一种将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于微生物检
测的用途及其检测方法
技术领域
[0001] 本
发明属于医学生物检测技术领域，尤其涉及将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于微生物检测的用途及方法。
背景技术
[0002] 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以
肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种
疾病死亡原因之首，建国后人民生活
水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因
艾滋病、吸毒、免疫
抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。对人类致病的有人型结核杆菌和
牛型结核杆菌，非典型分枝杆菌也可引起类似结核样病变，但少见。
[0003] 结核杆菌细长略弯曲，端极钝园，大小约1～4×0.4um，呈单个或分枝状排列，有荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。结核杆菌一般常用齐-尼式钠氏(Ziehl-Neelsen)抗酸性
染色法染色，结核杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。结核杆菌的抗酸性取决于胞壁内所含分枝菌酸残基和胞壁固有层的完整性有关。结核杆菌的检测方法不多，传统的直接检测法有平板涂片，革兰阴性、
荧光染色法、抗酸染色法、
显微镜观察等等，间接的有PCR检测法，荧光免疫法等等，操作步骤繁多，检测复杂，时间长，成本高等等。
[0004] 因此，临床诊断主要根据结核菌感染的类型，采取病灶部位的适当标本。如肺炎结核有采取咯痰(最好取早晨第一次咯痰，挑取带血或脓痰)；肾或膀胱结核以无菌
导尿或取中段尿液；肠结核采取
粪便标本，结核性脑膜炎进行腰脊穿刺采取
脑脊液；脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓汁。
[0005] (一)直接涂片染色
[0006] 咯痰可直接涂片。用萋～纳氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，但通常应报告：“查到抗酸性杆菌”，因标本中可能混杂有非致病性抗性抗酸杆菌，单凭形态染色不能确定是结核杆菌，需进一步分离培养鉴定。如标本中结核杆菌量少，杂菌和杂质多时，直接涂片不易检出(一般需要每毫升痰液含有结核杆菌10万个以上才能检出)，应浓缩集菌后，再涂片染色镜检，以提高检出阳性率。
[0007] 无菌直接采取的脑脊液、导尿或中段尿可直接用离心沉淀集菌。咯痰和粪便标本浓缩集菌因含杂功菌多，需用4％NaOH或3％HCL或6％H2SO4处理，然后，用离心沉淀法将结核杆菌浓缩聚集于管底，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查、分离培养或动物试验。
[0008] (二)分离培养
[0009] 结核杆菌生长缓慢，培养期长，当以酸
碱中和浓缩集菌的沉淀物，接种于固体培养基上，以蜡封口防止干燥。37℃培养4～6周后检查结果。根据生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色象菜花状，菌体染色抗酸性强，多数为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型，则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作
鉴别试验。
[0010] (三)动物试验
[0011] 常用豚鼠或地鼠鉴别凝似结核杆菌的分离培养物和毒
力测定。取经浓缩集菌处理的标本1.0毫升注射于豚鼠腹股沟皮下，经3～4周饲养观察，如出现局部淋巴结肿大，消瘦或结核菌素试验阳性，可及时剖检：若观察6～8周后，仍未见发病者，也要剖检。剖检时应注意观察淋巴结、肝、脾、肺等脏器有无结核病变。
[0012] 活细胞含NAD(P)H因此常用四氮唑盐检测，但是传统的MTT，CCK8,WST8,MTS方法对细胞有毒性只能检测几小时。对于CCK8和WST8有多篇文章报道，用
肿瘤细胞对CCK8检测，发现共育12小时后，细胞基本失活。
发明内容
[0013] 本发明研究了一种利用EZMTT
试剂建立了一种敏感快速简单的检测慢生长细菌(如结核杆菌)的诊断方法。NAD(P)+/NAD(P)H是一类重要的辅酶因子，存在于所有细菌中，其作为反应介质参与多种生命过程，包括
能量代谢，线粒体功能，
钙稳态，
氧化应激，基因调节，免疫功能，老化和细胞死亡等。NAD(P)+/NAD(P)H常用四氮唑盐检测，但是传统的MTT，CCK8,WST8,MTS方法对细胞有毒性，只能检测几小时，而且造成细胞死亡。因此，一种基于细胞水平、灵敏无毒、可长期孵育的检测方法来进行微生物测定，在科研、环境保持、医疗诊断等应用中具有关键的作用。
[0014] 单磺酸四氮唑盐作为一种新型的单磺酸四氮唑化合物，实验原理：在
电子耦合试剂1-methoxy PMS存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度
水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，通过酶标仪测定450nm
波长OD值。活细胞数量越多，则吸光度越高。
[0015] 单磺酸四氮唑盐相应的甲臜产物高度水溶、操作方便，对微生物无毒性、灵敏度高、具有抗氧化性药物筛选不产生
假阳性，因此在临床细菌快速检测，未知细菌增殖测定、细菌耐药性测定等应用上具有广阔的前景。
[0016] 利用新型单磺酸四氮唑盐试剂无毒、可与微生物共孵育、有
颜色变化的特点实时监测细菌，提供了一种快速细菌性质的检测方法。检测试剂选用EZMTT单磺酸四氮唑盐检测体系，在活细菌数量上呈现良好的线性剂量关系；测试剂通过单磺酸四氮唑盐反应物在450nm的吸光度值，得到EC50曲线，进行细菌活力评价。
[0017] 本发明的检测方法是一种基于细菌的高度灵敏的检测方法。本发明方法中提供的单磺酸四氮唑盐和吩嗪甲基
硫酸盐(PMS)衍生物的混合物配方对微生物无毒性，可与活结核杆菌共同孵育几周，不影响微生物活性，操作简单，检测快速，单磺酸四氮唑盐试剂温和且检测后的细胞可经漂洗进一步用于后续实验；单磺酸四氮唑盐试剂不易与还原性物质反应，干扰小；该试剂适用范围广，包括环境微生物富集后的检测，临床微生物的各类检测。
[0018] 包括如下内容：一种将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于微生物检测的用途，将单磺酸四氮唑盐和吩嗪甲基
硫酸盐(PMS)衍生物的混合物配方用于慢生长微生物长期孵育、
跟踪生长、生长倍增时间检测、细胞耐药性、细菌富集指示剂的用途。
[0019] 一种单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物检测微生物的方法，所述的剂型配方含单磺酸四氮唑盐的浓度为0.1～10mM，吩嗪甲基硫酸盐(PMS)衍生物的浓度为1～250μM，该剂型无毒性且不影响微生物生长，可与细菌长期共同培养1小时～30天，作为活细菌的指示剂；
[0020] 所述的单磺酸四氮唑盐化学式为：
[0021]
[0022] ；所述的吩嗪甲基硫酸盐(PMS)衍生物包括：
[0023]
[0024] R＝1-18个
碳原子的直链、支链、环状取代基，可包括其他N、O、S、P、Si5和卤素等原子。例如Methyl-PMS,ethyl-PMS，hexyl-PMS,Cyclohexyl-PMS,C18-PMS等等，[0025] 优选地，所述的将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于微生物检测的用途，所述的微生物包括：致病结核杆菌，白喉杆菌、麻
风杆菌、产水菌
门Aquificae，热袍菌门Therm，热
脱硫杆菌门Thermodesulfobacteria，异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Tmus，产金菌门Chrysiogenetes，绿弯菌门Chloroflexi，热微菌门Thermomicrobia，硝化螺旋菌门Nitrospirae，脱
铁杆菌门Deferribacteres，蓝藻门Cyanobacteria，绿菌门Chlorobi，
变形菌门Proteobacteria，厚壁菌门Firmicutes，放线菌门Actinobacteria，浮霉菌门Planctomycetes)，衣原体门Chlamydiae，螺旋体门Spirochaetes，
纤维杆菌门Fibrobacteres，酸杆菌门Acidobacteria，拟杆菌门Bacteroidetes，黄杆菌门Flteria，鞘脂杆菌门Sphingobacteria，梭杆菌门Fusobacria，疣微菌门Verrucomicrob，网团菌门Dictyoglomi，芽单胞菌门Gemm，金黄色葡萄球菌(金葡革兰阳性需氧球菌菌)、表皮葡萄球菌、α型溶血链球菌、β型溶血链球菌、非溶血链球菌、肺炎球菌、肠球菌，革兰氏阴性需氧球菌如脑膜炎球菌、淋球菌、摩拉卡他菌、革兰氏阴性需氧杆菌如不动杆菌属(无硝不动杆菌、洛菲氏不动杆菌)、假单胞菌属(绿脓杆菌和其他假单胞菌)、粪产碱杆菌、布鲁菌属、百日咳杆菌、军团菌属；革兰阴性兼性厌氧菌如肠杆菌科细菌(大肠杆菌、枸橼酸杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普鲁菲登菌属、摩根菌属)、鼠疫杆菌以及流感杆菌；弧菌科如霍乱弧菌、ElTor弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌；革兰阳性厌氧球菌如消化球菌、消化链球菌；革兰阴性厌氧球菌如费氏球菌，革兰阴性厌氧杆菌如脆弱类杆菌、梭形杆菌；形成芽胞的细菌如炭疽杆菌、蜡样杆菌、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、肉毒杆菌、难辨梭菌；不形成芽胞的革兰阴性杆菌如单核细胞增多性李斯特菌、红斑丹毒丝菌。
[0026] 优选地，所述的将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物检测微生物的方法，包括如下步骤：
[0027] 步骤一、将细菌接种于盛有加入单磺酸四氮唑盐检测试剂的各类细胞培养基的透明板，接种细胞1至105个每ml；
[0028] 步骤二、放入
培养箱孕育1小时以上，隔1小时-几周，测定450nm的吸光度，得到标准曲线，观察颜色变化和剂量响应。
[0029] 优选地，所述的将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物检测微生物的方法，将该单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于检测结核杆菌的倍增时间，包括如下步骤：
[0030] 步骤一、将待测细菌接种于盛有加入单磺酸四氮唑盐检测试剂的培养剂的透明板，接种细菌，2倍稀释，放入培养箱培育1小时；
[0031] 步骤二、每6～24小时连续几周检测450nm的吸光度，观察
信号倍增需要的时间就是结核杆菌的倍增时间。
[0032] 优选地，所述的将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物检测微生物的方法，将该单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于检测结核杆菌的耐药性检测，包括如下步骤：
[0033] 步骤一、将待测细菌接种于盛有加入药物如抗菌素、含培养基单磺酸四氮唑盐检测试剂的特定细菌培养基的透明板，接种细菌放入培养箱培育1小时；
[0034] 步骤二、每6～24小时连续性几周检测450nm的吸光度，观察信号变化判断细胞生长抑制或细胞死亡。
[0035] 优选地，所述的将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物检测微生物的方法，将该单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物用于检测结核杆菌的快速检测，包括如下步骤：
[0036] 步骤一、将生物标本痰液0.1～10ml，酶解处理后，用灭菌水稀释1～5倍，离心富集结核杆菌；
[0037] 步骤二、富集的结核杆菌加入高活性培养基，抗菌素和单磺酸四氮唑盐检测试剂，孕育1小时～15天，每6小时连续性几周检测450nm的吸光度，同时观察信号倍增需要的时间；
[0038] 步骤三、利用标准曲线定量结核杆菌数量,并通过信号倍增时间，区别结核杆菌和其它细菌。
[0039] 优选地，所述的将单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物检测微生物的方法，将该单磺酸四氮唑盐与PMS衍生物的混合物对结核杆菌进行诊断，富集和抑制剂的筛选。
[0040] 具体地，基于EZMTT的对慢生长微生物检测方法，根据不同的微生物使用相应培养基。以下是不同研究的实验方法：
[0041] 1.结核杆菌于液体培养基中，37℃静置培养饱和后，接种于盛有加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培养基的96孔板(2倍稀释)，37℃培育，每天测定450nm的吸光度，进行t1/2倍增时间检测。
[0042] 结核杆菌培养基：包括但不限于罗氏培养基，小川辰次鸡蛋培养基，苏通培养基，Middle brook 7H9(7H10,7H11)培养基，Bactec 460TM TB培养基等等。
[0043] 2.采集不同环境中样品5～1000ml，高速离心富集，加入含培养剂的单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时以上，测定450nm的吸光度，和时间效应，进行活细菌检测鉴定评价。
[0044] 3.采集痰液，酶解，加入含培养剂、各类抗菌素的单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育，测定450nm的吸光度，进行细菌活力检测的剂量效应和时间效应评价。快速检测微生物和微生物的耐药性。
[0045] 4.大肠杆菌培养于细菌液体培养基中，37℃、220～250rpm摇床培养，接种于盛有培养基的96孔板(2倍稀释)，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，每1小时连续测定450nm的吸光度，进行t1/2倍增时间检测。
[0046] 细菌液体培养基可用LB培养基为(1.0％胰蛋白胨、0.5％
酵母提取物、1.0％NaCl，pH 7.4)
[0047] 5.链霉菌于
发酵培养基中，28℃、220～250rpm摇床培养，接种于盛有培养基的96孔板，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，每1小时连续测定450nm的吸光度，进行t1/2倍增时间检测。
[0048] 链霉菌培养基：3.0％可溶性
淀粉，1.0％
蔗糖，0.5％
葡萄糖、0.8％麦芽糖、1.2％黄豆饼粉、0.4％蛋白胨、1.2％鱼粉、0.6％酵母粉、0.2％(NH4)2S04、0.35％MgSO4，0.02％KH2P04、0.4％CaC03、0.075％NaN03，pH 7.0
[0049] 实验原理
[0050] 在电子耦合试剂吩嗪甲基硫酸盐(PMS)衍生物存在的情况下，单磺酸四氮唑盐检测试剂可以被NAD(P)H体系或细胞线粒体中脱氢酶还原，生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，在450nm处有紫外吸收。
[0051] 本发明的检测方法是一种基于细胞的高度灵敏的检测方法。本发明方法中用到了单磺酸四氮唑盐和吩嗪甲基硫酸盐(PMS)衍生物的配方，对细菌生长无毒性，适用于与慢生长细菌的长达几周的共同孵育，用于检测细菌的活力，生长周期和耐药性检测。
[0052] 目前，本发明方法(即单磺酸四氮唑盐检测试剂测定法)的重现性是利用z因子来进行评估，无毒结核杆菌(每孔20000个细胞)作为阳性对照值和不含细胞的培养基作为阴性对照值。如在下图所示，阴性对照组表明背景峰为0.127±0.014Abs，而阳性对照组数值为1.021±0.104Abs，因此，单磺酸四氮唑盐检测试剂的z因子值为0.7；表明本发明测定法重复性更好；具体效果见图3。
附图说明
[0053] 为了更清楚地说明本发明
实施例或
现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0054] 图1是实施例1中针对结核杆菌优化EZMTT检测
试剂盒，信号增值变化的效应图[0055] 图2-1、2-2、2-3、2-4是实施例2中用比较无毒型EZMTT，CCK8,MTS检测试剂以及传统OD60细菌浓度检测法检测结核杆菌信号增值变化的效应图；
[0056] 其中结核菌稀释倍数依次为21-211；
[0057] EZMTT，细胞成长信号随时间增加而增加，极低浓度的细胞也可以被检测到；
[0058] cck8，细胞成长信号随时间增加很少，略低浓度的细胞就不能被检测到；
[0059] MTS，在同样条件下与细胞共育10天，无信号变化；
[0060] OD600也得不到好结果。
[0061] 图3是实施例3中结核杆菌检测信号增值的时间效应图。
[0062] 图4是实施例4，利用z因子评估单磺酸四氮唑盐检测试剂检测结核杆菌活力的重现性效果示意图。
[0063] 图5是实施例5中结核杆菌用荧光法和EZMTT法的比较，临床细菌可结合其特征倍增时间进行快速诊断。
[0064] 图6是实施例6中不同化合物通过生长抑制或细胞毒性进行细胞活力评价效果示意图。
[0065] 图7是实施例7中大肠杆菌细胞数量线性剂量反应检测图。
[0066] 图8是实施例8中大肠杆菌检测信号增值的时间效应图；由于颜色的
分辨率较低，在此进行描述，7条线中由下至上依次对应0-6h。
[0067] 图9是实施例9中大肠杆菌耐药性实验图。
[0068] 图10是实施例10中链霉菌细胞数量线性剂量反应检测图。
具体实施方式
[0069] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
[0070] 实施例1
[0071] 结核杆菌EZMTT检测试剂的优化，包括以下步骤
[0072] 结核杆菌接种于液体培养基(Middle brook 7H9)，直接种于盛有的培养基的96孔板，混合不同的单磺酸四氮唑和PMS衍生物，单磺酸四氮唑的取1mM,和PMS衍生物取100μM，并用
封口膜封口培养5天后。按照试剂方法，在450nm和600nm测定吸光度，进行细胞生长信号的检测。
[0073] 实施例2
[0074] 结核杆菌细胞活力检测的方法学比较，包括以下步骤
[0075] 结核杆菌(1000每孔)接种于液体培养基(Middle brook 7H9)，直接种于盛有的培养基的96孔板，加不同的四氮唑检测试剂，：CCK8，MTS，EZMTT，并用封口膜封口培养15天后。按照试剂方法，在相应试剂的最佳波长测定吸光度，进行细胞生长信号的检测。MTS不能检测悬浮细胞，CCK8不能跟踪信号变化小，MTS不能跟踪信号变化小，优化的EZMTT有很强信号，而且信号一直生长。
[0076] 实施例3
[0077] 结核杆菌细胞倍增时间的检测，包括以下步骤
[0078] 结核杆菌接种于液体培养基(Middle brook 7H9)，37℃培养72小时，由于细胞团聚无法用OD600检测，因此打散后，直接种于盛有加入单磺酸四氮唑盐检测试剂的培养基的96孔板，依次两倍稀释，并用封口膜封口。每天测定450nm的吸光度，进行细胞生长时间效应的检测。图2系列中显示在无氧条件下，结核杆菌的倍增时间是约24小时。
[0079] 实施例4
[0080] 结核杆菌(1000000个细胞)接种或不接种于盛有7H9液体培养基的96孔板。然后再加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育5天，测定450nm的吸光度。图3显示EZMTT法可靠性好(z factor＝7)。
[0081] 实施例5
[0082] 含结核杆菌的生物样品(100ul)接种与(Middle brook 7H9)液体培养基(带无氧荧光指示剂和EZMTT检测剂的液体7ml)，放入培养箱，检测无氧荧光指示剂显示和EZMTT变色，封闭培育，每天测定450nm的吸光度，进行细胞生长时间效应的检测。图5显示EZMTT可联合使用，EZMTT变色时间比无氧荧光指示剂报阳时间提前2天。因此可用于结核杆菌的快速诊断。
[0083] 实施例6
[0084] 含结核杆菌的生物样品(100ul)接种与(Middle brook 7H9)液体培养基(液体7ml)，不加或加化合物(0-20uM))放入培养箱孵育4天，加EZMTT每天测定450nm的吸光度，进行细胞生长时间效应的检测。图6显示EZMTT变色显示耐药菌株，倍增时间显示结核杆菌的长生长周期，是非常好的快速诊断方法。
[0085] 实施例7
[0086] 大肠杆菌细胞活力检测方法，包括以下步骤
[0087] 大肠杆菌接种于LB固体培养基，37℃恒温恒湿箱培养过夜；1:10～1:20比例扩培于LB液体培养基，37℃，220rpm，摇床中培养16～22小时；到时间后，测得OD600为3～5，接种于盛有培养基的96孔板，依次两倍稀释。再加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，测定450nm的吸光度；另一组稀释细胞不加单磺酸四氮唑盐，直接用OD600跟踪，进行细胞活力评价方法的比较。图7，显示EZMTT法和OD600法有比较好的相关性。
[0088] 实施例8
[0089] 实施例8的所有样品，每小时测定450nm的吸光度进行细胞生长时间效应的检测。图8，显示EZMTT法有更好的线性和更小的误差值，精确表明E.co l i倍增时间为0.5小时。
[0090] 实施例9
[0091] 过液培养的大肠杆菌(耐药&不耐药的1000-2000个细胞)接种于盛有LB液体培养基的96孔板。再加入抗菌素(Kan；0-50ug/ml)，然后再加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，测定450nm的吸光度。图9显示EZMTT法可以灵敏快速方便的检测微生物的耐药性。
[0092] 实施例10
[0093] 链霉菌细胞活力检测方法，包括以下步骤
[0094] 链霉菌接种于链霉菌培养基，28℃，250rpm，摇床中培养18～22小时；到时间后，测得OD600为3～5，接种于盛有培养基的96孔板，依次两倍稀释。再加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育0～1小时，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价图10。
[0095] 此外，需要说明的是，本
说明书中所描述的具体实施例，其产品试剂所取名称等可以不同。凡依本发明
专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的
修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本
权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
