专利汇可以提供治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了 治疗 移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,包括以下步骤:提取患者体内的T细胞,并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR 嵌合 抗体 编辑到T细胞内,制备CAR-T细胞;对CAR-T细胞进行体外培养,并筛选出编辑成功的CAR-T细胞,进行提纯;构建PD1和CTLA4点突变质粒,并将PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中,进行 包装 浓缩,制备目的蛋白;向CAR-T细胞中导入目的蛋白并激活,再筛选出导入成功的目的细胞,进行刺激、扩增制备细胞制剂,得到CAR-Treg军团;将培养好的CAR-Treg军团输回患者体内。有益效果:可以抑制细胞免疫, 预防 急性排斥反应的发生,同时有助于预防固有免疫介导的慢性排斥反应。,下面是治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用专利的具体信息内容。
1.治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
提取患者体内的T细胞,并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内,制备CAR-T细胞;
根据预设培养条件对所述CAR-T细胞进行体外培养,并筛选出编辑成功的所述CAR-T细胞,进行提纯;
采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒,并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中,进行包装浓缩,制备目的蛋白;
通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活,再筛选出导入成功的目的细胞,进行刺激、扩增制备细胞制剂,得到CAR-Treg军团;
将培养好的所述CAR-Treg军团输回患者体内。
2.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,所述提取患者体内的T细胞,并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内,制备CAR-T细胞具体包括以下步骤:
对所述T细胞进行分离处理,并将分离的CD3、CD8和T细胞激活后培养扩增;
使用携带CAR的重组慢病毒感染处理后的所述T细胞,制得CAR-T细胞。
3.根据权利要求2所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,所述提取患者体内的T细胞,并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内,制备CAR-T细胞还包括以下步骤:
获取患者血压样本;
采用离心法对所述血液样本进行离心处理,获取所述血液样本中的单个核细胞;
对所述单个核细胞进行分选获取所述T细胞。
4.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,所述预设培养条件为:恒温37℃,CO2浓度5%,相对饱和湿度95%,细胞培养基PH值
7.2-7.4。
5.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,所述采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒,并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中,进行包装浓缩,制备目的蛋白具体包括以下步骤:
以待突变的PD1和CTLA4质粒为模板,使用突变引物及Muta-directTM酶进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变,获取突变质粒DNA;
在所述PCR扩增反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒,并选择突变质粒DNA;
将反应后的所述突变质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中进行转化,获取PD1和CTLA4点突变质粒;
将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中进行逆转录,并进行包装浓缩,获取目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,所述突变引物的设计原则包括:
使用经过钝化的突变引物,且所述突变引物的长度为30-35bp,以要突变的碱基为中心,两边各加上至少11-12bp的突变引物,并且合成多一条反向互补的突变引物;
根据设定所述突变引物的长度,计算所述突变引物的Tm值,并确保所述Tm值达到78℃。
7.根据权利要求5所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,在所述PCR扩增反应完成后需要冰育5min,然后置于室温中。
8.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法,其特征在于,所述通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活,再筛选出导入成功的目的细胞,进行刺激、扩增制备细胞制剂,得到CAR-Treg军团具体包括以下步骤:
通过细胞扩散的方式将所述目的蛋白导入所述CAR-T细胞中获取目的细胞,并通过与试剂接触激活所述目的细胞;
筛选出导入成功的目的细胞,并将所述目的细胞置于扩增培养液中培养,每周重复刺激1次,连续刺激2周,以获得足够量的所述目的细胞,制备所述细胞制剂,得到所述CAR-Treg军团。
9.治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的应用,用于根据权利要求1构建的嵌合受体重组基因在治疗移植排斥反应中的应用。
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