发明领域

本发明涉及一种修饰的核酸寡聚体，及一种电化学测定特定序列的核酸寡聚 体杂合体的方法。

                背景技术

带有自动射线照相术或光学检测的凝胶电泳法通常用于DNA和RNA的序列 分析，例如，在疾病诊断，毒理试验程序，基因研究和发展，以及在农业和药学 界中。

为举例说明最著名的带有光学检测的凝胶电泳法(桑格Sanger法)，图1b 表示具有引物的DNA片段。在桑格法中，含有DNA的溶液被分成四份样品，每 份样品的引物用一种在特定波长发光的荧光染料进行共价修饰。例如图1b所示， 向每个样品中加入脱氧核糖核苷三磷酸的碱基A(腺嘌呤)，T(胸腺嘧啶)，C(胞 嘧啶)和G(鸟嘌呤)，即dATP,dTTP,dCTP和dGTP，由引物出发，通过DNA 聚合酶Ⅰ酶催复制单链。除了四个既氧核糖核苷三磷酸，每个反应混合物同样包 含足够的这些核苷三磷酸中之一的2’,3’-双脱氧类似物(图1a)作为嵌段碱基 (每个样品含一个属于四个可能的嵌段碱基中的一个)使在所有可能的键位上终 止复制。将四个样品混合后，被复制的DNA片段的所有长度都具有嵌段碱基特 有的荧光且可被凝胶电泳按照长度排序，并可用于荧光光谱定性。

另外一个光学检测方法是依据荧光染料的累积。例如，在寡核苷酸上的溴 化乙锭。当这样的染料在双链DNA或RNA上累积时，其荧光与这些染料在自由 的溶液中相比要增加约20倍，因此可被用于测定结合的DNA或RNA。

在放射标记中，32P被结合在寡核苷酸的磷酸骨架中，通常32P是通过多核 苷酸激酶被加到5’-羟基的末端。此后，被标记的DNA在限定的条件下，在四种 核苷酸的某一类型中的每种被优先断裂，以便得到每个链一种断裂的平均值。这 样，对于一个已经给定的碱基类型，都存在于反应混合物自32P标记到该碱基位 置延伸的链中(如果碱基存在多种外观，将得到相应不同的链长)。这四种片段 混合物，随后在用凝胶电泳法在四个泳道上进行分离。此后，准备凝胶自动射线 照相，从中可直接读出序列。

近年来发展出了一种基于光学(或自动射线照相)检测的更进一步的DNA 序列测定方法，及寡聚体杂合方法测序。(cf.例如，Drmanac et al.,Genomics 4,(1989),pp.114-128，或Pains et al.,Theor.Biol.135,(1988), pp.303-307)。在这种方法中，一整套短寡核苷酸或寡聚体(探针寡核苷酸)， 例如一种寡核苷酸八聚体的A,T,C，和G碱基的全部65,536种可能组合被键 合到一种载体上。在含有65,536种测试位点的有序的载网上发生附着，而且每 个单独的测定位点(寡核苷酸组合)的位置是已知的。在这样的一个杂合基质上， 寡核苷酸碎片，一种序列待测的DNA片段，即目标DNA，用荧光染料(或32P) 标记，并在仅允许一个特定的双链形成的条件下进行杂合。在这种方法中，目标 DNA片段仅附着在寡聚体上(在此例子中在八聚体上)，它们本身的序列正好被 相应的一部分(一种八聚体)补足。这样，片段中的所有寡聚体序列(八聚体序 列)都可以通过光学(或自动射线照相)检测杂合DNA片段的连接位置的方法 测定。由于相邻的寡聚体序列的相互覆盖，可以使用适当的数学算法测定连续的 DNA片段序列。这种方法的优点之一在于，测序的小型化并可在一次操作中同 时捕获大量的数据。另外，可免除引物和DNA片断的凝胶电泳分离。这种原理 可通过图2的有13个碱基长的DNA片段举例说明。在DNA/RNA序列测定中使用 放射活性的标记也伴随着一些缺点，例如，费事，在处理放射性物质时合法地需 要安全预防措施，空间上限制了分辨能力(最大1mm2)，且只有当灵敏度高时， 放射活性的片段才放射作用于X-射线胶片上一适当长的时间(几小时到几天)。 尽管可以通过额外的硬件和软件增加空间分辨率，且检测时间可用β-扫描器减 少，但这两种方法都会增加额外的开支。

通常用于标记DNA的一些荧光染料(例如溴化乙锭)是诱导基因突变的， 当用于自动放射照相时需要适当的安全防护措施。在几乎每种情况下，使用光学 检测都需要使用一种或多种激光系统，及有经验的人员和适当的安全防护措施。 荧光的实际检测还需要额外的硬件，例如放大用光学部件，以及在象Sanger法 中的具有变化的激发和询问波长的情况下还需要控制系统。这样，根据需要的激 发波长和需要的检测操作，将导致花费可观的费用。在用寡聚体碎片上的杂合测 序方法中，检测也相当昂贵，因为除了激发体系，还需要高分辩率CCD照相机 (电荷耦合装置照相机)用于荧光点的2-维检测。

因比，尽管现在有大量的极为灵敏的DNA/RNA序列测定方法，但这些方法 都是费时的，需要费力的样品准备及昂贵的设备，并且通常不能作为一种便捷的 系统被提供。

                  发明描述

因此，本发明的目的在于发明一种不存在现有技术的缺点的检测核酸寡聚 体杂合体的仪器和方法。

根据本发明，发明目的是通过按照独立权利要求1的方法修饰寡核苷酸， 按照独立权利要求9和10的方法制备修饰的寡核苷酸，按照独立权利要求11 的方法修饰导电表面，按照独立权利要求21的方法制备一种修饰的导电表面， 以及按照独立权利要求27的方法电化学测定寡聚体杂合体来解决的。

下面为本文中使用的缩略语和术语： 遗传学 DNA 脱氧核糖核酸 RNA 核糖核酸 PNA 肽核酸(以氨基酸取代糖磷酸部分的合成DNA或RNA。如果 用-NH-(CH2)2-N(COCH2-碱基)-CH2CO-部分代替糖磷酸部分， PNA将与DNA杂合。 A 腺嘌呤 G 鸟嘌呤 C 胞嘧啶 T 胸腺嘧啶 碱基 A,G,T或C  bp 碱基对 核酸 至少两个共价结合的核苷或至少两个共价结合的嘧啶(例如， 胞嘧啶，胸腺嘧啶，或尿嘧啶)或嘌呤碱(例如，腺嘌呤或 鸟嘌呤)。术语核酸是指共价结合的嘧啶或嘌呤碱基的任何主 链，例如DNA,cDNA，或RNA的糖磷酸主链，PNA的肽主链， 或类似的结构(例如，膦酰胺，硫代磷酸盐，或二硫代磷酸 盐主链)。根据本发明核酸的基本特征在于它可以与天然存在 的cDNA或RNA进行特定序列键合。 核酸寡聚体 核酸的碱基长度没有进一步的限定(例如核酸八聚体，一种

由8个嘧啶或嘌呤碱基相互间共价键合得到的任何主链)。 寡聚体 相当于核酸寡聚体。 寡核苷酸 相当于寡聚体或核酸寡聚体，例如DNA,PNA，或RNA片段的 碱基长度没有进一步限定。 寡核苷 寡核苷酸的缩写 dATP  A的脱氧核糖核苷三磷酸酯(DNA部分用A碱基与两个进一步 的磷酸酯构成一长链DNA片段或寡核苷酸) dGTP  G的脱氧核糖核苷三磷酸酯(DNA部分用G碱基与两个进一步 的磷酸酯构成一长链DNA片段或寡核苷酸) dCTP  C的脱氧核糖核苷三磷酸酯(DNA部分用C碱基与两个进一步 的磷酸酯构成一长链DNA片段或寡核苷酸) dTTP  T的脱氧核糖核苷三磷酸酯(DNA部分用T碱基与两个进一步 的磷酸酯构成一长链DNA片段或寡核苷酸) 引物 一种寡核苷酸的初始互补片段，引物的碱基长度仅为约4-8 个碱基。起到酶催复制寡核苷酸的起始位点的作用。 错配序列 为形成Waston Crick双链寡核苷酸结构，两个单链以下列方 式杂合，即一个链的A(或C)碱基与另一个链的T(或G) 碱基形成氢键(在RNA中，以尿嘧啶代替T)。其它的碱基对 不能形成氢键，扭曲了结构，因此被称作错配序列。 ds 双链 ss 单链 化学物质/基团 R 没有被进一步限定的任何有机残基的一种取代基或侧链

氧化还原剂 具有氧化还原活性的物质 烷基 术语烷基是指直链或支链的饱和烃基(例如，乙基，异丙基， 或2,5-二甲基己基，等)当烷基被用于指一种连接基团或间 隔基团时是指可提供两个共价键的基团(例如，-CH2CH2-,-CH2 CH2CH2-，或-CH2C(CH3)2CH2CH2C(CH3)2CH2-等)。烷基基 团是指链长1-30的R取代基或侧链(指原子间相互键合的最

长的连续的链)。烷基基团指链长1-20的连接基团或间隔基 团，特别的链长为1-14，链长代表连接基团或间隔基团之间 最短的连接。 烯基 烷基中的一个或多个C-C单键被C=C双键所取代。 炔基 烷基或烯基中的一个或多个C-C单键或C=C双键被C≡C三键 所取代。 杂烷基 烷基中的一个或多个C-H键或C-C单键被C-N,C=N,C-P,C-O, C=O,C-S，或C=S键所代替。 杂烯基 烯基中的一个或多个C-H键，C-C单键或C=C双键被C-N,C=N, C-P,C-O,C=O,C-S，或C=S键所代替。 杂炔基 炔基中的一个或多个C-H键，C-C单键，C=C双键或C≡C三 键被C-N,C=N,C-P,C-O,C=O,C-S，或C=S键所代替。 连接基团 连接在两个分子间，或原子表面，分子表面或分子基团表面 与另一分子之间的分子。连接基团通常以烷基，烯基，炔基， 杂烷基，杂烯基，或杂炔基链的形式购买，该链可在两个位 置被(相同或不同的)活性基团衍生。该基团在简单的/已知 的化学反应中与适当的反应物反应形成共价化学键。反应基 团也可以被光学激活，例如，活性基团仅被具有特定的或随 机的波长的光所激活。优选的连接基团为链长1-20，特别的 为链长1-14的基团，其中链长指在结构之间被连接的最短的 连续连接，即在两个分子之间，或原子表面，分子表面或分 子基团表面与另一分子之间。

间隔基团 一种从活性基团到一个或两个要被连接的结构之间通过共价 连接的连接基团(见连接基团)。优选的间隔基团为链长1-20， 特别的为链长1-14的基团，其中链长指在结构之间被连接的 最短的连续连接。 (n×HS-间 隔基)-寡核 苷 一种核酸寡聚体，其n个硫醇官能团每个都通过一个间隔基 团与之接触，其中每个间隔基团可具有不同的链长(在硫醇 官能团与核酸寡聚体之间最短的连续连接)，特别的可为1-14

之间的任意链长。这些间隔基团反过来可被那些本身存在于 核苷酸寡聚体中，或通过修饰的方法被固定在其上的不同的 活性基团所键合，“n”为任意整数，特别为1-20的整数。 (n×R-S-S- 间隔基)-寡 核苷 一种核酸寡聚体，其n个二硫代官能团每个都通过一个间隔 基团与之接触，且任何残基R都被二硫代官能团所饱和。每 个连接二硫代官能团和核酸寡聚体的间隔基团可具有不同的 链长(在二硫代官能团与核酸寡聚体之间最短的连续连接)， 特别的可为1-14之间的任意链长。这些间隔基团反过来可被 那些本身存在于核苷酸寡聚体中，或通过修饰的方法被固定 在其上的不同的活性基团所键合。“n”为任意整数，特别为 1-20的整数。 寡核苷-间隔 基-S-S-间隔 基-寡核苷 两个相同或不同的核酸寡聚体通过一二硫桥相互连接，二硫 桥与核酸寡聚体之间通过任意两个间隔基团连接，且两个间 隔基团可以潜在的具有不同的链长(在二硫桥与核酸寡聚体 之间最短的连续连接)，特别的可为1-14之间的任意链长。 这些间隔基团反过来可被那些本身存在于核苷酸寡聚体中， 或通过修饰的方法被固定在其上的不同的活性基团所键合。 PQQ 吡咯喹啉醌；对应于4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯-[2,3- f]-喹啉-2,7,9-三羧酸 TEATFB 四乙基铵-四氟硼酸盐 硫代-NHS  N-羟基硫代琥珀酰亚胺 EDC (3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺 HEPES  N-[2-羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸] Tris 三羟甲基胺甲烷 EDTA 乙二氨基二胺四乙酸盐(钠盐) 胱胺 (H2N-CH2-CH2-S-)2 修饰表面/电极 Mica  Muskovite小板，用于薄层的一种载体 Au-S-ss-寡核 在云母上的金薄膜，与衍生的12-bp单链寡核苷酸(序列：

苷-PQQ  TAGTCGGAAGCA)单层共价结合。这里，寡核苷酸在3’端的末 端磷酸基团用(HO-(CH2)2-S)2酯化成P-O-(CH2)2-S-S- (CH2)2-OH，均一的断裂S-S键，每个制成一个Au-S-R键。 寡核苷酸5’端的末端胸腺嘧啶碱基在C-5碳原子处用- CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-修饰，而残基反过来通过酰胺化 用其游离的氨基基团与PQQ的羧基基团结合。 Au-S-ds-寡核 苷-PQQ 与ss-寡核苷互补的寡核苷酸杂合的Au-S-ss-寡核苷-PQQ(序 列：TAGTCGGAAGCA) 电化学 E 工作电极的电极电位 E0 半波电位，用于循环伏安法的可逆电氧化或还原的氧化和还 原电流的最大值的中间电位。  i     电流密度(电极表面每cm2的电流)  循环伏安法     记录电流-电压曲线。固定工作电极的电位作为时间的函数发     生线性变化，从没有发生电氧化还原的电位开始，到一种物     质在电极上被氧化或还原而被溶解或吸收的电位结束(即电     流漂移)。通过氧化或还原启动操作后，在电流-电压曲线中     得到一初始增长电流，达到一最大值后，电流逐渐减小，以     电位可逆的方向反馈。产物的电氧化或电还原的行为而后在     可逆的过程中被记录。  电流分析法     记录电流-时间曲线。在此，工作电极的电位，通过例如一电     压降的方法，被设定为一个电位值，在此电位发生一溶液或     被吸收物种的电氧化或还原，且漂移电流被作为时间的函数     加以记录。

本发明涉及一种核酸寡聚体，该寡聚体被一种具有氧化还原活性的物质用 化学附着的方法修饰。根据本发明，核酸寡聚体为一种化合物包含至少两个共价 结合的核苷或至少两个共价结合的嘧啶(例如，胞嘧啶，胸腺嘧啶，或尿嘧啶) 或嘌呤碱(例如，腺嘌呤或鸟嘌呤)，优选的为DNA,RNA，或PNA片段。在此所 使用的术语核酸是指共价结合的嘧啶或嘌呤碱基的任何主链，例如DNA,cDNA, 或RNA的糖磷酸主链，PNA的肽主链，或类似的结构，例如，膦酰胺，硫代磷酸 盐，或二硫代磷酸盐主链。根据本发明核酸的基本特征在于它可以与天然存在的 cDNA或RNA进行特定序列键合。术语“(探针)寡核苷酸”，“核酸”，及“寡聚 体”作为术语“核酸寡聚体”的替代说法。

具有氧化还原活性的物质可在电位φ下选择性被氧化和还原，其中φ满足条 件2.0V≥φ≥-2.0V。电位在此是指游离的，没经修饰的具有氧化还原活性的物 质在适宜的溶剂中在正常的氢电极上测定。根据本发明，优选的电位范围为1.7V ≥φ≥-1.7V，特别优选的范围为1.4V≥φ≥-1.2V，及0.9V≥φ≥0.7V，在此 电位下应用的实施例的具有氧化还原活性的物质被氧化还原，是更为优选的。另 外，本发明涉及一种导电表面，在其上一种含有可被氧化还原物质吸附的核酸寡 聚体直接或间接的(通过一间隔基团)被化学键合。进一步的，本发明涉及一种 制备一种修饰的导电的表面的方法，其中将一种修饰的核酸寡聚体应用与导电的 表面。根据本发明的进一步的方面，本发明涉及一种方法，该方法允许电化学检 测分子结构，特别是在一种探针溶液中通过特定序列的核酸寡聚体的杂合来电化 学检测DNA/RNA/PNA碎片的结构。通过电化学信号的方法检测杂合体是一种简 单而且经济的方法，而且在一种测序装置的电池操作变化中允许现场应用。 将一氧化还原部分与核酸寡聚体键合

对于本发明的方法，将一种具有氧化还原活性的物质与核酸寡聚体键合是 十分必要的。根据本发明，任何氧化还原活性的物质都可以用于此目的，只要它 的选择性氧化和还原的电位满足在2.0V≥φ≥-2.0V的条件。电位在此是指游离 的，没经修饰的具有氧化还原活性的物质在适宜的溶剂中在正常的氢电极上测 定。根据本发明，优选的电位范围为1.7V≥φ≥-1.7V，特别优选的范围为1.4V ≥φ≥-1.2V，及0.9V≥φ≥-0.7V，在此电位下应用的实施例的具有氧化还原活 性的物质被氧化还原，是更为优选的。根据本发明，术语“选择性氧化的或还 原的”可以被理解为一种氧化还原反应，即释放或得到电子，选择性的发生在 具有氧化还原活性的物质上。因此，在最后，对于所应用的电位，没有核酸寡聚 体的其它部分被氧化或还原，只有排阻的，与核酸寡聚体键合的氧化还原活性物 质被还原或氧化。

根据本发明，氧化还原活性的物质可以理解为是指在相应的载体表面(电 极)上电化学可接受的电位范围内，可被在电极上应用一外部电压而电氧化或电 还原的任何分子。除了有机或非有机氧化还原活性物质例如六氰基高铁酸盐，二 茂铁，吖啶，酞菁染料，氧化还原活性染料例如具有通式1的(金属)卟啉， 具有通式2的(金属)叶绿素衍生物，或具有通式3的(金属)细菌叶绿素，(有 色的)天然存在的氧化剂例如通式4的黄素，通式5的吡啶-核苷酸，通式6的 吡咯-喹啉醌(PQQ)，或其它醌类例如通式7的1,4-苯醌，通式8的1,2-苯醌， 通式9的1,4-萘醌，通式10的1,2-萘醌，或通式11的9,10-蒽醌也是特别适 合在探针寡核苷酸上吸附的。

M=2H,Mg,Zn,Cu,Ni,Pd,Co,Cd,Mn,Fe,Sn,Pt等；R1到R12各自 独立的为H，或任意的烷基烯基炔基，杂烷基，杂烯基，或杂炔基。

R1到R8各自独立的为H，或任意的烷基，烯基，炔基，杂烷基，杂烯基， 或杂炔基。

根据本发明，一种具有氧化还原活性的物质是通过寡核苷酸与氧化还原活 性物质反应，共价键合到一种寡核苷酸上的。这种键可通过以下三种不同方法得 到： a)在核酸寡聚体上形成键的反应基团为寡核苷酸主链上的游离的磷酸，糖-C-3- 羟基，羧基，或氨基基团，特别的为寡核苷酸主链两端的基团。游离的末端磷酸， 糖-C-3-羟基，羧基，或氨基基团显示增加的反应性，因此可很容易地进行典型 的诸如与(伯或仲)氨基基团或与酸基团的酰胺化反应，与(伯、仲或叔)醇或 与酸基团的酯化反应，与(伯、仲或叔)硫醇或与酸基团的硫酯形成反应，或胺 和醛的缩合而后得到的CH=N键还原成CH2-NH键。共价连接所需要的具有氧化还 原活性的物质的结合基团(酸，氨基，醇，硫醇或醛官能团)可以是天然存在在 氧化还原活性物质中的，也可以是通过对氧化还原活性物质进行化学修饰后得到 的。 b)核酸寡聚体用用一种反应基团通过与任何组成和链长(代表要被连接的结构 之间的最短的连续的连接)的一共价连接的分子部分(间隔基团)在寡核苷酸主 链或在一碱基处加以修饰，特别的链长为1-14。修饰优选发生在寡核苷酸主链 的一端或在一末端碱基处。间隔基团可以为烷基，烯基，炔基，杂烷基，杂烯基， 或杂炔基。用于在氧化还原活性物质和核酸寡聚体之间形成共价连接的可能的简 单的反应如a)中所述，为酸基团和氨基基团的酰胺化反应，酸和醇基团的酯化 反应，酸和硫醇基团的硫酯形成反应，或胺和醛的缩合而后得到的CH=N键还原 成CH2-NH键。

在优选的实施方案中，使用一种显示某种区域的氧化还原活性物质修饰核 酸寡聚体，该区域具有一种扩充到一平面中的主要为平面的p-π-轨道系统，例 如实施例1中的PQQ，实施例5或7-12中的醌类，或式1-4中的卟吩结构，或 通式6中的吡啶核苷酸，或这些氧化还原活性物质的衍生物。在此情况下，氧化 还原活性物质通过间隔基团与核酸寡聚体键合，间隔基团可以以这样的方式被选 择，即氧化还原活性物质的π-轨道可将自身安排在平行于与氧化还原活性物质 相交界的核苷酸寡聚体的碱基的p-π-轨道系统。这种氧化还原活性物质的扩充 到一平面中的部分平面的p-π-轨道系统空间安排被征明是特别优选的。 c)在合成核酸寡聚体中，末端碱基被氧化还原活性物质所代替。

根据本发明，a)和b)中所述的氧化还原活性物质到寡核苷酸的键合可以发生 在寡核苷酸与导电表面的键合之前或之后。键合到导电表面的寡核苷酸与氧化还 原活性物质的连接象a)和b)中所述的那样进行。

如果在一普通表面上有许多不同的寡核苷酸连接点(测试位置)，那么，通过 适当选择不同测试位置的游离寡核苷酸端基的反应基团，将用于整个表面的氧化 还原活性物质到探针寡核苷酸的(共价)连接加以标准化将是有利的。 导电表面

根据本发明，术语“导电表面是指任何具有电传导的任意厚度的表面的载体， 特别是由铂，钯，金，镉，汞，镍，锌，碳，银，铜，铁，铅，铝，和镁制成表 面。根据本发明，术语“电极”和“导电的(载体)表面”是“导电表面”的 一种替换说法。

另外，任何涂布的或非涂布的任何厚度的半导体表面也同样可以被使用。 以纯物质或以混合物形式存在的所有半导体都是有用的。实例包括，但并不限制 于此，任何结晶结构的碳，硅，锗，α-锡，及Cu(Ⅰ)和Ag(Ⅰ)的卤化物。所有 第14和16组元素，13和15组元素，及15和16组元素的任意组合物及任意结 构的二元化合物同样是适合的。另外，也可以使用第11,13和16组元素，或12, 13和16组元素的任意组合物及任意结构的三元化合物。过渡体系的组的指定参 见1985年的IUPAC推荐。

寡核苷酸到导电表面的键合

根据本发明，核苷酸直接，或通过一连接基团/间隔基团与上述所描述的类 型的导电表面的载体表面原子或分子相连。该键合按照下列三种不同的方式进 行： a)表面按照反应的分子基团是可接受的方式被修饰。这可以通过表面分子的直 接衍生化发生，例如通过湿化学或电化学氧化/还原的方法。这种方法例如，石 墨电极的表面可被通过氧化的方法用湿化学提供醛或羧酸基团。电化学上，例如 可能用还原的方法，在芳香重氮盐的存在下与相应的(功能化的，即提供反应基 团的)芳基游离基耦合，或用氧化的方法，在R’CO2H存在下，与(功能化的)R’ 游离基耦合到石墨电极的表面。半导体表面的直接修饰的例子为将硅表面衍生为 反应的硅醇，即在表面上具有Si-OR”基团的硅载体，其中R”和R’为任意的功能 化的有机残基(例如烷基，烯基，炔基，杂烷基，杂烯基，或杂炔基)。可选择 的，整个表面可通过一种双官能的连接基团的反应基团的共价连接被修饰，这样， 在表面上得到了一种由任何分子组成的并包含反应基团的，优选为末端的，单分 子层。术语“双官能的连接基团”可理解为是指具有两个相同的(均双官能的) 或不同的(杂双官能的)可反应的分子基团的任意链长的任何分子，特别的链长 为2-14。

如果通过使用光刻法的工艺要在表面上形成许多不同的测试位置，那么至少 一种同双官能的或杂双官能的反应基团要是一种光诱导基团，即这种基团只有在 一种特定的或随机的波长的光的照射下才开始具有反应活性。这种连接基团按照 这种方法被应用，即在连接基团被共价连接到表面后这种/一种具有光反应活性 的反应基团才是可用的。核酸寡聚体被共价连接到表面，即被修饰，而且它们本 身被用一种反应基团修饰，优选在接近核酸寡聚体的一端，通过一任意组分和链 长的间隔基团，优选的链长为1-14。寡核苷酸的反应基团是一种直接(或间接) 与修饰表面反应形成共价犍的基团。另外，可以将进一步的反应基团键合到接近 核酸寡聚体的第二端，该反应基团，反过来，如上所述的，直接或通过任意组分 和链长的间隔基团，优选的链长为1-14，被连接。更进一步，作为这种进一步 的反应基团的替换物，一种具有氧化还原活性的物质也可以在这种核酸寡聚体的 第二端被吸附。 b)应用在导电表面的核酸寡聚体用一种或多种反应基团通过共价连接的任意组 分和链长的间隔基团，优选的链长为1-14，被修饰，这些反应基团被优选的定 位在接近核酸寡聚体的一端。反应基团为可与未修饰的表面直接反应的基团。一 些实例为：(ⅰ)通式为(n×HS-间隔基)-寡核苷，(n×R-S-S-间隔基)- 寡核苷或寡核苷-间隔基-S-S-间隔基-寡核苷的硫醇(HS-)或二硫化物(S-S-) 衍生的核酸寡聚体与一金表面反应形成金-硫键，或(ⅱ)通过化学吸收或物理 吸收累积在铂或硅表面上的胺。另外，一种进一步的反应基团可被键合到接近核 酸寡聚体的第二端，该反应基团，反过来，如上所述的，直接或通过任意组分和 链长的间隔基团，优选的链长为1-14，被连接。更进一步，作为这种进一步的 反应基团的替换物，一种具有氧化还原活性的物质也可以在这种核酸寡聚体的第 二端被吸附。特别的被硫醇或二硫桥((n×HS-间隔基)-寡核苷或(n×R- S-S-间隔基)-寡核苷)修饰的核酸寡聚体具有以下优点，即如果被硫醇或二硫 化物功能化连接的核酸寡聚体的间隔基，从核酸的一端观看，具有一种增加的或 下降的链长，这种核酸寡聚体可被以一种特殊的设定的角度(位于正常表面与双 链螺旋的核酸寡聚体的螺旋轴之间的角度，或正常表面与双链非螺旋的核酸寡聚 体的垂直轴之间的角度)应用到导电表面。 c)寡核苷酸主链的磷酸，糖-C-3-羟基，羧基，或氨基基团，特别是末端基团， 可被用作探针核酸寡聚体上的反应基团。磷酸，糖-C-3-羟基，羧基，或氨基基 团显示出较大的反应活性，因此可很容易的进行典型诸如与(伯或仲)氨基基团 或与酸基团的酰胺化反应，与(伯、仲或叔)醇或与酸基团的酯化反应，与(伯、 仲或叔)硫醇或与酸基团的硫酯形成反应，或胺和醛的缩合而后得到的CH=N键 还原成CH2-NH键的反应。在此情况下，共价连接磷酸，糖-C-3-羟基，羧基，或 氨基基团所需要的相应的基团是用具有任意的分子长度，如本部分a)中所述， 的一(单分子)层衍生化的表面的一部分，或磷酸，糖-C-3-羟基，羧基，或氨 基基团可以直接与未被修饰的表面反应，如本部分的b)中所述。另外，可以将 进一步的反应基团键合到接近核酸寡聚体的第二端，该反应基团，反过来，如上 所述的，直接或通过任意组分和链长的间隔基团，优选的链长为1-14，被吸附。 更进一步，作为这种进一步的反应基团的替换物，一种具有氧化还原活性的物质 也可以在这种核酸寡聚体的第二端被吸附。

选择性地，寡核苷酸与导电表面的键合可以发生在氧化还原活性物质到寡 核苷酸的吸附的之前或之后，或应用反应基团的间隔基团键合氧化还原活性物质 的吸附之前或之后。已经修饰的寡核苷酸到导电表面的键合，即在氧化还原活性 物质到寡核苷酸的吸附之后表面的键合，如a)到c)中所述的发生。(在“寡核 苷酸到导电表面的键合”部分)。

在制备测试位点时，当单链寡核苷酸吸附到表面时必须小心，在单个寡核 苷酸之间要保持足够大的距离，以给目标寡核苷酸提供必要的杂合空间。为此目 的，还包括其它的，采取两种不同的方法，它们是：

1．)通过吸附一杂合的寡核苷酸制备一修饰的载体表面，即一种用杂合 的探针寡核苷酸代替单链探针寡核苷酸衍生的载体表面。用于杂合的寡核苷酸链 是未修饰的(表面吸附如在“寡核苷酸到导电表面的键合”部分中的a)到c)中 所述的进行)。此后，杂合的寡核苷酸双链被热去杂合，于是制备出一种在探针 寡核苷酸之间具有较大距离的单链寡核苷酸修饰的载体表面。

2．)通过吸附一种单链或双链寡核苷酸制备一种修饰的载体表面，并在 载体表面衍生化中加入一种适宜的单官能的连接基团，除了向单链或双链寡核苷 酸，还向表面进行键合(表面吸附如在“寡核苷酸到导电表面的键合”部分中 的a)到c)中所述的进行)。根据本发明，单官能的连接基团具有与在载体表面 和寡核苷酸之间的间隔基团的链长相同的链长，或不同的链长，其差别最大为8 个链原子。如果双链寡核苷酸被用于载体表面的衍生化，杂合的寡核苷酸双链在 双链寡核苷酸和连接基团吸附到载体表面后，将被热去杂合，如上面的1．)中所 述。在连接基团到表面的吸附的同时，单链或双链核酸寡聚体之间的距离也象到 表面的键合那样被增大。如果使用双链核酸寡聚体这种效果将通过随后的热去 杂合被进一步扩大。 电化学检测核酸寡聚体杂合体的方法

根据电化学检测方法，一些在序列上不同的探针寡核苷酸，理想的为核酸寡 聚体的所有必要的组合，都可以有利地应用于寡聚体碎片或DNA碎片，可以值 得信赖的检测出任何目标寡聚体或(片段的)靶DNA的序列，或可以寻找和进 行靶中突变的特殊序列的检测。为此目的，一指定区域(测试位点)的载体表面 原子或分子可以与已知的但却随机的序列的DNA/RNA/PNA寡核苷酸在一导电的 载体表面上连接，如上所述。在更通常的实施方案中，DNA碎片还可以被一单探 针寡核苷酸所衍生。优选的探针寡核苷酸为碱基长度为3-50的核酸寡聚体(DNA, RNA，或PNA片段)，优选的长度为5-30，特别优选的长度为7-25。根据本发明， 一种具有氧化还原活性的物质可在探针寡核苷酸键合到导电表面之前或之后与探 针寡核苷酸键合。

如果对探针寡核苷酸的修饰发生在键合到导电表面之前，那么，已经修饰 的探针寡核苷酸如上所述的键合到导电表面。相反的，键合到导电表面的未经修 饰的探针寡核苷酸可用一种具有氧化还原活性的物质在寡核苷酸链的第二个游离 端直接或通过一间隔基团间接的被修饰。

在两种情况中，都得到一种通常结构为电子-间隔基-寡核苷-间隔基-氧化 还原剂(图3)的表面杂合体。通过通常结构为电子-间隔基-寡核苷-间隔基-氧 化还原剂的一单链寡核苷酸为桥的在(导电的)载体表面和具有氧化还原活性物 质(氧化还原剂)之间的电子传递是很弱的或者根本不存在的。这些桥当然也可 以在没有间隔基团或只有一个间隔基团(电子-ss-寡核苷-间隔基-氧化还原剂 或电子-间隔基-ss-寡核苷-氧化还原剂)下形成。

在下一步中，测试位点被引入到待测的寡核苷酸溶液中(靶)。杂合化将只 发生在以下条件下，即溶液含有与键合到导电表面的探针寡核苷酸互补的寡核苷 酸链，或者至少广泛的互补。在探针和靶寡核苷酸杂合的情况下，载体表面和具 有氧化还原活性的物质之间的导电性由于通过由双链细成的寡核苷酸而形成桥而 增加。(如图3所示，以电子-间隔基-ss-寡核苷-间隔基-氧化还原剂为例。)

由于探针寡核苷酸和与其互补的寡核苷酸链(靶)的杂合所导致的在(导 电的)载体表面和具有氧化还原活性物质之间的电子传递的变化，因此可以用电 化学方法例如循环伏安法法，电流分析法，或导电性测定法检测这种特定序列的 杂合事件。

在本发明的一种特别优选的实施方案中，使用一种显示某种区域的氧化还 原活性物质修饰核酸寡聚体，该区域具有一种扩充到一平面中的主要为平面的p- π-轨道系统，例如实施例1中的PQQ(参见图3)，实施例5或7-12中的醌类， 或式1-4中的卟吩结构，或通式6中的吡啶核苷酸，及这些氧化还原活性物质 的衍生物。在此情况下，在核酸寡聚体与氧化还原活性物质之间的间隔基团可以 以这样的方式被选择，即氧化还原活性物质的π-轨道可将自身安排在平行于与 互补的链杂合，且与氧化还原活性物质相交界的核苷酸寡聚体的碱基对的p-π- 轨道系统。这种氧化还原活性物质的扩充到一平面中的部分平面的p-π-轨道系 统空间安排被证明是对双链核酸寡聚体的电子传导性特别适宜的。

在循环伏安法中，固定工作电极的电位作为时间的函数发生线性变化。从 没有发生电氧化或还原的电位开始，电位不断变化直到氧化还原活性物质被氧化 或还原(即电流漂移)。进行在电流-电压曲线中得到一初始增长电流的氧化或还 原操作后，达到一最大电流(峰值)后，电流逐渐减小，电位方向向相反的方向 反馈。产物的电氧化或电还原的行为而后在可逆的过程中被记录。

一种可选择的电检测方法，电流分析法，该方法可通过氧化还原活性物质 被用一种合适的固定电极电位进行电氧化(或电还原)实现但是再还原(再氧 化)氧化还原活性物质到其原来的状态，不是通过象循环伏安法中的改变电极电 位那样实现的，而是通过向目标溶液中添加适合的还原试剂(氧化试剂)实现的， 关闭了整个系统的电流电路。只要还原试剂(氧化试剂)存在，或只要消耗的还 原试剂(氧化试剂)在相对的电极上被再还原(再氧化)，电流可被通过电流分 析法检测，且电流是与杂合事件的数目成比例的。

本发明将通过使用下面的应用实例和补充的附图加以进一步详细解释。 图1 表示Sanger法寡核苷酸测序的图解说明

图2 表示通过在一碎片上的杂合进行寡核苷酸测序的图解说明 图3 表示具有12-bp的寡核苷酸的通常结构为电子-间隔基-ss-寡核苷- 间隔基-氧化还原剂的表面杂合体的图解说明。电子-间隔基-ss-寡 核苷-间隔基-氧化还原剂的一种实施方式的实施例为样板序列5’- TAGTCGGAAGCA-3’(左)与Au-S-ss-寡核苷-PQQ杂合的状态。只表 示了具有一种杂合的互补链的探针寡核苷酸的一部分(右)，寡核苷 酸到表面的吸附通过一-S-CH2CH2-间隔基团，具有氧化还原活性的物 质PQQ的吸附是通过间隔基团-CH2-CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH-发 生的。 图4 表示一包含Au-S-ss-寡核苷-PQQ的测试位点的循环伏安法与具有完 全杂合的靶(Au-S-ds-寡核苷-PQQ，实线)的相同的测试位点的比 较。 图5 表示具有完全杂合的靶(Au-S-ds-寡核苷-PQQ)(实线)的测试位 点的循环伏安法与显示2-碱基对错配(具有2-碱基对错配的Au-S- ds-寡核苷-PQQ，虚线)的具有杂合的靶的测试位点的比较。

                     发明的实施

具有通常结构为电子-间隔基-ss-寡核苷-间隔基-氧化还原剂的杂合的靶 (Au-S-ds-寡核苷-PQQ)的样板测试位点如图3所示。在图3的实施例中，载 体表面为金电极。位于金电极和探针寡核苷酸之间的连接基团是用接头( HO-(CH2)2-S)2形成的，可被用3’端的末端磷酸基团酯化成P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH， 而后，S-S键在金表面发生均裂，每个得到一个Au-S键，通过它可将2-羟 基-巯基乙醇和以巯基乙醇为桥的寡核苷酸共同吸收在表面上。在图3的实施例 中的氧化还原活性物质为三羧基吡咯-喹啉醌(PQQ)，且三个羧基之一被官能化 的PQQ(在实施例中，C-7-CO2H被官能化)被用于PQQ到探针寡核苷酸的共价连 接(酰胺化和脱冰使得CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2间隔基的末端氨基官能团与5’- 胸腺嘧啶的C-5位相连)。游离的，未修饰的PQQ，以及与通过链长为1-6的短 的间隔基例如-S-(CH2)2-NH，或通过(修饰的)双链寡核苷酸，例如在HEPES 的缓冲液中添加0.7克分子的TEATFB(见缩略语)与载体表面成桥的PQQ，都 被在0.7V≥φ≥0.0V的电位下选择性地还原和氧化，电位通过标准氢电极测定。

在(导电的)载体表面和通过单链寡核苷酸为桥的氧化还原对之间在通常 的电子-间隔基-寡核苷-间隔基-氧化还原剂结构中的电子传递是很弱的或者根 本不存在的。可作范例的测试位点Au-S-ss-寡核苷-PQQ(具有12-bp寡核苷酸) 可以用循环伏安法表示(图4)。不用希望理论所描述的键合，假定磷酸骨架的 负电荷导致寡核苷酸单链的相互排斥，因此迫使间隔基-ds-寡核苷-间隔基-氧 化还原剂链与正常的载体表面(“标准管”)形成一角度φ＜70°。图3的(杂 合的)测试位点Au-S-ds-寡核苷-PQQ显示形成角为φ=30°。由于间隔基-ds- 寡核苷-间隔基-氧化还原剂链的长度(例如12个碱基对的寡核苷酸约40A°； 间隔基团和吸附的PQQ约10A°长)，如果φ＜70°，将导致载体表面与氧化还 原活性物质之间的距离＞17A°。结果，在载体和具有氧化还原活性物质之间的 直接电子转移或空穴转移的可能性被排除了。通过用一寡核苷酸溶液处理测试位 点，在探针和靶之间杂合的情况下，在载体表面和通过双链寡核苷酸为桥的氧化 还原对之间电传导将增加。电传导的变化表明它可被循环伏安法检测，以在载体 表面和具有氧化还原活性的物质之间的显著的电流(见图4)。因此，使用电化 学方法例如循环伏安法检测带有探针寡核苷酸的靶特定序列的杂合才成为可能。

另外，有缺陷的碱基对(碱基错配)可通过修饰循环伏安的特性(见图5) 的方法被识别。错配在电还原和电氧化的最大电流之间显示出较大的电位不同(当 电位反馈方向改变时电还原的反转)，或在循环伏安法的反向电子传递过程中在 电传导的载体表面与氧化还原活性物质之间的电氧化和电还原。这种事实基本上 对电流分析法测定产生有利的效果，因为电流可在一电位下被测试，在此电位下， 优选的杂合的寡核苷酸靶提供一显著的电流，但是有缺陷的成对的寡核苷酸靶则 没有。在图5的实施例中，这可能在约0.03V的电位E-E0。 实施例1:Au-S-ds-寡核苷-PQQ寡核苷酸电极的制备。Au-S-ds-寡核苷-PQQ的 制备分成4步，即制备载体表面，用互补的双链杂合探针寡核苷酸(杂合步骤)， 用双链寡核苷酸将载体表面衍生化(孵化步骤)，及氧化还原活性物质的吸附(氧 化还原步骤)。

在云母(白云母小盘)上的约100nm厚的金薄膜形成对双链寡核苷酸进行共 价连接的载体。在此步骤的最后，刚被劈开的云母用氩-离子等离子体在电子放 射箱中纯化，并用电子发射的方法加上一层厚度约为100nm的金(99.99％)。而 后，金薄膜用30％H2O2/70％H2SO4除去表面的杂质(有机物的氧化的积累物)并浸 在乙醇中约20分钟，以消除表面吸收的任何氧气。在用二次蒸馏水淋洗载体表 面后，一种预先制备的1×10-4克当量的(修饰的)双链寡核苷酸溶液被应用到 这种水平放置的表面上，以使整个载体表面被湿润(孵化步骤，见下面)。

制备ds寡核苷酸溶液，使用序列5’-TAGTCGGAAGCA-3’的双链修饰的12-bp 单链寡核苷酸，其用(HO-(CH2)2-S)2在3’端磷酸基团酯化成P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH。 在寡核苷酸的末端碱基5’端，胸腺嘧啶用CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2在C-5碳上加以修饰。这种寡核苷酸在杂合缓冲液(添加0.7克当量的TEATFB 的10mM Tris,1mM EDTA,pH值7.5，见缩略语)中的2×10-4克当量的溶液， 用(未修饰的)互补的链的2×10-4克当量的溶液在杂合缓冲液中于室温下杂合 约2小时(杂合步骤)。在约12-24小时的反应时间中，寡核苷酸的二硫代间隔 基P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH被均裂。在此过程中，该间隔基与表面上的Au原 子形成共价Au-S键，从而导致ds-寡核苷酸和2-羟基-巯基乙醇按照1∶1共吸 收。

金电极以这种渗饰方式得到一种含有ds-寡核苷酸和2-羟基-巯基乙醇的致 密的(1∶1)单层，用二次蒸馏水洗涤，而后用3×10-3克当量醌PQQ,10-2克 当量EDC，和10-2克当量的硫代NHS在HEPES缓冲液中的溶液湿润。反应约1小 时后，CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2间隔基与PQQ共价连接(在间隔基的氨基和PQQ 的酸官能团之间酰胺化，氧化还原步骤)。

用XPS法(X-射线光电波谱法)对表面组合物进行分辨显示得到ds-寡核 苷酸和2-羟基-巯基乙醇按照1∶1共吸收的一最大密度堆积的单层(4.7×1012ds- 寡核苷酸/cm2),ds-寡核苷酸的长轴(螺旋轴的方向)与金表面的表面法线形成 一角度φ≈ 30°。

实施例2:

Au-S-ss-寡核苷-PQQ寡核苷酸电极的制备。与Au-S-ds-寡核苷-PQQ寡核 苷酸电极的制备体系相似，将载体表面用修饰的单链寡核苷酸衍生，仅用序列 5’-TAGTCGGAAGCA-3’修饰的寡核苷酸与其互补的链进行杂合，而后在孵化步骤 中，在1×10-4克当量的水溶液及在10-2克当量Tris,10-3克当量EDTA，及0.7 克当量的TEATFB(或1克当量NaCl)存在下在pH值7.5下，使用双修饰的12- bp单链探针寡核苷酸(见实施例1)。氧化还原步骤按照实施例1中所示的方法 进行。

实施例3：

具有2个碱基对错配的Au-S-ds-寡核苷-PQQ寡核苷酸电极的制备。用修饰 的双链寡核苷酸衍生化的载体表面的制备，按照类似于Au-S-ds-寡核苷-PQQ体 系的制备方法进行，但是仅在杂合处使用一互补的链(序列为：5’- ATCAGATTTCGT-3’)与修饰的序列为5’-TAGTCGGAAGCA-3’的寡核苷酸进行杂合， 其中第6和第7碱基(从5’端数)是确实互补的，被从C到A或从C到T修饰， 引入两个碱基对错配)

实施例4：

具有较大的寡核苷酸间距离的Au-S-ss-寡核苷-PQQ寡核苷酸电极的制备。 在制备测试位点时，当用单链探针寡核苷酸进行载体表面的衍生化时，必须小心 注意，在吸附的单链寡核苷酸之间要保持足够大的距离，以给目标寡核苷酸提供 必要的杂合空间。为此，可进行三种不同的方法，它们是：(a)如实施例1所 述，制备Au-S-ds-寡核苷-PQQ电极，而后在T＞40℃的温度下进行双链的热去 杂合。(b)按照实施例2制备Au-S-ss-寡核苷-PQQ电极，但在孵化步骤中用(双 衍生化)单链寡核苷酸进行金表面的衍生，加入10-5-10-1克当量的2-羟基-巯 基乙醇或另一种硫醇或具有适当长度(根据目标的寡核苷酸间的距离)的二硫代 连接基团，并与单链寡核苷酸共吸收在金表面上。(c)按照实施例2制备Au-S- ss-寡核苷-PQQ电极，但在孵化步骤中用(双衍生化)单链寡核苷酸进行金表面 的衍生时，省去添加0.7克当量的电解液(实施例中的TEATFB)。由于缺少盐， 磷酸基团与寡核苷酸的氮-碱基原子之间没有静电屏蔽，而与金表面发生强烈的 内部作用。由此，导致电极表面的寡核苷酸的浅的堆积(φ＞60°)，及每个表 面单元相当少的寡核苷酸链合。此后，寡核苷酸在第二孵化步骤中(在吸附到PQQ 之前或之后)通过2-羟基-巯基乙醇或另一种硫醇或具有适当长度的二硫代连接 基团到仍然是游离的表面金原子的共价连接被返回到指定的位置。为此，用单链 寡核苷酸不紧密的覆盖的电极，在PQQ的修饰之前或之后(Au-S-ss-寡核苷， 或Au-S-ss-寡核苷-PQQ)，被用2-羟基-巯基乙醇或另一种硫醇或具有适当长度 的二硫代连接基团在乙醇中或HEPES缓冲液中的5×10-2克当量的溶液(或其混 合物，根据硫醇的溶解度)进行湿润，孵化2-24小时。

实施例5：

循环伏安法测定的进行。使用一计算机控制的双电位恒定器(CH仪器，832 型)在室温下，在一具有3-电极结构的标准池中进行循环伏安法测定。修饰的 金电极作为工作电极，铂线为辅助电极(反电极)，带有内饱和KCl溶液，通过 Luggin毛细管与探针空间分开的Ag/AgCl电极，被用作参比电极进行电位的测 定0.7克当量的TEATFB或1克当量NaCl作为电解液。与Au-S-ss-寡核苷-PQQ 相比较的Au-S-ds-寡核苷-PQQ电极的循环伏安法测定如图4所示，而2-碱基对 错配对Au-S-ds-寡核苷-PQQ电极的循环伏安法测定的影响如图5所示。电位是 指E-E0，即相对于半波电位。

在图4中，显示了与未杂合的结构相比较的明显较大的电流，这是双链寡 核苷酸存在的清楚的证明。这可以检测出特定序列的杂合事件。从图5可清楚的 看出，在用靶寡核苷酸链杂合显示2碱基对错配的情况下，其一，出现较弱的电 流，其二电流最大值的区别增加。