技术领域
[0001] 本
发明涉及一种定向的机械
力-
电刺激的方法，主要用于人工神经肌肉组织的定向刺激和训练。
背景技术
[0002] 肌肉是执行
机体运动的重要器官，也是机体
能量代谢的重要器官。当肌肉组织出现
疾病或者相关的
炎症时，容易造成各类肌肉不自主运动及痉挛等等，严重时可危及生命健康。一些肌肉疾病通过传统药物
治疗可以治疗，但对于一些已经发生病变的肌肉组织，例如已经萎缩的肌肉组织，传统的药物治疗无法从根本上去实现治疗。
[0003] 对于一些常见的肌无力，肌肉骨骼损伤的症状，可以通过一些外部的肌肉刺激装置进行刺激得到缓解(如美国发明
专利US6682496B1)。但对于一些导致肌肉组织萎缩的疾病，如肌源性
肌萎缩，主要是由于肌肉营养障碍、缺血、中毒等等所导致的，外部刺激无法从根本上进行治疗。这一类肌肉萎缩可以通过移植替换的方法得到解决。通过体外培养肌肉组织，然后通过外部手术的方法，移植替换由于营养缺失、缺血、中毒等等导致的萎缩的肌肉，实现肌肉疾病的康复。
[0004] 目前，体外培养的人工肌肉组织，主要是通过
生物兼容性材料作为培养
支撑，之后在
支架上或者支架内部培养肌肉细胞，形成肌肉组织。通常在培养过程中，为了使肌肉组织能更好地生长，还会在培养的组织里面同时培养神经细胞，构成神经-肌肉组织共培养，进而培养出人工神经肌肉组织。这种方法能够培养出各种形态的肌肉组织。为了提高肌肉组织的活性，现有多采用了电刺激肌肉生长的方法。但这一方法仅模仿了机体内神经电
信号对肌肉电刺激生长的过程，缺乏后期的肌肉组织收缩力刺激训练，无法提高组织培养的效率和活性。
发明内容
[0005] 针对
现有技术存在的问题，为了提供一种有较好活性和收缩力的人工神经肌肉组织，本发明提供了一种人工神经肌肉组织的定向刺激系统和培养方法。本发明的培养方法将滑台拉伸的机械刺激与
电极对的电刺激相结合，在光学
显微镜下进行模拟人骨骼肌训练的方式，包括离心收缩、向心收缩以及等张收缩三种模式的机械拉伸刺激以及电刺激，从而提高人工神经肌肉组织的活性和收缩力。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现。
[0007] 本发明第一方面提供了一种用于人工神经肌肉组织的定向刺激系统，包括：第一滑台、第二滑台、电极对、第一测量探针、第二测量探针和滑台固定座；
[0008] 所述第一滑台和所述第二滑台固定在所述滑台固定座上；
[0009] 所述第一测量探针设置在所述第一滑台的滑动部，所述第二测量探针设置在所述第二滑台的滑动部；所述人工神经肌肉组织的一端固定在所述第一测量探针，另一端固定在所述第二测量探针；
[0010] 所述电极对分别安装于所述人工神经肌肉组织的两端，并且与一信号发生器连接。
[0011] 优选地，所述滑台固定座上具有一个孔，所述第一滑台和所述第二滑台基本对称地固定在所述孔的两边；所述孔内放置有培养皿。
[0012] 优选地，所述第一滑台为手动滑台，所述第二滑台为电动滑台。
[0013] 优选地，所述第一测量探针由毛细玻璃
钢拉制而成，并在表面溅射金
原子层。
[0014] 优选地，所述第一测量探针的尖端直径约为50μm。
[0015] 优选地，所述电极对包括一
对电极片，通过电极对支架固定在所述培养皿内，所述电极对支架为U型槽结构，槽内用于固定所述电极对的电极片；所述电极对支架通过卡槽结构直接固定在培养皿边缘。
[0016] 本发明第二方面提供了一种人工神经肌肉组织的培养和定向刺激方法，包括如下步骤：
[0017] 将生物兼容性材料制作成带微流道的肌肉状基底；
[0018] 从所述微流道的入口通入包裹细胞的GelMa溶液；
[0019] 通过紫外灯照射使所述溶液在所述微流道内
固化，形成人工神经肌肉组织；
[0020] 将所述人工神经肌肉组织的两端分别固定在根据本发明第一方面中任一项所述的定向刺激系统的第一测量探针和第二测量探针；
[0021] 调节第一滑台和第二滑台，使所述人工神经肌肉组织的整体位于
水平面内；
[0022] 通过信号发生器输入一个固定
电压值，控制第二滑台拉伸人工神经肌肉组织，调节人工神经肌肉组织处于一个预拉伸的状态，记录测量探针的尖端
变形情况；
[0023] 对所述人工神经肌肉组织进行定向刺激。
[0024] 优选地，所述定向刺激的方式包括离心收缩刺激，其具体包括如下步骤：
[0025] 通过信号发生器对电极对输入不断递减的电压信号来刺激人工神经肌肉组织收缩；
[0026] 控制第二滑台运动，使第一滑台的第一测量探针尖端变形量保持不变。
[0027] 优选地，所述定向刺激的方式包括向心收缩刺激，其具体包括如下步骤：
[0028] 通过信号发生器对电极对输入一个不断递增的电压信号；
[0029] 控制第二滑台运动，使第一滑台的第一测量探针尖端变形量保持不变。
[0030] 优选地，所述定向刺激的方式包括等张收缩刺激，其具体包括如下步骤：
[0031] 通过信号发生器对电极对输入一个固定不变的电压信号；
[0032] 控制第二滑台运动，使第一滑台的第一测量探针尖端变形量保持不变。
[0033] 本发明所述的一种用于人工神经肌肉组织的定向刺激系统，通过测量探针将人工神经肌肉组织固定，通过控制滑台在
视觉反馈系统下的自动移动，以及通过电极对配合的电刺激，实现对人工神经肌肉组织的定向刺激。该系统包含多种刺激模式，通过弹性材料将变形力传递至细胞对细胞进行刺激，以提高人工神经肌肉组织的活性，为后续的形成可供移植的肌肉组织提供
基础。
附图说明
[0034] 图1是本发明系统的三维结构图。
[0035] 图2是本
发明人工神经肌肉组织部分的放大图。
[0036] 图3是本发明人工神经肌肉组织的微流道培养示意图。
[0037] 图4是本发明的人工神经肌肉组织的一个截面示意图。图4中(a)为在人工神经肌肉组织取一截面，(b)为组织在截面处的结构示意图，(c)为组织在系统刺激下的变化形式。
[0038] 附图中各个附图标记的含义如下：1-手动滑台；2-电极对；3-人工神经肌肉组织；4-测量探针(末端经过拉制)；5-测量探针(末端不经过拉制)；6-培养皿；7-电动滑台；8-滑台固定座；9-人工神经肌肉组织培养的基底；10-GelMa材料；11-神经及肌肉细胞。
具体实施方式
[0040] 本实施例提供了一种用于人工神经肌肉组织的定向刺激系统。
[0041] 如图1-2所示，根据本发明的用于人工神经肌肉组织的定向刺激系统包括：
光学显微镜、手动滑台1、电极对2、第一测量探针4、第二测量探针5、电动滑台7和滑台固定座8。
[0042] 所述手动滑台1和所述电动滑台7固定在所述滑台固定座8上。
[0043] 所述第一测量探针4设置在所述手动滑台1的滑动部，所述第二测量探针5设置在所述电动滑台7的滑动部。人工神经肌肉组织3的一端固定在所述第一测量探针4，另一端固定在所述第二测量探针5。
[0044] 电极对2包括一对电极片，分别安装于所述人工神经肌肉组织3的两端，并且与一信号发生器连接。
[0045] 所述滑台固定座8上具有一个孔，所述手动滑台1和所述电动滑台7基本对称地固定在所述孔的两边；所述孔内放置有培养皿6。
[0046] 在一优选的实施方式中，所述手动滑台1、电动滑台7包含XYZ三个方向
自由度，能实现三个方向的运动，各个方向的行程为11mm，移动
精度为0.2μm。
[0047] 在一优选的实施方式中，所述的电极对2为铂电极片，尺寸为10mm×10mm×0.1mm，通过3D打印的电极支架固定在所述培养皿内，所述电极对支架为U型槽结构，槽内用于固定所述电极对2的电极片。所述电极对支架通过卡槽结构直接固定在培养皿6的边缘。
[0048] 在一优选的实施方式中，所述的人工神经肌肉组织3包括由微纳加工制作出的，长度为20mm的仿肌肉基底；所述仿肌肉基底上由多条宽度为50μm、深度为50μm的微流道。微流道在出口和入口处汇集，出入口流道宽0.6mm，深50μm，用于通细胞溶液。
[0049] 在一优选的实施方式中，所述第一测量探针4由毛细玻璃钢拉制而成，尖端直径约为50μm，并在表面溅射金原子层。该测量探针在
电子显微镜下对尖端的
弹性模量进行了标定，用于在显微镜下对人工神经肌肉组织的弹性模量进行测量和记录。固定在电动滑台7的第二测量探针5为不经过拉制的毛细玻璃管。
[0050] 实施例2
[0051] 本实施例提供一种人工神经肌肉组织的培养和定向刺激方法，包括人工神经肌肉组织的培养及人工神经肌肉组织的定向刺激。
[0052] 如图3所示，所述的人工神经肌肉组织的培养包括如下步骤。
[0053] 通过微纳加工技术先
刻蚀出肌肉状模具，之后转印到生物兼容性材料上。
[0054] 将该人工神经肌肉组织的基底移至
载玻片上，同时盖上盖玻片在两端按照图3中箭头指示通入含有细胞的GelMa溶液，之后在紫外灯下进行固化。
[0055] 固化完成后，移除载玻片和盖玻片，在培养皿内对该组织进行培养。
[0056] 在一优选的实施方式中，所述的第一测量探针4由直径1mm的毛细玻璃管通过拉针仪拉制而成，尖端直径约为100μm。其表面喷溅了金原子，尖端的弹性模量在电子显微镜下面进行标定。
[0057] 所述的滑台固定座8上固定有手动滑台1和电动滑台7，中间为一直径100mm的通孔，用于放置培养皿6以及透光。
[0058] 所述的人工神经肌肉组织定向刺激包括如下步骤。
[0059] 在显微镜下，手动调节手动滑台和电动滑台运动，使人工神经肌肉组织的整体位于水平面内。
[0060] 通过信号发生器输入一个的固定电压值V，控制电动滑台预拉伸人工神经肌肉组织。控制人工神经肌肉组织的伸长率至一个设定值，同时通过视觉反馈系统记录手动滑台测量探针的尖端弯曲变形量δ。
[0061] 在控制程序中，选择定向刺激的刺激方式。所述定向刺激的刺激方式包括离心收缩刺激、向心收缩刺激和等张收缩刺激。
[0062] 离心收缩刺激为先通过信号发生器对电极对输入一个不断递减的电压信号，刺激人工神经肌肉组织收缩，通过视觉反馈系统调节电动滑台运动，使手动滑台测量探针尖端变形量一直保持为δ。
[0063] 向心收缩刺激为通过信号发生器对电极对输入一个不断递增的电压信号，同理控制电动滑台运动，使手动滑台测量探针尖端变形量一直保持为δ。
[0064] 等张收缩刺激为通过信号发生器对电极对输入一个固定不变的电压信号V，同理控制电动滑台运动，使手动滑台测量探针尖端变形量一直保持为δ。
[0065] 本领域技术人员能够理解，以上调节电动滑台运动的视觉反馈系统可以使用现有技术中任何适用的方案。
[0066] 在一优选的实施方式中，定向刺激的刺激方式也可以将离心收缩刺激和向心收缩刺激两种方式组合，形成对人工神经肌肉组织的连续刺激训练。
[0067] 如图4所示，系统通过材料将刺激力传递至细胞，对细胞产生刺激。如图4(a)所示，在人工神经肌肉组织取一截面AA’，人工神经肌肉组织在该截面处的结构如图4(b)所示。在拉伸的作用下，材料发生变形，
挤压细胞从而对细胞产生刺激，组织在系统刺激下的变化形式如图4(c)所示。
[0068] 实施例3
[0069] 本实施例使用如实施例1所述的人工神经肌肉组织定向刺激系统，以小鼠成肌细胞(C2C12)和神经细胞共培养成人工神经肌肉组织，然后对其施加定向刺激，包括以下步骤。
[0070] 通过拉针仪将直径1mm的毛细玻璃管拉制成尖端直径100μm的测量探针；测量探针的表面进行金原子层溅射，在电子显微镜下对探针尖端的弹性模量测量标定。
[0071] 通过微纳加工技术，先在
硅片上刻蚀出肌肉状模具。之后，通过转印的方法，用生物兼容性材料制作出肌肉状的组织基底。该基底有多条宽50μm、深50μm的微流道，微流道在出入口处汇合，出入口流道宽0.6mm，深0.5μm。
[0072] 用
镊子将该组织基底转移至载玻片上，并在上面盖上盖玻片。通过
注射器，从组织基底的入口通入含有C2C12和神经细胞的GelMa溶液，之后在紫外灯下固化。固化完成后，移除盖玻片，完成人工神经肌肉组织的制作。
[0073] 用镊子将人工神经肌肉组织转移至测量探针上，通过Cell-Tak
粘合剂将人工神经肌肉组织的两端与两个测量探针分别粘合在一起，并且让肌肉组织粘合的
位置尽量靠近探针尖端。
[0074] 通过3D
打印机制作出铂电极片的固定支架，将电极固定支架粘结在培养皿内，位于人工神经肌肉组织的两端，之后将铂电极片安装在支架上。同时，将电极片与信号发生器连接。
[0075] 手动调节两个滑台，对测量探针及人工神经肌肉组织进行平面校准，包括：XY方向校准，控制电动滑台让组织的纹路方向与探针垂直；Z方向校准，控制电动滑台让人工肌肉的整个组织保持在一个水平面，以保证测量精度。
[0076] 完成校准后，由信号发生器输入4V电压信号，预拉伸人工神经肌肉组织至5％左右的伸长率，通过视觉反馈系统记录测量探针尖端的变形量δ。在控制程序中选择刺激方式，包括：向心收缩、离心收缩和等张收缩。
[0077] 当刺激模式为向心收缩刺激时：信号发生器的
输出电压由4V开始递增，通过视觉反馈系统控制电动滑台自动移动，保持测量探针的尖端变形量为δ；
[0078] 当刺激模式为离心收缩刺激时：信号发生器的输出电压由4V开始递减，通过视觉反馈系统控制电动滑台自动移动，保持测量探针的尖端变形量为δ；
[0079] 当刺激模式为等张收缩刺激时：信号发生器的输出电压保持在4V，通过视觉反馈系统控制电动滑台自动移动，保持测量探针的尖端变形量为δ；
[0080] 在一优选的实施方式中，本发明的系统可以同时将向心收缩刺激和离心收缩刺激两种模式结合进行持续的收缩刺激训练。即通过铂电极片输入一个电压范围为0～8V的三
角波电压信号，同时反馈控制电动滑台，保持测量探针的尖端变形量为δ。
[0081] 本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
