质粒 pBT2-SPP-EGFP-ABP-XM(简称pAXM)，如图3所示和pBT2-SPP-EGFP-ABP-FnBPB(简称pAF)，如图4所示。
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