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一种同时检测母乳及婴幼儿配方奶粉中六种重要甘油三酯位置异构体的方法

阅读：822发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种同时检测母乳及婴幼儿配方奶粉中六种重要甘油三酯位置异构体的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明方法属于食品检测领域，涉及一种检测母乳及婴幼儿配方奶粉中6种甘油三酯位置异构体(rac-PPO/rac-POP,rac-OPO/rac-OOP,rac-LaOO/rac-OLaO)的方法。本发明主要包括以下步骤：(1)母乳乳及婴幼儿配方奶粉中甘油三酯的定性及目标甘油三酯分子的靶向收集；（2）离线二维液相色谱-ELSD分离6种位置异构体；（3）检测方法的方法学验证；（4）检测方法在母乳和婴幼儿配方奶粉中的应用。本发明方法能够同时检测6种乳及婴幼儿配方奶粉中的位置异构体，并且具有操作简单、精密度高、稳定性好、易于定量等优点。，下面是一种同时检测母乳及婴幼儿配方奶粉中六种重要甘油三酯位置异构体的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种单个或同时检测母乳及婴幼儿配方奶粉中六种重要甘油三酯位置异构体的方法，其特征在于:不仅能够检测母乳中尚未报道的LaOO甘油三酯的位置异构体（rac-LaOO/rac-OLaO），并且能够兼顾rac-OPO/rac-OOP和rac-PPO/rac-POP，位置异构体的检测,该方法按照以下步骤进行: 1) 脂质提取: 取母乳2ml或婴幼儿配方奶粉0.1g，用Folch法提取总脂，提取液旋蒸至干，然后用二氯甲烷定容，0.22μm有机相膜过滤备用; 2)一维色谱：目标甘油三酯分子（OPO、PPO、LaOO）的靶向收集:将样品1mg/ml的脂肪样品注入到连有C18色谱柱的液相色谱-三重四极杆质谱联用仪中，进样体积为10μl，并用质谱技术确定明确目标甘油三酯分子（OPO、PPO、LaOO）的保留时间; 然后将20mg/ml脂肪样品注入到连有C18色谱柱的液相色谱中，进样体积为20μl，利用自动收集器对目标甘油三酯分子进行靶向收集，并用氮气吹干备用; 3)二维色谱：目标甘油三酯分子位置异构体的检测: 利用银离子色谱柱，配合具有蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱对收集的甘油三酯分子的位置异构体进行进一步检测。
2.根据权力要求1所述的方法其特征在于利用二维色谱技术，有效排除样品中其他甘油三酯分子的干扰，使目标甘油三酯的位置异构体能够在银离子色谱柱中有效分离。
3.根据权力要求1-2所述的方法，其特征在于，利用C18反相色谱有效靶向收集目标甘油三酯分子,色谱柱为 Zorbax Eclipse Plus C18 (5µm, 250 mm×4.6 mm,Agilent Technologies,USA),液相洗脱条件见表1
表一: C18非水相液相色谱流动相梯度洗脱条件
样品浓度为20mg/ml,进样体积为20µl,柱温为30℃ 。
4.根据权力要求1-3所述的方法，其特征在于能够利用银离子色谱同时对rac-OPO/rac-OOP, rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/ rac-OLaO 六种位置异构体进行检测, 银离子色谱柱为Varian ChromSpher 5 Lipids (5μm,250 mm×4.6 mm, Agilent Technologies,USA),液相洗脱条件见表2
表二:银离子色谱流动相梯度洗脱条件
蒸发光检测器的条件为：漂移管温度恒定为40℃，喷雾气为氮气，压力为3.5bar。
5.根据权力要求1-4所述的方法，检测母乳中rac-OPO/rac-OOP、 rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/ rac-OLaO 六种位置异构体。
6.根据权力要求1-4所述的方法，检测婴幼儿配方奶粉中rac-OPO/rac-OOP, rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/ rac-OLaO 六种位置异构体。

说明书全文

一种同时检测母乳及婴幼儿配方奶粉中六种重要甘油三酯位

置异构体的方法

技术领域

[0001] 本发明属于脂质检测领域，本发明涉及一种同时或单个检测母乳中六种重要甘油三酯位置异构体的方法。

背景技术

[0002] 母乳为婴儿提供全部所需营养，乳脂作为乳中主要的成分之一，不仅能够为婴儿提供50%的能量并且能够提供多种具有生理功能的脂肪酸。母乳脂中主要的成分为甘油三酯约占乳脂的97-98%。研究表明，不仅脂肪酸的种类组成，脂肪酸在TAG中的分布位置及TAG的结构同样对脂肪的物理和营养特性起决定性作用。如饱和脂肪酸，尤其棕榈酸在Sn-2位分布时能够避免棕榈酸与钙离子形成皂钙，从而促进棕榈酸和钙离子的吸收。并且母乳脂中的脂肪酸分布不是随机的，例如70%的棕榈酸在Sn-2位，而油酸，亚油酸等不饱和脂肪酸多分布在Sn-1,3位上。因此不仅母乳中甘油三酯脂肪酸位置分布和甘油三酯分子组成的研究，母乳中甘油三酯同分异构体检测方法的建立，同样在婴幼儿奶粉仿母乳化发展进程中有着不可替代的地位。

[0003] 目前，在母乳甘油三酯大量的同分异构体中，除OPO和PPO的位置异构体的组成已经明确外，其他主要甘油三酯的位置异构体(LaOO等)尚未被报道。这形成了婴幼儿乳粉配方组织更深入仿母乳瓶颈，以及生产过程成分监控带来了困难。而rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP和rac-LaOO/rac-OLaO六种位置异构体同时检测方法的建立大大缩短了检测六种位置异构体的时间，并且有利于六种位置异构体的同时监控。

发明内容

[0004] 发明目的：提供一种母乳及婴幼儿配方奶粉中甘油三（rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP和rac-LaOO/rac-OLaO）位置异构体的单柱二维液相色谱-ELSD的方法。该方法操作简单，能够实现母乳及婴幼儿配方奶粉中六种甘油三酯位置异构体的同时检测。

[0005] 技术问题：本发明要解决的技术问题如下：1）由于母乳及婴幼儿配方奶粉中含有几十种甘油三酯分子，容易导致其他甘油三酯分子与目标甘油三酯在银离子色谱中的重叠现象；2）二维色谱法排除了银离子色谱检测位置异构体过程中目标甘油三酯易与其他甘油三酯重叠现象；3）rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP和rac-LaOO/rac-OLaO 六种甘油三酯在银离子色谱中的同时检测，简化了检测步骤，缩短了检测时间，为婴幼儿配方奶粉中的成分检测提供了便利。

[0006] 技术方案：本发明涉及一种同时或单个检测母乳及婴幼儿配方奶粉中六种位置异构体同时检测的方法。通过该方法，能够排除六种目标甘油三酯（rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP和rac-LaOO/rac-OLaO）以外的甘油三酯的干扰。并且能够同时监测rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP和rac-LaOO/rac-OLaO六种甘油三酯的位置异构体的含量。满足了操作简单，易于定量的要求。

[0007] 本发明采用的技术方案是：准确检测母乳或婴幼儿配方乳粉中OPO、PPO、LaOO甘油三酯分子组分：1）样品预处理：样品用Folch法提取总脂，提取液旋蒸至干，然后用二氯甲烷定容，过膜备用。2）甘油三酯分子分离过程：采用 Zorbax Eclipse Plus C18 (5µm, 250mm×4.6 mm,Agilent Technologies,USA)色谱柱，根据不同的ECN（碳原子当量）分离样品中的甘油三酯分子，将样品中的甘油三酯分子初步分离。液相梯度洗脱条件见表1。

[0008] 表一：C18非水相液相色谱流动相梯度洗脱条件样品浓度为20mg/ml,进样体积为20µl,柱温为30℃.
3）甘油三酯分子定性。采用APCI-MS（大气压力化学电离质谱，Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry）产生的离子碎片推断甘油三酯分子的结构。并且明确目标甘油三酯分子（OPO、PPO和LaOO）的保留时间。质谱条件如下：APCI离子源，fragmentor：70V，扫描范围：350 1200。4）目标甘油三酯分子的靶向收集。利用自动收集器，~
以2min/管的速度收集C18反向色谱的组分，将OPO、PPO和LaOO甘油三酯分子相应保留时间的试管收集起来，氮气吹干备用。

[0009] rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/rac-OLaO六种位置异构体同时检测方法的建立。1）标准溶液配制：用二氯甲烷溶解25mg OPO、OOP、OLaO、LaOO、POP、PPO六种标准品至25mL容量瓶中，配制成1000mg/L的标准储备液，过膜备用。2）银离子色谱液相条件的优化。采用银离子色谱柱Varian ChromSpher 5 Lipids (5μm,250 mm×4.6 mm, Agilent Technologies,USA)，配合具有蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱，对25 mg/L的混合标准品，进行检测。采用二氯甲烷、丙酮体系分别从流速和流动相梯度进行优化，进样体积 10μl。优化指标用分离度R表示，R>1.5认为两个色谱峰实现分离，分离度较好。最终银离子色谱的液相梯度洗脱条件见表2。

[0010] 表二: 银离子色谱流动相梯度洗脱条件蒸发光检测器的条件为：漂移管温度恒定为40℃，喷雾气为氮气，压力为3.5bar。

[0011] 外标法对样品中rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/ rac-OLaO 六种位置异构体进行定量。1）用液相色谱仪分别对取rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/ rac-OLaO六种标准储备液，二氯甲烷稀释成浓度为5、10、15、20、25、30、40mg/L的标准溶液，过膜后注入液相色谱分析（进样体积10μl），记录峰面积。2）根据蒸发光散热检测器的散射光响应值与粒子质量的关系为I=km b ，I表示待测组分所产生的散射光光强，m表示待测组分的粒子质量和，k和b为常数；通过使用双对数方法产生线性曲线，lg(I)=b·lg(m)+lg(k)。以甘油三酯峰面积的常对数值为X值，以甘油三酯含量的常对数值为Y值，绘制线性回归曲线，其线性回归方程可表示为：Y=aX+b。

[0012] 本发明测定方法的方法学验证。1）线性关系。取OPO等六种标准储备液适量，二氯甲烷稀释成浓度为5、10、15、20、25、30和40 mg/L的标准溶液，经滤膜孔径为0.45μm的针式抽滤器过滤后，经液相色谱分析（进样量10μl），记录峰面积，进行线性分析。2）精密度。分别取0.1g(精确到0.0001g)同一婴儿配方乳粉六份（母乳乳取2ml），按照[0007]对其进行前处理，液相色谱分析，记录峰面积，计算相对标准偏差。3) 稳定性。取浓度为20mg/L混合标准品溶液，分别于0、1、3、6、10和24小时测定其峰面积，计算相对标准偏差。4) 最低检测限与最低定量限的测定。取OPO标准储备液适量，加二氯甲烷逐步稀释，进入液相色谱仪进行测定，直至其峰高约为噪音的10倍(信噪比S/N=10)，记录进样浓度，按照公式D1= 10NW/A计算最低定量限(D1为定量限，N为噪音峰高，W为进样浓度，A为OPO峰高)。

[0013] 技术效果。本发明可以同时有效分离rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP、 rac-LaOO/ rac-OLaO六种位置异构体。有利于六种甘油三酯位置异构体的同时监测。并且利用二维液相色谱技术，能够有效快速获得目标甘油三酯组分，排除其他甘油三酯分子的干扰，实现了母乳及婴幼儿配方奶粉等复杂样品中六种甘油三酯位置异构体的检测。

[0014] 本发明利用C18色谱有效将样品中的甘油三酯分子初步分离，并能够靶向收集目标甘油三酯（图1）。

[0015] 本发明能够同时将rac-OPO/rac-OOP、rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/ rac-OLaO六种位置异构体进行分离（图2），且分离度良好， POP与PPO、OPO与OOP、OLaO与LaOO的分离度分别为 4.70， 2.52， 2.56。

[0016] 在本发明建立的银离子色谱柱-ELSD液相色谱条件中，rac-OPO/rac-OOP、 rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/ rac-OLaO六种甘油三酯分子的响应值与浓度呈现出良好的线性关系见表3。

[0017] 表三: 六种标准品的线性及相关系数说明能够本发明能够准确对样品中的六种位置异构体进行定量。

[0018] 本发明呈现出良好的精确度和稳定性。结果显示，母乳中PPO、OPO和LaOO精密度（RSD）分别为2.89%、2.85%和2.66%；而稳定性分别为1.37%、1.98%和2.09%。

[0019] 本发明的最低检测限与最低定量限能够满足所测样品需求。OPO的定量限为2μg/ml，检测限为0.6μg/ml；PPO的定量限为1μg/ml，检测限为0.3μg/ml；LaOO的定量限为2μg/ml，检测限为0.6μg/ml。

[0020] 加标回收率结果表明，本发明有较高的回收率。OPO的加标回收率为84.8% 90.2%；~
LaOO的加标回收率为85.2% 88.5%；PPO的加标回收率为83.2% 89.7%。
~ ~

[0021] 附图说明图中：图1是实例中C18现有方法的梯度洗脱条件下的母乳脂色谱图；图2 是银离子色谱在本发明的梯度洗脱条件下标准品混合液制作的液相色谱图；图3是本发明中 rac-OPO，rac-OOP，rac-LaOO，rac-OLaO的标准曲线图rac-OPO/rac-OOP位置异构体在本发明的液相条件下的液相色谱图；图4是婴幼儿配方奶粉中rac-OPO/rac-OOP位置异构体在本发明的液相条件下的液相色谱图；图5是母乳中rac-OLaO/rac-LaOO位置异构体在本发明的液相条件下的液相色谱图；图6是婴幼儿配方奶粉中rac-POP/rac-PPO，rac-OPO/rac-OOP位置异构体在本发明的液相条件下的液相色谱图。。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0023] 具体实施例 1：母乳样品，用刻度吸管移取2ml液体样品，加入20ml氯仿/甲醇（v:v，2:1），涡旋1min，冰浴30min。30min后取出静置5min，5000rpm离心10min，取下层有机相，水相用10ml氯仿/甲醇（v:v，2:1）重提两次，合并有机相，氮吹至干，备用。将20mg/ml的母乳脂肪样品注入到C18液相色谱中，进样量为 20μl，色谱条件同表1，收集目标OPO, PPO和LaOO组分。用氮气将收集的OPL-TAG组分吹干，并用50ul正己烷重溶。将5μl重溶的样品注入到银离子色谱中，色谱条件同表2，检测rac-OPO/ rac-OOP、rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/ rac-OLaO六种位置异构体。结果表明本发明能够有效检测母乳样品中六种位置异构体的含量。母乳中rac-OPO与rac-OOP的相对含量比例为rac-OPO占89.8±1.0%，rac-OOP占10.2±
1.0%。rac-OLaO与rac-LaOO的相对含量比例为rac-OLaO占73±1.1%，rac-LaOO占27.0±
1.1%。rac-PPO与rac-POP的相对含量比例为rac-PPO占97.4±0.6%，rac-POP占2.6±0.6%。

[0024] 具体实施例2：乳粉试样，称取0.1g（精确到0.0001g），加入1ml 40℃的蒸馏水涡旋混匀，加入10ml氯仿/甲醇（v:v，2:1），涡旋1min，置于-20°C 冰箱中30min，每10min取出涡旋混匀一次。30min后取出静置5min，5000rpm离心10min，取下层有机相，水相用5ml氯仿/甲醇（v:v，2:1）重提两次，合并有机相，氮吹至干，待用。将20mg/ml提取的脂肪样品注入到C18液相色谱中，进样量为 20μl，色谱条件同表1，收集目标OPO, PPO和LaOO组分。用氮气将收集的OPL-TAG组分吹干，并用50ul正己烷重溶。将5μl重溶的样品注入到银离子色谱中，色谱条件同表2，检测rac-OPO/ rac-OOP、rac-PPO/rac-POP、rac-LaOO/ rac-OLaO六种位置异构体。结果表明，rac-OPO与rac-OOP的相对含量比例为rac-OPO占72.1±0.8%，rac-OOP占27.9±0.8；rac-PPO与rac-POP的相对含量比例为rac-PPO占96.6±0.6%，rac-POP占3.4±0.6%。 rac-LaOO和 rac-OLaO在乳粉中未检测到。

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