检测microRNA的纸基比率光电化学生物传感器的制备方法
专利汇可以提供检测microRNA的纸基比率光电化学生物传感器的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于检测microRNA的纸基比率光电化学 生物 传感器 的制备方法。在由工作 电极 和内参比电极组成的纸基双电极表面生长金 纳米粒子 ，随后 电沉积 氧 化亚 铜 并敏化 石墨 烯 量子点 和碘化 银 纳米粒子，增强光 电流 信号 ；在目标microRNA存在时，将不同浓度和恒定浓度microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应输出的DNA探针分别孵化在 工作电极 和内参比电极表面，其联合DNA桥接链和电极表面的DNA发夹H1和H2诱导形成DNA桥纳米结构，导致标记在H1和H2端部的碘化银纳米粒子远离电极表面，降低光电流信号，基于工作电流信号和内参比电流信号的比值，实现对microRNA的灵敏检测。，下面是检测microRNA的纸基比率光电化学生物传感器的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测microRNA的纸基比率光电化学生物传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）首先在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计纸辅助板和纸检测板的蜡染图案，然后通过型号为Color Qube 8580的蜡打印机将设计好的蜡染图案打印在色谱纸上，最后将蜡打印过的色谱纸在130 ℃的烘箱中加热50 s，获得纸辅助板的亲水辅助区域和纸检测板的亲水工作电极区域及内参比电极区域；
（2）在步骤（1）中获得的纸检测板的亲水工作电极区域及内参比电极区域功能化金纳米粒子导电层，具体步骤如下：首先制备金种子，将100-200 μL浓度为0.2-0.25 M的巯基乙胺加入到10-15 mL浓度为1.0-1.5 mM的氯金酸溶液中，在室温下磁力搅拌10-30 min后，向获得的混合液中加入2-5 μL浓度为10-20 mM的硼氢化钠溶液，继续在黑暗条件下磁力搅拌
5-10 min，获得酒红色的溶液；然后在工作电极区域及内参比电极区域分别滴加80-100 μL制备的金种子溶液并在60 ℃烘箱中干燥，重复操作上述“滴加-干燥”过程3-5次后，在工作电极区域及内参比电极区域分别滴加80-100 μL生长溶液，所述的生长溶液由浓度为20-25 mM的氯金酸和浓度为200-300 mM的盐酸羟胺组成，在室温下反应20-40 min后，用二次水洗涤工作电极区域及内参比电极区域表面并在60 ℃烘箱中干燥，获得金纳米粒子包覆的工作电极及内参比电极；
（3）首先在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计Ag/AgCl参比电极和碳对电极的印刷图案，然后通过丝网印刷技术将设计好的印刷图案印刷在步骤（1）中获得的纸辅助板的亲水辅助区域，获得Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
（4）首先利用由步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的工作电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，在步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的工作电极区域电沉积菱形状的氧化亚铜，沉积电压为-0.2 V，沉积时间为40 min，沉积温度为70 ℃，沉积电解液为由浓度为0.02 M的醋酸铜和浓度为0.4 M的乳酸组成的混合液，沉积电解液的pH由浓度为1 M的氢氧化钠调节至9，电沉积完成后，用二次水洗涤工作电极区域表面，并在60 ℃烘箱中干燥；然后首先利用由步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的内参比电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，采用上述相同的沉积条件在步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的内参比电极区域电沉积菱形状的氧化亚铜，最后获得氧化亚铜修饰的工作电极和内参比电极；
（5）制备石墨烯量子点：将0.25 g碳粉溶解到50 mL浓度为6 M的硝酸溶液中，磁力搅拌
1 h后，在130 ℃加热回流24 h，待冷却到室温后，将获得的混合液离心20 min并收集上清液，随后将收集的上清液在100 ℃条件下加热除去水和硝酸，获得红褐色的固体，最后将获得的红褐色的固体溶解在二次水中，并在透析袋中透析72 h，获得石墨烯量子点溶液；
（6）制备碘化银纳米粒子标记的DNA发夹H1和H2，该过程分为两步：第一步是合成碘化银纳米粒子，将1-2 mmol KI和0.2-0.8 g聚乙烯吡咯烷酮溶解在20-40 mL二次水中，磁力搅拌40-60 min后，逐滴加入5-10 mL浓度为0.1-0.3 M的硝酸银溶液，将获得的黄色混合液在透析袋中透析24-36 h，获得碘化银纳米粒子；第二步是将获得的碘化银纳米粒子标记在DNA发夹H1和H2上，所用的H1 5′端标记氨基，3′端标记巯基，H2 5′端标记巯基，3′端标记氨基，首先利用浓度为10 mM的三羟甲基氨基甲烷(2-羧甲基)磷化氢液将H1和H2端部巯基中的二硫键断裂，然后将获得的H1和H2与2 mL制备的碘化银纳米粒子混合并在室温下孵化1 h，最后将获得的混合液离心洗涤除去多余的H1和H2，获得碘化银纳米粒子标记的H1和H2；
（7）双链特异性核酸酶催化的目标物循环反应：将10 μL浓度为0.3 μM的DNA发夹HP与
10 μL不同浓度的目标microRNA、4 μL浓度为 0.5 U的双链特异性核酸酶和6 μL pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液混合，所用的pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液由浓度为50 mM的Tris-HCl、浓度为1 mM的二巯基苏糖醇和浓度为5 mM的氯化镁组成，将获得的混合液在50 ℃条件下加热反应60 min，随后加入5 μL浓度为15 mM的乙二胺四乙酸，继续在50 ℃条件下加热反应20 min后，获得不同浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物；同时，在上述相同的双链特异性核酸酶反应条件下，进行恒定浓度的目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应，获得恒定浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物；
（8）纸基比率光电化学生物传感器的构建：在步骤（4）中获得的氧化亚铜修饰的工作电极和内参比电极表面分别滴加20 μL质量分数为2 %的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温下反应50 min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤，所用的磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，随后分别滴加20 μL由步骤（5）中获得的石墨烯量子点溶液、浓度为20 mM的1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和浓度为20 mM的羟基硫代琥珀酰亚胺组成的混合液，并在室温下反应1 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，分别滴加20 μL步骤（6）中获得的碘化银纳米粒子标记的H1和H2，孵化反应2 h后用pH 7.4的PBS洗涤，继续分别滴加20 μL浓度为1 mM的巯基己醇并在室温下反应1 h，用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的巯基己醇后，将20 μL步骤（7）中获得的不同浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物滴加到工作电极表面，20 μL步骤（7）中获得的恒定浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物滴加到内参比电极表面，在37 ℃条件下反应1 h后用pH 7.4的PBS洗涤，最后在工作电极和内参比电极表面分别滴加20 μL浓度为5.0 μM的DNA桥接链，在室温下孵化反应1 h后，用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的DNA桥接链，最终在工作电极和内参比电极表面形成DNA桥纳米结构；
（9）双信号比率检测：首先利用由步骤（8）中获得的工作电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，通过时间-电流法进行工作电流信号检测，检测过程中所用的激发波长范围为200-2500 nm，所用的检测电压为0.0 V，所用的检测电解液为浓度为0.1 M的pH 7.4的PBS，当工作电流信号记录10 s后，将工作电极断开，随后利用由步骤（8）中获得的内参比电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，通过上述检测工作电流信号的条件记录内参比电流信号，记录时间为10 s，最后计算工作电流信号和内参比电流信号的比值，实现对microRNA的灵敏检测。
检测microRNA的纸基比率光电化学生物传感器的制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）在步骤（1）中获得的纸检测板的亲水工作电极区域及内参比电极区域功能化金纳米粒子导电层，具体步骤如下：首先制备金种子，将100-200 μL浓度为0.2-0.25 M的巯基乙胺加入到10-15 mL浓度为1.0-1.5 mM的氯金酸溶液中，在室温下磁力搅拌10-30 min后，向获得的混合液中加入2-5 μL浓度为10-20 mM的硼氢化钠溶液，继续在黑暗条件下磁力搅拌
5-10 min，获得酒红色的溶液；然后在工作电极区域及内参比电极区域分别滴加80-100 μL制备的金种子溶液并在60 ℃烘箱中干燥，重复操作上述“滴加-干燥”过程3-5次后，在工作电极区域及内参比电极区域分别滴加80-100 μL生长溶液，所述的生长溶液由浓度为20-25 mM的氯金酸和浓度为200-300 mM的盐酸羟胺组成，在室温下反应20-40 min后，用二次水洗涤工作电极区域及内参比电极区域表面并在60 ℃烘箱中干燥，获得金纳米粒子包覆的工作电极及内参比电极；
（3）首先在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计Ag/AgCl参比电极和碳对电极的印刷图案，然后通过丝网印刷技术将设计好的印刷图案印刷在步骤（1）中获得的纸辅助板的亲水辅助区域，获得Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
（4）首先利用由步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的工作电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，在步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的工作电极区域电沉积菱形状的氧化亚铜，沉积电压为-0.2 V，沉积时间为40 min，沉积温度为70 ℃，沉积电解液为由浓度为0.02 M的醋酸铜和浓度为0.4 M的乳酸组成的混合液，沉积电解液的pH由浓度为1 M的氢氧化钠调节至9，电沉积完成后，用二次水洗涤工作电极区域表面，并在60 ℃烘箱中干燥；然后首先利用由步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的内参比电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，采用上述相同的沉积条件在步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的内参比电极区域电沉积菱形状的氧化亚铜，最后获得氧化亚铜修饰的工作电极和内参比电极；
（5）制备石墨烯量子点：将0.25 g碳粉溶解到50 mL浓度为6 M的硝酸溶液中，磁力搅拌
1 h后，在130 ℃加热回流24 h，待冷却到室温后，将获得的混合液离心20 min并收集上清液，随后将收集的上清液在100 ℃条件下加热除去水和硝酸，获得红褐色的固体，最后将获得的红褐色的固体溶解在二次水中，并在透析袋中透析72 h，获得石墨烯量子点溶液；
（6）制备碘化银纳米粒子标记的DNA发夹H1和H2，该过程分为两步：第一步是合成碘化银纳米粒子，将1-2 mmol KI和0.2-0.8 g聚乙烯吡咯烷酮溶解在20-40 mL二次水中，磁力搅拌40-60 min后，逐滴加入5-10 mL浓度为0.1-0.3 M的硝酸银溶液，将获得的黄色混合液在透析袋中透析24-36 h，获得碘化银纳米粒子；第二步是将获得的碘化银纳米粒子标记在DNA发夹H1和H2上，所用的H1 5′端标记氨基，3′端标记巯基，H2 5′端标记巯基，3′端标记氨基，首先利用浓度为10 mM的三羟甲基氨基甲烷(2-羧甲基)磷化氢液将H1和H2端部巯基中的二硫键断裂，然后将获得的H1和H2与2 mL制备的碘化银纳米粒子混合并在室温下孵化1 h，最后将获得的混合液离心洗涤除去多余的H1和H2，获得碘化银纳米粒子标记的H1和H2；
（7）双链特异性核酸酶催化的目标物循环反应：将10 μL浓度为0.3 μM的DNA发夹HP与
10 μL不同浓度的目标microRNA、4 μL浓度为 0.5 U的双链特异性核酸酶和6 μL pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液混合，所用的pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液由浓度为50 mM的Tris-HCl、浓度为1 mM的二巯基苏糖醇和浓度为5 mM的氯化镁组成，将获得的混合液在50 ℃条件下加热反应60 min，随后加入5 μL浓度为15 mM的乙二胺四乙酸，继续在50 ℃条件下加热反应20 min后，获得不同浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物；同时，在上述相同的双链特异性核酸酶反应条件下，进行恒定浓度的目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应，获得恒定浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物；
（8）纸基比率光电化学生物传感器的构建：在步骤（4）中获得的氧化亚铜修饰的工作电极和内参比电极表面分别滴加20 μL质量分数为2 %的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温下反应50 min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤，所用的磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，随后分别滴加20 μL由步骤（5）中获得的石墨烯量子点溶液、浓度为20 mM的1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和浓度为20 mM的羟基硫代琥珀酰亚胺组成的混合液，并在室温下反应1 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，分别滴加20 μL步骤（6）中获得的碘化银纳米粒子标记的H1和H2，孵化反应2 h后用pH 7.4的PBS洗涤，继续分别滴加20 μL浓度为1 mM的巯基己醇并在室温下反应1 h，用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的巯基己醇后，将20 μL步骤（7）中获得的不同浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物滴加到工作电极表面，20 μL步骤（7）中获得的恒定浓度目标microRNA诱导的双链特异性核酸酶反应产物滴加到内参比电极表面，在37 ℃条件下反应1 h后用pH 7.4的PBS洗涤，最后在工作电极和内参比电极表面分别滴加20 μL浓度为5.0 μM的DNA桥接链，在室温下孵化反应1 h后，用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的DNA桥接链，最终在工作电极和内参比电极表面形成DNA桥纳米结构；
（9）双信号比率检测：首先利用由步骤（8）中获得的工作电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，通过时间-电流法进行工作电流信号检测，检测过程中所用的激发波长范围为200-2500 nm，所用的检测电压为0.0 V，所用的检测电解液为浓度为0.1 M的pH 7.4的PBS，当工作电流信号记录10 s后，将工作电极断开，随后利用由步骤（8）中获得的内参比电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，通过上述检测工作电流信号的条件记录内参比电流信号，记录时间为10 s，最后计算工作电流信号和内参比电流信号的比值，实现对microRNA的灵敏检测。
10 mL浓度为1.5 mM的氯金酸溶液中，在室温下磁力搅拌20 min后，向获得的混合液中加入
5 μL浓度为15 mM的硼氢化钠溶液，继续在黑暗条件下磁力搅拌5 min，获得酒红色的溶液；
然后在工作电极区域及内参比电极区域分别滴加80 μL制备的金种子溶液并在60 ℃烘箱中干燥，重复操作上述“滴加-干燥”过程4次后，在工作电极区域及内参比电极区域分别滴加80 μL生长溶液，所述的生长溶液由浓度为20 mM的氯金酸和浓度为200 mM的盐酸羟胺组成，在室温下反应35 min后，用二次水洗涤工作电极区域及内参比电极区域表面并在60 ℃烘箱中干燥，获得金纳米粒子包覆的工作电极及内参比电极；
（3）首先在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计Ag/AgCl参比电极和碳对电极的印刷图案，然后通过丝网印刷技术将设计好的印刷图案印刷在步骤（1）中获得的纸辅助板的亲水辅助区域，获得Ag/AgCl参比电极和碳对电极；
（4）首先利用由步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的工作电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，在步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的工作电极区域电沉积菱形状的氧化亚铜，沉积电压为-0.2 V，沉积时间为40 min，沉积温度为70 ℃，沉积电解液为由浓度为0.02 M的醋酸铜和浓度为0.4 M的乳酸组成的混合液，沉积电解液的pH由浓度为1 M的氢氧化钠调节至9，电沉积完成后，用二次水洗涤工作电极区域表面，并在60 ℃烘箱中干燥；然后首先利用由步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的内参比电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，采用上述相同的沉积条件在步骤（2）中获得的金纳米粒子包覆的内参比电极区域电沉积菱形状的氧化亚铜，最后获得氧化亚铜修饰的工作电极和内参比电极；
（5）制备石墨烯量子点：将0.25 g碳粉溶解到50 mL浓度为6 M的硝酸溶液中，磁力搅拌
1 h后，在130 ℃加热回流24 h，待冷却到室温后，将获得的混合液离心20 min并收集上清液，随后将收集的上清液在100 ℃条件下加热除去水和硝酸，获得红褐色的固体，最后将获得的红褐色的固体溶解在二次水中，并在透析袋中透析72 h，获得石墨烯量子点溶液；
（6）制备碘化银纳米粒子标记的DNA发夹H1和H2，该过程分为两步：第一步是合成碘化银纳米粒子，将1.5 mmol KI和0.52 g聚乙烯吡咯烷酮溶解在20 mL二次水中，磁力搅拌60 min后，逐滴加入10 mL浓度为0.1 M的硝酸银溶液，将获得的黄色混合液在透析袋中透析24 h，获得碘化银纳米粒子；第二步是将获得的碘化银纳米粒子标记在DNA发夹H1和H2上，所用的H1 5′端标记氨基，3′端标记巯基，H2 5′端标记巯基，3′端标记氨基，首先利用浓度为10 mM的三羟甲基氨基甲烷(2-羧甲基)磷化氢液将H1和H2端部巯基中的二硫键断裂，然后将获得的H1和H2与2 mL制备的碘化银纳米粒子混合并在室温下孵化1 h，最后将获得的混合液离心洗涤除去多余的H1和H2，获得碘化银纳米粒子标记的H1和H2；
（7）双链特异性核酸酶催化的目标物循环反应：将10 μL浓度为0.3 μM的DNA发夹HP与
10 μL不同浓度的目标microRNA-141、4 μL浓度为 0.5 U的双链特异性核酸酶和6 μL pH为
8.0的Tris-HCl缓冲溶液混合，所用的pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液由浓度为50 mM的Tris-HCl、浓度为1 mM的二巯基苏糖醇和浓度为5 mM的氯化镁组成，将获得的混合液在50 ℃条件下加热反应60 min，随后加入5 μL浓度为15 mM的乙二胺四乙酸，继续在50 ℃条件下加热反应20 min后，获得不同浓度目标microRNA-141诱导的双链特异性核酸酶反应产物；同时，在上述相同的双链特异性核酸酶反应条件下，进行恒定浓度的目标microRNA-141诱导的双链特异性核酸酶反应，获得恒定浓度目标microRNA-141诱导的双链特异性核酸酶反应产物；
（8）纸基比率光电化学生物传感器的构建：在步骤（4）中获得的氧化亚铜修饰的工作电极和内参比电极表面分别滴加20 μL质量分数为2 %的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在室温下反应50 min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤，所用的磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，随后分别滴加20 μL由步骤（5）中获得的石墨烯量子点溶液、浓度为20 mM的1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和浓度为20 mM的羟基硫代琥珀酰亚胺组成的混合液，并在室温下反应1 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，分别滴加20 μL步骤（6）中获得的碘化银纳米粒子标记的H1和H2，孵化反应2 h后用pH 7.4的PBS洗涤，继续分别滴加20 μL浓度为1 mM的巯基己醇并在室温下反应1 h，用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的巯基己醇后，将20 μL步骤（7）中获得的不同浓度目标microRNA-141诱导的双链特异性核酸酶反应产物滴加到工作电极表面，20 μL步骤（7）中获得的恒定浓度目标microRNA-141诱导的双链特异性核酸酶反应产物滴加到内参比电极表面，在37 ℃条件下反应1 h后用pH 7.4的PBS洗涤，最后在工作电极和内参比电极表面分别滴加20 μL浓度为5.0 μM的DNA桥接链，在室温下孵化反应1 h后，用pH
7.4的PBS洗涤除去多余的DNA桥接链，最终在工作电极和内参比电极表面形成DNA桥纳米结构；
（9）双信号比率检测：首先利用由步骤（8）中获得的工作电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，通过时间-电流法进行工作电流信号检测，检测过程中所用的激发波长范围为200-2500 nm，所用的检测电压为0.0 V，所用的检测电解液为浓度为0.1 M的pH 7.4的PBS，当工作电流信号记录10 s后，将工作电极断开，随后利用由步骤（8）中获得的内参比电极及步骤（3）中获得的Ag/AgCl参比电极和碳对电极组成的三电极体系，通过上述检测工作电流信号的条件记录内参比电流信号，记录时间为10 s，最后计算工作电流信号和内参比电流信号的比值，实现对microRNA-141的灵敏检测。
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