靶向生物毒素的G-四联体式核酸适配体三级结构预测方法
专利汇可以提供靶向生物毒素的G-四联体式核酸适配体三级结构预测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于核苷酸三级结构预测技术领域，具体为一种靶向 生物 毒素的G-四联体式核酸适配体三级结构预测方法。本发明方法包括：G-四联体二级结构预测；G-四联体三级拓扑构型预测；核酸适配体末端补全和结构优化； 温度 依赖型分子动 力 学模拟（包括两个过程：恒温分子动力学模拟和升温分子动力学模拟）；采用RMSD分析方法获得最稳定核酸三级结构模型。本发明方法已用于预测靶向膝沟藻毒素的特异性核酸适配体序列GO18-T-d的三级结构，该序列为已知的通过指数富集配基进化技术筛选得到G-四联体式适配体序列，通过圆二色谱实验检测到其G-四联体构型为平行式G-四联体构型，预测结果与圆二色谱实验检测结果完全吻合，证明本预测方法具有良好的准确性。，下面是靶向生物毒素的G-四联体式核酸适配体三级结构预测方法专利的具体信息内容。
1.一种靶向生物毒素的G-四联体式核酸适配体三级结构预测方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：G-四联体二级结构预测：
对于获得的核苷酸序列，使用核酸G-四联体结构分析网站QGRS Mapper 预测其二级结构；在QGRS Mapper网站中，对所有可能出现的G-四联体二级结构进行打分，得分越高，作为此结构存在的可能性越大，取得分最高者；
第二步：G-四联体三级拓扑构型预测：
使用三维核酸结构的可视化建模网站3D-Nus 的G-Quadruplex模块对最高分数的二级结构进行G-四联体拓扑构型预测，得到G-四联体的三级拓扑构型；
第三步：核酸适配体末端补全和结构优化：
对于获得的适配体G-四联体三级拓扑构型，利用AutoPSF VMD插件补全适配体的5'端和3'端，以获得核酸适配体的全长三级结构模型；由于四个鸟嘌呤形成的平面中心之间的金属阳离子是维持G-四联体结构的要素，对于不同G-四联拓扑构型，维持其结构稳定的阳离子种类不同，主要为K+、Mg2+，故在G-四联体的中心放置相应的金属阳离子来稳定G-四联体；
经过上述处理后，使用版本2.10NAMD程序对每个三级结构模型进行至少5000次迭代的能量最小化处理，以消除不合理的核酸结构；
第四步：温度依赖型分子动力学模拟：
本步骤旨在评估其结构的热稳定性；温度依赖型分子动力学模拟包括两个过程：恒温分子动力学模拟和升温分子动力学模拟；其中，恒温分子动力学模拟过程，是将第三步获得的每个模型的三级结构模型放置于293K下保持不少于10 ns的时间，从而获得稳定性更好的三级结构模型；随后系统升温，进行升温分子动力学模拟，即每个模型的模拟温度在不少于4ns的时间内逐渐从293K升高到693K，使核酸能够克服能垒来完成所有可能的结构转变；
由此获得了每个合理的全长三级结构模型的分子动力学模拟轨迹，这些轨迹显示了每个结构模型在恒定温度下的最稳定构象以及随温度升高而发生的构象变化过程；
第五步：采用RMSD分析方法获得最稳定核酸三级结构模型：
为了比较不同结构模型之间的热稳定性差异，进一步对其结构模型中的G-四联体拓扑结构进行RMSD分析，从而定量地比较不同结构模型的G-四联体拓扑构型的热稳定性，选择热稳定性最好的G-四联体作为其天然G-四联体拓扑构型。
2. 根据权利要求1所述的预测方法，其特征在于，第四步中，所述温度依赖型分子动力学模拟在Gromacs5.1.4软件中进行，即利用Gromacs5.1.4软件进行每个全长核酸三级结构模型的温度依赖型模拟；为了构建适用于Gromacs5.14软件的模拟体系，使用AMBER99 bsc1力场并采用SPC水模型进行建模；模型建立后，将模型放置在模拟体系水立方体的中心，并在体系中插入金属阳离子以及相应的阴离子以达到所需的离子浓度；恒温、升温和冷却过程由Gromacs5.1.4的模拟退火模块完成；模拟体系搭建完成后，利用速度重新缩放的方法将模拟温度保持在恒定温度293K，在此温度下进行每个全长核酸三级结构模型的恒温分子动力学模拟；随后模拟体系升温，进行升温分子动力学模拟。
3.根据权利要求1所述的预测方法，其特征在于，第五步的RMSD分析中，子步骤一，计算每个G-四联体拓扑结构在恒温模拟中的初始构象的RMSD随模拟时间的变化，以检查它们是否能够在293K模拟温度下保持稳定，RMSD随模拟时间的变化波动越小，说明核酸的结构越稳定，排除掉不稳定的G-四联体拓扑结构；子步骤二，找出升温分子动力学模拟过程中不同G-四联体拓扑结构之间的RMSD随模拟时间变化的差异，选择RMSD随模拟时间变化波动最小的G-四联体拓扑结构模型作为核酸适配体的最可能的天然G-四联体拓扑结构，此轨迹下的核酸适配体全长三级结构模型最有可能为其天然三级结构。
靶向生物毒素的G-四联体式核酸适配体三级结构预测方法
技术领域
背景技术
发明内容
预测程序的第一步是核酸序列的G-四联体二级结构预测。在获得核苷酸序列之后，使用核酸G-四联体分析网站QGRS Mapper （http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php/）预测其二级结构[7]。在QGRS Mapper网站中，对所有可能出现的G-四联体二级结构进行打分，得分越高，作为此结构存在的可能性越大，得到最高分数的二级结构。
定的阳离子种类不同（主要为K、Mg ），所以需要在G-四联体的中心放置金属阳离子来稳定G-四联体；
经过上述处理后，使用NAMD（版本2.10）程序对每个三级结构模型进行至少5000次迭代的能量最小化处理[3]，以消除不合理的核酸结构[10]。
由此获得了每个合理的全长三级结构模型的分子动力学模拟轨迹，这些轨迹显示了每个结构模型在恒定温度下的最稳定构象以及随温度升高而发生的构象变化过程。
附图说明
具体实施方式
预测程序的第一步是GO18-T-d序列的G-四联体二级结构预测。在获得GO18-T-d核苷酸序列（5’-AACCTTTGGTCGGGCAAGGTAGGTT-3’（SEQ. ID. NO1））之后，使用QGRS Mapper 网站预测其二级结构。在QGRS Mapper中，所有可能出现的G-四联体二级结构都根据得分进行排名：得分越高，作为此结构存在的可能性越大。结果显示GO18-T-d的G值高达20，表明形成G-四联体结构的可能性很大。
模拟体系搭建完成后，本发明利用速度重新缩放的方法将模拟温度保持在恒定温度293K，并将已建好的九个模型的模拟体系放置于293K的恒定温度下保持10ns，其RMSD随模拟时间变化过程如附图3所示。分析结果表明，Q5、Q15、Q16三个结构模型的RMSD波动较大，而Q1、Q2、Q3、Q4、Q14、Q17的波动趋势相对稳定，这表明GO18-T-d适配体作为前三种结构存在的可能性较小，因此将它们排除在可能的三级结构之外。在随后的升温过程中，每个模型的温度在10 ns内逐渐从293K增加到693K，以便GO18-T-d核酸适配体能够通过克服能量壁垒来完成所有可能的构象变化。升温模拟部分的RMSD随时间变化图如附图4所示。很明显，Q3结构模型的G-四联体结构区域随着温度的升高而波动最小，通过观测Q1、Q2、Q3、Q4、Q14、Q17六个结构模型的结构，发现仅有Q3结构模型保持稳定的G-四联体拓扑结构。因此，Q3结构模型作为GO18-T-d适配体最有可能的三级结构模型，并且其G-四联体拓扑构型为平行式G-四联体。
0.2μm的水相过滤膜过滤以出去溶液中的颗粒物。本实验所用的核酸适配体GO18-T-d购买于生工生物工程股份有限公司，用缓冲液将核酸稀释到20μmol/L，取200μL核酸样品置于加热器中95℃加热10分钟,关闭加热器，再以2℃/min降至室温。
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