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分析物浓度的检测方法

阅读：942发布：2020-05-11

专利汇可以提供分析物浓度的检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的分析物浓度的检测方法包含使第一复合体与标准分析物或待测分析物进行竞争反应，以使第一复合体与金属纳米粒子结合并分别形成控制组的第二复合体和待测组的第三复合体。利用第二复合体和第三复合体的热扩散度差异，可判断待测组的待测分析物浓度高于或低于控制组的标准分析物浓度。，下面是分析物浓度的检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种分析物浓度的检测方法，其特征在于包含：
提供至少二反应溶液，其中该至少二反应溶液的每一者包含第一复合体，且该第一复合体包含：
标记粒子；
结合配偶体，固定于该标记粒子的一表面；以及
受质，与该结合配偶体结合；
于该至少二反应溶液的一者中，同时加入标准分析物以及金属纳米粒子，以形成第二复合体，其中该金属纳米粒子具有该结合配偶体，且该标准分析物于该至少二反应溶液的该者中具有一已知浓度；
于该至少二反应溶液的另一者中，同时加入包含待测分析物的样本以及该金属纳米粒子，以形成第三复合体，其中该待测分析物于该至少二反应溶液的该另一者中具有一待测浓度，该标记粒子的等效粒径大于该金属纳米粒子的等效粒径，且该受质、该标准分析物以及该待测分析物实质为相同物质；以及
利用光源检测该第二复合体的第一热扩散度和该第三复合体的第二热扩散度；以及进行判断分析物浓度的步骤，其中当该第一热扩散度小于该第二热扩散度时，判断该待测浓度大于该已知浓度；或，当该第一热扩散度大于该第二热扩散度时，判断该待测浓度小于该已知浓度。
2.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中利用该光源检测该第一热扩散度和该第二热扩散度时，更包含对该金属纳米粒子施加激光。
3.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该金属纳米粒子具有不大于80纳米的等效粒径。
4.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该标记粒子具有100纳米以上的等效粒径。
5.如权利要求4所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该标记粒子和该金属纳米粒子的等效粒径比为2.5至125。
6.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该金属纳米粒子的材料包含金。
7.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该标记粒子的材料包含荧光化合物。
8.如权利要求2所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该激光的功率不大于
0.23mW。
9.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该样本包含泪液、血液、尿液、血清或其他生物样本。
10.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该待测浓度为至少
10pg/ml。
11.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该光源激发该第二复合体和该第三复合体各自的该标记粒子。
12.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该光源包含汞灯、氙灯或金属卤化物灯。
13.如权利要求1所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该结合配偶体包含抗原、抗体、受体或配体。
14.如权利要求13所述的分析物浓度的检测方法，其特征在于其中该受质、该标准分析物和该待测分析物分别包含该结合配偶体的抗原的抗体、该结合配偶体的抗体的抗原、该结合配偶体的受体的配体，或该结合配偶体的配体的受体。

说明书全文

分析物浓度的检测方法

技术领域

[0001] 本发明是有关于一种分析物浓度的检测方法，且特别是有关于一种利用二分法和粒子在溶液中的热扩散度，来判断分析物浓度高于或低于标准值的检测方法。

背景技术

[0002] 随医学日渐进步，非侵入式的疾病检测发展逐渐成为研发重点。举例而言，在糖尿病的视网膜病变的检测中，常见的非侵入式疾病检测可例如为眼部断层扫描，但无论是仪器或是检测费用都十分昂贵。另一种检测方式为荧光血管照影，然需在静脉施打荧光染剂，属于侵入式的检测方式。针对上述问题，应发展出可快速筛检、价格便宜且非侵入式的检测方法。

[0003] 目前有一种方法是将抗原标准品标记荧光，并将上述抗原对应的抗体接附于载体上(后称抗体载体)。之后，将待测抗原样品、抗原标准品及抗体载体混合，使待测抗原样品与抗原标准品进行竞争反应，以与抗体载体结合。之后，利用抗原标准品上的荧光标记观测其布朗运动的情形。自由态的抗原标准品越多代表待测样品浓度越高，从而可得知待测抗原样品浓度的高低。然而，此习知方法的缺点在于，将待测抗原样品与抗原标准品混合的方法，使得同一抗原标准品无法重复使用来检测多组待测抗原样品，增加检测成本。此外，此习知方法也可能增加样品污染的风险。

[0004] 另一种方法是利用接附有对应待测分析物的第一结合配偶体的至少二种大小不同且具有特定尺寸比的第一粒子，来增加可侦测的浓度动态范围(Dynamic range)。具体而言，将大的第一粒子、小的第一粒子，及具有标记和可与上述第一结合配偶体接合的第二结合配偶体的第二粒子，同时加入具有待测分析物的样品溶液中。接着，第二粒子与待测分析物进行竞争反应，以与大的第一粒子或小的第一粒子接合。藉由大/小第一粒子和第二粒子的接合信息的大小，判断待测分析物的浓度。然而，上述方法要判断出分析物的浓度，至少需在待测样品中额外加入至少三种粒子，增加检测复杂性。此外，此习知方法对于大/小第一粒子的尺寸限制极为严格，造成应用上的限制。

[0005] 尚有另一种方法是在纳米粒子的表面上接上抗体，以形成抗体掺杂。然后，将抗体掺杂加入含抗原的待测溶液中。之后，检测待测溶液中抗体和抗原结合后，纳米粒子布朗运动效应的改变量，并根据事前利用标准品所制作的检量线推算所检测的抗原浓度。然而，此方法须使用检量线，故当待测样品未落于检量线的范围时，或是更换待测样品种类时，则需要更多的准备工作来完成分析物浓度的检测，也使可侦测的最低浓度受到限制(即侦测灵敏度不佳)。因此，上述方法也不适用于疾病的快速筛检上。再者，为增加抗体接上纳米粒子后所产生的相对体积差异(影响布朗运动变化量)，此习知方法所使用的纳米粒子的粒径较小，制备较困难，且可侦测的浓度动态范围小。

[0006] 因此，目前亟需提出一种分析物浓度的检测方法，其可具有良好的灵敏度、低侦测极限、广动态范围、操作简易且快速、再现性高的优点，以克服上述种种问题。

发明内容

[0007] 本发明的一个方面在于提供一种分析物浓度的检测方法。在一实施例中，上述检测方法包含下述步骤。首先，提供至少二反应溶液，至少二反应溶液的每一者包含第一复合体，且第一复合体包含标记粒子、固定于标记粒子表面的结合配偶体以及与结合配偶体结合的受质。接下来，于上述至少二反应溶液的一者中，同时加入标准分析物以及金属纳米粒子，以形成第二复合体，其中金属纳米粒子具有上述的结合配偶体，且标准分析物在至少二反应溶液的一者中具有已知浓度。然后，于上述至少二反应溶液的另一者中，同时加入包含待测分析物的样本以及上述金属纳米粒子，以形成第三复合体，其中待测分析物于上述反应溶液的另一者中具有待测浓度，标记粒子的等效粒径大于金属纳米粒子的等效粒径，且受质、标准分析物以及待测分析物实质为相同物质。然后，利用光源检测第二复合体的第一热扩散度以及第三复合体的第二热扩散度。接着，进行判断分析物浓度的步骤，其中当第一热扩散度小于第二热扩散度时，判断待测浓度大于已知浓度，或是当第一热扩散度大于第二热扩散度时，判断待测浓度小于已知浓度。

[0008] 依据本发明的一些实施例，在利用光源检测第一热扩散度和第二热扩散度时，可更包含对上述金属纳米粒子施加激光。

[0009] 依据本发明的一些实施例，所述金属纳米粒子可具有不大于80纳米的等效粒径。

[0010] 依据本发明的一些实施例，所述标记粒子具有100纳米以上的等效粒径。

[0011] 依据本发明的一些实施例，标记粒子和金属纳米粒子的等效粒径比可为2.5至125。

[0012] 依据本发明的一些实施例，所述金属纳米粒子的材料包含金。

[0013] 依据本发明的一些实施例，所述标记粒子的材料包含荧光化合物。

[0014] 依据本发明的一些实施例，所述激光的功率不大于0.23mW。

[0015] 依据本发明的一些实施例，所述样本包含泪液、血液、尿液、血清或其他生物样本。

[0016] 依据本发明的一些实施例，所述待测浓度为至少10pg/ml。

[0017] 依据本发明的一些实施例，所述光源激发第二复合体和第三复合体各自的标记粒子。

[0018] 依据本发明的一些实施例，所述光源包含汞灯、氙灯或金属卤化物灯。

[0019] 依据本发明的一些实施例，所述结合配偶体包含抗原、抗体、受体或配体。

[0020] 依据本发明的一些实施例，所述受质、标准分析物和待测分析物分别包含前述结合配偶体的抗原的抗体、前述结合配偶体的抗体的抗原、前述结合配偶体的受体的配体，或前述结合配偶体的配体的受体。

[0021] 本发明的分析物浓度的检测方法，藉由二分法的进行而可增加侦测灵敏度和动态范围、降低侦测极限、操作简单并具有良好的再现性。上述分析物浓度的检测方法可应用于非侵入式的疾病筛检。附图说明

[0022] 为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的详细说明如下：

[0023] 图1根据本发明的一些实施例所述的分析物浓度的检测方法绘示形成第一复合体的流程示意图；

[0024] 图2根据本发明的一实施例所述的分析物浓度的检测方法绘示形成第二复合体的流程示意图；

[0025] 图3A绘示形成待测组的第三复合体300A的示意图；

[0026] 图3B绘示形成待测组的第三复合体300B的示意图；

[0027] 图4绘示含有第二复合体或第三复合体的样品的承载装置的示意剖面图；

[0028] 图5A至图5B绘示本发明实施例1的热扩散度检测结果的长条图；

[0029] 图5C至图5D绘示本发明实施例2的热扩散度检测结果的长条图；

[0030] 图5E至图5F绘示本发明实施例3的热扩散度检测结果的长条图；

[0031] 图6A至图6C分别绘示本发明比较例1至3的热扩散度检测结果的长条图；

[0032] 图7A绘示本发明实施例4和5的第二复合体施加激光与否的热扩散度结果的长条图；

[0033] 图7B绘示本发明实施例4、实施例6以及比较例4的复合体施加激光与否的热扩散度结果的长条图；

[0034] 图8绘示应用本发明的分析物浓度的检测方法于泪液样本的实验结果；

[0035] 图9A至图9D绘示本发明的实施例8至11的电脑模拟结果图；

[0036] 其中，符号说明：

[0037] 100：第一复合体 101、102、201、301、303：步骤

[0038] 110：标记粒子 111：表面

[0039] 120、220：结合配偶体 130：受质

[0040] 200：第二复合体 210：金属纳米粒子

[0041] 230：标准分析物 300A、300bB：第三复合体

[0042] 330：待测分析物 400：承载装置

[0043] 401：样品 410、430：玻片

[0044] 420：间隔件 440：磁铁。

具体实施方式

[0045] 本发明的分析物浓度的检测方法包含使第一复合体与标准分析物或待测分析物进行竞争反应，以使第一复合体与金属纳米粒子结合并分别形成控制组的第二复合体和待测组的第三复合体。利用第二复合体和第三复合体的热扩散度差异，可判断待测组的待测分析物浓度高于或低于控制组的标准分析物浓度。

[0046] 进一步而言，第二复合体和第三复合体之间的扩散度差异起因于分析物的浓度高低：当分析物浓度高时，金属纳米粒子与分析物之间的反应强于金属纳米粒子与第一复合体之间的反应，因此所形成的复合体所接的金属纳米粒子较少；反之，当分析物浓度低时，金属纳米粒子与第一复合体之间的反应强于金属纳米粒子与分析物之间的反应，因此所形成的复合体接上较多的金属纳米粒子，造成复合体体积变大、热扩散度降低。此外，本发明的检测方法进一步利用施加激光，引发第二复合体和第三复合体上的金属纳米粒子的表面等离子体共振，使其热扩散效应更显著，以提高检测的灵敏度。因此，本发明的分析物浓度的检测方法具有高侦测灵敏度、低侦测极限、广动态范围、操作简单、具有良好再现性的优点，并可适用于非侵入式地快速筛检疾病的平台。

[0047] 本发明说明书所称的结合配偶体(Binding Partner)是指针对特定分析物具有专一性结合力的物质，举例而言，抗体与抗原、蛋白与其受体，或其他类似的结合关系的物质，可互为彼此的结合配偶体。

[0048] 本发明说明书所称的热扩散度是指特定溶液中，经光源激发后可测得的特定物质的布朗运动情形(即扩散情形)，其中物质体积越大，布朗运动情形越不明显，即后述所称的热扩散度小。

[0049] 本发明说明书所称的二分法是指设定一预设值，并利用热扩散度的差异判断待测值为高于或是低于上述预设值。由于不需利用检量线进行定量以精准判断出实际数值，本发明的检测方法可大幅降低侦测极限、提高侦测灵敏度，并加速检测时间。

[0050] 本发明说明书所称的高浓度是指高于控制组的分析物浓度；反的，所称的低浓度是指低于控制组的分析物浓度。

[0051] 本发明说明书所称的金属纳米粒子的等效粒径指尚未有结合配偶体修饰的纯金属纳米粒子的尺寸大小。

[0052] 以下分别叙述本发明的分析物浓度的检测方法的各个步骤。

[0053] 1.提供至少二反应溶液

[0054] 本发明此处所称的反应溶液包含第一复合体。所提供的至少二反应溶液的一者是用以制成控制组的第二复合体，而至少另一者可用以制成待测组的第三复合体，换言之，本发明的检测方法可同时进行多组样品的检测。详细请容后述。

[0055] 以下配合图1说明形成第一复合体100的步骤流程，图1根据本发明的一些实施例所述的分析物浓度的检测方法绘示形成第一复合体100的流程示意图。在一实施例中，首先，如步骤101所示，将结合配偶体120固定于标记粒子110的表面111，其中标记粒子110的表面111可修饰有氨基，图1的结合配偶体120以抗体做为代表，然也可使用其他物质作为结合配偶体。固定结合配偶体120的方法可例如使结合配偶体120与标记粒子110之间形成共价键结。所述共价键结可例如利用碳二亚胺交联化学法(Carbodiimide Crosslinker Chemistry)，以形成酰胺键。

[0056] 接下来，如步骤102所示，将固定于标记粒子110表面111上的结合配偶体120与受质130反应，从而可形成第一复合体100。结合配偶体120上所接附的受质130的量取决于反应时间，惟本发明此处并不针对上述反应时间加以限制，仅以同一实验使用相同反应时间为宜。

[0057] 如图1所示，第一复合体100包含标记粒子110、固定于标记粒子110的表面的结合配偶体120，以及与结合配偶体120结合的受质130。第一复合体100实质分散于盐类溶液中，以形成反应溶液(未绘示)。

[0058] 在一实施例中，标记粒子110的材料可包含荧光化合物。在一例子中，标记粒子110的表面可有氨基修饰。在一例子中，标记粒子110的等效粒径可为100纳米以上。特别说明的是，由于本发明是藉由竞争反应搭配二分法增加侦测灵敏度，且进一步藉由后述的金纳米粒子增加热扩散度差异，故所使用的标记粒子110的等效粒径较大，其相对容易取得、具有稳定的性质，且可提供较大的动态范围。因此，本发明的方法也具有再现性良好、可侦测浓度范围大、成本低廉且易于操作的优点。

[0059] 在一实施例中，结合配偶体120可包含但不限于抗原、抗体、受体(Receptor)或配体(Ligand)。

[0060] 在一实施例中，受质130可包含但不限于前述结合配偶体120的抗原的抗体、前述结合配偶体120的抗体的抗原、前述结合配偶体120的受体的配体或前述结合配偶体120的配体的受体。在一实施例中，可使用后述待测分析物的标准品(或称标准分析物)做为第一复合体100的受质130。换言之，受质130、后述的待测分析物以及标准分析物实质为相同的物质。

[0061] 在一实施例中，反应溶液可为进行各种蛋白质反应时常用的缓冲溶液，例如但不限于：磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline；PBS)、含非离子界面活性剂的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline Tween 20；PBST)、Tris缓冲液(Tris Buffered Saline；TBS)或其他类似的缓冲溶液等。

[0062] 2.形成控制组的第二复合体

[0063] 以下利用图2说明形成控制组的第二复合体的流程，图2根据本发明的一实施例所述的分析物浓度的检测方法绘示形成第二复合体200的流程示意图。如图2的步骤201所示，将具有结合配偶体220的金属纳米粒子210以及标准分析物230同时加入前述反应溶液的一者中，标准分析物230与图1所述的第一复合体100进行竞争反应，以形成包含第一复合体100及金属纳米粒子210的第二复合体200，其中标准分析物230在前述反应溶液的一者中具有已知浓度。在一实施例中，前述标记粒子110(图1)的等效粒径大于金属纳米粒子210的等效粒径。所述已知浓度可根据待测样品的情况而做调整，本发明并无特别限制。

[0064] 特别说明的是，倘若金属纳米粒子210与标准分析物230未同时加入上述反应溶液中，例如先将金属纳米粒子210与标准分析物230进行反应后才加入，则无法达到竞争反应的效果，从而无法进行待测分析物浓度的侦测。

[0065] 在一些实施例中，在进行步骤201前，本发明的方法更包含以化学修饰方法，将金属纳米粒子210修饰上结合配偶体220，上述化学修饰方法可利用市售的套组以及已知的任何修饰方法进行，本发明并无特别限制。

[0066] 所形成的第二复合体200可做为本发明的分析物浓度的检测方法的控制组，以第二复合体200在反应溶液中的热扩散度为基准，判断后述形成的第三复合体300的热扩散度为大于或小于第二复合体的热扩散度，从而可判断待测样品中待测分析物的浓度。

[0067] 3.形成待测组的第三复合体

[0068] 以下分别利用图3A和图3B说明当待测分析物330浓度高于和低于图2的标准分析物230时的情况。首先请先参考图3A，其是绘示形成待测组的第三复合体300A的示意图，其中待测分析物浓度330高于标准分析物230。如图3A的步骤301所示，将与前述图2相同且等量的具有结合配偶体220的金属纳米粒子210，以及包含待测分析物330的样本同时加入前述的反应溶液的另一者中，待测分析物330与图1所述的第一复合体100进行竞争反应，以形成包含第一复合体100和金纳米粒子210的第三复合体300A。

[0069] 如图3A所示，由于待测分析物330的浓度较高，其与金属纳米粒子210的反应强于金属纳米粒子210与第一复合体100之间的反应，因此大部分的金属纳米粒子210与待测分析物330结合，而与第一复合体100结合的金属纳米粒子210较少，从而所形成的第三复合体300A的体积小于图2所示的第二复合体200的体积。

[0070] 接着请参考图3B，其是绘示形成待测组的第三复合体300B的示意图，其中待测分析物浓度330低于标准分析物230。图3B的步骤303的操作方法与图3A的步骤301的操作方法相同。如图3B所示，由于待测分析物330的浓度较低，金属纳米粒子210与第一复合体100之间的反应强于待测分析物330与金属纳米粒子210的反应，因此部分的金属纳米粒子210与第一复合体100结合，从而所形成的第三复合体300B的体积大于图2所示的第二复合体200的体积。

[0071] 在一实施例中，所述待测分析物330的待测浓度(相当于本发明的检测方法的侦测极限)可为至少10pg/ml。

[0072] 在一实施例中，所述金属纳米粒子210可具有不大于80纳米的等效粒径。在另一实施例中，所述金属纳米粒子210的材料包含金。

[0073] 在一实施例中，前述第一复合体100的标记粒子110与金属纳米粒子210的等效粒径比可例如为2.5至125，然本发明不限于此。上述等效粒径比仅以标记粒子110与金属纳米粒子210所形成的复合体，可依照不同金属纳米粒子210的接附量而有热扩散度的差异即可。然而，需特别说明的是，标记粒子110的等效粒径越大，会伴随灵敏度的下降。因此，在一实施例中，标记粒子的等效粒径较佳为100纳米至5微米。

[0074] 在一实施例中，结合配偶体220可包含但不限于抗原、抗体、受体或配体。所述结合配偶体220可与图1的结合配偶体120相同或不同。在一实施例中，标准分析物230和待测分析物330实质为与前述受质130相同的物质，故此处不另赘述。

[0075] 在一实施例中，所述待测分析物330的样本可包含泪液、血液、尿液、血清或其他生物样本。

[0076] 具体而言，只是要可以亲和地、共价地、离子性地或其他物理性或化学性地结合的组合，皆可应用于本发明的标准分析物(或待测分析物)与所使用的结合配偶体。

[0077] 4.检测第二复合体和第三复合体的热扩散度

[0078] 接着，利用光源检测上述第二复合体和第三复合体在反应溶液中的热扩散度。具体而言，检测热扩散度的步骤主要是利用光源激发第二复合体和第三复合体各自的标记粒子，以获得其在反应溶液中的布朗运动情形。在一实施例中，上述光源可例如为汞灯、氙灯或金属卤化物灯。

[0079] 在一实施例中，本发明的检测方法更包含在以光源照射第二复合体和第三复合体时，对其中的金属纳米粒子施加激光。在一例子中，所述激光的功率不大于0.23mW。倘若激光的功率过大，过多的能量可能影响分析物与结合配偶体之间的结合，或是分析物或结合配偶体本身的构型。在另一例子中，所述激光的波长范围可为可见光的波长范围，例如绿光激光。

[0080] 5.进行判断分析物浓度的步骤

[0081] 所述判断分析物浓度的步骤是指比较前述第二复合体和第三复合体的热扩散度的差异。

[0082] 以下配合图2、图3A和图3B说明第二复合体和第三复合体的热扩散度的差异原因。

[0083] 承上形成第三复合体的过程所述，当待测分析物浓度高于标准分析物浓度时，所得的第三复合体300A的体积小于第二复合体200，因此第三复合体300A的热扩散度会大于第二复合体200(意即第三复合体300A的布朗运动情形较显著)。换言之，当所形成的待测组的第三复合体的热扩散度大于控制组的第二复合体时，代表待测样品中的待测分析物浓度高于控制组的标准分析物。

[0084] 另一方面，在待测分析物浓度330低于标准分析物230的情况中，第三复合体300B的体积大于第二复合体200的体积，因此第三复合体300B的热扩散度会小于第二复合体200(意即第三复合体300B的布朗运动情形较不显著)。换言之，当所形成的待测组的第三复合体的热扩散度小于控制组的第二复合体时，代表待测样品中的待测分析物浓度低于控制组的标准分析物。

[0085] 以下利用具体的实施例说明本发明的分析物浓度的检测方法的进行方式以及优点。

[0086] 实施例1

[0087] 制备包含第一复合体的反应溶液

[0088] 以2-吗啉乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid；MES)清洗2微升(μl)的标记粒子(浓度为4.54×1012个/ml)，其中标记粒子为氨基修饰的聚苯乙烯荧光粒子(直径200纳米；型号：8764，赛默飞世尔(Thermo Fisher)制)，且所述荧光粒子具有放光波长为515纳米的黄绿色荧光。之后，将4μl的N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS；浓度为10μg/μl)、2μl的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide；EDC；浓度为10mg/ml)，以及10μl的2-吗啉乙磺酸(pH
5.5)加入10μl的单株肿瘤坏死因子的免疫球蛋白G型抗体(anti-TNF-αImmunoglobulin；取自小鼠；浓度为0.1μg/μl；后简称TNF-α抗体)中，以活化TNF-α抗体的羧酸基。接着，于25℃下反应15分钟后，于含Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)中，将标记粒子与活化的TNF-α抗体混合并于4℃下反应过夜。再来，利用分子筛移除多余的抗体，并加入1％的小牛血清蛋白(Bovine serum albumin；BSA)以减少非专一性吸附。然后，以PBST清洗标记粒子与TNF-α抗体键结的产物，并于其中加入10μl的TNF-α蛋白(型号为ab9642，abcam制)，在25℃下反应1小时，则可制得包含第一复合体的反应溶液。

[0089] 制备控制组的第二复合体

[0090] 在制备第二复合体前，需将纯金纳米粒子修饰上结合配偶体。实施例1的结合配偶体是使用多株肿瘤坏死因子的免疫球蛋白G型抗体(取自兔子；型号：ab9635，Abcam制)，而纯金纳米粒子具有80纳米的等效粒径。下述的修饰方法是使用Abcam生产的金结合套组(型号：ab154876)进行。具体而言，将上述多株抗体稀释至浓度为0.1mg/ml，再将12μl上述稀释后的多株抗体添加至42μl的金反应缓冲溶液中并充分混合。接着，将45μl上述混合液加入纯金纳米粒子中充分混合并反应20分钟。接着，加入5μl的反应中止剂，以制得具有多株抗体修饰的金纳米粒子。此金纳米粒子是用于第二复合体以及后述第三复合体的制备。

[0091] 于4μl的前述第一复合体的反应溶液中同时加入6μl金纳米粒子(有多株抗体修饰)以及标准分析物(TNF-α蛋白)，使得反应溶液的金纳米粒子的最终浓度为7.5OD，且TNF-α蛋白的最终浓度为10μg/ml，并在25℃下反应1小时后，可制得所述第二复合体。

[0092] 制备第三复合体

[0093] 制备第三复合体的方法与制备第二复合体的方法相同，且实施例1包含四组不同TNF-α蛋白的最终浓度的第三复合体。实施例1的第三复合体的制备方法是将上述第二复合体的标准分析物取代为含有待测分析物(TNF-α蛋白)的样本。本发明实施例1是以标准品的稀释溶液或较高浓度的标准品溶液作为上述样本。在此实施例中，含有第三复合体的反应溶液中的金纳米粒子的最终浓度为7.5OD，且四组待测样品的TNF-α蛋白的最终浓度分别为1、100、2以及50μg/ml。

[0094] 检测第二复合体和第三复合体的热扩散度

[0095] 以下利用图4说明本发明检测第二复合体和第三复合体的热扩散度的装置与方法。图4是绘示含有第二复合体或第三复合体的样品的承载装置400的示意剖面图。如图4所示，含有第二复合体(或第三复合体)的样品401是承载于玻片410上，玻片410的二侧设有间隔件420，以提供样品401的容置空间。间隔件420上方设有另一玻片430，以覆盖样品401。玻片410和玻片430朝外的一侧可各设有一个磁铁440，以固定上述承载装置400。

[0096] 接着，以汞灯(型号为U-RFL-T，Olympus制)照射承载装置400中的样品401，并同时施加波长为532纳米、功率为0.23mW的绿光激光。使用直立式显微镜和照相机(型号为FL3-U3-13S2C，Point Grey制)配合电脑软体，以每秒15画格的速率拍摄40秒钟，并经影像迭加以及交越相关分析(cross-correlation)后，可获得影像的强度峰值。上述影像的强度峰值与第二复合体和第三复合体各自在单位时间内因布朗运动所产生的位移(以Evaluation software for Digital Particle Image Velocimetry(EDPIV)的软体进行计算)相关，而上述位移即代表本发明所称的热扩散度。实施例1的结果如图5A和图5B所示。关于本发明的热扩散度的具体计算方式，请参考台湾申请号TW 105100716一案。

[0097] 实施例2至3以及比较例1至3

[0098] 实施例2至3以及比较例1至3是使用与实施例1相同的方法进行，不同的是，实施例2至3以及比较例1至3改变标准分析物及/或待测分析物的最终浓度，以测试分析物浓度的检测方法的侦测灵敏度以及侦测极限。具体的制程条件悉如表1所示，此处不另赘述。实施例2的结果如图5C至图5D所示，且实施例3的结果如图5E至图5F所示。比较例1至3的结果分别如图6A至图6C所示。

[0099] 实施例4

[0100] 实施例4是单用第二复合体来检视施加激光对于热扩散度的影响。实施例4使用TNF-α蛋白浓度为1μg/ml的第二复合体来进行，其制备方法与实施例1相同，此处不另赘述。然后，利用如实施例1所示的检测第二复合体的热扩散度的方法，检测施加及不施加绿光激光时，第二复合体的热扩散度的差异。实施例4的结果悉如图7A所示。

[0101] 实施例5

[0102] 实施例5使用与实施例4相同的方法进行，不同的是，实施例5是使用实施例2的第二复合体(TNF-α蛋白浓度为1ng/ml)。实施例5的结果悉如图7A所示。

[0103] 实施例6

[0104] 实施例6使用与实施例4相同的方式，但实施例6是使用实施例3的第二复合体，并将其所使用的金纳米粒子等效粒径改变为40纳米。实施例6的结果悉如图7B所示。

[0105] 实施例7

[0106] 实施例7以与实施例1相同的方式进行，不同的是，实施例7做为标准分析物的TNF-α蛋白的浓度为10pg/ml，而实施例7的待测分析物分别为三位受试者的泪液样本12.5μl，其结果如图8所示。

[0107] 实施例8

[0108] 实施例8以电脑软体模拟使用100纳米的标记粒子(聚苯乙烯荧光粒子)与40纳米的金纳米粒子，形成如上述的第二复合体时，随标记粒子上所附接的金纳米粒子的数量变化而产生的热扩散度的变化情形。所述电脑模拟是依照下述数学式进行运算，其简述如下：首先，使用式(1)计算金纳米粒子接附于标记粒子上的数量；接着，使用式(2)及上述数量换算得到接附有金纳米粒子的标记粒子(即第二复合体)的体积；然后，使用式(3)计算第二复合体的有效半径；接下来，使用式(4)计算第二复合体在常温下的热扩散度。实施例8的电脑模拟结果如图9A所示。

[0109]

[0110]

[0111]

[0112]

[0113] 于式(1)至式(4)中，R为标记粒子半径，r为金纳米粒子半径，N为单一标记粒子所接附的金纳米粒子数量，V为第二复合体的体积，dp为有效半径，Kb为波兹曼常数，ν为水的粘度，T为温度(此处以25℃计)。

[0114] 实施例9至11

[0115] 实施例9至11是与实施例8以相同的方式进行，不同的是，实施例9至11改变标记粒子及/或金纳米粒子的等效粒径，其中实施例9使用200纳米的标记粒子和80纳米的金纳米粒子，实施例10使用5微米的标记粒子和40纳米的金纳米粒子，而实施例11使用5微米的标记粒子和80纳米的金纳米粒子。实施例9至11的结果如图9B至图9D所示。

[0116] 比较例4

[0117] 比较例4是使用与实施例4相同的方式来进行，但比较例4是使用实施例1的第一复合体进行施加激光与否对热扩散度的影响的测试。比较例4的结果悉如图7B所示。

[0118] 特别说明的是，本发明图5A至图7B中的「*」代表p<0.05「，**」代表p<0.01，及「***」代表p<0.001。

[0119] 请先参考图5A至图5F，其绘示本发明实施例1至3的热扩散度检测结果的长条图。如图所示，在TNF-α蛋白标准分析物的浓度分别为10μg/ml、1ng/ml以及10pg/ml的实施例1至3中，分别可检测与标准分析物浓度差为5倍至10倍的样品(例如图5A绘示使用10μg/ml的标准分析物，可检测10倍浓度差的1μg/ml和100μg/ml的待测分析物的例子)。在上述实施例中，标准分析物与待测分析物的热扩散度有显著差异。显然地，利用本发明的检测方法，侦测极限可达至少10pg/ml以上，且可达到较大的动态范围。

[0120] 另一方面，请参考图6A至图6C，其绘示本发明比较例1至3的热扩散度检测结果的长条图。如图所示，在TNF-α蛋白标准分析物的浓度分别为10μg/ml、1ng/ml以及10pg/ml的比较例1至3中，当标准分析物与待测分析物的浓度差为2倍时，其结果较为不稳定，因此本发明的标准分析物与待测分析物的浓度差较佳为大于2倍。

[0121] 接下来请参考图7A，其是绘示本发明实施例4和5的第二复合体施加激光与否的热扩散度结果的长条图。如图所示，实施例4(TNF-α蛋白浓度为1μg/ml)和实施例5(TNF-α蛋白浓度为1ng/ml)在施加激光后，对于第二复合体的热扩散度皆显著性地增加，代表施加激光可增加具有金纳米粒子(等效粒径为80纳米)的复合体的震动，从而可增加本发明的分析物浓度的检测方法的灵敏度。

[0122] 请参考图7B，其是绘示本发明实施例4、实施例6以及比较例4的第二复合体施加激光与否的热扩散度结果的长条图。如图所示，在具有相同浓度(10μg/ml)的TNF-α蛋白的第二复合体中，具有40纳米的金纳米粒子(实施例6)的第二复合体在施加激光前后的热扩散度差异显著，其是因为40纳米的金纳米粒子符合所施加的激光的波长，因而可产生显著的表面等离子体共振效应之故。而实施例4的80纳米的金纳米粒子对于激光有无的热扩散度差异相对较不明显但仍有差异。另一方面，比较例4的未有金纳米粒子的第一复合体虽然在统计上仍有显著性差异，其是因为施予激光会使粒子产生热泳的效应所致，然而根据图7B也可了解，相较于具有40纳米的金纳米粒子的第二复合体，比较例4的未有金纳米粒子的第一复合体施加激光与否的热扩散度差异不大。

[0123] 接着请参考图8，其是绘示应用本发明的分析物浓度的检测方法于泪液样本的实验结果。如图8所示，可藉由前述所说明的二分法定义标准线(10pg/ml)，检测样本中的特定物质的浓度是否高于或低于标准线。因此，可快速筛检出图8的三个样本(分别进行5重复)均低于标准线。据此，可将本发明的检测方法应用于临床的疾病快速筛检上。

[0124] 请参考图9A至图9D，其分别绘示实施例8至11的电脑模拟结果图。从图9A至图9D可知，接合不大于80纳米的金纳米粒子与100纳米以上(例如100纳米至5微米)的标记粒子所形成的第二复合体，对应不同接附量的金纳米粒子都可具有热扩散度的差异。此外，举例而言，以显微镜使用100倍物镜，CCD解析度为10μm/pix的状况而言，整体解析度可达10-16。因此，图9A至图9D的热扩散度确实可使用目前已知的设备观察。据此，本发明的分析物浓度的检测方法至少可适用100纳米至5微米的标记粒子与不大于80纳米的金纳米粒子的组合。

[0125] 本发明的分析物浓度的检测方法利用竞争反应分别制得的标准分析物的控制组以及待测分析物的待测组，比较上述二组的热扩散度差异，因而可简单利用二分法得知待测分析物的浓度高于或低于标准分析物，故可具有较低的侦测极限。上述方法利用金属纳米粒子增加所得的复合体的热扩散度差异，并可进一步利用激光造成金属纳米粒子的表面等离子体共振，从而更提高本发明的检测方法的侦测灵敏度。此外，本发明的标记粒子的等效粒径限制较少，本发明的检测方法的标准分析物可重复使用，并同时用于检测多组待测分析物。本发明的检测方法具有高侦测灵敏度、低侦测极限、广动态范围、操作简单、快速、良好再现性及低成本等优点，适用于非侵入式的疾病筛检。

[0126] 虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

[0127]

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