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用于分析细胞的方法和装置

阅读：691发布：2023-12-13

专利汇可以提供用于分析细胞的方法和装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种用于分析细胞的方法，其中，将细胞分离，使分离的细胞通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域，其中针对通过测量区域的至少一个分离细胞，生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的时间序列，通过处理单元针对强度图案序列的至少一部分计算每两个空间强度图案的光流，并且对计算出的光流进行评估。此外，本发明还涉及用于分析细胞的装置，其包含细胞分离装置、空间分辨辐射强度测量单元和处理单元，该处理单元用于计算所生成强度图案中的每两个强度图案的光流，并且对计算出的光流进行评估。，下面是用于分析细胞的方法和装置专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于分析细胞的方法，其中
a)借助细胞分离单元分离细胞；
b)使分离的细胞通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域，其中针对通过测量区域的分离的细胞中的至少一个，生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列；
c)借助处理单元针对强度图案的时间序列的至少一部分，计算每两个空间强度图案的光流；并且
d)对计算出的光流进行评估。
2.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，
-在步骤d)中对计算出的光流的评估由处理单元或用于对计算出的光流进行评估的附加单元执行，或者，
-在步骤d)中对计算出的光流的评估部分地由处理单元执行并且部分地由用于对计算出的光流进行评估的附加单元执行。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤d)中对光流的评估中确定细胞的至少一种性质，所述至少一种性质优选选自细胞的形状、细胞尺寸、细胞体积、细胞类型、形态、细胞的形变及其组合。
4.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在步骤b)中生成强度图案的时间序列时，用电磁辐射照射至少一个细胞，其中所述照射优选地由天然辐射源和/或人工辐射源进行，其中所述人工辐射源特别选自相干辐射源、部分相干辐射源、非相干辐射源、点状辐射源、平面辐射源及其组合。
5.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在步骤b)中生成空间强度图案的时间序列时，针对每个细胞生成如此多的强度图案，使得在待评估的光流中出现的不连续尽可能少。
6.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述至少一种性质根据通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域的多个细胞来确定，所述多个细胞优选是所有细胞，并且在步骤d)之后借助于细胞分选器基于所述至少一种性质的差异将细胞分成至少两组，所述细胞分选器优选是可控门。
7.一种用于分析细胞的装置，包括：
-至少一个细胞分离单元；
-至少一个空间分辨辐射强度测量单元，其配置为使得其能够生成由分离的细胞在通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域时发出的电磁辐射的强度图案的时间序列；以及-处理单元，用于计算所生成强度图案中的每两个强度图案的光流并且对计算出的光流进行评估。
8.根据前述权利要求所述的装置，其特征在于，所述装置包括对计算出的光流进行评估的附加单元。
9.根据权利要求7或8之一所述的装置，其特征在于，所述装置包括辐射源，所述辐射源优选地选自相干辐射源、部分相干辐射源、非相干辐射源、点状辐射源、平面辐射源及其组合。
10.根据权利要求7到9之一所述的装置，其特征在于，所述空间分辨辐射强度测量单元具有优选地包括光电二极管、CCD 传感器和/或摄像机的电子元件的几何布置。
11.根据权利要求7到10之一所述的装置，其特征在于，所述装置包括将细胞成像在空间分辨辐射强度测量单元上的系统。
12.根据权利要求7到11之一所述的装置，其特征在于，所述空间分辨辐射强度测量单元和处理单元布置在共同的半导体芯片上，其中优选地，在该共同的半导体芯片上还布置有辐射源和/或用于对计算出的光流进行评估的附加单元。
13.根据权利要求7到12之一所述的装置，其特征在于，所述细胞分离单元是微通道，优选是微流体通道。
14.根据权利要求7到13之一所述的装置，其特征在于，所述装置包括细胞分选器，优选是可控门。
15.根据权利要求1到6之一所述的方法，其特征在于，所述方法利用根据权利要求7至
14之一所述的装置来执行。

说明书全文

用于分析细胞的方法和装置

[0001] 本发明涉及一种用于分析细胞的方法，其中，将细胞分离，使分离的细胞通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域，其中针对通过测量区域的分离细胞中的至少一个，生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列，借助处理单元针对强度图案序列的至少一部分计算每两个空间强度图案的光流，并且对计算出的光流进行评估。此外，本发明还涉及一种用于分析细胞的装置，其包括细胞分离装置、空间分辨辐射强度测量单元和用于计算所生成强度图案中的每两个强度图案的光流以及对计算出的光流进行评估的处理单元。

[0002] 细胞术是一种广泛用于医学和生物技术的方法，其用于检测细胞及其性质。应用范围包括细胞计数、各种细胞类型的检测和固有细胞参数分析，例如单个细胞的机械特性或DNA含量测量。如今，这些方法的结果是医学诊断中不可或缺的部分，也是靶向治疗方法的基础(主要用于：白血病、识别肿瘤转移)。

[0003] 不同的技术大致可分为两类。所谓的图像细胞计(图像细胞仪)使用视频显微镜设置来分析细胞样本。这里通过图像处理来分析细胞的各种参数。该方法特别适用于粘附细胞，因为它们在测量期间不移动。通过使细胞在微流体通道中通过测量单元，在流式细胞术中避免了悬浮细胞布置的问题。这是在研究和诊断中最广泛使用的方法，并根据所使用的检测方法的类型细分为其他子区域。

[0004] 流式细胞术的标准方法基于对细胞上的散射激光的检测和分析。这里检测和分析前向散射光(用于尺寸确定)和侧向散射光(形态特征)。为了获得更高的特异性，在该方法中能够用荧光染料标记细胞。由此，还能够区分彼此仅在视觉上略微不同但仍然具有不同生物化学特性的细胞。

[0005] 最近一种流式细胞术的方法来自Lincoln(B.Lincoln等人，Cytometry Part A 2004,59A，203-209)，并且在技术上已经由例如von Jochen Guck(O.Otto等人,Nature Methods 2015,12,199-202；WO 2015/024690 A1；J.Guck等人,Biophysical Journal
2005,第88卷,3689-3698；WO 2012/045716 A1)在实验室实施。还分析了医学诊断领域的应用(H.T.K.Tse等人,Sci.Transl.Med.2013,5,212ral63,DOI:10.1126/
scitranslmed.3006559)。这里细胞不是基于光学和荧光性质识别的，而是由于不同的细胞机械性能来识别。不同的细胞类型有时表现出相当大的刚度差异。因此，细胞在已知力下的变形也能是特定的细胞标记。由此细胞高速通过微流体通道。由于通道上的压力梯度，作用在细胞壁上的力不同。通常，细胞壁逆着流动方向向后缩小。这将细胞的外观从大致椭圆形改变为子弹形。这些不同的形状取决于细胞尺寸和给定速度下的弹性。通过高速摄像机观察通道。算法从图像中检测形状，从而检测细胞的尺寸和形变。

[0006] 光学拉伸器也是一种能够用来测量悬浮细胞的机械性能的仪器(J.Guck等人,Biophysical Journal 2005,第88卷,3689-3698)。细胞在微流体通道中被两个激光束捕获。如果增加激光的强度，则由于细胞与介质的折射率不同，细胞在激光束方向上彼此被拉开。通过摄像机记录所述过程(以及拉伸后的松弛过程)，并使用算法确定细胞的形状和形变。使用所谓的蠕变图进行表征，该蠕变图中绘制了随时间变化的形变。根据这些图能够识别不同刚度的细胞。

[0007] 细胞计数器的另一种可能方法涉及对使用磁性纳米颗粒找到的细胞进行免疫化学标记(D.Issadore等人,Sei.Transl.Med.2012,4(141),141ra92)。使用小型霍尔传感器进行检测。使用这种方法，甚至能够在大样本中检测到非常少的细胞。

[0008] 还有不同的方法来分选细胞。在大多数情况下，分选之前是检测步骤，通过所述检测步骤激活可控门(“门”)。使用FACS(荧光激活细胞分选)的例子，这种类型的分选可能最容易解释。待分选的细胞用荧光染料标记。在微流体通道中，它们用激光照射并根据检测到的信号分类。在通道的进一步过程中，选择几何形状，使得液体被分成单个液滴，理想情况下液滴中有一个细胞。液滴被给予电荷，然后电极根据细胞类型将液滴引导到两个通道之一中。最近开发的RACS方法也基于类似的原理，该方法使用细胞的拉曼信号代替荧光作为判定标准。

[0009] 基于机械性质的分选方法根据完全不同的方法。通过通道中不同限制的组合或通过具有不同密度的柱的范围扩大导致具有不同可变形性的细胞相互分离。然而，分选单元的尺寸必须持续适应所分析的细胞尺寸和弹性。

[0010] 对于商业分析，几乎只使用基于散光的流式细胞术。利用该方法能够通过尺寸和形态来区分不同的细胞类型，其例如用于生成血像。通过额外的荧光分析步骤或对涂片的手动评估来规避任何不充分的特异性。这些设备技术成熟，能够由医务人员操作。

[0011] 近年来，细胞的机械性能日益突出。例如，转移性肿瘤细胞通常具有增加的弹性。由此它们能够通过组织转移到身体的其他部分，能够在那儿附着并继续生长。因此，分析细胞的机械性能是一些肿瘤疾病的诊断和分期确定中的重要一点。用于检测或分选的形变敏感型装置迄今尚未达到“原理证明”的地位(M.Xavier等人,Integr.Biol.2016,8,616；
A.Mietke等人,Biophysical Journal 2015,第109卷,2023-2036)。

[0012] 基于散光检测结合荧光检测的最常见方法具有以下主要缺点。这种商用设备的购置成本在非常简单的设计中已经非常高，因此仅对集中式分析实验室有收益。这主要是因为一方面所需的光源和具有荧光滤光片组的检测系统是非常昂贵的，另一方面，技术度非常高，以便尽可能地降低应用障碍。后者主要是由于方法的复杂性。另外，在所述方法中不利的是，在一些情况下必须通过特定的荧光染料标记待测细胞类型。虽然这种系统对特定蛋白质具有高选择性，但它无法检测到例如细胞机械性能的变化(仅对所追求的蛋白质频率敏感)。这种技术的一大缺点是对必须经常手动分类的病理样本的测量存在很大的不确定性。

[0013] 对细胞机械性能敏感的“实时形变细胞术”(RT-DF)(O.Otto等人,Nature Methods 2015,12,199-202)也具有产品特定限制。由于检测基于图像评估，因此必须将完整的配置放在尽可能好的显微镜上。此时必须将高速摄像机连接到显微镜以记录图像。这两种设备都非常昂贵，每种设备都可能为大约几万欧元。根据开发人员的说法，目前完整设备的纯采购成本约为150000欧元(包括显微镜)，因此甚至高于基于荧光的设备。每次测量都需要进行样品处理以调节粘度和浓度。此外，显微镜、摄像机、泵送系统和微流体通道必须始终正确调整，因为例如高分辨率显微镜在锐度和对比度方面对非最佳设置总是反应非常敏感。
这至少需要经过精心培训或甚至是高素质的实验室人员。由于机械限制和这种结构的高财力要求，可扩展性也非常有限。由于图像的三维数据结构，实时处理能力也受到现代计算机技术的限制。同时还设置了处理延迟，对作为分类设备的用途有害，因为延迟导致选择性降低。根据文献，实现了约1000个细胞/s的细胞速率(O.Otto等人,Nature Methods 2015,12,
199-202)。这对于例如分析大量血液是不够的。因此，需要对方法进行扩展或并行化，但如上所述，这不容易实现。根据制造商的说法，最终分析结果会延迟大约15分钟，这会妨碍实时监控。

[0014] 基于细胞的特定拉曼信号并且与形变细胞术一样无标记的拉曼光谱细胞术也有很大的局限性。此外，这种配置的购置非常昂贵，因为拉曼信号强度非常低，因此必须进行大量的放大和降噪工作。信噪比通常在中等个位数范围内，积分时间低于一秒。这导致这种单元的最大处理量约为1个细胞/s。由于检测器的高购置成本和尺寸(它们必须被冷却以改善信噪比)，因此可扩展性也非常有限。

[0015] “光学拉伸器”的缺点也与其他方法类似。由于复杂性和所需的高性能激光器和检测器，购置成本超过250000欧元。同时，检测速率被限制在约2个细胞/秒，因为必须捕获细胞用于测量并且观察到细胞变形后的松弛。因此，所述方法对集成光纤的流体动力学部分结构也提出了很高的要求。尽管激光功率高，但拉伸力非常小，这导致限于相对软的细胞类型。该方法仍然需要操作者的高技能和高度注意力，因为该装置对调节不准确性的反应非常灵敏，并且监测过程是手动的。由于后一点以及每个拉伸器需要单独的4瓦单模激光器，因此系统可扩展性也几乎被消除。

[0016] 总之，现有技术中已知的方法由此具有以下缺点：

[0017] 传统流式细胞术：

[0018] -需要用荧光染料或其他特定标记进行标记以提高特异性

[0019] -光学元件价格昂贵，因此也只能在有限的范围内扩展，从而导致高投资成本[0020] -集成不同测量系统需要极高的技术度

[0021] -病理变化通常只能手动分类

[0022] -不适合作为分选器，例如用于血液处理

[0023] 形变细胞术：

[0024] -高投资成本>150000欧元

[0025] -由于机械限制而没有可扩展性(此外，伴随并行化成本增加)

[0026] -专业人员进行的调整工作是必要的(显微镜，泵送系统......)

[0027] -由于并行化耗力和/或昂贵，较慢的测量技术不适合于分选大量细胞

[0028] -最终分析结果延迟约15分钟获得

[0029] 拉曼光谱细胞术：

[0030] -极差的信号强度限制了处理速率(积分时间)

[0031] -拉曼设备的成本仍远高于其他所有方法

[0032] -可扩展性非常有限

[0033] 光学拉伸器:

[0034] -慢检测速率<2个细胞/s

[0035] -极高购买成本>250000欧元

[0036] -只有高素质技术人员才能操作

[0037] -限于软细胞类型，因为拉伸力非常小

[0038] -没有可扩展性

[0039] 基于此，本发明的目的是提供一种成本合适的用于分析细胞的方法，其可以以简单的方式实施并且能够高速分析细胞，而不必用荧光染料或其他特定标记物来标记细胞。另外，本发明的目的是提供一种成本合适的用于执行这种方法的装置。

[0040] 所述目的是通过具有权利要求1的特征的方法和具有权利要求7的特征的装置来实现的。各个从属权利要求代表有利的进一步发展。

[0041] 因此，本发明提供了分析细胞的方法，其中

[0042] a)借助细胞分离单元分离细胞，

[0043] b)使分离的细胞通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域，其中针对通过测量区域的分离细胞中的至少一个，生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列，

[0044] c)借助处理单元针对强度图案的时间序列的至少一部分计算每两个空间强度图案的光流，以及

[0045] d)对计算出的光流进行评估。

[0046] 在根据本发明的方法中，能够分析任何种类和来源的生物细胞。细胞优选使用悬浮细胞，其中特别优选使用待分析细胞的水悬浮液。特别优选使细胞悬浮液流过细胞分离单元，其中细胞最初由该单元分离，然后在通过单元时以单独或分离的方式流过该单元的测量区域以进行空间分辨辐射强度测量。

[0047] 在该方法的步骤a)中，首先通过细胞分离单元分离细胞。物理系统能够作为这种单元，例如限制横截面的流体管。特别地，微通道或微流体通道能用作细胞分离单元。在这种情况下，通常在这种通道的入口处分离细胞。然而，也可以使用更复杂的物理、化学和/或光学系统例如使用具有抗体反应的系统或使用光学镊子来分离细胞。通过适当稀释原始悬浮液进行统计学分离也是可能的。

[0048] 在细胞分离后，在该方法的步骤b)中细胞通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域。当细胞通过空间分辨辐射强度测量单元时，细胞发出电磁辐射和/或影响电磁辐射。例如，这能够通过在细胞通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域期间和/或之前用电磁辐射照射细胞来实现。然后该辐射例如能被细胞散射或改变并再次发射。随后空间分辨辐射强度测量单元能够检测到这种(散射或发射的)辐射。能够利用简单的未限定的环境光对细胞进行照射，例如日光或传统的室内照明。然而，也能用手电筒、激光器、发光二极管或其他辐射源进行照射。能够用可见光、来自UV范围的电磁辐射、来自IR范围的电磁辐射、以及任何其他形式的电磁辐射进行照射。

[0049] 在该方法的步骤b)中，针对通过测量区域的至少一个分离细胞，通过空间分辨辐射强度测量单元生成由细胞发出的电磁辐射的空间强度图案的时间序列。这意味着，最后借助于空间分辨辐射强度测量单元针对通过测量区域的至少一个分离细胞进行测量。在该测量中，通过空间分辨辐射强度测量单元在多个连续时间点处检测到由通过测量区域的细胞发出的电磁辐射，其中针对每个单独的时间点生成空间强度图案。这种空间强度图案应理解为表示由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射强度的空间分布。因此，最终在不同时间点检测到在分离的细胞通过测量区域时从测量区域的各个位置发出的辐射强度如何。通过这种方式，每个测量时间点生成一维或二维强度图案，其描述了当细胞通过测量区域时由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间分布。

[0050] 空间强度图案优选是二维强度图案。然而，其也能够是一维强度图案。

[0051] 针对每个分离细胞生成强度图案的时间序列。这意味着在细胞通过测量区域时在多个不同的时间点处测量同一细胞的空间强度图案。这生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列。如果针对通过测量区域的多个分离的细胞生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列，则因此针对分离的细胞中的单个细胞生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列是必要的。以这种方式，能够与其他细胞分开地评估每个单独的细胞。

[0052] 由此优选地，针对通过测量区域的多个(特别优选地基本上所有)细胞，生成由细胞发出和/或受细胞影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列。在这种情况下，针对通过测量区域的每个单独的细胞生成由其发出或受其影响的电磁辐射的空间强度图案的时间序列。以这种方式能够获得通过测量区域的每个细胞的空间强度图案的时间序列，所述时间序列能够在方法的其他步骤c)和d)中被转换和评估。

[0053] 空间分辨辐射强度测量单元能够包括电子部件的几何布置。该布置能够优选地包括光电二极管、CCD传感器和/或摄像机。空间分辨辐射强度测量单元也能是用于辐射强度测量的分段组件。可以想到一维分段(segmentation)，例如成行的光电二极管；二维分段，例如成行和成列的光电二极管的布置，其中诸如蜂窝的这种形式的分辨率将实现二维分段。

[0054] 例如，能够使用传感器(例如，光学鼠标中使用的传感器)作为空间分辨辐射强度测量单元。然而，也可以想到来自摄像机领域的更复杂的传感器，其检测不同的颜色并将传感器点阵列的强度集成到除了位置信息之外还分配了颜色信息和强度信息的光学像素中。

[0055] 在该方法的步骤c)中，借助处理单元针对强度图案序列的至少一部分计算每两个空间强度图案的光流。

[0056] 光流是描述强度随时间的空间变化或位移的参数。通常，光流被表示为矢量场，其中矢量最终表示两个时间点之间的强度的空间变化。

[0057] 在步骤c)中将在步骤b)中生成的各个细胞的空间强度图案转换成光流。这里根据在步骤b)中针对每个细胞生成的空间强度图案的时间序列计算每两个空间强度图案的光流。总之，因此针对每个单独的细胞获得能够在方法的后续步骤d)中评估的多个光流。

[0058] 优选地，在步骤c)中，借助处理单元针对整个强度图案序列(针对每个细胞)计算每两个空间强度图案的光流。在这种情况下，例如，能够分别针对时间上直接连续的时间序列的所有空间强度图案生成光流。然而，替代地，也可以仅针对强度图案的时间序列的一部分计算光流，这意味着并非所有生成的空间强度图案都用于光流的计算。

[0059] 最后，在该方法的步骤d)中，评估步骤c)中计算出的光流。这里能够例如通过确定的细胞光流来推断出细胞的某些性质。基于此，因此能够单独评估每个细胞本身的性质。换句话说，因此能够通过评估计算出的光流来推断出单个细胞的性质。这些性质能够是例如细胞的形状、细胞尺寸、细胞体积、细胞类型、形态或细胞形变。此外，能够定量检测细胞的生化成分例如染色。

[0060] 例如首先能够在评估中根据计算出的光流推断出细胞的尺寸和形态以及其形变以及由此推断出机械性能。此外，能够通过细胞的尺寸进行细胞类型的简单区分。机械性质的确定基于悬浮细胞通过微流体通道在流体中移动并且由于垂直于通道的速度梯度而变形。这种形变例如取决于细胞相对于通道的尺寸及其机械性能，尤其是切变模量。

[0061] 因此，本发明的核心是基于通过确定和评估由待分析的细胞发出和/或受该细胞影响的电磁辐射的光流来分析细胞。根据计算出的光流能够通过评估得出细胞的特定性质。使用光流的概念大大减少数据量。此外，提供了简单的系统可扩展性。

[0062] 光流的概念主要通过光学鼠标的使用而为人所知。这种传感器的原理基于：CCD芯片捕获由光源照射的支架的图像。如果传感器相对于支架移动，则传感器上的图像会发生变化。借助OF算法(OF＝光流)确定灰度值在两个图像之间如何移位。计算灰度值的哪个部分以什么方向移位并因此达到子像素分辨率。为了确定净运动，在x和y方向上在整个传感器上对光流求平均或求和。

[0063] 通过本发明，单个细胞基于它们的性质可以区分开，例如，机械性能，形态和尺寸。能够区分不同的细胞类型，但也能够检测病理细胞变化。由于每个单独细胞的单独测量，对单个病变细胞存在理论检测限制。

[0064] 在商业上可获得的传感器的传统帧速率下，对于根据本发明的方法，可能的测量处理量为超过1000个细胞/秒，方法所需的装置或单元的成本非常低。因此，根据本发明的方法极其经济有效并且能够高速评估细胞。

[0065] 由于非常高的测量处理量或高测量速度以及通过可快速执行的光流计算，根据本发明的方法中的光流评估能够实时进行。这意味着能够在测量期间直接确定各个细胞的某些性质。这导致细胞在通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域之后能够在没有时间延迟的情况下实施细胞分选步骤，其中基于在评估中确定的性质将各个细胞分成或归类成不同的组。

[0066] 此外，所述方法中使用的单元的机械尺寸极小。如已经提到的，在所述方法中使用的处理单元和空间分辨辐射强度测量单元在共同的计算机芯片上相互配合。

[0067] 不需要用荧光标记或其他特定标记来标记待分析的细胞，因为根据本发明光流的确定和评估不需要使用这样的标记。因此，根据本发明的方法也可以以更简单的方式进行，因为能够省去为细胞提供荧光标记的复杂实验步骤。

[0068] 而且，根据本发明的方法的简单实用性也是由于能够省去使用复杂的设备和装置，例如特殊的显微镜和泵送系统。

[0069] 由于设备简单和机械要求低，两次测量之间的等待时间和测量时间本身都能够减少。该设备更易于操作，并且例如还可以想到能够在专业实验室外使用的手持装置。

[0070] 根据本发明的方法的优选变型的特征在于，

[0071] -步骤d)中对计算出的光流的评估由处理单元或由用于对计算出的光流进行评估的附加单元执行，或者

[0072] -在步骤d)中对计算出的光流的评估部分地由处理单元执行并且部分地由用于对计算出的光流进行评估的附加单元执行。

[0073] 通过处理单元执行光流计算和评估，能够节省另一评估设备的空间和成本，使得该方法更节省空间并且更加便宜。另外，该方法独立于附加的外部单元并且也能够通过便携式装置来执行。然而，使用附加单元来评估计算出的光流使复杂的评估过程成为可能并由此也提供了更好的分析可能性。也可以以这种方式进行图形评估。用于对计算出的光流进行评估评估的附加单元例如可以是计算机，优选具有用于评估的专用软件的计算机。

[0074] 根据本发明方法的另一优选实施例，在步骤d)中对光流的评估中，确定细胞的至少一种性质，所述性质优选地选自细胞的形状、细胞尺寸(或细胞的长度和宽度)、细胞体积、细胞类型、形态、细胞的形变及其组合。

[0075] 另一优选的变型的特征在于，在步骤b)中生成强度图案的时间序列时，用电磁辐射照射至少一个分离的细胞，其中所述照射优选地通过天然辐射源和/或人工辐射源进行。人工辐射源尤其选自相干辐射源、部分相干辐射源、非相干辐射源、点状辐射源、平面辐射源及其组合。辐射源例如能够是激光器。也可以通过暗场照明来照射细胞。

[0076] 根据所述方法的另一优选变型，在步骤b)中生成空间强度图案的时间序列时，针对每个细胞生成如此多的强度图案，使得在待评估的光流中出现的不连续尽可能少。这优选地通过使帧率(在一秒内记录的强度图案的数量，fps)相对于细胞速度v满足以下关系来实现：

[0077] fps[图案/秒]＞v[像素/秒]

[0078] 完整通过的细胞的图案数量N[图案/秒]通过下式得出：

[0079]

[0080] 检测器长度描述检测器上方向的像素数。通过这种方式能够在很大程度上避免可能出现在待评估信号或光流中的不连续性，从而导致分析质量的改进。

[0081] 根据本发明的方法的另一优选变型的特征在于，确定通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域的多个(优选所有)细胞的至少一种性质，并且在步骤d)之后基于其中至少一种性质之间的差异借助细胞分选器，优选可控门，将细胞分成至少两组。通过根据本发明的方法中的高分析速度，在步骤d)中对光流的实时评估之后能够立即将细胞分成不同的组。分选基于方法中评估的性质进行。这例如允许从大量细胞中分离健康和病变的血细胞。因此，根据本发明的方法的这种变型可以特别快速和方便地分选细胞，而不需要为细胞提供荧光标记或其他特殊标记。

[0082] 根据本发明方法的另一优选变型，在步骤b)中，针对至少一个细胞，生成通过测量区域的分离细胞的图像时间序列。在这种情况下，随后在步骤c)中针对图像序列的至少一部分，计算每两个(时间上连续的)图像的光流。在该实施例中，空间强度图案因此是(二维)图像。

[0083] 该方法的另一变型的特征在于，当通过测量区域时，每个细胞的一部分被覆盖，使得从细胞的该部分发出的电磁辐射不到达空间分辨辐射强度测量单元。这例如能够通过适当地通过掩膜遮挡传感器与空间分辨辐射强度测量单元的测量区域之间的直接路径的一部分来实现。当使用微流体通道时，例如能够覆盖通道的一部分。优选基本上覆盖每个细胞的一半。通过覆盖细胞的一部分或一半，能够实现对称性破坏。如果只有通过评估对称形变才能获得要确定的性质，则这尤其有用。在这种情况下，平均光流的确定通常产生在测量期间发生这种对称性破坏时能够评估的结果。

[0084] 能够优选地首先将计算出的光流转换为更清晰且在步骤d)的评估中更容易评估的各个值。例如，为此目的，每两个时间上连续的空间强度图案的光流分别能够被转换成两个值OFx和OFy。这些值的计算能够例如通过将相应的(二维)光流一次投影到x轴上并且一次投影到与x轴线性无关的y轴上来执行，然后将相应的平均值建立在相应投影的所有像素上。最后，OFx和OFy将分别对应于这些平均值中的一个。但是，还可以使用不同的值，例如，各个值的总和，而不是各个值的平均值。原则上能够针对每个确定的光流计算两个值OFx和OFy，从而显著减小数据量，因为最终对每个光流只需要处理和进一步评估两个简单值而不是整个矢量图像。

[0085] 当使用刚刚描述的优选评估方法时，使用光流作为测量变量导致非常小的存储空间要求，因为在光流的评估中通过仅两个值(OFx和OFy)来给出。这保证了信号的快速处理。在传统设备中是相反的，其具有摄像机的完整图像，在存储器并且处理方面要大几个数量级。

[0086] 然后能够根据每个单独细胞的光流的值OFx和OFy，生成随时间变化的一个信号OFx(t)和随时间变化的一个信号OFy(t)。以这种方式对于每个分析的细胞最终能够获得信号对OFx(t)和OFy(t)。最后，能够为该信号对赋予细胞的特定性质的值。这优选地使用校准来完成。信号OFx(t)和OFy(t)也能够例如在图中示出。然后能够从图的变化推导出细胞的性质。但即使单独考虑OFx(t)和OFy(t)之一，也能够提供有关单个细胞的信息。

[0087] 本发明还涉及一种用于分析细胞的装置，包括

[0088] -细胞分离单元；

[0089] -空间分辨辐射强度测量单元，其配置为使得其能够生成由分离的细胞在通过空间分辨辐射强度测量单元的测量区域时发出和/或受分离的细胞影响的电磁辐射的强度图案的时间序列，以及

[0090] -处理单元，用于计算所生成强度图案中的每两个强度图案的光流并且对计算出的光流进行评估。

[0091] 根据本发明的装置的优选实施例的特征在于，该装置包括用于计算出的光流进行评估的附加单元。以这种方式，能够部分地或完全地通过所述附加单元执行评估，由此可以执行复杂的评估方法或图形评估。例如使用外部计算机作为附加评估单元，其优选地具有用于评估的专用软件。

[0092] 在另一优选的实施例中，该装置含有辐射源。辐射源选自相干辐射源、部分相干辐射源、非相干辐射源、点状辐射源、平面辐射源及其组合。也能使用用于暗场照明的辐射源。

[0093] 此外，空间分辨辐射强度测量单元优选地包括电子元件的几何布置，其优选地包括光电二极管、CCD传感器和/或摄像机。

[0094] 根据本发明的装置的另一优选实施例的特征在于，该装置包括用于将细胞成像在空间分辨辐射强度测量单元上的系统。该系统例如能够是透镜系统。这种透镜系统能够例如利用已知的光刻工艺制造，其结构优选直接写入光致抗蚀剂中。成像系统也能够通过简单的针孔实现。通过细胞成像系统能够提高分辨率以及由细胞发出的辐射的信号水平，这使得即使细胞的辐射很弱也可以对细胞进行更好的定量分析。

[0095] 此外优选的是，空间分辨辐射强度测量单元和处理单元布置在共同的半导体芯片上。如果装置还应该包括辐射源和/或对计算出的光流进行评估的附加单元，则该辐射源和/或用于对计算出的光流进行评估的附加单元也能够布置在该共同的半导体芯片上。该实施例是特别有利的，因为获得了特别节省空间的装置，该装置也能配置为便携式。

[0096] 根据另一优选的实施例，细胞分离单元是微通道，优选微流体通道。例如能够根据已知光刻工艺来生成微通道。为此目的，该结构能够直接写入光致抗蚀剂中。

[0097] 此外，优选的是，根据本发明的装置包括细胞分选器，优选可控门。在该实施例中，借助该装置不仅能够快速、廉价且容易地分析细胞，而且还能够在分析细胞之后立即根据所评估的性质评估来分选细胞。

[0098] 特别优选的是，根据本发明的用于分析细胞的装置或针对其描述的实施例之一是用于执行根据本发明的方法以分析细胞的装置或其中一种所述优选变型。

[0099] 在(形变)细胞术中，本发明提供了优于常规方法的许多优点。根据本发明的装置能够使用电子工业的批量生产的产品来操作，从而带来非常低的成本，非常简单的执行性以及非常简单的可行性和调试。

[0100] 由于能够用作空间分辨辐射强度测量单元的传感器的广泛使用(例如，鼠标传感器)，价格也比高速摄像机的价格低几个数量级。此外，根据本发明的装置不需要显微镜，这再次显著降低了成本。由于消除了诸如显微镜和摄像机之类的占用大量空间的设备，整个系统能够集成在计算机芯片上。这不仅简化了测量室的设置(无需受训练的实验室人员，降低了人为因素)，而且极大地降低了潜在的生产成本。

[0101] 由于低成本以相同的程度扩展了设备的应用范围扩展。低投资成本允许开发全新的业务领域或者客户。此外，该装置能够被设计为完全便携的，因此能够在必要时容易地移动。也可以想象在技术较不发达的地区使用。

[0102] 与荧光细胞术相比，取消了染色过程。也就是说，节省了特定染料的成本以及耗时的染色工艺。

[0103] 在优选实施例中，根据本发明的装置能够包括多个细胞分离单元和/或多个空间分辨辐射强度测量单元。这使得大规模并行化分析过程成为可能。借助当今的半导体和芯片技术，这种集成(即将多个传感器和通道安装到细胞计数器中)是没问题的。这增加了每秒分析的细胞数量，并导致更强大的结果。

[0104] 总之，因此得到本发明的以下优点：

[0105] ·低基础设施成本

[0106] ·低消耗成本

[0107] ·比RT-DC(实时形变细胞术)更快且更稳健的计算

[0108] ·高处理速率

[0109] ·可以集成在芯片上

[0110] ·装置易于设置

[0111] ·能够并行化

[0112] ·小型用户设备是可能的

[0113] ·无标记。

[0114] 优选地，根据本发明的用于分析细胞的方法或其优选变型之一使用根据本发明的用于分析细胞的装置或其已描述的优选实施例之一执行。

[0115] 将参考以下附图和实施例更详细地解释本发明，但是本发明不限于具体示出的参数。

[0116] 图1以两个不同的视图示出了根据本发明的装置的特定实施例。上图显示了侧视图。下图显示了鸟瞰视图。图示的装置包括微通道120。还示出了细胞110、111如何流过微通道120，其中细胞110首先在通道入口处被分离并变形(111)。另外，所示装置包括计算机芯片130，该芯片包括激光器140、摄像机150和处理单元160。在计算机芯片130和微通道120之间布置有透镜系统170。细胞111在被分离之后通过摄像机150的测量区域180。在这种情况下，用来自激光器的电磁辐射照射细胞111。当通过测量区域180时，细胞借助于透镜系统170成像到摄像机150上，其中借助摄像机150生成由细胞发出的电磁辐射的空间强度图案的时间序列。随后，借助于处理单元160，针对整个强度图案序列计算每两个空间强度图案的光流。此后，光流直接由处理单元160或外部单元(未示出)评估。

[0117] 在下文中，将基于示例性测量阐明根据本发明的方法中评估光流的可能变型。显示的数据是实际测量结果。这里显示能够通过光流确定在微流体通道中移动的细胞的某些性质，例如形状和尺寸。

[0118] 为此目的，测试了两种不同的细胞类型，圆形细胞和子弹形细胞，两者都在图2中示意性地显示。

[0119] 图2在左侧示出了“子弹形”细胞210的示意图。例如当初始圆形细胞在流过通道时由于通道横截面上的压力梯度而被剪切并因此变形时，会出现该形状。在图2的右侧，示出了与子弹形细胞明显不同的球形细胞220(例如，白细胞)，并且通道230、240的边缘也是可见的。

[0120] 在测量期间，细胞以恒定速率移动通过通道。使用高速摄像机进行系统测试。在图像中，使用Horn-Schunk方法在单独的步骤中针对每个图像计算图像的光流。这提供了针对图像每个像素的光流。然后将图像的所有像素的OF相加。该方法的扩展被执行，使得不是覆盖通道的一部分以破坏对称性，而是在OF的计算中，单独考虑图像的上半部分和下半部分。由此得出OF信号，OFx＝OFx底部+OFx顶部和OFy＝OF底部–OF顶部。这不是对所提出方法的限制。x分量对应于时间内的信号OFx(t)，y分量对应于时间内的信号OFy(t)。为了实现高流速并通过通道中的剪切力生成足够的变形，细胞必须尽快流过通道。确保在约4.85cm/s的所选速度下，由于通道中的剪切引起的变形足够大并且细胞的流速足以在每单位时间内获得足够的细胞以实现快速且统计上有意义的测量。

[0121] 图3是实际测量的子弹形细胞的光流的图形表示，其与图2在通过传感器的视场时的示意图相当。数据的处理如下。使用Matlab函数“opticalFlowHS”得到光流，然后使其平滑以补偿信号噪声并促进进一步的数据处理。在轴上绘制光流310随时间320的变化。实曲线330表示曲线OFx(t)，而虚曲线340表示曲线OFy(t)。一旦细胞进入传感器的视场，沿x方向的光流增加(350)。OF增加直到细胞的圆形部分完全位于视场中。如果细胞继续移动，则OF不会改变很多，直到细胞的后端位于传感器区域中(360)。如果细胞通过通道并且完全可见，则OF具有恒定值。只有当细胞再次离开视场时，OF逐级减小(370)，直到返回0，此时细胞已完全离开传感器区域(380)。现在能够根据该曲线计算出不同的参数。细胞完全位于传感器区域或再次离开传感器区域的时间能用于计算细胞尺寸。所需的通过时间可以推导出细胞速度，并且平台在进入和离开时的不同高度是细胞不对称性的量度。结合OFy(t)信号的积分值，能够确定细胞的形状(子弹形、椭圆形、圆形)。

[0122] 图4示出了如图2中示意性所示的实际圆形细胞的OF信号以用于比较。轴410，420与图3中的相同，但为了清楚起见，选择不同的刻度。可以看出，圆形细胞中的平台明显不如图3中的子弹形细胞中那么明显(430、440)。能够根据示图与集成的y信号的低得多的值将子弹形细胞与球形细胞区分开。测量数据清楚地表明，通过根据本发明的方法获得了独特的数据，其(可选地结合参考值和所谓的“查找表”)导致细胞/细胞类型或细胞的形变或细胞的其他性质的识别。将根据所述方法获得的数据与使用成像方法的常规测量结果进行比较。通过上述方法正确地确定细胞尺寸和流速两者。在上面显示的示例中，能够很好地看到细胞形状的差异，以便能够很容易地通过基于阈值的程序将其区分出来，这会快速限制下游查找表的搜索范围。

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用于分析细胞的方法和装置

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