関連出願の相互参照 本出願は、2017年2月14日に出願された米国仮特許出願第62/458,805号および2017年8月29日に出願された米国特許出願第15/690,178号の利益および優先権を主張するものであり、それらの全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、後の時点でその領域を識別し視覚化するために、生体組織の領域、例えば胃腸管の領域をマーキングするための組織染色組成物に関する。

特定の医療処置では、その後、例えば、数週間、数ヶ月、または数年後に、内視鏡的処置、腹腔鏡的処置、または開放的な外科的処置を介して後で識別することができるように組織の領域(例えば、癌性または前癌性の病変)をマークする必要がある。そのようなマーキングは、その後の処置によって外科的に切除されるべき組織を識別することができ、または医師もしくは他の医療提供者が問題の組織を除去または治療するための医学的介入(例えば外科手術もしくは薬物治療)を正当化し得る細胞学的または形態学的変化が経時的に起こったかどうかを評価することを可能にする。

このタイプのマーキングおよび監視は、胃腸病学の分野において日常的なものである。例えば、胃腸管の内視鏡検査中に、医師または他の開業医は、その後の監視および/または外科的介入のために異常なエリアまたは潜在的な病変をマークすることを望むことがある。マーキング処置では、染色組成物を胃腸管の内腔粘膜表面を通じて粘膜下組織に注入する。しかしながら、既存の染色(例えば、メチレンブルー、インジゴカルミン、インドシアニングリーンベースの染色)は、染色が、侵入点で組織から漏出または拡散することがあり、このためマークされているエリアを視覚的に不明瞭にするので、目的の組織への注入時であっても内視鏡的に視覚化するのが困難な場合がある。さらに、注入後でさえも、マークは、経時的に消えていくか、または見えなくなり得るので、数ヶ月から数年後にマークされた領域を識別することが困難になる場合がある。言い換えれば、そのような染色は、目的の組織の正確な長期追跡に対応するための組織の永続的なマーキングを促進しない場合がある。結果として、医師または他の開業医にとって、異常な組織、前癌性、または癌性病変を経時的に自信をもって監視することは困難であるかまたは不可能でさえあり得る。例えば、膀胱、尿路、乳房、リンパ節、中枢神経系および末梢神経系、ならびに肺において、目的の他の組織を監視するための同様の必要性がある。

さらに、特定の組織染色では、粒子状の場合、染色剤は、経時的に溶液から沈降し得ることが観察されている。結果として、使用のための説明書は、典型的には、適切なマーキングを確実にするために染色剤が使用前に再懸濁または再分配されるように、組織染色を振盪またはボルテックスすることを要求する。しかしながら、この工程は、注入前に、仮にそうであるとしても十分に実行され得ず、その結果として、異なるマーキング処置の間、または同じ処置の間に異なるエリアがマーキングされる場合、異なる量の染色剤が送達され得、これは、耐久性のあるマークを作るために不十分な染色剤が導入されている場合、一致しないマークが生じる。

さらに、特定の染色(例えば、墨)は、シェラック、フェノール、アンモニア、および動物性製品などの不純物を含有することが多い。これらの不純物は、炎症反応などの合併症と関連している可能性があり、またはさらには発ガン性物質である場合もある。

組織マーキング剤、例えば内視鏡的組織マーキング剤における進歩にもかかわらず、今日まで、依然として改善されたマーキング信頼性、耐久性、および安全性を有する薬剤に対する必要性が存在する。

直接観察によるか、または内視鏡、腹腔鏡、または他の同様の装置を使用した検査のいずれかにより、使用が容易で信頼性があり、組織への注入中に容易に観察可能であり、かつ経時的に視覚化することができる耐久性があり信頼性のあるマークを提供する、生体適合性炭素粒子ベースの組織染色組成物を製造することが可能であることが発見された。これは、染色剤として炭素粒子を使用する場合、炭素粒子は、染色剤の暗さを向上させるために、直径0.3μm未満(例えば、直径0.2μm未満、または本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つ)の平均粒径を有するべきであるという発見によって促進された。粒子の凝集を減少させるのに十分な量で存在する、薬剤、例えば界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤の存在に応じて、粒子は、ほとんどまたは全く沈殿(沈降)せずに長期間懸濁状態のままであり得る。しかしながら、組成物は、沈降防止剤および/または粘膜付着剤も含み得る。ある状況下では、単一の薬剤が沈降防止剤および粘膜付着剤の両方として作用することができる。本明細書に記載の組織染色組成物は、改善された貯蔵特性を有し、これは、貯蔵時に炭素粒子が溶液から沈降する可能性が低く、マーキング処置を通じて同じ均一な光学濃度を提供し、他の市販の炭素粒子ベースの組織染色よりも暗く、したがって目的の組織の領域への注入時に視覚化するのがより容易であり、かつ経時的により容易に視覚化することができる領域に耐久性のあるマークを提供するためである。さらに、組織染色組成物は、組織染色の配合物が熱安定性であるので、例えばオートクレーブ処理によって熱的に滅菌することができる。

一態様では、本発明は、直径0.3μm未満(例えば、直径0.2μm未満、例えば本明細書に開示されている粒子サイズ範囲のうちの1つ)の平均粒径を有する、約0.025%〜約2.0%(w/v)の濃度の炭素粒子;任意の沈降防止剤(ASA)、例えば、約0.025%〜5.0%(w/v)未満(例えば、約0.05%〜約5.0%(w/v)未満、約0.05%〜約1.0%(w/v)、約0.1%〜約1.0%(w/v)、または約0.1〜約0.5%(w/v)の濃度でヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、およびグアーガムからなる群から選択されるASA;ならびに任意の粘膜付着剤を含む液体組織染色組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、直径0.3μm未満(例えば、直径0.2μm未満、例えば本明細書に開示されている粒子サイズ範囲のうちの1つ)の平均粒径を有する約0.025%〜約2.0%(w/v)の濃度の炭素粒子;沈降防止剤(ASA)、例えば、約0.025%〜5.0%(w/v)未満(例えば、約0.05%〜約5.0%(w/v)未満、約0.05%〜約1.0%(w/v)、約0.1%〜約1.0%(w/v)、または約0.1〜約0.5%(w/v)の濃度でヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、およびグアーガムからなる群から選択されるASA;ならびに任意の粘膜付着剤を含む液体組織染色組成物を提供する。

特定の実施形態では、および前述の態様のそれぞれに関して、炭素粒子は、0.2μm未満、例えば、約0.05μm〜0.2μm未満、または本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つの平均粒径を有する。さらに、特定の実施形態では、組成物は、5,000×gで60分間遠心分離したときに、50%未満の炭素粒子が溶液から沈降することを特徴とすることができる。

炭素粒子は、カーボンブラック、活性炭素、不活性炭素、またはそれらの組み合わせから誘導することができる。炭素粒子は、好ましくは、炭素粒子の総量に基づいて、0.5ppm以下のレベルの多環式芳香族炭化水素を有する。好ましくは、炭素粒子は、脱発熱物質化されるか、さもなければ発熱物質を含まない。これは、例えば、炭素粉末を220℃で1時間加熱して発熱物質を含まない乾燥炭素を製造することによって達成することができる。

特定の実施形態では、ASAは、粘膜付着剤でもある(または粘膜付着性を有する)。粘膜付着性を有する例示的なASAとしては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、およびグアーガムが挙げられる。

別の実施形態では、組成物は、増粘剤をさらに含む。増粘剤は、約5%〜約25%(w/v)の濃度で存在することができる。例示的な増粘剤は、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、セルロース、およびそれらの組み合わせを含む。

別の実施形態では、組成物は、消泡剤をさらに含む。特定の実施形態では、消泡剤は、約0.005%〜約1.0%(w/v)の濃度で存在することができる。消泡剤の例としては、例えば、ジメチコンおよびシメチコンならびにそれらの組み合わせが挙げられる。

別の実施形態では、組成物は、界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤をさらに含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、約0.01%〜約2.0%(w/v)の濃度で存在することができる。例示的な界面活性剤としては、例えば、脂肪酸でエステル化された薬学的に許容されるポリオキシエチレンソルビタン、例えば、Tween(登録商標)80などのTween(登録商標)が挙げられる。

別の実施形態では、組成物は、防腐剤、例えばベンジルアルコール、メチル、またはエチルパラベン、および塩化ベンザルコニウムをさらに含む。特定の実施形態では、防腐剤は、約0.01%〜約4.0%(w/v)の濃度で存在することができる。

特定の実施形態では、例えば、胃腸用途に使用するための組成物は、約32N以下(例えば、約22〜32N、または約22N以下、または約10N以下)の力を加えると、長さ約240cmの25ゲージ針を通過して、組成物を針を通じて押すことができる。他の特定の実施形態では、例えば、乳癌組織マーキングに使用するための組成物は、約32N以下(例えば、約22〜32N、または約22N以下、または約10N以下)の力を加えると、長さ約5cmの14ゲージ針を通過して、組成物を針を通じて押すことができる。

別の実施形態では、組成物は、約0.025%〜約2.0%(w/v)の炭素粒子、または約0.05%〜約2.0%(w/v)の炭素粒子、または約0.1%〜約2.0%(%)の炭素粒子;任意に、また存在する場合は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、およびグアーガムからなる群から選択される0.025%〜5.0%(w/v)未満のASA;任意に、また存在する場合は、約5.0%〜約25%(w/v)の増粘剤;約0.005%〜約1.0%(w/v)の消泡剤;ならびに約0.1%〜約2.0%(w/v)の界面活性剤を含む。別の実施形態では、組成物は、約0.025%〜約1.0%(w/v)の炭素粒子、または約0.05%〜約2.0%(w/v)の炭素粒子、または約0.1%〜約1.0%(%)の炭素粒子;任意に、また存在する場合は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、およびグアーガムからなる群から選択される0.025%〜1.0%(w/v)未満のASA;任意に、また存在する場合は、約12%〜約18%(w/v)の増粘剤;約0.05%〜約0.25%(w/v)の消泡剤;ならびに約0.7%〜約1.5%(w/v)の界面活性剤を含む。前述の組成物のそれぞれは、防腐剤、例えばベンジルアルコールをさらに含み得る。

得られる染色組成物が無菌になるように無菌剤を互いに組み合わせることによって、染色組成物を製造することができると考えられる。しかしながら、別の手法では、組織染色組成物が調製されたら、それを例えばフィルター滅菌によって、または1つ以上の滅菌剤に別々にもしくは組み合わせて曝露することによって、例えば高温および/または高圧に曝露(例えばオートクレーブ処理中)、または電離放射線に曝露することによって滅菌することができる。あるいは、組織染色組成物は、送達装置(例えば、バイアル、シリンジなど)中に含まれた後、滅菌の分野で既知でありかつ使用されている1つ以上の処置を使用して、例えば、別々にまたは組み合わせて、1つ以上の殺菌剤への曝露、例えば高温および/または高圧への曝露(例えば、オートクレーブ中)によって、または電離放射線への曝露によって滅菌することができる。滅菌プロセスは、好ましくは10⁻³以上の滅菌保証レベル(SAL)を達成し;すなわち、プロセス後に製品の任意の所与の単位が滅菌されていない確率は、10³分の1以下である。より好ましくは、滅菌プロセスは、10⁻⁴以上、10⁻⁵以上、10⁻⁶以上、または10⁻⁷以上のSALを達成する。

別の態様では、本発明は、上記の組織染色組成物を調製する方法であって、(a)直径0.3μm未満もしくは0.2μm未満の平均粒径、または本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つの平均粒径を有する炭素粒子、好ましくは脱発熱炭素粒子を含む組成物を製造すること;ならびに(b)炭素粒子を含む組成物を任意のASA、および任意の粘膜付着剤、および/または1つ以上の他の賦形剤と組み合わせて組織染色組成物を製造することを含む、方法を提供する。工程(a)の間、炭素粒子は、好ましくは、0.3μm未満または0.2μm未満の平均粒径を与えるように炭素粒子を製造する脱凝集処置の前に、界面活性剤および消泡剤と組み合わされる。例えば、工程(a)で製造される炭素粒子は、例えば直径5.0μm超の平均粒径を有する炭素粒子(炭素一次粒子、凝集物、および凝集体を含む)を超音波処理または均質化し、直径0.3μm未満または0.2μm未満の平均粒径を有する炭素粒子を製造することによって、製造することができる。

得られた組成物は、例えばフィルター滅菌、オートクレーブ滅菌、または電離放射線への曝露により滅菌することができる。さらに、組成物が送達装置に導入されると、得られた装置は、本明細書に記載されている1つ以上の滅菌手法を使用することによって最終的に滅菌することができる。

別の態様では、本発明は、対象の組織の領域を染色する方法であって、目視検査によって、例えば、肉眼、内視鏡、腹腔鏡、または他の装置によって見えるように、領域を染色するのに有効な量で上記組織染色組成物を対象の目的の領域に注入することを含む、方法を提供する。

一実施形態では、組織は、対象の胃腸管、膀胱、乳房、リンパ節、肺、または中枢もしくは末梢神経系に存在する。特定の実施形態では、組織は、対象の胃腸管中に存在する。

別の実施形態では、染色は、組織の染色後少なくとも6ヶ月、12ヶ月、24ヶ月、36ヶ月、48ヶ月、60ヶ月、または120ヶ月の間、例えば内視鏡的に見ることができる。

本発明のこれらおよび他の態様および特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲に記載されている。

本発明の前述および他の目的、特徴、ならびに利点は、付随する図面に示される好ましい実施形態の以下の説明から明らかとなる。同様の参照要素は、対応する図面中の共通の特徴を識別する。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本発明の原理を示すことに重点が置かれている。

本発明の例示的な染色液の開発および特徴を示す図である。

組織染色液の暗さに対する炭素粒子サイズおよび濃度の影響を示す棒グラフである。

0.50%(w/v)の炭素粒子を含有する炭素粒子ベースの組織染色液の沈降防止特性が、粒子サイズと十分な量のASAの存在との組み合わせに基づくことを示す棒グラフである。

0.25%(w/v)の炭素粒子を含有する炭素粒子ベースの組織染色液の沈降防止特性が、粒子サイズと十分な量のASAの存在との組み合わせに基づくことを示す棒グラフである。

ASA、HEC 2Kを含有する組織染色液の暗さに対する炭素粒子サイズおよび濃度の影響を示す棒グラフである。

ASA、HEC 5Kを含有する組織染色液の暗さに対する炭素粒子サイズおよび濃度の影響を示す棒グラフである。

傾斜したムチン/寒天ゲルに沿った移動速度に基づく、例示的な炭素粒子ベースの組織染色液の粘膜付着特性を示す棒グラフである。

寒天/ムチンプレートを傾斜させる前(図8A)またはプレートを傾斜させた後(図8B)のいずれかのHEC 5Kを含有する様々な染色液の暗さおよび粘膜付着性を視覚的に示す写真である。

寒天/ムチンプレートを傾斜させる前(図8A)またはプレートを傾斜させた後(図8B)のいずれかのHEC 5Kを含有する様々な染色液の暗さおよび粘膜付着性を視覚的に示す写真である。

本発明は、少なくとも部分的には、直接観察または内視鏡検査もしくは腹腔鏡検査のいずれかによって経時的に視覚化することができる、使用するのに信頼性があり、組織への注入中に容易に観察可能であり、かつ耐久性のある信頼性の高いマークを提供する生体適合性炭素粒子ベースの組織染色を製造することが可能であるという発見に基づく。これは、染色剤として炭素粒子を使用する場合、染色剤の暗さを向上させるためには、0.3μm未満(例えば、0.2μm未満、または本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つ)の平均粒径を有する炭素粒子を使用することが重要であるという発見によって促進された。

炭素粒子の凝集を低減または排除する薬剤(例えば、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤)の存在に応じて、炭素粒子は、ほとんどまたは全く沈殿(沈降)することなく長期間懸濁状態を維持し得る。しかしながら、状況に応じて、組成物は、沈降防止剤および/または粘膜付着剤も含み得る。単一の薬剤は、沈降防止特性および粘膜付着特性の両方を有することができる。得られた組織染色は、炭素粒子がより大きい平均粒径を有する場合、より多くの量の炭素粒子を含有する同等の炭素粒子ベースの組織染色よりもはるかに暗い。結果として、本発明の組織染色は、目的の組織の領域への注入時に視覚化するのがより容易であり、経時的に視覚化することができるその領域に耐久性のあるマークを提供する。さらに、炭素粒子は、貯蔵時に溶液から沈降する可能性が低く、市販の針および注入システムを使用して目的の組織に容易に注入することができるので、得られる組織染色は、取扱いおよび貯蔵特性が改善される。

用語「組織染色」、「組織染色組成物」、および「組織マーキング組成物」は、本明細書では互換的に使用される。

本発明の炭素可溶分ベースの組織染色組成物の特性および利点は、図1に概略的に示されている。特に、本発明の組織染色組成物は、(i)(炭素粒子のサイズを減少させることにより達成される)はるかに暗色であり、したがって目的の組織への導入時に視覚化するのが容易であり、次いで経時的に、視覚化できる耐久性のあるマークを製造し、(ii)炭素粒子の沈降を減少を示し(粒子サイズを減少させ、任意に沈降防止剤を添加することによって達成される)、したがって使用者による操作が容易であり、かつ(iii)粘膜付着性(粘膜付着剤の添加および/または粘膜付着特性を有する沈降防止剤の使用により達成される)であり、したがって、導入部位からの染色の「にじみ」が少なく、目的の組織への導入時に視覚化するのがより容易であり、経時的に視覚化することができる耐久性のあるマークを製造すると考えられる。

本発明の組織染色は、染色が目的の組織の領域に注入されているときに容易に視覚化することができ、導入時、組織染色の暗さおよび任意の粘膜付着性を考慮すると、染色は、例えば直接観察によって、または、例えば内視鏡もしくは腹腔鏡などの医療機器によって、長期間、例えば数週間、数ヶ月、もしくは数年にわたって視覚化することができる。組織染色は、医師または他の開業医がその後の外科手術のために組織をマークすること、または例えば潜在的に異常な組織が前癌性または癌性になったかどうかを評価するために、経時的に組織の領域を監視することを望むときに特に有用である。

例えば、癌性または前癌性の病変が消化管、膀胱、肺の気管支、乳房組織、もしくはリンパ節、または他の場所に見つかった場合、その部位のマーキングを使用して、次の処置で、外科医をその部位に誘導することができる。例として、結腸中のポリープは、典型的には悪性腫瘍の可能性があるため速やかに除去される。ポリープは、腸管腔に突出する個別の腫瘤である。粘膜腫瘍性(腺腫性)ポリープは、結腸の腺癌を生じるので、S状結腸鏡検査またはバリウム注腸で検出されたポリープは、結腸鏡下ポリープ切除術または米国特許第5,122,147号および同第5,542,948号に記載されるような他の技術によって、可能な限り早く除去され、大腸内視鏡検査ではポリープまたは腫瘍を安全にまたは完全に除去できないことがあり、外科的切除を続いて行わなければならない。ポリープが除去されると、見逃したポリープ、新しい腺腫、および残存または再発がんを探すために、定期的に監視大腸内視鏡検査が繰り返される。

組織染色組成物を対象の種々の組織、例えば胃腸管、乳房、リンパ節、膀胱、および尿路などの組織をマークするために使用することができることが理解される。しかしながら、以下により詳細に論じるように、特定の組織染色配合物は、目的の組織への送達および/または目的の組織の染色のために最適化することができる。

I.炭素粒子 本発明の組織マーキング組成物は、顔料の供給源として炭素粒子を含む。色の濃さ(暗さ)は、懸濁液中の炭素粒子の濃度を増加させることによって増加させることができるが、粒子サイズを減少させることは、懸濁液の暗さに対してさらに一層大きな影響を及ぼし得ることも発見された。結果として、例えば解凝集によって粒子サイズを減少させることによって、サイズがより大きいより高濃度の粒子を有する同等の染色組成物よりもはるかに暗い染色組成物を製造することが可能である。この特徴は、図2、5、6、および8で実証されている。粒子サイズの減少はまた、溶液中の粒子の沈降速度を減少させ得る。さらに、粒子のサイズ(例えば、0.3μm未満、または好ましくは0.2μm未満の平均粒径を有する粒子)および炭素粒子の再凝集を減少または防止する、薬剤、例えば界面活性剤(例えば、非イオン性界面活性剤)の存在に応じて、炭素粒子が長期間懸濁液中に留まる染色を製造することが可能であり得る。粒子の濾過は、配合物中に含まれる粒子のサイズを減少させることができるが、それは実際には凝集体のサイズを変化させず、粒子の最小サイズがフィルターのサイズによって制限される。

本明細書で使用される場合、用語「炭素粒子」は、個々の炭素粒子(一次炭素粒子)ならびに個々の炭素粒子の凝集物を意味し、より小さい粒子の凝集物は、単一の粒子として挙動するのに十分強く結合され、これらは両方とも、例えば本明細書に記載の処置を使用することによって、例えば超音波処理または均質化によって、機械的力および/またはエネルギーに曝すことによって減少させることができない粒子サイズを有する。個々の炭素粒子および/または凝集物は弱い結合(たとえばファンデルワールス力)によって一緒に保持されて凝集体を形成し得、これは、機械的な力および/またはエネルギーの追加(例えば、超音波処理または均質化による)によって破壊され、主に個々の炭素粒子、凝集物、およびそれらの組み合わせ(例えば、5μm超の平均直径を有する凝集体は、組成物の30%、20%、10%、または5%、4%、3%、2%、または1%未満を表す)を製造することができる。

特定の実施形態では、任意で解凝集プロセスに曝された炭素粒子は、直径0.3μm未満、例えば、直径0.2μm未満、または本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つの平均粒径を有する。本発明の組織染色組成物において、炭素粒子(一次炭素粒子、炭素粒子の凝集物、またはそれらの組み合わせであり得る)は、直径0.3μm未満、好ましくは直径0.2μm未満の平均粒径を有する。炭素粒子のサイズは、動的光散乱(DLS)、レーザー光散乱粒子サイズ分析(LLSPSA)、またはディスク遠心分離分析などの当技術分野で既知の技術を使用して測定することができる。

本明細書で使用される場合、用語「平均粒径」は、(i)目的の試料中の優勢な粒子集団(最頻値)に寄与する粒子の平均粒子サイズ、(ii)目的の試料中に存在する粒子のD50値、および/または(iii)例えば、試料中に複数の粒子集団(最頻値)が存在する場合に、目的の試料中の優勢な粒子集団(最頻値)に寄与する粒子のD50値を指す。平均粒径は、様々な検出技術、例えば動的光散乱(DLS)またはレーザー光散乱粒径分析(LLSPSA)によって生成された粒子サイズおよび分布データから計算することができる。

粒子サイズを表す他の方法としては、例えば、MV、MI、MN、およびMAが挙げられる。MVは、粒子の体積分布の平均直径(例えば、ミクロンで表される)を指し、これは、試料中の粒子の分布の重心を表す。MIは、試料中の粒子の強度分布の平均直径(例えば、ミクロンで表される)を指す。MNは、体積分布データを使用して計算される、試料中の粒子の数分布の平均直径(例えば、ミクロンで表される)を指す。MAは、体積分布データから計算される、試料中の粒子の面積分布の平均直径(例えば、ミクロンで表される)を指す。

炭素粒子は、約0.1μm〜0.3μm未満の範囲の平均粒径を有し得る。特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.1μm〜約0.2μmの範囲の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.1μm〜約0.18μmの範囲の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.15μm〜約0.2μmの範囲の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.13μm〜約0.18μmの範囲の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.15μm〜約0.18μmの範囲の平均粒径を有する。特定の実施形態では、平均粒径は0.2μm未満である。

特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.01μm〜0.3μm未満、約0.01μm〜0.25μm未満、約0.01μm〜0.2μm未満、0.01μm〜0.15μm未満の範囲の平均粒径を有する。

特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.05μm〜0.25μm以下、約0.05μm〜0.2μm以下(例えば、0.05μm〜0.19μm、0.05μm〜0.18μm、0.05μm〜0.17μm、0.05μm〜0.16μm、0.05μm〜0.15μm、0.05μm〜0.14μm、0.05μm〜0.13μm、0.05μm〜0.12μm、0.05μm〜0.11μm、または0.05μm〜0.1μm)の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、約0.08μm〜0.2μm以下(例えば、0.08μm〜0.19μm、0.08μm〜0.18μm、0.08μm〜0.17μm、0.08μm〜0.16μm、0.08μm〜0.15μm、0.08μm〜0.14μm、0.08μm〜0.13μm、0.08μm〜0.12μm、0.08μm〜0.11μm、または0.08μm〜0.1μm)の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、0.1μm〜0.2μm以下(例えば、0.1μm〜0.19μm、0.1μm〜0.18μm、0.1μm〜0.17μm、0.1μm〜0.16μm、0.1μm〜0.15μm、0.1μm〜0.14μm、0.1μm〜0.13μm、または0.1μm〜0.12μm、または0.1μm〜0.11μm)の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、0.12μm〜0.2μm以下(例えば、0.12μm〜0.19μm、0.12μm〜0.18μm、0.12μm〜0.17μm、0.12μm〜0.16μm、0.12μm〜0.15μm、0.12μm〜0.14μm、または0.12μm〜0.13μm)の平均粒径を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、0.13μm〜0.2μm以下(例えば、0.13μm〜0.19μm、0.13μm〜0.18μm、0.13μm〜0.17μm、0.13μm〜0.16μm、0.13μm〜0.15μm、または0.13μm〜0.14μm)の平均粒径を有する。

特定の実施形態では、炭素粒子は、0.05μm〜0.2μm以下(例えば、0.05μm〜0.19μm、0.05μm〜0.18μm、0.05μm〜0.17μm、0.05〜0.16μm、0.05μm〜0.15μm、0.05μm〜0.14μm、0.05μm〜0.13μm、0.05μm〜0.12μm、0.05μm〜0.11μm、または0.05μm〜0.1μm、0.1μm〜0.2μm以下(例えば、0.1μm〜0.19μm、0.1μm〜0.18μm、0.1μm〜0.17μm、0.1μm〜0.16μm、0.1μm〜0.15μm、0.1μm〜0.14μm、または0.1μm〜0.13μm、または0.1μm〜0.12μm)、0.12μm〜0.2μm以下(例えば、0.12μm〜0.19μm、0.12μm〜0.18μm、0.12μm〜0.17μm、0.12μm〜0.16μm、0.12μm〜0.15μm、0.12μm〜0.14μm、または0.12μm〜0.13μm、または0.13μm〜0.2μm以下(例えば、0.13μm〜0.19μm、0.13〜0.18μm、0.13μm〜0.17μm、0.13μm〜0.16μm、0.13μm〜0.15μm、または0.13μm〜0.14μm)のMI値を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、0.13μm〜0.17μmのMIを有する。

特定の実施形態では、炭素粒子は、0.05μm〜0.2μm以下(例えば、0.05μm〜0.19μm、0.05μm〜0.18μm、0.05μm〜0.17μm、0.05〜0.16μm、0.05μm〜0.15μm、0.05μm〜0.14μm、0.05μm〜0.13μm、0.05μm〜0.12μm、0.05μm〜0.11μm、または0.05μm〜0.1μm、0.1μm〜0.2μm以下(例えば、0.1μm〜0.19μm、0.1μm〜0.18μm、0.1μm〜0.17μm、0.1μm〜0.16μm、0.1μm〜0.15μm、0.1μm〜0.14μm、または0.1μm〜0.13μm、または0.1μm〜0.12μm)、0.12μm〜0.2μm以下(例えば、0.12μm〜0.19μm、0.12μm〜0.18μm、0.12μm〜0.17μm、0.12μm〜0.16μm、0.12μm〜0.15μm、0.12μm〜0.14μm、または0.12μm〜0.13μm、または0.13μm〜0.2μm以下(例えば、0.13μm〜0.19μm、0.13μm〜0.18μm、0.13μm〜0.17μm、0.13μm〜0.16μm、0.13μm〜0.15μm、または0.13μm〜0.14μm)のMA値を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、0.12μm〜0.17μmのMAを有する。

特定の実施形態では、炭素粒子は、0.05μm〜0.2μm以下(例えば、0.05μm〜0.19μm、0.05μm〜0.18μm、0.05μm〜0.17μm、0.05〜0.16μm、0.05μm〜0.15μm、0.05μm〜0.14μm、0.05μm〜0.13μm、0.05μm〜0.12μm、0.05μm〜0.11μm、または0.05μm〜0.1μm、0.1μm〜0.2μm以下(例えば、0.1μm〜0.19μm、0.1μm〜0.18μm、0.1μm〜0.17μm、0.1μm〜0.16μm、0.1μm〜0.15μm、0.1μm〜0.14μm、または0.1μm〜0.13μm、または0.1μm〜0.12μm)、0.12μm〜0.2μm以下(例えば、0.12μm〜0.19μm、0.12μm〜0.18μm、0.12μm〜0.17μm、0.12μm〜0.16μm、0.12μm〜0.15μm、0.12μm〜0.14μm、または0.12μm〜0.13μm、または0.13μm〜0.2μm以下(例えば、0.13μm〜0.19μm、0.13μm〜0.18μm、0.13μm〜0.17μm、0.13μm〜0.16μm、0.13μm〜0.15μm、または0.13μm〜0.14μm)のMN値を有する。特定の実施形態では、炭素粒子は、0.1μm〜0.15μmのMNを有する。

炭素粒子は、カーボンブラック、木炭、またはコークスから誘導することができる。カーボンブラックは、部分酸化を使用して炭化水素を燃焼させることによって製造される気化重油留分のような微粉化炭素である。顔料は、97%を超える炭素を含有することができる。オイルファーネス法は、カーボンブラックを製造するために最も広く使用されている方法を表す。一般的には、液体炭化水素系原料は、流体燃料と酸素とを反応させることによって製造された燃焼の乱流生成物に噴霧され、炭化水素原料は、燃焼ガスから分離されるカーボンブラックに変換される。カーボンブラックは、天然ガスを燃焼させて炎を冷たい表面に衝突させることによっても製造することができる。本明細書で有用な好ましいカーボンブラックは、製造中に吸収され得る不完全燃焼した炭化水素が少なく;特に、カーボンブラックは、芳香族化合物およびその他の発ガン物質の可能性がある化合物が少ない。より詳細には、好ましいカーボンブラックは、残留多環式芳香族炭化水素が少ない。「少ない」とは、実質的に非発癌性のレベルを意味する。好ましい実施形態では、カーボンブラックは、カーボンブラックの量に基づいて、0.5μm以下のレベルの多環式芳香族炭化水素を有する。

木炭は、空気の不在下で木材、砂糖、および他の炭素含有化合物を点火することによって調製することができる。それは、グラファイト構造を有するが、結晶度がよく発達していない。したがって、それは本明細書中では非晶質として分類される。活性炭素は、同様に植物性物質、例えば木材、木の実の殻、骨、または他の炭素質材料の炭化または破壊蒸留によって得られる。炭素は、水または二酸化炭素の存在下で高温に加熱することによって活性化され、その結果、多孔質内部構造を有する炭素が得られる。この処理を受けていない炭素は、本明細書では不活性化と呼ばれる。コークスは、空気の不在下で石炭を加熱することによって調製される。

例示的な炭素粒子、好ましくは4750 Monarchは、Cabot Corp.,Billerica,MAから得ることができ、またはAsbury Carbon 5388もしくは5377は、Asbury Carbons,Asbury,NJから得られる。

本発明の組織染色組成物に典型的に使用される炭素粒子の密度は、約1.7g/cm³〜約1.9g/cm³であり、それは単独でまたはグリセロールとともに水の密度より大きい。代表的な製剤ビヒクルとして、25%(w/v)のグリセロールを含有する水の密度は、明らかに1.0g/cm³以下である。液相よりも炭素粒子の密度が高いため、炭素粒子は、典型的にはある程度沈降し、これは液体部分と沈降した固体部分とをもたらし、その結果、液体部分は、全体として元の組成物と比較してより少ない数の炭素粒子を有する。炭素粒子の量が少ないと、組成物の液体部分のマーキング性能が低下する可能性がある。そのような溶液は、使用前に振盪、ボルテックス、または別の方法で混合するべきである。何人かの使用者が使用前に染色剤を(例えば振盪することによって)再分配しないかもしれないことを考えると、経時的に炭素粒子の沈降量を減らすことが望ましい。沈降を減少させるための方法は、単独で、もしくは組成物の液体粘度を増加させることと組み合わせてのいずれかで粒子サイズを減少させること、および/または沈降防止剤を含むことを含む。炭素粒子の沈降速度が、平均粒径(凝集物を含む)を直径0.3μm未満(例えば、直径0.2μm未満)に減少させること、および任意に沈降防止剤を含むことによって著しく遅くすることができることが発見された(図3および4参照)。

典型的には、炭素は、一次炭素粒子、凝集物、凝集体、およびそれらの組み合わせとして入手可能である。一次炭素粒子および凝集物は、例えば、超音波処理または均質化を介して、例えば、機械的力および/またはエネルギーを加えることによって、サイズを減少させることはできない。炭素が凝集体(例えば、5μm超の平均粒径を有する凝集体)を含むことが多いと仮定すると、凝集体は、個々の炭素粒子および/または凝集物を遊離させるための解凝集プロセスによって分解することができる。凝集体を一緒に保持する引力が、例えば機械的におよび/またはエネルギーの適用により妨害されると、得られる炭素粒子は、0.3μm未満、例えば0.2μm未満の平均粒径を有する、または約0.1〜約0.2μmの範囲の平均粒径を有する、または約0.1μm〜約0.18μmの範囲の平均粒径を有する、または約0.05μm〜0.2μm未満の範囲の平均粒径を有する、または本明細書に開示されている範囲のうちの1つの平均粒径を有することができる。

より小さい粒子は、同等の重量のより大きい粒子よりもはるかに暗く見える。理論に束縛されることを望むものではないが、粒子が大きくなるにつれて所与の重量の炭素粒子の視認性が低下すると考えられ、これは、大きな粒子間の「スペース」が大きいため、目には大きな粒子の方が、同じ重量のより多くのより小さな炭素粒子よりも黒が少ないと感じられるためである。したがって、解凝集は、マークの視認性を向上させることができると同時に、沈降の量および速度を減少させる。粒子のサイズは、例えば、レーザー光散乱粒子分析(LLSPA)(レーザー回折またはレーザー回折法としても既知)、および動的光散乱(DLS)を含むいくつかの手法を使用することによって決定することができる。LLSPAは、より大きな粒子(例えば、約5μm超の平均粒径を有する粒子)を分析するときにより正確であり得るが、DLSは、より小さな粒子(例えば、0.5μm以下の平均粒径を有する粒子)を分析するときにより正確であり得る。さらに、粒子サイズは、例えば20nm〜100μmの範囲の粒子を測定する、空間および時間分解消光プロファイル(STEP)技術を用いるLUMiSizer650を使用して測定することができる。

炭素粒子を含有する組織染色組成物の暗さは、X Rite 504ポータブルカラー反射分光濃度計およびThermo Scientific Biomate S3 UV−Vis分光光度計などの濃度計またはUV/可視分光光度計によって吸光度または反射率の関数として測定することができ、暗さは、%吸光度、%反射率、または光学濃度で表され得る。

解凝集プロセスは、超音波処理、均質化、高剪断混合もしくはボールミル粉砕、または粒子サイズを減少させるための他の手法によって達成することができる。好ましくは、解凝集は、超音波処理または均質化によって達成される。特定の実施形態では、炭素は、60%出力で、BioLogics、Inc.,Manassas,VAsonatorからの直径1/2インチの固体チタンチップを有する350W Biologics Model 3000超音波ホモジナイザーで約3分間、またはおおよその粒子サイズが達成されるまで超音波処理によって解凝集される。他の実施形態では、炭素は、均質化により、例えば、約8,500rpmで約1時間(例えば、Silverson Model L5M−Aミキサー−ホモジナイザーを使用して)またはおおよその粒子サイズが達成されるまで均質化することによって解凝集される。均質化によって炭素粒子を解凝集させるための1つの例示的な手法は、実施例2に記載されている。

特定の実施形態では、炭素粒子は、それらが他の賦形剤、例えばASAおよび任意の粘膜付着剤と混合される前に解凝集されるが、これは、特にASAまたは粘膜付着剤が、高剪断条件によって変化し得るポリマーから製作されているか、または他の方法で含有する場合、解凝集のプロセスがASAおよび粘膜付着剤に対する粘度変化をもたらし得るからである。炭素粒子は、追加の添加剤、例えば下記の1つ以上の界面活性剤を含むことにより0.3μm未満(例えば0.2μm未満)の平均粒径を有する凝集物として維持され得、これは、ファンデルワールスの引力により再凝集を防止する、またはその速度を遅くする。

好ましくは、炭素粒子は、脱発熱物質化されるか、さもなければ発熱物質を含まない。これは、例えば、炭素粉末を220℃で1時間加熱して発熱物質を含まない乾燥炭素を製造することによって達成することができる。

意図する用途に応じて、組織染色組成物中の炭素の最終濃度は、約0.025%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約0.5%(w/v)、0.1%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.25%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.25%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.25%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.25%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.25%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約1.0%(w/v)〜約2.0%(w/v)、または約1.0%(w/v)〜約1.5%(w/v)であり得る。

特定の好ましい実施形態では、組織染色組成物中に存在する炭素、好ましくは解凝集炭素の最終濃度は、約0.25%(w/v)〜約0.5%(w/v)の範囲である。しかしながら、より暗いマークが望まれるとき、存在する炭素の最終濃度は、約0.5%(w/v)〜約1.0%(w/v)の範囲に増加させることができる。

II.沈降防止剤(ASA) 炭素粒子の再凝集を低減または防止する薬剤(例えば、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤)に加えて、組織マーキング組成物は、任意に、炭素粒子の沈降の防止または低減を補助するための沈降防止剤(ASA)も含み得る。多くのASAが入手可能であるが、それらは組成物中の他の成分および/または組成物を作製もしくは滅菌する方法と不適合であってもよい。好ましいASAは、例えば、オートクレーブ処理による滅菌を促進するために熱的に安定であり、直径0.3μm未満(例えば、直径0.2μm未満)の平均粒径を有する炭素粒子の沈降速度を低下させるべきである。

オートクレーブ処理の条件下での水性溶液中のそれらの熱安定性の欠如を考えると、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、非架橋ヒアルロン酸、キサンタン、ペクチン、トラガカントガム、およびポリビニルピロリドンは、それがオートクレーブ処理により滅菌されるのであれば組成物中に含まれるべきではない。オートクレーブ処理によって滅菌することができる組成物に使用するのに好適なASAとしては、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、およびグアーガムが挙げられる。ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、およびグアーガムも粘膜付着性を有する(表3および4参照)。

例示的なヒドロキシエチルセルロース(HEC)は、1%(w/v)で約2000cpの粘度を有する約1.0×10⁶Daの分子量を有するヒドロキシエチルセルロース(HEC2K)および1%(w/v)で約5000cpの粘度を有する約1.3×10⁶Daの分子量を有するヒドロキシエチルセルロース(HEC5K)を含み、これはSpectrum ChemicalまたはAshlandから得ることができる。例示的なヒドロキシプロピルセルロース(HPC)は、5%(w/v)で約4950cpの粘度を有する約8.5×10⁵Daの分子量を有するヒドロキシプロピルセルロースを含み、これはSpectrum ChemicalまたはAshlandから得ることができる。

最終生成物中のASAの濃度は、約0.025%(w/v)〜5.0%(w/v)未満、約0.025%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約1.5 %(w/v)、約0.75%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約1.0%(w/v)〜約2.0%(w/v)、または約1.0%(w/v)〜約1.5%(w/v)の範囲であることができる。

実施例2に示すように、そのようなASAと、約0.3μm未満の平均粒径を有する炭素粒子との組み合わせは、他の炭素粒子ベースの液体内視鏡組織染色組成物よりもはるかに遅い沈降速度をもたらすことができる。沈降は、経時的に起こり、数分、数時間、数日、数ヶ月、または数年の期間にわたって進行し得るプロセスである。例えば、沈降プロセスを促進するための遠心分離を介して、種々の手法を使用して沈降速度を定量化することが可能である。同様に、沈降速度および粒子サイズ分析は、LUMGmbH,Berlin,Germanyから入手可能なLUMiSizer 650を使用して決定することができる。

組成物の沈降特性を分析するための比較方法として、目的の組成物を数分から数時間で沈降月数のシミュレーションを可能にする重力の何倍もの遠心力にかけてもよい。目的の試料を含有する管を遠心すると、管の底部に炭素粒子の沈降をもたらし、液体の最上部の領域に炭素粒子が枯渇した液体が残り得る。次いで、液体の最上部の領域中の液体の一部(例えば、上部の第3の部分)を分析して、沈降した炭素粒子の量を決定することができる。特定の実施形態では、染色組成物は、5000×gで60分間遠心分離にかけたときに、ASAを含む染色組成物が、粒子が5μmを超える平均粒径を有し、かつ/または組成物がASAを欠く同様の組成物と比較した場合、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、または20%未満の沈降を示すことを特徴とすることができる。

III.粘膜付着剤 ASAの選択(例えば、粘膜付着性も有しないASA)に応じて、さらなる粘膜付着剤を含めることが好ましくなり得る。粘膜付着剤は、標的組織への組成物のマーキングにおいて染色剤の付着を助けることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、より大きな粘膜付着性は、マークの粘着力を促進し、したがって潜在的に時間の経過とともに顔料の広がりを減少させることによって、マークが一箇所に留まり、目的のエリアの近くでより容易に見えるようになる可能性を高める。さらに、粘着力の増加は、注入後のマーキング溶液に関連する漏れを減少させ得ることも考えられ、そのような漏れは、内視鏡の視野を曇らせ、見ているエリアを洗うことを手術医が要求する可能性があるので望ましくない。

好ましい粘膜付着剤は、任意に熱安定性であり、配合物中の他の成分と相溶性であり、直径0.3μm未満の平均粒子直径を有する炭素粒子の粘膜付着性を増大させる。例示的な粘膜付着剤は、Saraswathi et al.(2013)INT.J.PHARM.PHARM.SCI.5:423−430に記載されている。例示的な粘膜付着剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、アルギン酸塩、キトサン、デキストラン、グアーガム、ポリエチレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール200,000〜400,000ダルトン)、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択することができる。

粘膜接着剤は、約0.025%(w/v)〜5.0%(w/v)未満、約0.025%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.025%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.05%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.075%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.1%(w/v)〜約0.5%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約0.5%(w/v)〜約0.75%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約2.0%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約1.5%(w/v)、約0.75%(w/v)〜約1.0%(w/v)、約1.0%(w/v)〜約2.0%(w/v)、または約1.0%(w/v)〜約1.5%(w/v)の最終濃度で染色組成物中に存在することができる。

特定の実施形態では、例えば実施例3に記載されるように、粘膜付着性について試験した場合、(ASAまたは別の粘膜付着剤のいずれかによる)粘膜付着剤を含む染色組成物は、粘膜付着剤を欠く同様の組成物と比較して、2%のムチンおよび2%の寒天(胃組織の裏地を模した)を含有する傾斜した(例えば、水平から30°傾斜した)表面に沿った移動速度の少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも40%、少なくとも30%、または少なくとも20%の減少を示す。

IV.増粘剤 組成物は任意に、炭素粒子の沈降を防止または他の方法で低減し、かつ組成物の粘度を所望のレベルに調整するための増粘剤も含み得る。水の粘度より高い粘度は、沈降プロセスを遅くし得るが、高すぎる粘度は、好適な送達針、例えば25ゲージ針を通じて注入することができない溶液をもたらす場合がある。特定の実施形態では、染色組成物は、約32N以下、任意に約22〜約32N、または約22N以下、または約10N以下の力を加えると、長さ240cmの25ゲージ針を通過して、組成物を針を通じて押すことができる。

好ましい増粘剤としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒアルロン酸が挙げられる。特定の実施形態では、薬剤は、熱的に安定であり、他の配合物成分と相溶性であり、炭素粒子が溶液から急速に(例えば、60分、30分、20分、10分、または5分未満)沈降するのを防止する。特定の実施形態では、増粘剤は、グリセロールである。増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースが熱的に安定でない限り、組織染色液は、濾過滅菌されてもよいし、または他の非熱的手法であってもよい。

増粘剤は、染色組成物中に、約5%〜約25%、5%〜約20%、5%〜約15%、5%〜約10%、10%〜約25%、10%〜約20%、10%〜約15%、15%〜約25%、または15%〜約20%(w/v)の最終濃度で存在することができる。

V.追加の添加剤 組成物はまた、他の添加剤、例えば界面活性剤、消泡剤、および/または防腐剤を含み得る。

組成物は任意に、炭素粒子の再凝集を低減もしくは排除するために、かつ/または炭素粒子を水性溶媒中で湿潤させるために界面活性剤を含む。界面活性剤は、炭素凝集体を水溶液中により容易に分散させることを可能にし、超音波処理/均質化後の再凝集を妨げる。特定の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリエトキシル化ソルビタンエステルおよび/またはソルビタンエステルからなる群から選択される。例示的なポリエトキシル化ソルビタンエステルとしては、例えば、PEG−20ソルビタンモノラウレート(Tween(登録商標)20)、PEG−4ソルビタンモノラウレート(Tween(登録商標)21)、PEG−20ソルビタンモノパルミテート(Tween(登録商標)40)、PEG−20ソルビタンモノステアレート(Tween(登録商標)60)、PEG−20ソルビタントリステアレート(Tween(登録商標)65)、およびPEG−20ソルビタンモノオレエート(Tween(登録商標)80)が挙げられ、これらは、Croda Europe Ltd,Englandから市販されている。特定の実施形態では、PEG−20ソルビタンモノオレエート(Tween(登録商標)80)が好ましい。例示的なソルビタンエステルとしては、例えば、ソルビタンモノラウレート(Span(登録商標)20)、ソルビタンモノパルミテート(Span(登録商標)40)、ソルビタンモノステアレート(Span(登録商標)60)、ソルビタンモノオレエート(Span(登録商標)80)、ソルビタンセスキオレエート(Span(登録商標)83)、ソルビタントリオレエート(Span(登録商標)85)、およびソルビタンイソステアレート(Span(登録商標)120)が挙げられる。

特定の実施形態では、界面活性剤は、約0.01%〜約4.0%(w/v)、約0.05%〜約2.0%(w/v)、約0.05%〜約1.5%(w/v)、約0.05%〜約1.0%(w/v)、約0.05%〜約0.75%(w/v)、約0.5%〜約4%(w/v)、約0.5%〜約2.0%(w/v)、約0.5%〜約1.5%(w/v)、約0.5%〜約1.0%(w/v)、約0.5%〜約0.75%(w/v)、約0.75%〜約4%(w/v)、約0.75%〜約2%(w/v)、約0.75%〜約1.5%(w/v)、または約0.75%〜約1.0%(w/v)の最終濃度で存在することができる。

好ましい消泡剤としては、例えば、ジメチコンおよびシメチコンが挙げられる。シメチコン(USP)は、ポリ(ジメチルシロキサン)と二酸化ケイ素との混合物を含む。ポリ(ジメチルシロキサン)は、α−(トリメチルシリル)−t−メチル−ポリ[オキシ(ジメチルシリレン)]である。消泡剤は、約0.01%〜約0.5%(w/v)、約0.05%〜約0.25%(w/v)、または約0.1%〜約0.2%(w/v)の最終濃度で存在することができる。

組成物は、抗菌剤として機能することができるベンジルアルコール、メチルもしくはエチルパラベン、または塩化ベンザルコニウムなどの好適な防腐剤も含むことができる。特定の実施形態では、防腐剤は、約0.01%〜約4.0%(w/v)、約0.05%〜約2.0%(w/v)、約0.05%〜約1.5%(w/v)、約0.05%〜約1.0%(w/v)、約0.05%〜約0.75%(w/v)、約0.5%〜約4%(w/v)、約0.5%〜約2.0%(w/v)、約0.5%〜約1.5%(w/v)、約0.5%〜約1.0%(w/v)、または約0.5%〜約0.75%(w/v)の最終濃度で存在する。

他の薬学的に許容される賦形剤、例えばクエン酸塩またはリン酸緩衝剤などの緩衝剤を添加してもよい。特定の実施形態では、組成物は、有意量のシェラック、フェノール、多環式芳香族炭化水素、アンモニア、またはゼラチンを含有しない。

組織染色組成物のpHは、生体組織を染色することに適合するべきであり、好ましくは約6〜約8の範囲のpHを有する。

例えば、炭素粒子、ASA、粘膜付着剤、増粘剤、および追加の添加剤を含む、組織染色液の前述の成分のそれぞれは、薬学的に許容されることが理解される。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。

VI.製造方法および使用方法 組織染色組成物は、種々の手法を使用して調製することができる。

第1の手法では、マーキング組成物は、0.3μm未満、好ましくは0.2μm未満、例えば、本明細書に記載の粒子サイズ範囲の1つである平均粒径を有する炭素粒子を含む溶液を作製することによって製造される。これは、上述したように、例えば、炭素粒子含有溶液を超音波処理または均質化することによって達成することができる。その後、粒子を他の賦形剤、例えばASA、粘膜付着剤、界面活性剤、および他の薬剤などと組み合わせる。

ASAを含有する組織染色を作製するための例示的なプロトコルでは、界面活性剤(例えば、Tween(登録商標)80)および消泡剤(例えば、シメチコン)を水溶液(例えば、水)中に溶解することによって第1のプレミックス溶液(カーボンプレミックス)が調製され、次いで、脱発熱物化炭素粒子を添加し、界面活性剤、消泡剤、および炭素粒子を混合して、界面活性剤/炭素粒子混合物を製造する。次いで、界面活性剤/炭素粒子混合物を(例えば、超音波処理および/または均質化による)解凝集処置に曝して、第1のプレミックス溶液を製造する。この方法では、界面活性剤が炭素粒子を被覆して、炭素粒子の凝集または再凝集を減速または防止する。第2のプレミックス溶液(ポリマープレミックス)は、ASA(例えば、HEC)を任意の増粘剤(例えば、グリセロール)と組み合わせ、混合することによって調製される。グリセロールはまた、ASA(例えば、HEC)を湿潤させることができる。得られた混合物(またはASA単独)を水溶液(例えば水)と組み合わせる。好ましくは、ASA(例えば、HEC)は、ポリマーを剪断し、それによってポリマーの有益な特性を低下させるかまたは他の方法で排除し得るので、解凝集処置にさらされない。言い換えれば、炭素粒子は、ASAと混合される前に解凝集される。防腐剤を第1のプレミックス溶液、第2のプレミックス溶液、または第1および第2のプレミックス溶液の両方に添加することができる。次いで、第1および第2のプレミックス溶液を組み合わせ、混合し、かつ好適な容器または送達装置、例えばシリンジに導入する。

最終組織染色が任意のASAおよび/または増粘剤を欠いている場合、第2のプレミックス溶液は、ASAおよび/または増粘剤を欠いている可能性がある。ASAなしで組織染色を作製するためのプロトコルの例は、実施例2に記載されている。簡単に説明すると、第1のプレミックスは、界面活性剤(例えば、Tween(登録商標)80)、消泡剤(例えば、シメチコン)、および増粘剤(例えば、グリセロール)を水中で組み合わせ、次いで得られた混合物を混合しながら炭素粒子に添加して、第1のプレミックスを製造する。防腐剤を第1のプレミックスに添加することができる。第2のプレミックスは、界面活性剤(例えば、Tween(登録商標)80)を撹拌しながら水に添加し、次いで増粘剤(例えばグリセロール)を添加して第2のプレミックスを製造する。防腐剤を第2のプレミックスに添加することができる。その後、所望の粒子サイズを有する炭素粒子を含有する組織染色が得られるまで、適切な速度で適切な時間、例えば20時間超混合(均質化)しながら、第1のプレミックスと第2のプレミックスとを組み合わせる。

第2の手法では、解凝集炭素粒子を賦形剤、例えば任意のASA、粘膜付着剤、界面活性剤などと混合し、次いで炭素粒子を0.2μmフィルター(またはより小さい孔サイズを有するフィルター)で濾過して、平均粒径が0.3μm未満または0.2μm未満になるように分類される。

好適な容器に導入された場合、前述の手法およびプロトコルによって作られた、得られた組織染色組成物は、次いで、適宜、オートクレーブ処理、電離放射線への曝露または滅菌濾過を含む当技術分野で既知の滅菌技術を使用して貯蔵寿命を最大にするために滅菌することができる。同様に、いったん組織染色組成物が送達装置に含まれると、送達装置は、最終滅菌の分野で既知の1つ以上の処置を使用して、例えばオートクレーブ処理または電離放射線への曝露により最終的に滅菌され得る。

滅菌プロセスは、好ましくは10⁻³以上の滅菌保証レベル(SAL)を達成し;すなわち、プロセス後に製品の任意の所与の単位が滅菌されていない確率は、10³分の1以下である。より好ましくは、滅菌プロセスは、10⁻⁴以上、10⁻⁵以上、10⁻⁶以上、または10⁻⁷以上のSALを達成する。

染色組成物は、既知の内視鏡技術および/または腹腔鏡技術を使用した内視鏡的および/または腹腔鏡的マーキング用の液体外科用マーカーの形態で使用することができる。例えば、液体組織マーキング溶液をシリンジに吸い込み、針、例えば25ゲージ針を通じて目的の組織に注入することができる。特定の実施形態では、組成物は、約32N以下、例えば約22N〜約32N、または約22N以下、または約10N以下、または約7N以下、または約5N以下の力を加えることによって長さ240cmの25ゲージ針を通過して、組成物を針を通じて押すことができる。目的の組織に組織染色を導入するための適切な針および/または注入システムの選択は、使用者にとって明らかである。

特定の実施形態では、組織染色液は、米国特許第9,024,087号に記載されているように、乳化剤を含まず、かつ/または乳化剤中にカプセル化された炭素粒子も含有せず、かつ/またはミセルを含有する乳化剤中にカプセル化された炭素粒子も含有しない。

胃腸組織をマーキングするのに好適な例示的な水性組織染色組成物は、 (i)0.3μm未満または0.2μm未満の平均粒径を有する約0.025%〜約2.0%(w/v)の炭素粒子(例えば、本明細書に開示されている粒子サイズ25の範囲のうちの1つ);ならびに (ii)任意に、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、デキストラン、およびグアーガムから選択される約0.025%〜5.0%(w/v)未満のASA、またはそれらの組み合わせ(例えば、HEC2KもしくはHEC5K、またはそれらの組み合わせ); (iii)任意に、約5.0%〜約25%(w/v)の増粘剤(例えば、グリセロール); (iv)任意に、約0.1%〜約2.0%w/vの界面活性剤(例えば、Tween(登録商標)80);ならびに (v)任意に、約0.005%〜約1.0%(w/v)の消泡剤(例えば、シメチコン) を含む。

胃腸組織をマーキングするのに好適な例示的な水性組織染色組成物は、 (i)0.3μm未満または0.2μm未満の平均粒径を有する約0.025%〜約2.0%(w/v)の炭素粒子(例えば、本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つ);ならびに (ii)任意に、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、デキストラン、およびグアーガムから選択される約0.025%〜5.0%(w/v)未満のASA、またはそれらの組み合わせ(例えば、HEC2KもしくはHEC5Kまたはそれらの組み合わせ); (iii)約5.0%〜約25%(w/v)の増粘剤(例えば、グリセロール); (iv)約0.1%〜約2.0%(w/v)の界面活性剤(例えば、Tween(登録商標)80);ならびに (v)約0.005%〜約1.0%(w/v)の消泡剤(例えば、シメチコン) を含む。

胃腸組織をマーキングするのに好適な別の例示的な水性組織染色組成物は、 (i)0.3μm未満または0.2μm未満の平均粒径を有する0.025%〜0.5%(w/v)の炭素粒子(例えば、本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つ); (ii)任意に、0.1%〜0.5%(w/v)のHEC、例えばHEC2KもしくはHEC5Kまたはそれらの組み合わせ; (iii)任意に、約15%のグリセロール; (iv)任意に、約1%のTween(登録商標)80; (v)任意に、約0.01%のシメチコン;および (vi)任意に、約1%のベンジルアルコール を含む。

胃腸組織をマーキングするのに好適な別の例示的な水性組織染色組成物は、 (i)0.3μm未満または0.2μm未満の平均粒径を有する0.025%〜0.5%(w/v)の炭素粒子(例えば、本明細書に開示される粒子サイズ範囲のうちの1つ); (ii)任意に0.1%〜0.5%(wiv)のHEC:例えば、HEC2KもしくはHEC5K(またはそれらの組み合わせ); (iii)約15%のグリセロール; (iv)約1%のTween(登録商標)80; (v)約0.01%のシメチコン;および (vi)約1%のベンジルアルコール を含む。

明細書全体を通して、機器、装置、およびシステムが特定の構成要素を有する、含む、または備えるとして記載されている場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む、備えるとして記載されている場合、さらに、列挙された構成要素から本質的になるか、またはそれらからなる本発明の機器、装置、およびシステムが存在し、列挙された処理工程から本質的になるか、またはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが想到される。

本明細書において、要素または構成要素が列挙された要素または構成要素のリストに含まれるおよび/またはそれらから選択されると言われる場合、その要素または構成要素は、列挙された要素または構成要素のいずれかであり得るか、または元素もしくは構成要素は、列挙された元素または構成要素のうちの2つ以上からなる群から選択することができる。

さらに、本明細書に記載される組成物または方法の要素および/または特徴は、本明細書での明示的または暗示的を問わず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の方法で組み合わせることができる。例えば、特定の染色液に言及する場合、その染色液は、文脈から他に理解されない限り、本発明の組成物の様々な実施形態において、および/または本発明の方法において使用することができる。言い換えれば、本出願の範囲内で、明確で簡潔なアプリケーションを書いて描くことができるように実施形態を説明し描いてきたが、実施形態は、本教示および本発明から逸脱することなく、様々に組み合わされてもよく、または分離されてもよいことが意図され、理解されるであろう。例えば、本明細書に記載および描写した全ての特徴は、本明細書に記載および描写した本発明の全ての態様に適用可能であり得ることが理解されよう。

「少なくとも1つの」という表現は、文脈および使用法から他に理解されない限り、表現の後に列挙されたオブジェクトのそれぞれおよび引用されたオブジェクトのうちの2つ以上の様々な組み合わせを個々に含む。3つ以上の列挙されたオブジェクトに関連する表現「および/または」は、文脈から他に理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。

文法的にその等価なものを含む「include(含む)」、「includes(含む)」、「including(含む)」、「have(有する)」、「has(有する)」、「having(有する)」、「contain(含有する)」、「contains(含有する)」、または「containing(含有する)」という用語の使用は、一般に、特に明記または文脈から理解されない限り、オープンエンド、および非限定的、例えば、追加の記載がされていない要素または工程を除外しないと理解されるべきである。

用語「約」の使用が定量的値の前にある場合、本発明はまた、他に具体的に述べられていない限り、具体的な定量的値自体も含む。本明細書で使用される場合、用語「約」は、他に指示または推論がない限り、公称値からの±10%の変動を指す。

分子量が提供され、例えばポリマーの絶対値ではない場合、そのとき分子量は、他に述べられない限り、または文脈から理解されない限り、平均分子量であると理解されるべきである。

本発明が実施可能なままである限り、工程の順序または特定の動作を実行する順序は、重要ではないことを理解するべきである。さらに、2つ以上の工程またはアクションが同時に行われてもよい。

本明細書の様々な箇所で、染色液、成分、またはそれらの特徴は、群または範囲で開示されている。その説明は、そのような群のメンバーおよび範囲のそれぞれのおよびあらゆる個々のサブコンビネーションを含むことを特に意図している。他の例として、1〜20の範囲の整数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、および20を個別に開示することを特に意図している。

例えば「など」または「含む」などの本明細書におけるありとあらゆる例、または例示的な言葉の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特許請求の範囲を除いて本発明の範囲を制限しない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求されていない要素を本発明の実施に必須として示すものと解釈されるべきではない。

一般事項として、百分率を特定する組成物は、他に特定されない限り重量基準である。 本発明の実施は、例示の目的でのみ本明細書に提示されている先の例からより完全に理解され、決して本発明を限定すると解釈されるべきではない。

実施例1−組織染色の暗さに対する炭素粒子サイズの影響。 この実施例は、炭素粒子サイズが組織染色組成物の暗さに大きな影響を与えることを示している。

解凝集せず、したがって約6.6μmの平均粒径を有する炭素粒子を含有するか、または0.2μm未満の平均直径を有する炭素粒子を製造するために超音波処理によって解凝集した、0.025%〜1.0%(w/v)の炭素粒子(Cabot Corp.,BillericaからのMonarch 4750)の範囲の異なる濃度の炭素粒子を含有する様々な試験溶液を調製した。各試験溶液の残りは、15%(w/v)グリセロール、1%(w/v)Tween(登録商標)80、1%(w/v)ベンジルアルコール、0.01%(w/v)シメチコン、および注射用滅菌水(SWFI)を含んでいた。

試験溶液を以下のように調製した。 次の成分を80〜100℃でSWFIに一度に1つずつ添加し、以下の成分を添加する前に15分間混合することによって、第1の(2×)プレミックスを調製し、プレミックス中および添加順序で、以下の各成分の最終濃度を得た−15%(w/v)のグリセロール、次いで2%(w/v)のTween(登録商標)80、次いで2%のベンジルアルコール、次いで0.02%(w/v)のシメチコン、次いで第1のプレミックスが等量の第2のプレミックスと混合されたときに、最終製品において望まれる炭素粒子の必要濃度の2倍。溶液を混合し、室温に冷却した。超音波処理していない試料については、得られた溶液の一部を保存して第2のプレミックスと混合した。超音波処理試料については、得られた溶液の一部を、混合前に、固体の直径1/2インチのチタン製チップを備えた350W Biologics Model 3000超音波ホモジナイザー(BioLogics、Inc.,Manassas VA)を使用して、60%の電力で3分間超音波処理して、第2のプレミックスと混合した。

80〜100℃でグリセロールをSWFIに添加することによって第2のプレミックスを調製し、最終濃度15%(w/v)のグリセロールを得た。

次いで、第1および第2のプレミックスは、等量の各プレミックスを混合することによって合わせて、各成分の最終濃度、すなわち特定量の炭素粒子、15%(w/v)のグリセロール、1%(w/v)のTween(登録商標)80、1%(w/v)のベンジルアルコール、0.01%(w/v)のシメチコンを得た。

各最終溶液中の炭素粒子のサイズは、LLSPSAまたはDLSを使用して、さらなる希釈または超音波処理もしくは均質化することなく決定した。

得られた溶液の暗さを、xRite 504ポータブル太陽光反射分光濃度計を使用して濃度測定によって測定した。

色深度および結果として生じる吸収された光%に対する炭素濃度ならびに解凝集の影響を以下の表1にまとめ、図2に絵で示す。

表1および図2から分かるように、試料中のより多量の炭素粒子は、より暗いマーキング溶液をもたらし得る。しかしながら、0.2μm未満の平均粒径を有する組織染色組成物は、約6.6μmの平均粒径を含有する組織染色組成物よりもはるかに暗かった。この実験は、0.1%(w/v)の濃度で炭素粒子を含有し、かつ0.2μm未満の平均粒径を有する組織染色組成物が、約6.6μmの平均粒径を有する炭素粒子を一桁大きい1.0%(w/v)の濃度で含有する組織染色組成物とほぼ同程度に暗色であることを実証している。

0.025%(w/v)のみの解凝集炭素粒子を含有する溶液は、解凝集されなかった炭素を10倍以上の重量(0.25%(w/v)で含有する溶液と同等の暗さを有する。

実施例2−粒子沈殿(沈降)に対する炭素粒子サイズの影響 この実施例は、炭素粒子のサイズが炭素粒子の沈降に大きな影響を及ぼし得ることを実証する。

この実施例では、解凝集せず、したがって約6.6μmの平均粒径を有する炭素粒子を含有するか、または0.2μm未満の平均直径を有する炭素粒子を製造するために均質化によって解凝集された、同じ(1%(w/v)のTween(登録商標)80、15%(w/v)のグリセロール、1%(w/v)のベンジルアルコール、および0.01%(w/v)のシメチコンを含有する)および0.27%(w/v)の炭素粒子(Cabot Corp.,Billerica、MAからのMonarch 4750)を含有する、2つの組織染色を調製した。得られた粒子を粒子サイズおよび安定性について分析した。

解凝集炭素粒子を含有する組織染色は、表2Aに記載の成分および表2Bに記載のTween(登録商標)80プレミックスを含有する炭素粒子プレミックスから調製した。

炭素粒子プレミックスを製造するために、Tween(登録商標)80、シメチコン、およびグリセリンを80℃でSWFIに添加した。成分が溶解したら、得られた混合物を室温に冷却して、Tween(登録商標)80、シメチコン、グリセリン(TSG)混合物を製造した。得られたTSG混合物の3分の1を全炭素(Cabot)と合わせ、全全炭素が湿潤するまでゆっくり撹拌することによって炭素を湿潤させた。炭素含有混合物をミキサー(Silverson Model L5M−A)中で4,000rpmで10分間、全ての炭素が大きな塊なしで溶液中に分散するまで均質化した。次いで、ミキサー(Silverson Model L5M−A)を5〜10分間1,000rpmで運転しながら、得られた混合物をTSG混合物の別の3分の1に添加した。残りの1/3のTSG混合物を、さらに45分間、5,600rpmで均質化混合物に添加した。次いで、ベンジルアルコールを最後の1分間の均質化のために添加した。

炭素粒子プレミックスをそのまま使用することもできるし、さらなる処理まで貯蔵することもできる。後者の場合、さらなる処理の前に、炭素粒子プレミックスを再び3,800rpm(Silverson Model L5M−A)で10分間均質化するべきである。この実施例では、炭素粒子含有プレミックスを、例えば、表2Bに記載の成分を含有して調製されたTween(登録商標)80プレミックスと合わせることによって、さらなる試薬を添加する前に(Silverson Model L5M−A)において3,800rpmで10分間均質化した。

Tween(登録商標)80プレミックスを以下のように調製した。10Lの水を80℃〜100℃の範囲の温度に予熱した。別個の容器に、Tween(登録商標)80を80℃〜100℃で約500mLのSWFIに添加し、15分間撹拌しながら混合した。次いで、ベンジルアルコールおよびグリセリンを添加して混合物を得て、次いで、それを450rpmで混合しながら10Lの水に添加する。次いで、残りの水を添加してTween(登録商標)80プレミックスを形成した。

その後、次いで、炭素粒子プレミックスをTween(登録商標)80プレミックス(ServoDyne Model SSM54)に700rpmで15分間、次いで450rpmで27時間混合しながら添加する。

解凝集していない炭素粒子を含有する同様の組織染色を、表2Cに記載の成分を用いて以下のようにして製造した。

Tween(登録商標)80プレミックスを以下のように調製した:Tween(登録商標)80を80℃〜100℃で約750mLのSWFIに添加し、15分間撹拌しながら混合した。シメチコンプレミックスを以下のように調製した:シメチコンを245mLのSWFIに添加し、15分間混合した。

グリセリンを、450rpmで作動するServoDyneミキサー中で80℃〜100℃で10LのSWFIに添加し、10分間混合し、次いで残りのSWFIを添加した。その後、Tween80(登録商標)プレミックスを添加して10分間混合し、次いでベンジルアルコールを添加して5分間混合し、次いでシメチコンプレミックスを添加して5分間混合した。最後に炭素を添加し、得られた混合物を約20時間混合した。

調製したら、各組織染色中の炭素粒子の粒子サイズを動的光散乱分析器で測定した。解凝集炭素粒子を含有する組織染色中の炭素粒子は、0.2μm(0.17μm)未満の平均粒径を有していたが、解凝集していない組織染色中に存在する炭素粒子は、約6.6μmの平均粒径を有していた。

さらに、各組織染色をLUMiSizer 650(LUM BmbH,Berlin,Germany)で分析して、室温での安定性(沈殿)を決定した。沈殿速度は、中央沈殿速度(μm/s)またはD90沈殿速度(μm/s;全粒子の90%は、沈殿速度がD90値未満であるのに対して、粒子の10%は、D90値より高い沈殿速度を有する)として表すことがでる。

解凝集しなかった粒子を含有する組織染色は、約8μm/sの沈殿速度中央値および約171μm/sのD90沈殿速度を有したのに対して、解凝集しなかった粒子を含有する組織染色は、2.7μm/sの沈殿速度中央値および約4.9μm/sのD90沈殿速度を有することが分かった。

組織染色中の解凝集粒子のサイズを考慮すると、例えば有効量の界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤の存在によって炭素粒子が再凝集するのを防止すれば、沈殿は、ブラウン逆拡散のために減少するかさらには排除されると考えられる。

実施例3−望ましい沈降防止性および粘膜付着性を有する炭素粒子ベースの組織染色 この実施例は、市販の組織維持溶液よりも沈降に対してより耐性のある炭素粒子ベースの組織染色組成物を作ることが可能であることを実証する。炭素粒子のサイズは、粒子の沈降に大きな影響を与える。例えば、0.3μm未満(例えば0.2μm未満)の平均粒径を有する炭素粒子は、特に薬剤、例えば、炭素粒子の再凝集を防止する非イオン性界面活性剤のような界面活性剤の存在下で経時的にはるかに少ない沈降を示す。

しかしながら、ある状況下では、(例えば、界面活性剤の存在下で)炭素粒子を沈降防止剤と組み合わせることが望ましくなり得る。この実施例はまた、粒子サイズおよび/または沈降剤を使用して、適切な沈降防止特性を有する組織染色組成物を作ることができることを実証する。

さらに、例示的な組織染色組成物が粘膜付着性を有する場合、炭素粒子は、以前にマーキングされた目的の組織領域から拡散しないので、粘膜付着性のない染色液を使用する場合よりも、使用者は、これらの領域をより明瞭に、かつより長期間視覚化すること可能になることが想到される。

この実施例では、様々な組織染色組成物を作り、遠心分離によって分析して、約7ヶ月間静置した状態を模倣した。各組成物は、水中に15%のグリセロール、1%のTween(登録商標)80、1%のベンジルアルコール、および0.01%のシメチコンを含有していた。しかしながら、各特定の組織染色組成物は、粒子サイズを減少させるために、実施例1に記載したように超音波処理によって解凝集したか、またはしなかったかのいずれかである、0.50%(w/v)(表3)または0.25%(w/v)(表4)の炭素粒子(Cabot Corp.,BillericaからのMonarch 4750)のいずれかを異なるタイプおよび量のポリマー(例えば、Spectrum ChemicalまたはAshlandからのHEC300、HEC2K、およびHEC5Kを含むHEC;グアーガム(Spectrum Chemical,Ashlandから)、ならびにヒドロキシプロピルセルロース(Spectrum Chemical,Ashland,またはFisherからのHPC 4956)とともに含有した。ポリマーを欠いた溶液は、表3および4において「ポリマーなし−対照」と呼ばれる。

最終組織染色組成物溶液の暗さを実施例1に記載したように測定し、結果を%吸光度として表した。

様々な組織染色組成物の各々における炭素粒子の沈降特性を遠心分離により比較した。特に、5mLの各試料をThermo Scientific Multifuge X1R遠心分離機の遠心管に入れ、60分間5,000×gで回転させた(約7ヶ月での沈降を表す)。これにより、炭素粒子の一部が沈降して、各遠心分離管の底部に沈降した固体のペレットおよびペレットの上に液体の上澄みが得られた。次いで、上澄みの1/3からのアリコートを取り出し、UV/可視分光法により分析して炭素濃度を決定し、これを次に遠心分離前の試料中の炭素濃度と比較した。沈降が少ない試料は、遠心分離後の液体の上から3分の1に多くの炭素が残っているため、損失率が低くなる。

組織染色組成物の粘膜付着性もまたアッセイした。簡単に説明すると、2%のブタムチンおよび2%の寒天を含む寒天プレートを、20gの粒状寒天および20gのブタムチンを1000mLの蒸留水に20分間煮沸することで溶解することによって調製した。溶融ムチン−寒天混合物を、長さ約13インチ、幅10インチ、および深さ2インチの寸法のプラスチック容器に注いだ。ムチン−寒天混合物を室温で固化させた。次いで、各試料の75μLを試験プレートの表面にスポットとして塗布し、次いでプレートを水平に対して30度の角度で傾斜させ、プレートを下って移動した距離を1分後に測定した。より短い距離を走行した試料は、より長い距離を走行した試料よりも粘膜付着性が高い。

結果を表3および4に要約する。

結果は図3の棒グラフとしてもまとめられている。結果は、(例えば、試料7、10、および11からの結果を比較することによって)、長期間にわたる粒子の沈降を防止するために、炭素粒子のサイズを減少させる(試料10および11を比較)および沈降防止特性を実証する適量のポリマーを含む(試料7および10を比較)ことが必要であることを実証する。特に、粒子が超音波処理によって解凝集され、0.2%のHEC5K(試料10)を含有する溶液中に存在する場合、20%未満の粒子が試験条件下で沈降した。しかしながら、試料中に0.05%のHEC5K(試料7)しか存在しない場合、試験条件下で粒子の80%以上が沈降し、粒子が解凝集しないが0.20%のHEC5K(試料10)を含有する溶液中に、試験した条件下で、沈降した粒子の約90%が存在する。HEC5Kの代わりにHEC2Kを使用した場合にも同様の傾向が観察された。

粘膜付着に関しては、粒子の沈降を防止することに加えて、HEC2KおよびHEC5Kも粘膜付着性であることが見出された。染色液がポリマーを欠いていた場合、溶液は、ムチン/寒天プレートに沿って1分で約20cm移動したが、0.20%のHEC5Kを含有する染色液は、1分で約8.8cm移動した。

溶液(試料番号1〜16)の全ては、240cmの長さを有する25ゲージ針(Interject,Boston Scientific,MA)を通過させるために23N未満の印加圧力を必要とした。結果として、これらの試験溶液は、胃腸組織のマーキングを促進するためにそのような注射針によって送達することができると考えられる。

表4からの結果も図4の棒グラフとしてまとめられている。 炭素粒子濃度を0.5%〜0.25%(w/v)に低下させた場合にも同様の結果が得られた。例えば、試料19および20(両方とも0.2%のHEC2Kを含有する)からの結果を比較することによって、炭素粒子が超音波処理によって解凝集されたとき、試験条件下で、粒子の約11%のみが沈降した(試料19)が、炭素粒子は解凝集せず、試験条件下で、粒子の約90%が沈降した(試料20)。HEC2KをHEC5Kで置き換えた場合にも同様の結果が観察された(試料23および24参照)。

表3および4に記載の各溶液の暗さを実施例1に記載のように試験した。結果を図5および6に要約する。結果は、沈降防止剤(例えば、HEC2KまたはHEC5K)の存在下での粒子サイズの影響が、炭素粒子の暗さに大きな影響を及ぼし得ることを実証している。HEC2K(図5)またはHEC5K(図6)の存在下で超音波処理された(S)または超音波処理されていない(NS)0.25%または0.5%(w/v)の炭素粒子を含有する溶液の暗さを表す図5および6を参照のこと。結果は、炭素粒子の超音波処理(解凝集)が染色液の暗さ(%吸光度として表される)に大きな影響を与えることを実証している。ASAの存在下でさえ、0.2μm(0.18μm)未満の平均粒径を有する炭素粒子を含有する溶液は、炭素粒子が超音波処理によって解凝集されず、約6.6μmの平均粒径を有する同等の溶液よりもはるかに暗かった。

粘膜付着に関しては、粒子の沈降を防止することに加えて、HEC2KおよびHEC5Kも粘膜付着性であることが見出された。染色液がポリマーを欠いた場合(試料25および26参照)、溶液は、1分間で約20cmでムチン/寒天プレート上を移動したが、0.20%のHEC5Kを含有する染色液は、1分で約8cmだけ移動した。

結果を図7にも示すが、これは、粘膜付着性(例えば、HEC2KまたはHEC5K)を有するASAの濃度が増加するにつれて(例えば、0.075%〜0.2%(w/v))、1分間に移動した距離によって表されるように、組織染色液の粘膜付着性が増大したことを実証する。HECの濃度が高いほど、寒天/ムチンプレート上を移動する距離は短くなる。これらの結果を視覚的に図8に示すが、図8は、HEC5Kが粘膜付着性を有し、炭素粒子凝集体のサイズが超音波処理によって減少したときに組織染色組成物が視覚的にはるかに暗く見えることを示す。グアーガムを含有する染色液も粘膜付着性であった。

暗さおよび粘膜付着性は、図8Aおよび8Bに視覚的に示されており、ここで、染色は、解凝集していない0.25%(w/v)の炭素粒子の存在下で異なる濃度のHEC5Kを含有する。図8Aおよび図8Bのそれぞれにおいて、試料1、2、3、4、5、および6は、それぞれの染色液26(HECなし、非解凝集炭素粒子)、25(HECなし、解凝集炭素粒子)、22(0.1%のHEC5K、非解凝集炭素粒子)、21(0.1%のHEC5K、解凝集炭素粒子)、24(0.2%のHEC5K、非解凝集炭素粒子)、および23(0.2%のHEC5K、解凝集炭素粒子)に対応する。解凝集炭素粒子を含有する染色液(2、4、6行目)は、非解凝集炭素粒子を含有する染色液よりはるかに暗かった。さらに、HECの濃度が増加するにつれて、試料は、小さいスポットほどより粘膜付着性であったプレートを傾斜させる前(図8A)および最短距離を移動した試料が最も粘膜付着性であったプレートを傾斜させた後(図8B)の各スポットのサイズによって実証されるようにより粘膜付着性であった。

この実施例に記載されている例示的な染色は、匹敵する界面活性剤を含有する市販の炭素粒子ベースの組織染色よりもはるかに粘膜付着性である。結果として、本発明の組織染色は、以前にマークした目的の組織領域から拡散または滲み出さず、それによって使用者が先行技術の染色を使用するときよりも明確かつ長期間にわたってそれらの領域を視覚化することを可能にする。

溶液(試料番号17〜26)の全ては、240cmの長さを有する25ゲージ針(Injector,Boston Scientific,MA)を通して溶液を加圧するために23N未満の印加圧力を必要とした。結果として、この実施例における組織染色のそれぞれは、市販の針および/または注射システムを使用して目的の組織に導入することができる。

参照による組み込み 本明細書で言及した特許および科学文献のそれぞれの開示全体は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。

等価物 本発明は、その趣旨またはその主要な特徴から逸脱することなく、他の特定の形で実施され得る。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点で本明細書に記載の発明を限定するのではなく例示と見なすべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等の意味および範囲内にある全ての変更は、その中に包含されることが意図される。