拟环纹豹蛛D家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用
阅读：607发布：2024-02-13
专利汇可以提供拟环纹豹蛛D家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种拟环纹豹蛛D家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用，该拟环纹豹蛛D家族杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示；拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽的 氨 基酸如SEQ ID NO.11-15所示。本发明利用 生物 信息学分析方法，对拟环纹豹蛛转录组 数据库 中的基因进行筛选，获得一类相似的拟环纹豹蛛毒素的候选基因，将该基因构建到原核表达载体pET-32a(+)中，即可获得该基因编码的杀虫肽，该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源，具有不同于Bt毒素的杀虫机制，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全 风 险，减少 杀虫剂 的使用具有重要的科学及现实意义。，下面是拟环纹豹蛛D家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用专利的具体信息内容。
1.一种拟环纹豹蛛D家族杀虫基因，其特征在于，所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示。
2.一种权利要求1所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的杀虫蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6-10所示。
3.一种权利要求1所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽，其特征在于，所述成熟肽氨基酸序列如SEQ ID NO.11-15所示。
4.一种编码权利要求3所述的成熟肽的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16-20所示。
5.一种含有权利要求4所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因的重组质粒。
6.一种权利要求3所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽在农作物害虫防治中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述成熟肽优选在农作物害虫褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱防治中的应用。
8.一种含权利要求3所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂。
9.一种权利要求8所述的含拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂在农作物害虫防治中的应用。
拟环纹豹蛛D家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用
技术领域
背景技术
[0002] 目前广泛用于害虫防治的杀虫基因主要是苏云金芽孢杆菌产生Bt毒素的基因，Bt毒素对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等农业害虫表现出极高的杀虫特异性。因此Bt毒素基因被转基因到棉花、玉米、烟草等广泛种植的重要作物中。携带抗虫基因的转基因作物在农业害虫防治方面起着重要的作用。然而，单一抗虫基因的长期使用使害虫对Bt毒素的抗性不断增加。多种昆虫群体在自然环境下对Bt蛋白制剂和Bt转基因作物产生了抗性，如棉铃虫、小菜蛾及二化螟等(易晓莉等，昆虫对Bt毒素抗性研究进展[J]，江苏农业科学，2014年第7期)。因此，开发另外一种高效环保的新型抗虫基因或蛋白质能够增加对抗虫基因的选择和降低抗性的发展。
[0003] 蜘蛛毒素因其化学多样性和广谱性而被作为潜在的杀虫剂受到广泛关注(G.F.King,et al.,Spider-Venom peptides:structure,pharmacology,and potential for control of insect pests,Annu.Rev.Entomol.2013,58:475-496.)。蜘蛛毒素能够作用于昆虫细胞膜的多种通道和受体，如离子通道、神经配体门控通道和G蛋白关联受体等。因此对多种昆虫都具有抗虫作用。但目前对蜘蛛毒素的研究多集中在黑寡妇蜘蛛中集中重要毒素的作用机制，对其杀虫作用的直接测试比较少。综上，现有对蜘蛛毒素的研究还不能满足抗虫基因的选择需求。因此需要一种具有杀虫效果的蜘蛛毒素，该毒素能够通过分子基因工程的方法大量表达或通过转基因技术在作物中表达，从而达到抗虫的效果。
发明内容
[0004] 发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种拟环纹豹蛛D家族杀虫基因，通过生物学手段可获得该基因编码的成熟肽，该成熟肽作为全新的杀虫基因资源，具有神经毒性，作用于昆虫离子通道，具有不同于Bt毒素的杀虫机制，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。
[0005] 本发明还公开拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的的成熟肽与应用。
[0006] 技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种拟环纹豹蛛D家族杀虫基因，所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示。
[0007] 本发明所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的杀虫蛋白，所述杀虫蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.6-10所示。
[0008] 本发明所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽，所述成熟肽氨基酸序列如SEQ ID NO.11-15所示。
[0009] 编码本发明所述的成熟肽的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16-20所示。
[0010] 含有本发明所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因的重组质粒。
[0011] 本发明所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽在农作物害虫防治中的应用。
[0012] 进一步地，所述成熟肽在农作物害虫褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱防治中的应用。
[0013] 含有本发明所述的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂。
[0014] 本发明所述的含拟环纹豹蛛D家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂在农作物害虫防治中的应用。
[0015] 本发明参考黑寡妇等蜘蛛的毒素基因，利用生物信息学分析方法，对拟环纹豹蛛转录组数据库中的基因进行筛选，获得一类相似的拟环纹豹蛛毒素的候选基因，然后利用多聚酶链式反应(PCR)及Sanger法测序，获得其中一个基因的完整序列。将该基因构建到原核表达载体pET-32a(+)中，经原核系统表达，即可获得该基因编码的成熟肽即为杀虫肽。制备周期短，氨基酸序列小，适合体外大规模生产，同时，该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源，具有不同于Bt毒素的杀虫机制，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。
[0016] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0017] 本发明采用的拟环纹豹蛛作为农业害虫天敌，长期以昆虫为食，其毒素主要作用于昆虫，对脊椎动物相对安全。本发明通过拟环纹豹蛛筛选到全新的拟环纹豹蛛D家族杀虫基因，根据该基因通过生物学手段可获得该基因编码的成熟肽即为杀虫肽，该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源，具有神经毒性，作用于昆虫离子通道，具有不同于Bt毒素的杀虫机制Bt毒素作用于昆虫围食膜，对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。
[0018] 本发明预测拟环纹豹蛛毒素的成熟肽，并成功构建表达载体，优化诱导条件，使蛋白产量最大化，同时优化纯化条件，减少蛋白损失。此外，本发明采用的体外表达体系高效且产量高，得到的杀虫肽纯度高，且具有较高活性。本发明制备的重组毒素具有较高的杀虫活性。附图说明
[0019] 图1为注射CK和重组毒素PPTX-07后，褐飞虱在不同时间点的死亡率示意图；
[0020] 图2为注射CK和重组毒素PPTX-07后，灰飞虱在不同时间点的死亡率示意图；
[0021] 图3为注射CK和重组毒素PPTX-07后，白背飞虱在不同时间点的死亡率示图。
具体实施方式
[0022] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0023] 实施例中所设计的试剂和培养基配方：
[0024] (1)LB液体培养基：
[0026] (2)LB固体培养基：
[0027] 在900ml双蒸水中加入10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl和15g琼脂，搅拌混匀，用双蒸水定容至1L，置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20min，冷却后至50℃加入终浓度为100mg/L的羧苄青霉素，倒板，冷却后置于4℃保存。
[0028] (3)转膜缓冲液：
[0029] 甘氨酸2.9g，Tris base 0.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加入双蒸水定容至1L。
[0030] (4)PBST：
[0031] PBS中加入0.05％体积的吐温-20。
[0032] (5)封闭液：
[0033] PBST中加入1％的脱脂奶粉。
[0034] (6)Tris-HCl：
[0035] 将1M的Tris-HCl稀释至20mM。
[0036] (7)结合缓冲液：
[0038] (8)洗脱缓冲液：
[0039] 20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，500mM咪唑，双蒸水定容至1L，pH7.4。
[0040] 实施例1
[0041] 毒素的制备
[0042] 蜘蛛毒素基因的设计和构建
[0043] 拟环纹豹蛛采自江苏省南京市浦口区水稻田，并在室内用褐飞虱饲养90天后，取毒腺并进行转录组测序，根据注释结果，筛选出拟环纹豹蛛毒素基因，根据其半胱氨酸的数量、排列方式、结构域预测和序列分析，获得一类拟环纹豹蛛毒素的候选基因，并选取其中的一种，即PPTX-07，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，通过SpiderP(http://www.arachnoserver.org/spiderP.html)预测其信号肽、前肽和成熟肽，将其成熟肽序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，设计出用于在大肠杆菌中表达的PPTX-07毒素基因序列如SEQ ID NO.16所示，设计完成的基因由Invitrogen公司合成，并在南京金斯瑞公司完成测序，将合成的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中，构建出含有目的基因的pET-32a(+)-PPTX-07重组质粒，该毒素基因引入BanH I和EcoR I酶切位点。
[0044] 重组质粒pET-32a(+)-PPTX-07的诱导表达
[0045] 将pET-32a(+)-PPTX-07重组质粒转化到Escherichia coli BL21菌株中，在含有羧苄青霉素的LB平板中生长16h后，挑取不同的阳性菌斑，分别加入到含有100mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，恒温摇床中250r/min，37℃，12h。将培养后的菌液按照1∶100的体积比，接种到含有100mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，200r/min，37℃，培养4h，此时菌液的OD值为0.5-0.7；在pET-32a(+)-PPTX-07重组子中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，200r/min，37℃，诱导表达培养5h；取表达后的菌液4ml，4℃，12000rpm离心5min，弃上清，在菌体沉淀中加入1.5ml 20mM的Tris-HCl，pH＝7.4，重悬后进行超声破菌，强度12％，10min，运行5s，暂停5s；破菌后4℃，18000rpm，离心10min，取上清，弃沉淀，破碎液用于重组毒素检测。
[0046] Western Blot检测
[0047] 取50μl的破碎液，加17μl的Loading Buffer和2μl的β-巯基乙醇，100℃煮沸5min，加20μl的混合液到SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并加入10μl的蛋白标样，50V，50min，然后100V直至上样缓冲液至凝胶底部；电泳结束后，将凝胶取出后进入转膜缓冲液中，并将PVDF膜浸泡于甲醇1min后转入转膜缓冲液，之后进行转膜，100mA，50min；转膜结束后，将膜取出，PBST洗3次，每次5min，封闭液封闭2h，37℃，80r/min；封闭后将膜取出，PBST洗3次，每次10min，转入加入一抗的封闭液(1∶1000)，孵育2h，37℃，80r/min；一抗孵育结束后，将膜取出，PBST洗3次，每次10min，转入加入二抗的封闭液(1∶2000)，孵育1.5h，37℃，80r/min；二抗孵育结束后，PBST洗3次，每次10min，加入发光液，避光3min，滤纸吸干表面液体后，化学发光检测。
[0048] 重组质粒pET-32a(+)-PPTX-07的大量诱导表达
[0049] 将培养后的菌液按照1∶100的体积比，接种到100ml含有100mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，培养基的体积不能超过容器体积的20％，200r/min，37℃，培养4h，此时菌液的OD值为0.5-0.7；在pET-32a(+)-PPTX-07重组子中加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，200r/min，37℃，诱导表达培养5h；取表达后的菌液，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，在菌体沉淀中加入20％培养基体积的20mM的Tris-HCl，pH＝7.4，重悬后进行超声破菌，强度12％，30min，运行5s，暂停5s；破菌后4℃，18000rpm，离心30min，取上清，弃沉淀，破碎后粗蛋白液用于分离纯化重组毒素。。
[0050] 重组毒素PPTX-07的纯化
[0051] 将大量诱导表达破菌后的粗蛋白液用0.22μm的滤膜过滤，采用AKTA avant全自动蛋白质分离纯化系统和HisTrapTM HP镍柱(5ml)进行纯化。先用5个柱体积的结合缓冲液平衡镍柱，流速5ml/min，上样流速1ml/min，上样后用6个柱体积的结合缓冲液清洗柱子，流速1ml/min，最后用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速5ml/min。纯化后的蛋白产量约为9.85mg/L，纯化后的蛋白为成熟肽即重组毒素PPTX-07，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0052] 实施例2
[0053] 采用实施例1中蜘蛛毒素基因的设计和构建方法，制备出拟环纹豹蛛的杀虫基因SEQ ID NO.2-4：PPTX-13、PPTX-28、PPTX-38、PPTX-39；并通过相同的方法构建出对应的重组质粒的并分别大量诱导表达，经过纯化后得到不同基因编码的重组毒素。
[0054] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-07的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，如下：
[0055]atgatgtctttgaaaatgcaagcgatgttgttggttgtaggcttgattacattcatagcagttcacgctgaagaagatataagtgaaaccgtagaatcagaacgatcgtgcgctaaggaataccaaagatgtgattggaacaacaaaccctgttgcgataatatttcttgcgtgtgtagcttgataggaaccaactgtgaatgtaagaaaggtatcatacgtactataaaagactggttcagtggaaaa
[0056] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-13的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，如下：
[0057]atgatgagagcctcaactgtattcggattatgtgcaattgctgttttgctgcttacgatcccagacgtttctggtgaagatgagatcaattctcaaaatgctccagaagaacgtggatactgtgctgagaacggcattcgatgtgacgatattcactgctgcactggtctaaaatgcaaatgcaacgccagcggttacaactgtgtttgcaggaagaag
[0058] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-28的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，如下：
[0059]atgggccgttggatttttgccattttccttggaattactcttttgactcaagtgcttcttccatcagcatatatggccacttcagacgcagatacgcctgccgtggatgactatgcagatgtcgctcgcttgttatactttgctcggaagagaagttgtattaagcgtggatcgagctgcgatcatcggccaaatgactgctgtgacaactcttcctgtcgatgcaatttgtggggaactaattgccgctgccaacgaatgggcctcttccagaagtggggcaaa
[0060] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-38的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，如下：
[0061]atgaaatacttgctgttagcgacagttgttgtattcctgtttgtgcaagctctggcggcagtgccatacccaccacctcttgatcgtaacctctcagatgactacaatgaaaatgtggacatgtacatgaaagcggacaagcgtgcttgcattcgcaggggaggtggatgtgacggaaaacccaatgactgctgccccaactcatcatgcaggtgcaacctctggggaaccaattgcagatgcgaacgtgcaggtctcttccagcaatggggcaaa
[0062] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-39的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，如下：
[0063]atgaaatactttctaaaacctttggttgtgacggtcctcctattcttatgctatgctgtcatgactaatgcttacgtaatgcgtgacagttctctggacagctaccaggaaccgaactatgaagctctccgccagtacctcctgtcgacacggaaaaggagctgcattcgacgaggtagcagctgcgatcaccgaccaagtgactgctgtttcaactcatcctgcagatgcaacttgtggggaaccaactgcagatgccagagggctggtctctttcagaaatggggaaag
[0064] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-07的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，如下：
[0065] MMSLKMQAMLLVVGLITFIAVHAEEDISETVESERSCAKEYQRCDWNNKPCCDNISCVCSLIGTNCECKKGIIRTIKDWFSGK
[0066] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-13的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，如下：
[0067] MMRASTVFGLCAIAVLLLTIPDVSGEDEINSQNAPEERGYCAENGIRCDDIHCCTGLKCKCNASGYNCVCRKK
[0068] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-28的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，如下：
[0069] MGRWIFAIFLGITLLTQVLLPSAYMATSDADTPAVDDYADVARLLYFARKRSCIKRGSSCDHRPNDCCDNSSCRCNLWGTNCRCQRMGLFQKWGK
[0070] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-38的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，如下：
[0071] MKYLLLATVVVFLFVQALAAVPYPPPLDRNLSDDYNENVDMYMKADKRACIRRGGGCDGKPNDCCPNSSCRCNLWGTNCRCERAGLFQQWGK
[0072] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-39的氨基酸序列为SEQ ID NO.10，如下：
[0073] MKYFLKPLVVTVLLFLCYAVMTNAYVMRDSSLDSYQEPNYEALRQYLLSTRKRSCIRRGSSCDHRPSDCCFNSSCRCNLWGTNCRCQRAGLFQKWGK
[0074] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-07的成熟肽序列为SEQ ID NO.11，如下：
[0075] ERSCAKEYQRCDWNNKPCCDNISCVCSLIGTNCECKKGIIRTIKDWFSGK
[0076] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-13的成熟肽序列为SEQ ID NO.12，如下：
[0077] RGYCAENGIRCDDIHCCTGLKCKCNASGYNCVCRKK
[0078] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-28的成熟肽序列为SEQ ID NO.13，如下：
[0079] KRSCIKRGSSCDHRPNDCCDNSSCRCNLWGTNCRCQRMGLFQKWGK
[0080] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-38的成熟肽序列为SEQ ID NO.14，如下：
[0081] KRACIRRGGGCDGKPNDCCPNSSCRCNLWGTNCRCERAGLFQQWGK
[0082] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-39的成熟肽序列为SEQ ID NO.15，如下：
[0083] KRSCIRRGSSCDHRPSDCCFNSSCRCNLWGTNCRCQRAGLFQKWGK
[0084] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-07的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.16，如下：
[0085]gaacgatcgtgcgctaaggaataccaaagatgtgattggaacaacaaaccctgttgcgataatatttcttgcgtgtgtagcttgataggaaccaactgtgaatgtaagaaaggtatcatacgtactataaaagactggttcagtggaaaa[0086] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-13的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.17，如下：
[0087]cgtggatactgtgctgagaacggcattcgatgtgacgatattcactgctgcactggtctaaaatgcaaatgcaacgccagcggttacaactgtgtttgcaggaagaag
[0088] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-28的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.18，如下：
[0089]aagagaagttgtattaagcgtggatcgagctgcgatcatcggccaaatgactgctgtgacaactcttcctgtcgatgcaatttgtggggaactaattgccgctgccaacgaatgggcctcttccagaagtggggcaaa
[0090] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-38的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.19，如下：
[0091]aagcgtgcttgcattcgcaggggaggtggatgtgacggaaaacccaatgactgctgccccaactcatcatgcaggtgcaacctctggggaaccaattgcagatgcgaacgtgcaggtctcttccagcaatggggcaaa
[0092] 拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-39的成熟肽的基因序列为SEQ ID NO.20，如下：
[0093]aaaaggagctgcattcgacgaggtagcagctgcgatcaccgaccaagtgactgctgtttcaactcatcctgcagatgcaacttgtggggaaccaactgcagatgccagagggctggtctctttcagaaatggggaaag
[0094] 试验例1
[0095] 生测的过程和方法
[0096] 采用显微注射法测定了重组毒素PPTX-07对3种稻飞虱的杀虫活性，试虫选取5龄若虫，每个处理3个重复，每个重复选取30头试虫，注射前，先把试虫用CO2麻醉，每头试虫注射重组毒素20nl，注射部位为第一和第二胸板节间膜，注射结束后，将试虫放置在装有水稻苗的一次性口杯中，水稻苗用2％的琼脂固定，整个实验过程要轻柔，减少对试虫的伤害。实验共分为对照组和实验组，对照组注射等量的PBS，pH＝7.4，实验组注射重组毒素PPTX-07。图1、2和3分别为注射重组毒素PPTX-07后，3种稻飞虱在不同时间点的死亡情况，可以看出重组的毒素PPTX-07对3种稻飞虱都有优良的杀虫活性良的杀虫活性，证明本发明得到的拟环纹豹蛛的杀虫基因PPTX-07的成熟肽为有效的杀虫肽，可以用于制备杀虫剂在应用在农作物害虫如褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱的等防治，本发明其他重组毒素PPTX-13、PPTX-28、PPTX-38、PPTX-39与重组毒素PPTX-07功能类似。
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