检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用
专利汇可以提供检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种差分脉冲 伏安法 检测循环 肿瘤 细胞的 传感器 。该传感器的制备,包括以下步骤：按照现有方法制备出五 氧 化二 钒 纳米线 ，金 银 核壳 纳米粒子 ；将五氧化二钒纳米线-金银 核壳纳米粒子 结合修饰适配体；将金纳米粒子修饰于 电极 表面，后连接硫醇化的适配体，特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体；将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测；利用电化学工作站检测。本发明的传感器特异性强，灵敏度高，操作简单， 检测限 低。，下面是检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用专利的具体信息内容。
1.一种检测循环肿瘤细胞的电化学传感器的制备方法，其包括以下步骤：
首先，按照现有方法制备出五氧化二钒纳米线，金银核壳纳米粒子；
然后，将五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体，先由0.1 M的氢氧化钠调整五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的pH至9，后加入50 μL的5 μM硫醇化适配体，混合溶液在4 °C条件下磁搅拌12 h，后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，弃去上层清液，将
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沉淀溶解于含有1 mM Ca ，1 mM Mn 和0.1 %牛血清白蛋白的孵化缓冲液中，4 °C下放置备用；
最后，将清洗好的玻碳电极插入2mL 1 mM的氯金酸，在-0.2 V电压下电沉积40 s，修饰上金纳米粒子，磷酸盐缓冲溶液冲洗，晾干备用，后连接硫醇化的适配体，由6-巯基-1-己醇封装位点，接着特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体。
2.上述传感器的应用方法是：将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测。
3.根据权利要求1所述，五氧化二钒纳米线的制备特征是，将水溶性的硫酸氧钒与氧化剂溴酸钾在室温下混合，磁搅拌反应30 min，后通过硝酸降低酸度，将混合物水溶液在高压釜中于180 ℃反应24 h，取出高压釜冷却至室温，二次水多次冲洗得深黄色沉淀，沉淀在
80 ℃烘箱中烘干备用。
4.根据权利要求1所述，金纳米粒子储备液的制备特征是，将1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL二次水，置于100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL 1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软粉色，溶液经过离心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金纳米粒子储备液。
5.根据权利要求1所述，金银核壳纳米粒子的制备特征是，将7 mL制备的金纳米粒子储备液与0.65 mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合磁搅拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β-环糊精和1.5 mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁搅拌几分钟混匀；加入氢氧化钠溶液孵化10 min调整pH至10，将混合溶液85 °C水浴；后连续磁搅拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸银溶液，滴加过程中，溶液逐渐由粉色变为亮黄色，得到金银核壳纳米粒子。
6.根据权利要求1所述，五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的制备特征是，将制备的五氧化二钒纳米线取10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二烯二甲基胺溶液，超声30 min，离心水洗4次，后加入制备的金银核壳纳米粒子0.5 mL，磁搅拌1 h，沉淀离心水洗多次至颜色不变，最后获得五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子。
检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器的制备及应用
技术领域
背景技术
发明内容
（2）将五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体；
（3）将金纳米粒子修饰于电极表面，后连接硫醇化的适配体，特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体；
（4）将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测。
（2）金纳米粒子储备液的制备：其特征是将1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL二次水，置于100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL
1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软粉色，溶液经过离心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金纳米粒子储备液；
（3）金银核壳纳米粒子的制备：其特征是将7 mL（2）制备的金纳米粒子储备液与0.65 mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合，磁搅拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β-环糊精和
1.5 mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁搅拌几分钟混匀。加入氢氧化钠溶液孵化10 min调整pH至10，将混合溶液85 °C水浴。后连续磁搅拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸银溶液，滴加过程中，溶液逐渐由粉色变为亮黄色，得到金银核壳纳米粒子；
（4）五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的制备：其特征是将（1）制备的五氧化二钒纳米线取10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二烯二甲基胺溶液，超声30 min，离心水洗4次，后加入（3）制备的金银核壳纳米粒子0.5 mL，磁搅拌1 h，沉淀离心水洗多次至颜色不变，最后获得五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子；
（5）制备五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体：其特征是先由0.1 M的氢氧化钠调整五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的pH至9，后加入50 μL的5 μM硫醇化适配体，混合溶液在4 °C条件下磁搅拌12 h，后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，弃去上层清
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液，将沉淀溶解于含有1 mM Ca ，1 mM Mn 和0.1 %牛血清白蛋白的孵化缓冲液中，4 °C下放置备用；
（6）玻碳电极的修饰：其特征是将清洗好的玻碳电极插入2mL 1 mM的氯金酸，在-0.2 V电压下电沉积40 s，修饰上金纳米粒子，磷酸盐缓冲溶液冲洗，晾干备用；
（7）将（6）修饰好的玻碳电极连接硫醇化的适配体，其特征是由6-巯基-1-己醇封装位点，接着捕获循环肿瘤细胞，连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体，电极插入包含25 μM硫堇的0.01 M磷酸盐缓冲溶液中，通过差分脉冲伏安法检测还原电流得到结果。
（2）利用生物活性稳定、催化性质良好的五氧化二钒作为催化剂，并且五氧化二钒可以在双氧水存在的条件下催化染料小分子，产生还原电流；
（3）金银核壳纳米粒子具有高导电性，同时放大了还原电流，起到放大信号作用。
附图说明
具体实施方式
（2）将五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体；
（3）将金纳米粒子修饰于电极表面，后连接硫醇化的适配体，特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体；
（4）将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测。
（2）金纳米粒子储备液的制备：其特征是将1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL二次水，置于100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL
1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软粉色，溶液经过离心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金纳米粒子储备液；
（3）金银核壳纳米粒子的制备：其特征是将7 mL（2）制备的金纳米粒子储备液与0.65 mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合，磁搅拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β-环糊精和
1.5 mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁搅拌几分钟混匀。加入氢氧化钠溶液孵化10 min调整pH至10，将混合溶液85 °C水浴。后连续磁搅拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸银溶液，滴加过程中，溶液逐渐由粉色变为亮黄色，得到金银核壳纳米粒子；
（4）五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的制备：其特征是将（1）制备的五氧化二钒纳米线取10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二烯二甲基胺溶液，超声30 min，离心水洗4次，后加入（3）制备的金银核壳纳米粒子0.5 mL，磁搅拌1 h，沉淀离心水洗多次至颜色不变，最后获得五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子；
（5）制备五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体：其特征是先由0.1 M的氢氧化钠调整五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的pH至9，后加入50 μL的5 μM硫醇化适配体，混合溶液在4 °C条件下磁搅拌12 h，后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，弃去上层清
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液，将沉淀溶解于含有1 mM Ca ，1 mM Mn 和0.1 %牛血清白蛋白的孵化缓冲液中，4 °C下放置备用；
（6）玻碳电极的修饰：其特征是将清洗好的玻碳电极插入2mL 1 mM的氯金酸，在-0.2 V电压下电沉积40 s，修饰上金纳米粒子，磷酸盐缓冲溶液冲洗，晾干备用；
（7）将（6）修饰好的玻碳电极连接硫醇化的适配体，由6-巯基-1-己醇封装位点，接着捕获循环肿瘤细胞，连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体，电极插入包含25 μM硫堇的0.01 M磷酸盐缓冲溶液中，通过差分脉冲伏安法检测还原电流得到结果。
（2）五氧化二钒纳米线的制备：将水溶性的硫酸氧钒与氧化剂溴酸钾在室温下混合，磁搅拌反应30 min，后通过硝酸降低酸度，将混合物水溶液在高压釜中以180 ℃反应24 h，取出高压釜冷却至室温，二次水多次冲洗得深黄色沉淀，将沉淀在80 ℃烘箱中烘干备用；
（3）金纳米粒子储备液的制备：1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL二次水，置于
100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL 1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软粉色，溶液经过离心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金纳米粒子储备液；
（4）金银核壳纳米粒子的制备：将7 mL（2）制备的金纳米粒子储备液与0.65 mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合，磁搅拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β-环糊精和1.5 mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁搅拌几分钟混匀。加入氢氧化钠溶液孵化10 min调整pH至10，将混合溶液85 °C水浴。后连续磁搅拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸银溶液，滴加过程中，溶液逐渐由粉色变为亮黄色，得到金银核壳纳米粒子；
（5）五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的制备：将（1）制备的五氧化二钒纳米线取
10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二烯二甲基胺溶液，超声30 min，离心水洗
4次，后加入（3）制备的金银核壳纳米粒子0.5 mL，磁搅拌1 h，沉淀离心水洗多次至颜色不变，最后获得五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子；
（6）制备五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体：先由0.1 M的氢氧化钠调整五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的pH至9，后加入50 μL的5 μM硫醇化的SYL3C适配体，混合溶液在4 °C条件下磁搅拌12 h，后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，弃去上
2+ 2+
层清液，将沉淀溶解于含有1 mM Ca ，1 mM Mn 和0.1 %牛血清白蛋白的孵化缓冲液中，4 °C下放置备用；
（7）玻碳电极的修饰：清洗好的玻碳电极插入2mL 1 mM的氯金酸，在-0.2 V电压下电沉积40 s，修饰上金纳米粒子，磷酸盐缓冲溶液冲洗，晾干备用；
（8）将（7）修饰好的玻碳电极连接硫醇化的适配体，由6-巯基-1-己醇封装位点，接着捕获MCF-7细胞，连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的SYL3C适配体，电极插入包含25 μM硫堇的0.01 M磷酸盐缓冲溶液中，通过差分脉冲伏安法检测还原电流得到结果。
（2）五氧化二钒纳米线的制备：将水溶性的硫酸氧钒与氧化剂溴酸钾在室温下混合，磁搅拌反应30 min，后通过硝酸降低酸度，将混合物水溶液在高压釜中以180 ℃反应24 h，取出高压釜冷却至室温，二次水多次冲洗得深黄色沉淀，将沉淀在80 ℃烘箱中烘干备用；
（3）金纳米粒子储备液的制备：1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL二次水，置于
100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL 1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软粉色，溶液经过离心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金纳米粒子储备液；
（4）金银核壳纳米粒子的制备：将7 mL（2）制备的金纳米粒子储备液与0.65 mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合，磁搅拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β-环糊精和1.5 mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁搅拌几分钟混匀。加入氢氧化钠溶液孵化10 min调整pH至10，将混合溶液85 °C水浴。后连续磁搅拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸银溶液，滴加过程中，溶液逐渐由粉色变为亮黄色，得到金银核壳纳米粒子；
（5）五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的制备：将（1）制备的五氧化二钒纳米线取
10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二烯二甲基胺溶液，超声30 min，离心水洗
4次，后加入（3）制备的金银核壳纳米粒子0.5 mL，磁搅拌1 h，沉淀离心水洗多次至颜色不变，最后获得五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子；
（6）制备五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体：先由0.1 M的氢氧化钠调整五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的pH至9，后加入50 μL的5 μM硫醇化的SYL3C适配体，混合溶液在4 °C条件下磁搅拌12 h，后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，弃去上
2+ 2+
层清液，将沉淀溶解于含有1 mM Ca ，1 mM Mn 和0.1 %牛血清白蛋白的孵化缓冲液中，4 °C下放置备用；
（7）玻碳电极的修饰：清洗好的玻碳电极插入2mL 1 mM的氯金酸，在-0.2 V电压下电沉积40 s，修饰上金纳米粒子，磷酸盐缓冲溶液冲洗，晾干备用；
（8）将（7）修饰好的玻碳电极连接硫醇化的适配体，由6-巯基-1-己醇（MCH）封装位点，接着捕获T47D细胞，连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的SYL3C适配体，电极插入包含25 μM硫堇的0.01 M磷酸盐缓冲溶液中，通过差分脉冲伏安法检测还原电流得到结果。
10 cells·mL ，检测限为40 cells·mL 。
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