检测赭曲霉毒素A的电化学传感器和方法
阅读：848发布：2020-05-08
专利汇可以提供检测赭曲霉毒素A的电化学传感器和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种利用特定 碱 基位点上标记电化学标记物(例如亚甲基蓝)的核酸适配体修饰的 电极 构建的电化学 传感器 和检测方法，可以实现快速灵敏检测赭曲霉毒素A。相应的核酸适配体利用末端标记的硫醇，核酸适配体被固定到金电极表面。通过考察一系列标记位点，优化出可使传感器产生灵敏 信号 变化的标记位点。通过测定电化学标记物的电化学信号变化可以实现对赭曲霉毒素A的检测。这种传感器操作简单、响应迅速、具有高灵敏度、而且可再生重复使用、具有高 稳定性 。利用制备的电化学传感器可以实现检测30pM赭曲霉毒素A，并可以用于复杂样品基质中赭曲霉毒素A的检测。，下面是检测赭曲霉毒素A的电化学传感器和方法专利的具体信息内容。
1.一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感器，其特征在于，包括：利用赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极，其中所述赭曲霉毒素A核酸适配体带有电化学标记物，所述电化学标记物位于所述赭曲霉毒素A核酸适配体的特定碱基上以增强检测信号。
2.根据权利要求1所述检测赭曲霉毒素A的电化学传感器，其中，所述赭曲霉毒素A核酸适配体为特异性结合赭曲霉毒素A的DNA序列。
3.根据权利要求1所述检测赭曲霉毒素A的电化学传感器，其中，所述电化学标记物为亚甲基蓝或二茂铁。
4.根据权利要求1所述检测赭曲霉毒素A的电化学传感器，其中，所述特定碱基选自A、G、C或T。
5.根据权利要求1所述检测赭曲霉毒素A的电化学传感器，其中，所述DNA序列包括SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成，其5’端或3’端利用硫醇分子修饰，所述电化学标记物位于所述序列的第30位的T碱基上，或者所述DNA序列包括在SEQ ID NO：1的一端或两端减少或增加一个或多个碱基的序列，所述电化学标记物位于与SEQ ID NO：1的上述T碱基对应的T碱基上。
6.根据权利要求1所述检测赭曲霉毒素A的电化学传感器，其中，所述电极为金电极或具有金涂层或纳米金材料修饰的电极。
7.一种权利要求1-6任一项所述电化学传感器的制备方法，包括：将带有电化学标记物标记的赭曲霉毒素A核酸适配体固定在电极上。
8.根据权利要求7所述的电化学传感器的制备方法，其中，所述电极为经过表面处理的金电极，所述表面处理包括将所述金电极打磨(例如利用0.01-0.1μm的氧化铝粉打磨)后使用超纯水超声清洗，再进行电化学清洗。
9.一种利用权利要求1-6任一项所述电化学传感器检测赭曲霉毒素A的方法，包括将所述电极在含有待测样品的反应缓冲溶液中温育2-5分钟后，采用电化学法进行测定；
优选地，所述反应缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，其含有Ca2+或Mg2+(例如CaCl2或Mg Cl2，其浓度为1-100mM，优选为10-30mM)中的一种或两种和Na+或K+(例如NaCl或KCl，其为浓度为50-500mM，优选为100-300mM)中的一种或两种，pH为7-8(例如7.2、7.5或7.8)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述电化学法选自方波伏安法、差分脉冲伏安法或交流伏安法。
检测赭曲霉毒素A的电化学传感器和方法
技术领域
[0001] 本发明属于电化学分析技术领域，具体涉及一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感器和方法。
背景技术
[0002] 赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，简称OTA)是由赭曲霉(Aspergillus)、疣孢青霉(Pmicilium)等真菌产生的次级代谢产物。赭曲霉毒素A容易对谷物(玉米和小麦等)、坚果、咖啡、葡萄等农产品和食物，以及加工后的食品中造成污染。动物和人类食用OTA污染后的食物后，OTA对动物和人类造成健康危害。赭曲霉毒素A可产生肾毒性、肝毒性、免疫毒性、致癌性等。世界癌症研究组织将OTA定为2B类致癌物。赭曲霉毒素A在很多农产品和食品中的含量需要严格控制，各个国家和地区都制定了严格的限量标准。赭曲霉毒素A在产品中超标的事件也屡有报道。因此，对赭曲霉毒素A进行定量检测在生产生活、食品安全和环境健康等领域中具有重要需求。
[0003] 色谱分析、质谱分析法等具有准确性高、选择性好等优势，但往往需要昂贵的仪器、繁琐的分析步骤、专业技术人员、检测时间长、检测费用高，并不利于在现场、快速、低成本检测赭曲霉毒素A。
[0004] 电化学传感器具有成本低、灵敏、操作简单等优点，与光学检测传感方法相比，电化学检测不容易受有色物质、荧光物质或浑浊溶液的干扰。然而，目前已有报道的一些检测赭曲霉毒素A的电化学传感器还存在不少局限。
[0005] 一些利用免疫抗体检测赭曲霉毒素A的传感器需要采用免疫抗体，免疫抗体制备成本高、稳定性和批间重现性差、而且基于免疫抗体的电化学传感器电化学信号产生方式比较复杂，在快速检测方面仍有不足。基于免疫抗体的电化学传感器的制备也不容易，免疫抗体传感器储存过程中抗体容易失活。
[0006] 基于核酸适配体的传感器结合了核酸适配体的优点，核酸适配体是一种核酸型的亲和配体，其可以通过化学合成手段进行制备，容易引入功能团用于标记或固定化，热稳定性好。目前报道的一些检测赭曲霉毒素A的核酸适配体电化学传感器大多采用在核酸适配体末端标记电化学活性基团，电极表面的核酸适配体与赭曲霉毒素A结合后，引起赭曲霉毒素A的电化学活性基团的电化学信号的变化，然而电流信号变化幅度不大，而且一些传感器检测灵敏度不高。其他的核酸适配体电化学传感器需要很复杂的制备过程，需要一些信号放大策略，检测步骤多，且耗时，而且电化学传感器不能很好再生重复使用，检测重现性不好，不容易操作。这些电化学传感器不能满足快速灵敏检测赭曲霉毒素A的需求。
发明内容
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出了一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感器和方法，可以快速、灵敏地分析赭曲霉毒素A。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感器，包括：利用赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极，其中所述赭曲霉毒素A核酸适配体带有电化学标记物，所述电化学标记物位于所述赭曲霉毒素A核酸适配体的特定碱基上以增强检测信号。
[0010] 在一些实施方案中，所述赭曲霉毒素A核酸适配体为特异性结合赭曲霉毒素A的DNA序列。
[0012] 在一些实施方案中，所述特定碱基选自A、G、C或T。
[0013] 在一些实施方案中，所述DNA序列包括SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成，其5’端或3’端利用硫醇分子修饰，所述电化学标记物位于所述序列的第30位的T碱基上，或者所述DNA序列包括在SEQ ID NO：1的一端或两端减少或增加一个或多个碱基的序列，所述电化学标记物位于与SEQ ID NO：1的上述T碱基对应的T碱基上。
[0014] 在一些实施方案中，所述电极为金电极或具有金涂层或纳米金材料修饰的电极。
[0015] 一种所述电化学传感器的制备方法，包括：将带有电化学标记物标记的赭曲霉毒素A核酸适配体固定在电极上。
[0016] 所述电极为金属电极或非金属电极，优选为金电极，具体步骤包括：对金电极进行表面处理后浸入含有赭曲霉毒素A核酸适配体的缓冲溶液，静置0.5-2(例如1小时或1.5小时)小时后利用超纯水清洗；
[0017] 将所述金电极浸入含有巯基己醇的缓冲溶液，静置1-3(例如1.5小时、2小时或2.5小时)小时后利用超纯水清洗。
[0019] 在一些实施例中，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液，pH为7-8(例如7.2、7.5或7.8)，所述核酸适配体的浓度为100-1000nM(例如100nM、300nM、500nM或800nM)，巯基己醇的浓度为1-5mM(例如2mM、3mM或4mM)。
[0020] 一种利用所述电化学传感器检测赭曲霉毒素A的方法，包括将所述电极在含有待测样品的反应缓冲溶液中温育2-5分钟后，采用电化学法进行测定。
[0021] 在一些实施例中，所述反应缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，其含有Ca2+或Mg2+(例如CaCl2或Mg Cl2，其浓度为1-100mM，优选为10-30mM)中的一种或两种和Na+或K+(例如NaCl或KCl，其为浓度为50-500mM，优选为100-300mM)中的一种或两种，pH为7-8(例如7.2、7.5或7.8)。
[0022] 在一些实施方案中，所述电化学法选自方波伏安法、差分脉冲伏安法或交流伏安法。
[0024] 与现有技术相比，本发明所构建的核酸适配体电化学传感器制备容易、传感器响应迅速、检测操作简单只需要将电化学传感器置于样品溶液中就可进行测定，无需额外的试剂。所构建的电化学传感器具有高灵敏度，检测限达到30pM，检测范围宽涵盖了几个数量级。而且，这种电化学传感器容易再生，可重复使用。这种核酸适配体电化学传感器具有很好的稳定性。这种传感器具有高选择性。附图说明
[0025] 图1用于考察序列中不同碱基T标记MB的核酸适配体对应的电化学传感器针对OTA的信号响应；
[0026] 图2为本发明实施例中核酸适配体电化学传感器检测OTA的典型方波伏安检测曲线；
[0027] 图3为电化学传感器检测OTA时，方波伏安分析中MB峰电流与OTA浓度关系；
[0028] 图4用于说明本发明实施例中电化学传感器的选择性；
[0029] 图5为在稀释的啤酒中检测OTA的结果；
[0030] 图6为在稀释的牛奶样品中检测OTA的结果。
具体实施方式
[0031] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0032] 本发明利用赭曲霉毒素A的核酸适配体作为亲和配体，通过在序列内部特定碱基上标记电化学标记物(例如亚甲基蓝(MB))构建了一种操作简单、可灵敏快速检测赭曲霉毒素A的电化学传感器。
[0033] 本发明实施例在可识别赭曲霉毒素A的核酸适配体序列的特定碱基(如A、G、C或T碱基)位点上标记上电化学标记物(例如亚甲基蓝)电化学活性基团，同时末端标记上硫醇，再将这种核酸适配体修饰固定到金电极表面上。当赭曲霉毒素A与电极表面的核酸适配体结合时，导致核酸适配体的构象可能发生改变，特定碱基上所标记的电化学标记物在电极表面的电子传递速率改变，从而电化学标记物电流信号产生变化。根据电化学标记物电化学信号的改变可以实现对赭曲霉毒素A的分析传感。通过筛查核酸适配体序列中不同的T碱基标记位点，发现了可以产生明显电流信号增加的T碱基标记位点。利用这种特定T碱基位点上标记了电化学标记物的核酸适配体，构建了可检测赭曲霉毒素A电化学传感器。
[0034] 需要说明的是，电化学标记物修饰的特定位点并不限于T碱基，还可以是A、G或C碱基，电化学标记物也并不限于亚甲基蓝，采用其他电化学标记物(例如二茂铁等)均可能获得相似的技术效果。
[0035] 针对赭曲霉毒素A的电化学传感检测，所述核酸适配体为可结合赭曲霉毒素A的核酸适配体，例如DNA，本发明实施例中用到的DNA序列为SEQ ID No：1(5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCG-3′)，其中5’端修饰硫醇分子用于将适配体固定到金电极表面。亚甲基蓝(methylene blue，缩写MB)修饰到序列中的第30个碱基T上。
[0036] 在另外的实施例中，核酸适配体序列还可以是在SEQ ID NO：1所示DNA序列的一端或两端减少或增加一个或多个碱基的序列，例如在其一端或两端减少1-3个碱基(例如2个)或增加1-10个(例如2、3、4、5、6、7、8、9个)碱基而得到的序列(需保证T30不处于序列末端)，例如：
[0037] 5′-ATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCG-3′(SEQ ID NO：2)
[0038] 5′-GGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCG-3′(SEQ ID NO：3)
[0039] 5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC-3′(SEQ ID NO：4)
[0040] SEQ ID NO：2-4中的电化学标记物位于与SEQ ID NO：1的上述特定T碱基对应的T碱基上，例如，在一个实施例中，电化学标记物位于SEQ ID NO：1的T30上，则相应地，在SEQ ID NO：2中，电化学标记物位于T29上；在SEQ ID NO：3中，电化学标记物位于T31上；在SEQ ID NO：4中，电化学标记物位于T30上，以此类推。
[0041] 下述实施例中所用的实验材料和试剂，如无特殊说明，均购自常规试剂公司。
[0042] 反应缓冲溶液：20mM Tris-HCl(pH 7.5)+10mM CaCl2+200mM NaCl。
[0043] 所用DNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备纯化。
[0044] 金电极购自上海辰华公司，直径2毫米。
[0045] 电化学传感方法：采用常规三电极系统，工作电极为核酸适配体修饰的金电极，参比电极为Ag/AgCl(3M KCl)，对电极为铂丝。电化学检测中，将第30个碱基T上带有MB标记的核酸适配体修饰的金电极置入到含有不同浓度OTA的反应缓冲溶液中室温温育3分钟后，采用方波伏安法进行测定(范围0～-0.5V，采样间隔1mV，幅度25mV，频率250Hz)，记录MB在-0.25V左右的峰电流。
[0046] 实施例1：核酸适配体电化学传感器的制备
[0047] 本发明将特定T碱基带有MB标记且5’末端带有硫醇修饰的核酸适配体固定到金电极表面作为电化学传感器，具体步骤如下。金电极表面采用粒径为0.05μm的氧化铝粉打磨，然后使用超纯水超声清洗电极。采用三电极体系，在0.5M H2SO4溶液中，-0.35V to 1.55V范围内进行反复循环伏安扫描，对金电极表面进行电化学清洗。表面处理干净的金电极浸没在50μL含有所述核酸适配体(500nM)PBS溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.75mM KH2PO4，pH 7.5)中，室温静置1小时，然后超纯水冲洗。把金电极浸没在200μL含2mM巯基己醇(MCH)的PBS溶液中，室温静置2小时，然后超纯水清洗，制得电化学传感器。
[0048] 实施例2：MB标记在不同T碱基位点的核酸适配体对应的电化学传感器对OTA的信号响应比较
[0049] 利用实施例1中的方法，制备了6种电化学传感器，不同之处在于核酸适配体序列中MB标记的位置不同。MB标记在核酸适配体序列中不同T碱基位置分别为T3、T8、T10、T14、T19、T30，分别对应核酸适配体序列中第3、8、10、14、19、30个碱基T。通过方波伏安分析法，所述传感器分别测定空白样品和含有500nM OTA样品溶液中MB的峰电流信号。如图1所示，T30上标记MB对应的电化学传感器，在OTA样品中MB峰电流信号明显增加。而其余碱基T位点上标记MB对应的电化学传感器在OTA存在时，MB峰电流信号变化不显著。
[0050] 实施例3：电化学传感器检测OTA
[0051] 按照实施例1中的方法，利用序列中第30个碱基T(T30)上标记了MB的核酸适配体制备电化学传感器，检测OTA。在方波伏安检测中，随着OTA浓度的增加，MB在-0.25V左右的峰电流逐渐升高。图2中显示了典型的方波伏安检测曲线结果，曲线由低到高对应的OTA浓度分别为0，20，100，500，2000nM OTA。图3给出了方波伏安法中MB峰电流与OTA浓度间的关系。所述电化学传感器可以检测到30pM OTA。图3所示，实验中考察的最高检测浓度为3μM，MB峰电流信号变化显著，3μM OTA对应的MB峰电流值与空白样品对应的MB峰电流值相比增加了112％。
[0052] 实施例4、方法的选择性
[0053] 利用实施例3中对应的电化学传感器，采用实施例3中相同的方法检测其他真菌毒素分子，如赭曲霉毒素B(简称OTB，500nM)，伏马毒素B1(简称FB1，1000nM)，伏马毒素B2(简称FB2，1000nM)，玉米赤霉烯酮(简称ZAE，1000nM)，赭曲霉毒素A(简称AFB1，1000nM)。与空白溶液样品相比，这些被检测的分子存在时，电化学传感器并没有产生明显的MB峰电流信号变化。而OTA(500nM)存在时，MB峰电流信号明显增加。检测结果如图4所示。结果说明本发明的电化学传感器具有很好的选择性。
[0054] 实施例5、电化学传感器检测稀释啤酒中的OTA
[0055] 利用实施例3中对应的电化学传感器，检测稀释的啤酒中的OTA。啤酒采用反应缓冲溶液稀释20倍。对含有不同浓度OTA的稀释的啤酒样品，采用实施例3中相同方法进行检测。实验结果如图5所示，随着OTA浓度的增加，MB的峰电流信号逐渐升高，表明所述的电化学传感器可以检测稀释啤酒中的OTA。
[0056] 实施例6、利用核酸适配体电化学传感器检测稀释牛奶中的OTA
[0057] 按照实施例3中对应的电化学传感器，检测稀释的牛奶中的OTA。牛奶采用缓冲溶液进行20倍稀释。对含有不同浓度OTA的稀释的牛奶样品，采用实施例3中相同方法进行检测。实验结果如图6所示，随着OTA浓度的增加，测得的MB峰电流信号逐渐升高，表明所述的电化学传感器可以检测稀释牛奶中的OTA。
[0058] 对比例1
[0059] 将MB修饰在3’端，其余均与实施例3相同，结果表明：相应的传感器的检测限大于1nM OTA，高于在T30碱基上修饰MB对应的传感器的检测限，表明MB修饰在特定碱基T30上的检测效果更好。
[0060] 在本发明的另一些实施例中，采用SEQ ID NO：2-4所示的序列作为赭曲霉毒素A核酸适配体，结果表明，上述序列能够取得相似的检测效果。
[0061] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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