技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术及分析化学领域，具体涉及一种应用全自动在线固相萃取-液相色谱-
串联质谱技术(on-line SPE-LC-MS/MS)快速准确检测植物样品中褪黑素含量的方法。
背景技术
[0002] 褪黑素(Melatonin，MLT)又名N-乙酰基-5-甲
氧基色胺，是一种吲哚色胺类
激素，最早发现于
牛的松果体中，随后发现其在人体、动物、
微生物、植物中广泛存在，并发挥着重要的激素调节功能。在动物和人体内，褪黑素能够维持生理节奏活动的昼夜节律，有利于睡眠；同时还具有增加
机体免疫功能、抗衰老、抑制
肿瘤细胞生长、缓解精神压
力的作用。在高等植物体内，褪黑素不但参与调控
种子萌发、根系生长、
叶片衰老、开花及果实成熟等重要的生长发育过程，而且参与植物对重金属、盐、低温、高温、干旱、病菌等生物和
非生物胁迫的响应和调控。由于其广泛而重要的生理功能，褪黑素正逐渐被广泛定义为一种新的激素类化合物，越来越多的农业和植物领域科学家开始关注植物褪黑素的研究。
[0003] 褪黑素是一种色胺类小分子化合物，在植物体内以低浓度来调节植物的生理活动，其性质不稳定并且容易受到植物基质中其他次生代谢产物的干扰。因此准确定量分析植物体内的褪黑素含量对于阐明其合成代谢途径及重要生理功能具有非常重要的意义。
[0004] 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术具有灵敏度高、重现性好等优点，是目前复杂基质中痕量化合物分析检测的有效手段，也是目前检测分析褪黑素方法的主流技术。然而，现有的植物材料内源褪黑素的定量分析方法中，样品前处理的方法均为离线人工多步骤处理。如Rita Paroni等人(Journal of Food Composition and Analysis，2019)检测杏仁和开心果中褪黑素时，采用5、2.5、2.5mL的
乙醇分三次进行提取，每次提取时分别涡旋3min，离心5min后，上清液在-80度静置30min，再用
滤纸过滤后再进行SPE柱富集纯化。此方法存在操作复杂、，耗费时间长和重复性差等的问题。Melanie Stürtz等人(Food Chemistry，2011)采用10mL的乙腈检测对10-15g草莓样品超声中的提取褪黑素，此方法存在
有机溶剂试剂消耗量大和样品材料量大等问题。总之，多步骤离线的样品前处理的方法存在操作繁琐复杂，耗费时间长，
净化效率低，消耗大量
有机溶剂等问题，而且离线操作人为影响因素较大，容易引入误差和污染。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种植物样品中内源褪黑素的定量检测方法，所述方法具有快速、准确、高通量和高灵敏度的特点。
[0006] 本发明所提供的植物样品中内源褪黑素的定量检测方法，包括：
[0007] 步骤(1)待检测样品的制备；
[0008] 步骤(2)采用全自动在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术对待检测样品进行检测；
[0009] 步骤(3)根据检测得到的所述待检测样品中植物褪黑素和所述褪黑素稳定同位素内标的峰面积值，计算植物样品中内源性褪黑素的含量。
[0010] 步骤(1)待检测样品的制备采用包括以下步骤的方法：对植物样品进行预处理，得到处理后的溶解液，即待检测样品；
[0011] 所述植物样品包括富含和/或不富含油脂的植物组织材料；
[0012] 所述植物样品为不富含油脂的植物组织材料，所述预处理为处理a：将所述植物组织材料在液氮中
研磨成粉末，准确称取样品量，加入提取试剂和褪黑素稳定同位素内标，混匀，进行提取，离心，收集上清液，吹干，用复溶溶剂溶解已吹干的样品，得到处理后的溶解液，即待检测样品；
[0013] 所述植物样品为富含油脂的植物组织材料，所述预处理为处理b：将所述植物组织材料在液氮中研磨成粉末，准确称取样品量，加入提取试剂和褪黑素稳定同位素内标，混匀，进行提取，离心，收集上清液，吹干，用复溶溶剂溶解已吹干的样品，离心，吸取
中间层不含油脂的部分，得到处理后的溶解液，即待检测样品；
[0014] 其中，所述植物样品可为拟南芥、
水稻、油菜、玉米、番茄、烟叶、豆类等多种植物的根、茎、叶、花、花粉、果实、种子等组织，具体可为水稻叶片、黄豆果实或玉米籽粒；
[0015] 所述提取试剂为可以溶解植物褪黑素的试剂，由于褪黑素具有亲脂性，易溶于有机溶剂，所述提取试剂可为乙酸乙酯或甲醇等有机试剂，也可为甲醇与水的
混合液，优选乙酸乙酯作为提取试剂。
[0016] 所述褪黑素稳定同位素内标可通过以下任意一种方法制备得到：
[0017] 1)将植物褪黑素中部分或全部的
碳原子替换为12C的同位素(如13C)；
[0018] 2)将植物褪黑素中部分或全部的氮原子替换为14N的同位素(如15N)；
[0019] 3)将植物褪黑素中部分或全部的氢原子替换为1H的同位素(如2H)；
[0020] 4)将植物褪黑素中部分或全部的氧原子替换为16O的同位素(如18O)。
[0021] 具体地，所述褪黑素稳定同位素内标为将褪黑素中4个氢原子替换为2H制得，即2H4-MLT，其结构式如下所示：
[0022]
[0023] 具体可为加拿大C/D/N ISOTopes公司的产品；
[0024] 所述植物组织材料的用量可为10-500mg，具体可为100mg，其与提取试剂的用量比例可为100mg：(0.5-5)mL，具体可为100mg：1mL。
[0025] 所述褪黑素稳定同位素内标的加入量计为S0，其与所述植物组织材料的配比可为：50-500pg：100mg，具体可为100pg：100mg。
[0026] 所述提取步骤中，提取方法可为超声、震荡、离心、低温过夜提取等常规方法，具体可为在低温(如0或4℃)条件下进行超声，超声时间大于10min，具体可为30-120min,更具体可为60min。
[0027] 所述离心的条件具体可为：在4℃下15000rpm的转速离心15min；
[0028] 所述复溶溶剂既要很好溶解目标化合物，又要兼容在线固相萃取的设计方案，可为不同比例的甲醇和水的混合溶剂，具体可为体积比为1：4的甲醇和水的混合溶剂，所述复溶溶剂与植物组织材料的配比可为(50-300)μL:100mg，具体可为200μL:100mg。
[0029] 步骤(2)采用全自动在线SPE-LC-MS/MS系统通过全自动在线固相萃取-液相色谱-串联质谱技术对待检测样品进行检测，
[0030] 其中，所述在线SPE-LC-MS/MS系统具体为：SymbiosisTMPharma在线固相萃取-液相色谱系统(荷兰Spark Holland公司)串联Qtrap 5500三重四级杆线性
离子阱混合模式质谱系统(美国AB SCIEX)，以及与其原理和使用相似的在线SPE系统也均适用于本发明。
[0031] 所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在线固相萃取的条件如下：
[0032] 采用反相材料的SPE小柱，具体可为C18填料的小柱，更具体可为HysphereTM C18HD SPE柱；
[0033] 所述在线SPE的处理过程包括活化、平衡、上样、淋洗、洗脱、再生小柱，其参数见下表：
[0034]
[0035] 所述在线SPE-LC-MS/MS系统中色谱条件如下：
[0036] 采用的色谱柱为C18填料的反相基质分析柱，具体可为XBridgeTM BEH C18柱，3.0mm×75mm，3.5μm，柱温为30℃；
[0037] 流动相由A、B组成，其中A为体积分数0.05％的乙酸水溶液，B为体积分数0.05％的乙酸乙腈溶液，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱流程具体如下表：
[0038]
[0039] 所述在线SPE-LC-MS/MS中质谱参数如下：
[0040] 电离方式：ESI源正离子模式；扫描方式：MRM；
[0041] 离子源参数：气帘气(CUR)，20-30psi；源温(TEM)，450-600℃；雾化气(GS1)，40-50psi；去溶剂气(GS2)，45-55psi；
裂解气(CAD)，6-8psi；喷雾
电压(IS)，4500-5500V。
[0042] 步骤(3)的操作为：将检测得到的所述待检测样品中的植物褪黑素和所述褪黑素稳定同位素内标的峰面积值分别记为S1和S2，所称取的植物样品量为W；根据公式1计算所述植物样品中植物内源性褪黑素的含量：
[0043] 植物样品中褪黑素的含量＝(S0×S1)/(S2×W)(公式1)；
[0044] 其中，S0为加入的褪黑素稳定同位素内标的量。
[0045] 本发明是基于全自动在线SPE-LC-MS/MS技术建立的一种全自动在线检测植物样品中褪黑素的方法，具有快速、准确、通量高、灵敏度高等特点，同时使用的有机溶剂更少，不但降低了成本而且该方法更加绿色和环保。
[0046] 本发明建立了一种全自动的在线纯化、分离、分析的褪黑素定量分析方法，该方法能够实现对植物样品中褪黑素的准确定量分析，所用的C18小柱能够重复利用，大大降低了样品处理的时间和成本。本发明的自动化程度高，降低了样品的损失，提高了样品利用率，并且在很大程度上解决了人为操作带来的污染和误差等问题，同时全自动在线SPE串联三重四级杆线性离子阱混合模式质谱技术具有高灵敏度和高选择性的优势。
附图说明
[0047] 图1为褪黑素标准品及其稳定同位素内标(2H4-MLT)的MRM色谱图，其中a为褪黑素标准品的MRM色谱图，b为褪黑素稳定同位素内标(2H4-MLT)的MRM色谱图。
[0048] 图2为水稻叶片样品中褪黑素定量分析的MRM检测色谱图。
[0049] 图3为黄豆样品中褪黑素的MRM检测色谱图。
[0050] 图4为新鲜玉米籽粒样品中褪黑素的MRM检测色谱图。
具体实施方式
[0051] 下面通过具体
实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0052] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053] 下述实施例中所采用的在线SPE-LC-MS/MS系统为：SymbiosisTMPharma在线固相萃取-液相色谱系统(荷兰Spark Holland公司)串联Qtrap 5500三重四级杆线性离子阱混合模式质谱系统(美国AB SCIEX)。
[0054] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0055] 实施例1、水稻叶片样品中褪黑素的测定
[0056] 1)褪黑素的提取：
[0057] 将日本晴背景的野生型水稻新鲜的叶片组织材料在液氮中研磨成粉末，准确称取100mg样品，加入1mL乙酸乙酯试剂与100pg褪黑素稳定同位素内标2H4-MLT，混匀，进行
冰水超声提取1h，在4℃的条件下15000rpm的转速离心15min，收集上清液，用氮气吹干，用200μL的复溶溶剂20％(v/v)甲醇/水溶解已吹干的样品，0.2μm滤
膜过滤，过滤后的溶解液注入全自动在线SPE-LC-MS/MS系统进行检测。
[0058] 2)褪黑素的在线SPE处理：
[0059] 所述在线SPE的处理过程包括活化、平衡、上样、淋洗、洗脱、再生小柱，其参数见下表：
[0060]
[0061] 注：为了保证再生效率，实际实验中我们设了2步再生，中间有时间间隔。
[0062] 3)液相方法及质谱条件：
[0063] 液相方法条件为：色谱柱为Waters公司XBridgeTM BEH C18，3.0mm×75mm，3.5μm，柱温30℃；流动相由A、B组成，其中A为体积分数0.05％的乙酸水溶液，B为体积分数0.05％的乙酸乙腈溶液，洗脱方式为梯度洗脱，具体如下表：
[0064]
[0065]
[0066] 质谱条件为：在ESI源正离子模式下使用多重反应监测(MRM)模式检测[0067] 离子源参数：气帘气(CUR)，20-30psi；源温(TEM)，450-600℃；雾化气(GS1)，40-50psi；去溶剂气(GS2)，45-55psi；裂解气(CAD)，6-8psi；喷雾电压(IS)，4500-5500V。
[0068] 褪黑素的MRM通道为233.1/130.1和233.1/159.1，去簇电压(DP)，35V，碰撞
能量(CE)分别为36V和61V。
[0069] 褪黑素稳定同位素内标2H4-MLT的MRM通道为237.1/134.1和237.1/163.1，去簇电压(DP)，35V，碰撞能量(CE)分别为36V和61V。
[0070] 4)褪黑素含量的计算
[0071] 实验结束后分析计算得到的MLT的峰面积S1，2H4-MLT的峰面积S2，根据公式1计算日本晴水稻叶片中MLT的含量为0.50±0.03ng/g。(全程耗费时间包括提取，在1.5-2.0小时左右)
[0072] 实施例2、方法学考察
[0073] 按照实施例1的步骤进行操作，进行该方法的方法学考察。
[0074] 将日本晴背景的野生型水稻新鲜的叶片组织材料在液氮中研磨成粉末，准确称取6份100mg样品，加入1mL的乙酸乙酯试剂，随后分别依次加入30pg、60pg、100pg、500pg、1ng、
3ng褪黑素稳定同位素内标2H4-MLT。其余步骤按照实施例1的步骤进行操作，进行该方法的方法学考察。
[0075] 结果出呈现良好的线性关系，标准曲线方程为y＝107.92x-3038.1，线性回归方程的相关系数平方(R2)为0.999；该方法对MLT的
检测限LOD(S/N＝3)为0.05ng/mL，定量限LOQ(S/N＝10)为0.25ng/mL。将不经过SPE处理的MLT标准品的峰面积记为P1，经过SPE处理后的同浓度MLT标准品的峰面积记为P2，根据公式2进行该方法的回收率计算：回收率＝P1/P2(公式2)，计算出回收率接近95％。将加入同等浓度的内标的植物样品的处理液的2H4-MLT峰面积记为P3，根据公式3进行该方法的基质效应的计算：基质效应＝P3/P2(公式3)，计算基质效应为67％。基质效应是指样品中干扰实验结果准确性的组分，不同的样品其基质效应是不同的，本实施例采用的水稻叶片由于含有较多的基质，所以基质影响较大。具体方法学考察参数如下表：
[0076]
[0077] 实施例3、黄豆样品中褪黑素的测定
[0078] 本实施例采用的食用黄豆是从当地超市购买得到的干燥的黄豆，将其在液氮中研磨成粉末，准确称取100mg样品量，加入1mL的乙酸乙酯试剂，随后加入500pg的褪黑素稳定同位素内标2H4-MLT混匀，进行冰水超声提取1h，在4℃的条件下15000rpm的转速离心15min，收集上清液，用氮气吹干，用20％(v/v)甲醇/水150μL溶解已吹干的样品，20000rpm的转速离心15min以使样品中的油脂与溶剂分离，吸取中间的澄清液，0.2μm滤膜过滤，过滤后的溶解液注入全自动在线SPE-LC-MS/MS系统进行检测。其余条件按照实施例1操作。根据公式1计算出干燥黄豆中褪黑素的含量为93.15±2.68ng/g。
[0079] 实施例4、新鲜玉米籽粒样品中褪黑素的测定
[0080] 本实施例采用的鲜玉米籽粒是从当地超市购买得到的，在液氮的环境中研磨成粉末，准确称取100mg样品量，加入1mL的乙酸乙酯试剂，随后加入500pg的褪黑素稳定同位素内标2H4-MLT混匀，进行冰水超声提取1h，15000rpm的转速离心15min，收集上清液，用氮气吹干，用20％(v/v)甲醇/水150μL溶解已吹干的样品，0.2μm滤膜过滤，过滤后的溶解液注入全自动在线SPE-LC-MS/MS系统进行检测。其余条件按照实施例1操作。根据公式1计算出鲜玉米籽粒中褪黑素的含量为1.34±0.05ng/g。
