技术领域
[0001] 本
发明涉及微
电极生物技术领域，具体涉及一种同时活体检测水杨酸和吲哚乙酸的传感器及其构建方法与应用。
背景技术
[0002] 吲哚乙酸和水杨酸是两种重要的
植物激素，它们在
种子发芽、
幼苗生长、开花结果以及应激反应中发挥重要作用。因此检测植物激素的含量可以有助于对激素代谢过程及作用机理的研究，且两者在植物生理过程中相互影响、共同作用，同时测定水杨酸和吲哚乙酸有助于理解它们之间的相互作用。
[0003] 目前，常用的植物激素检测方法集中在免疫法、
光谱法、色谱法，这几种检测方法操作复杂，耗时长，设备昂贵，特别是对样品的处理，条件苛刻又花费时间，并且都是离体检测方法，只能反映静态结果及累积效应，因此急需发展植物激素的活体检测方法。电化学传感器具有高的灵敏度及选择性、成本较低、操作简单、易于集成及便携等特点，因此适合活体检测应用。目前已有用电化学传感器同时检测检测水杨酸及吲哚乙酸的工作，但都使用的传统的大电极，电极直径5mm左右。无法进行植物的活体检测应用。并且植物激素
氧化后的产物极易
吸附在电极表面，造成电极毒化，使用寿命降低。因此急需发展一些新的方法，解决这一问题。
发明内容
[0004] 针对现有检测技术的缺点，本发明通过使用不锈
钢丝(直径优选为0.38mm)作为
工作电极，通过化学修饰提高检测灵敏度，实现植物水杨酸和吲哚乙酸的同时活体监测，真实地获取植物水杨酸和吲哚乙酸活体的、即时的信息，为植物生命活动规律、揭示植物生命现象本质提供更多的理论依据。
[0005] 本发明提供的生物传感系统由
不锈钢丝电极、
信号采集系统等主要模
块构成，获取的
电流为μA级。
[0006] 本发明使用的不锈钢丝电极是对常见的市售不锈钢丝进行藏红T、纳米铂、
石墨烯和纳米金的多次修饰而成的。
[0007] 用已知浓度的标准溶液
对电极和系统进行校正，获取斜率S和截距I，斜率偏差在15％之内表明电极可通过计算校正以正常使用。然后将不锈钢传感器置入待测植株部位，连接电化学系统获取电流i，单位为μA，通过校正的工作曲线计算得到被测部位植物激素浓度C，单位为μmol/L。
[0008] 本发明技术方案如下：
[0009] 一种不锈钢丝电极的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 1)取一段不锈钢丝(长度不限，例如长约5cm)，连接为恒压电源的
阳极，取一
碳棒连接为
阴极，插入浓度为0.1～1mol/L(优选为0.3mol/L)的
磷酸二氢钠溶液中(能够浸没该不锈钢丝即可)；加载恒压
电压5～50V(优选35V)
腐蚀5～1800s(优选300s)；腐蚀结束后，清洁干净(可用超声清洗)；
[0011] 2)将步骤1)腐蚀好的不锈钢丝作为工作电极，连接电化学工作站；连接铂对电极、参比电极，浸入含有
硫酸钠和氯金酸的硫
酸溶液中，其中硫酸钠、氯金酸、硫酸浓度均≤10mol/L，在固定电压下进行电化学沉积，电压可以是-3～0V，沉积时间≤120min，(优选在含1mol/L硫酸钠和50mmol/L氯金酸的0.5mol/L硫酸溶液中，在-1V下电化学沉积100s)，得到纳米金修饰的不锈钢电极；
[0012] 3)将步骤2)所得纳米金修饰的不锈钢电极浸入氯铂酸和氧化
石墨烯的混合溶液中，氯铂酸浓度≤10mol/L，氧化石墨烯浓度≤10mg/ml(优选为含2mmol/L氯铂酸和2mg/ml氧化石墨烯的混合溶液)，在0至-1.5V、0.025V/s下通过循环
伏安法进行电还原沉积(沉积时间可根据需要进行选择，优选沉积时间为20min)，得到纳米铂/石墨烯修饰的纳米金/不锈钢电极；
[0013] 4)将步骤3)所得纳米铂/石墨烯修饰的纳米金/不锈钢电极浸入含有藏红T和
硝酸钾的硫酸溶液，藏红T、硝酸钾、硫酸浓度均≤10mol/L(优选藏红T、硝酸钾、硫酸浓度浓度分别为0.5mmol/L、0.1mol/L、0.1mol/L)，在-0.8至1.6V、0.025V/s下通过
循环伏安法进行电还原沉积(沉积时间可根据需要进行选择，优选沉积时间为64min)，即得藏红T修饰的纳米铂/石墨烯/纳米金/不锈钢电极。
[0014] 进一步地，所述不锈钢丝的直径为0.2～1mm，优选为0.38mm。
[0015] 具体地，上述不锈钢丝电极的制备方法，包括如下步骤：
[0016] 1)取一段直径0.2～1mm(优选0.38mm)的不锈钢丝，连接为恒压电源的阳极，取一碳棒连接为阴极，插入浓度为0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液中；加载恒压电压35V腐蚀300s；腐蚀结束后，超声清洁干净；
[0017] 2)将步骤1)腐蚀好的不锈钢丝作为工作电极，连接电化学工作站；连接铂对电极、参比电极，浸入含1mol/L硫酸钠和50mmol/L氯金酸的0.5mol/L硫酸溶液中，在-1V下电化学沉积100s，得到纳米金修饰的不锈钢电极；
[0018] 3)将步骤2)所得纳米金修饰的不锈钢电极浸入含2mmol/L氯铂酸和2mg/ml氧化石墨烯的混合溶液中，在0至-1.5V、0.025V/s下通过循环伏安法进行电还原沉积20min，得到纳米铂/石墨烯修饰的纳米金/不锈钢电极；
[0019] 4)将步骤3)所得纳米铂/石墨烯修饰的纳米金/不锈钢电极浸入含有0.5mmol/L藏红T、0.1mol/L硫酸和0.1mol/L硝酸钾的混合溶液中，在-0.8至1.6V、0.025V/s下通过循环伏安法进行电还原沉积64min，即得藏红T修饰的纳米铂/石墨烯/纳米金/不锈钢电极。
[0020] 本发明还包括上述方法制得的不锈钢丝电极(即藏红T修饰的纳米铂/石墨烯/纳米金/不锈钢电极)。
[0021] 本发明还提供一种传感器，包括上述不锈钢丝工作电极，还包括至少两根直径0.2～1mm(优选0.38mm)的不锈钢丝(该两根不锈钢丝为普通不锈钢丝，不再经过处理)分别用作参比电极和对电极。
[0022] 上述传感器至少裸露出3mm长的工作区域，其余部分可包裹绝缘材料。
[0023] 上述不锈钢丝电极或上述传感器可与电化学工作站连接使用。
[0024] 本发明还提供一种生物传感系统，包括上述不锈钢丝电极或上述传感器，还包括信号采集系统等主要模块，获取的电流为μA级。
[0025] 本发明还包括上述不锈钢丝电极或上述传感器或上述生物传感系统在活体在线检测植物水杨酸和吲哚乙酸方面的应用。
[0026] 本发明还提供一种同时活体检测植物水杨酸和吲哚乙酸的方法，包括如下步骤：
[0027] 1)分别配制一系列不同浓度的吲哚乙酸和水杨酸的混合磷酸缓冲溶液(pH＝6.0)，使用上述修饰好的不锈钢丝电极进行相关电化学方法检测(如差分脉冲伏安法、循环伏安法、方波伏安法等)，电压范围包含0.6-1.2V，得到一组激素浓度与扣除背景电流的峰电流的关系曲线，分别制作吲哚乙酸和水杨酸的工作曲线；所述混合磷酸缓冲溶液中吲哚乙酸和水杨酸的浓度相同；
[0028] 2)将上述传感器的三根电极同时插入待测植物体内，连接电化学工作站，按步骤1)相同的方法对待测植物进行电化学扫描，将获得的电流信号通过上述校正后的工作曲线计算得到待测植物中吲哚乙酸和水杨酸的即时浓度。
[0029] 进一步地，可将上述传感器先分别检测两份标准浓度(1，10μmol/L)标准吲哚乙酸-水杨酸溶液进行电化学校准，计算工作曲线与标准曲线斜率偏差如在15％以内，认为传感器可正常工作。
[0030] 进一步地，待测植物包括作物、绿植、花卉等。
[0031] 进一步地，检测部位包括植物体的根、茎、叶、果实等组织。
[0032] 在符合本领域常识的
基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
[0033] 本发明的关键点：
[0034] 1)本发明是在体检测分析植物体中水杨酸和吲哚乙酸的即时浓度；
[0035] 2)本发明利用不锈钢丝的低成本构建一次性传感器，从而解决水杨酸和吲哚乙酸氧化产物吸附的问题；
[0036] 3)基于不锈钢丝能够同时检测水杨酸和吲哚乙酸的独特电极修饰方法；
[0037] 4)检测目标材料是植物体，包括作物、绿植、花卉等；
[0038] 5)检测部位是植物体的根、茎、叶、果实等组织；
[0039] 6)植株被检测部位无离体、无破坏性损伤。
[0040] 本发明的有益效果：
[0041] 本发明能够利用不锈钢丝的硬度对被测植物组织进行置入式检测，而且不锈钢丝取材容易、成本低、延展性好、强度高，可适应环境改
变形状；所构建的不锈钢丝
生物传感器能够实现同时在体检测分析植物活体样本中的水杨酸和吲哚乙酸含量，并且成本低廉，可作为一次性电极使用，从而避免了水杨酸和吲哚乙酸氧化产物吸附的问题。相对于传统的生物鉴定、化学检测方法来说，该方法无需离体取样、前处理简单，检测方法直接可靠快速简便。
附图说明
[0042] 图1为本发明不锈钢丝电极制备过程示意图。
具体实施方式
[0043] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品
说明书进行。所用
试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0044] 实施例1
[0045] 利用不锈钢丝构建生物传感器同时在体检测大豆幼苗茎部样本中的水杨酸和生长素含量。
[0046] 1.传感器制备
[0047] (1)取一段不锈钢丝，长约5cm，直径0.38mm。
[0048] (2)将该不锈钢丝连接为恒压电源的阳极，取一碳棒连接为阴极，插入浓度为0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液中，能够浸没一定长度的不锈钢丝即可，加载恒压电压35V腐蚀
300s。腐蚀结束后，超声清洁干净。
[0049] (3)将步骤(2)中腐蚀好的不锈钢丝作为工作电极，连接电化学工作站，连接铂对电极，饱和甘汞电极作参比电极，浸入含有1mol/L硫酸钠的50mmol/L氯金酸的0.5mol/L硫酸溶液中，在-1V下电化学沉积100s得到纳米金修饰的不锈钢电极。
[0050] (4)将步骤(3)中得到的修饰电极，在2mmol/L氯铂酸和2mg/ml氧化石墨烯的混合溶液中，在0～-1.5V、0.025V/s下通过循环伏安法进行电还原沉积20min得到纳米铂/石墨烯修饰的纳米金/不锈钢电极。
[0051] (5)将步骤(4)中得到的修饰电极，在含有0.5mmol/L藏红T的0.1mol/L硫酸和0.1mol/L硝酸钾的混合溶液中，在-0.8～1.6V、0.025V/s下通过循环伏安法进行电还原沉积64min得到藏红T修饰的纳米铂/石墨烯/纳米金/不锈钢电极。
[0052] (6)将步骤(5)中修饰好的不锈钢工作电极用绝缘
胶带控制出3mm长的工作区域；另取两根直径0.38mm的普通不锈钢丝，该两根不锈钢丝不再经过处理，其中一根作对电极，另一根作参比电极，同样控制出3mm长的导电区域，三者组成传感器，与电化学工作站连接使用。
[0053] 2.标准曲线制作
[0054] 分别配制浓度为0、0.5、1、5、10、20、30、40、50μmol/L相同浓度的吲哚乙酸和水杨酸的混合磷酸缓冲(pH＝6.0)溶液，使用上述方法制备的不锈钢丝电极进行差分脉冲伏安法检测(电压范围包含0.6-1.2V)，得到一组激素浓度与扣除背景电流的峰电流的关系曲线，分别制作吲哚乙酸和水杨酸的工作曲线，得到吲哚乙酸的工作方程为i(μA)＝4.19+0.23lnC(μmol/L)，水杨酸的工作方程i(μA)＝2.11+0.29lnC(μmol/L)，线性范围可达0.5～
50μM。
[0055] 3.在线活体检测
[0056] (1)选用大豆(绥农26)为实验材料，通过
水培将大豆培育至幼苗期。进行
盐胁迫处理10h，分为对照组(0mm NaCl)，处理组1(50mm NaCl)，处理组2(150mm NaCl)三组。
[0057] (2)将制备的传感器先分别检测两份标准浓度(1，10μmol/L)标准吲哚乙酸-水杨酸溶液进行电化学校准，计算工作曲线与标准曲线斜率偏差如在15％以内，认为传感器可正常工作。
[0058] (3)将大豆幼苗用穿刺针在茎部插孔，然后将传感器的三根电极同时放入孔内，连接工作站对实验样本进行差分脉冲伏安扫描(电压范围包含0.6-1.2V)，获得的电流信号通过校正后的工作曲线计算得到被测样品的即时浓度。
[0059] (4)切取微电极检测部位的部分组织进行HPLC-MS检测，与传感器检测的即时结果进行对比，如表1所示。结果表明该微电极传感检测结果的变化趋势与HPLC-MS的趋势一致，但结果更为准确可靠。
[0060] 表1
[0061]
[0062] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
