一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法及应用
专利汇可以提供一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种基于多种 信号 放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法及应用，DNA与溶菌酶适体部分互补杂交，通过溶菌酶与适体的特异性结合反应，将DNA释放出来。释放的DNA与金片上修饰的发卡DNA和助理DNA互补杂交形成“Y”型结构，在限制性内切酶的作用下，通过特异性识别位点剪切打开发卡DNA，在DNA连接酶和DNA聚合酶的作用下，以 锁 扣环状DNA为模板链，沿被打开的发卡DNA聚合生长，形成一条具有大量重复序列的单链。标记有 生物 素的信号探针与生成的重复序列杂交互补，并与HRP标记的链酶亲和素结合后催化过 氧 化氢氧化4-氯 萘 酚发生沉淀反应，从而增加了芯片表面 质量 ，实现了QCM对溶菌酶的高灵敏度检测。，下面是一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法，其特征是，该检测方法包括：将连接有磁珠载体的溶菌酶适体与主DNA部分互补杂交，通过溶菌酶与溶菌酶适体的特异性结合反应，将主DNA释放出来；主DNA与助理DNA和连接有金片的发卡DNA互补杂交形成Y型结构；在限制性核酸内切酶作用下，通过特异性识别位点剪切打开发卡DNA，并游离出完整的主DNA循环使用，完整的主DNA与其他发卡DNA和助理DNA形成模板增强杂交；在DNA连接酶和DNA聚合酶的作用下，以锁扣环状DNA为模板链，沿被打开的发卡DNA聚合生长，形成一条具有若干段重复序列的DNA单链；标记有生物素的信号探针与生成的DNA单链中的重复序列杂交互补，并与HRP标记的链酶亲和素结合后催化过氧化氢氧化4-氯萘酚发生沉淀反应，从而增加了金片表面质量，实现QCM对溶菌酶的检测；其中，
所述主DNA包括相互连接的第一段主DNA和第二段主DNA，所述第一段主DNA与部分溶菌酶适体序列互补杂交；
所述助理DNA包括相互连接的第一段助理DNA和第二段助理DNA，所述第二段助理DNA与部分第一段主DNA序列互补杂交；
所述发卡DNA中环状序列中包含限制性内切酶的特异性识别位点，部分环状序列能与第二段主DNA互补杂交，部分环状序列能与第一段助理DNA互补杂交，从而形成Y型结构。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，具体包括以下方法：
(1)磁珠的活化：
取咪唑盐酸缓冲液洗涤羧基修饰的磁珠，加入含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的咪唑缓冲液中震荡；
(2)磁珠载体的修饰：
向活化好的磁珠加入溶菌酶适体进行反应；磁分离，洗涤，加入主DNA溶液进行反应；磁分离，洗涤，加入含有溶菌酶的待测样品溶液进行反应；磁分离，取上清液；
(3)金片修饰DNA：
将发卡DNA加入到金片上进行反应，洗涤，干燥，发卡DNA固定后，将金片进行钝化；加入助理DNA、步骤(2)中的上清液和限制性核酸内切酶进行反应，洗涤、干燥；
(4)滚环复制放大反应：
将DNA连接酶、连接酶缓冲液和锁扣环状DNA混合均匀加入到步骤(3)中处理得到的金片上进行反应，洗涤，干燥；然后将DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTPs和水混合均匀后加入到金片上进行反应，洗涤，干燥；
(5)HRP修饰：
将生物素修饰的探针加入到步骤(4)中处理得到的金片进行反应，洗涤，干燥；然后加入链霉亲和素修饰的HRP进行反应；
(6)QCM检测：
向步骤(5)中处理得到的金片加入H2O2和四氯萘酚的混合液，通过石英晶体微天平实时检测频率变化值。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征是，步骤(1)中，加入含有EDC的咪唑缓冲液中反应时间为2h；
优选的，磁珠活化的具体步骤为：取咪唑盐酸缓冲液洗涤羧基修饰的磁珠若干次，加入
100μL含有EDC的咪唑缓冲液中，37℃下振荡2h；其中，所述咪唑盐酸缓冲液的浓度为0.1M，pH6.8。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征是，步骤(2)中，向活化好的磁珠加入溶菌酶适体后，反应16h；
加入主DNA溶液后反应时间为1h；
加入含有溶菌酶的待测样品溶液的反应时间为1h；
优选的，磁珠载体的修饰的具体步骤为：向活化好的磁珠加入溶菌酶适体，37℃下反应
16h；磁分离，Tris-HCl洗涤，加入主DNA溶液，温育1h；磁分离，Tris-HCl洗涤，再加入含有溶菌酶的待测样品溶液，37℃下振荡1h；磁分离，取上清液保存，备用。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征是，步骤(3)中，发卡DNA与金片结合的反应时间为16h；
加入助理DNA、步骤(2)中的上清液和限制性核酸内切酶进行反应的时间为1.5h；
具体步骤为：发卡DNA加入到金片上，37℃下静置16h，Tris-HCl和超纯水分别洗涤3次，氮气吹干；发卡DNA固定后，向金片上加入1％牛血清白蛋白钝化2h；加入助理DNA、步骤(2)中的上清液和限制性核酸内切酶，37℃下静置1.5h，Tris-HCl和超纯水分别洗涤若干次，氮气吹干。
6.如权利要求2所述的检测方法，其特征是，步骤(4)中，DNA连接酶和锁扣环状DNA反应时间为1h；
将DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTPs和水混合均匀后加入到金片上进行反应时间为2h；
具体步骤为：将DNA连接酶、连接酶缓冲液和锁扣探针混合均匀滴加在步骤(3)中处理得到的金片上，37℃下静置1h，Tris-HCl和超纯水分别洗涤3次，氮气吹干；将DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTPs和超纯水混合均匀后滴加到金片表面，37℃下静置2h，Tris-HCl和超纯水分别洗涤3次，氮气吹干。
7.如权利要求2所述的检测方法，其特征是，步骤(5)中，将生物素修饰的探针加入到步骤(4)中处理得到的金片进行反应时间为1h；
加入链霉亲和素修饰的HRP进行反应的时间为0.5h；
具体步骤为：将生物素修饰的探针滴加到金片表面，37℃下静置1h，Tris-HCl和超纯水分别洗涤3次，氮气吹干；之后加入链霉亲和素修饰的HRP，37℃下静置0.5h。
8.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征是，所述溶菌酶适体序列为5’-TTTT ATC TAC GAA TTC ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-NH2-3’；
所述主DNA的序列为5’-ATG AAT TCG TAG ATC CGT TCG AC-3’；
所述助理DNA序列为5’-CCT CAG CAA AAT CTA CGA ATT CAT-3’；
所述发卡DNA序列为5’-SH-TTTTTT CTG TGT CCG TAT TTA GAG GGT CGA ACGGTG CTG AGG TAC GGA CAC AG-3’。
9.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征是，所述锁扣环状DNA的序列为5’-PO4-GAC CCT CTA AAA CCC AAC CCG CCC TAC CCA AAA CCC AAC CCG CCC TAC CCA AAA CCC AAC CCG CCC TAC CCA AGC ACC GTT C-3’；
所述生物素修饰的探针序列为5’-biotin-TTTTTT CCC AAC CCG CCC TAC C-3’。
10.采用权利要求1～9中任一项所述的基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法的检测试剂盒，其特征是，其包括：
连接有磁珠载体的溶菌酶适体、主DNA、助理DNA、连接有金片的发卡DNA、核酸内切酶；
滚环复制放大反应体系：包括用于滚环复制放大的锁扣环状DNA、DNA连接酶、DNA聚合酶和扩增原料dNTPs。
一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的QCM检测方法及
应用
技术领域
背景技术
发明内容
具体实施方式
Tris-HCl洗涤，再加入30μL不同浓度(1.0×10 mol/L、1.0×10 mol/L、1.0×10 mol/L、
1.0×10-12mol/L、1.0×10-11mol/L)的溶菌酶，37℃孵育1h，磁分离，取上清液保存，备用。
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