包含高浓度伊枯草菌素脂肽的组合物
阅读：972发布：2020-05-11
专利汇可以提供包含高浓度伊枯草菌素脂肽的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有高浓度伊枯草菌素脂肽的组合物。特别地，根据本发明的组合物具有浓度为20至150g/l的伊枯草菌素脂肽；由于存在 表面活性剂 ，它们稳定且均匀。，下面是包含高浓度伊枯草菌素脂肽的组合物专利的具体信息内容。
1.稳定且均匀的组合物，其特征在于其包含浓度高于20g/L的伊枯草菌素脂肽以及选自阴离子表面活性剂家族、非离子表面活性剂家族或油家族的一种或更多种表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度为20至150g/L。
3.根据权利要求1或2之一所述的组合物，其特征在于，阴离子表面活性剂家族的所述表面活性剂选自：表面活性素家族的分子、丰杆菌素家族的分子或氨基酸衍生物。
4.根据权利要求1或2之一所述的组合物，其特征在于，非离子表面活性剂家族的所述表面活性剂选自脂肪醇氧烷基化物、戊二醇及其衍生物、烷基多糖苷类型的助水溶性分子(烷基多糖苷和烷基乙氧基多糖苷)、多糖苷结构改进剂类型的分子(黄原胶、阿拉伯胶、西黄蓍胶、瓜尔胶、槐豆胶、罗望子胶、果胶、结冷胶、角菜酸类、琼脂、藻酸类)。
5.根据权利要求1或2之一所述的组合物，其特征在于，油家族的所述表面活性剂选自：
油以及改性(酸化、甲基化、酯化)油的提取物，特别是来自：杏仁、落花生、摩洛哥坚果、鳄梨、油菜籽、罗伦佐、印楝、榛子、腰果、澳洲坚果、橄榄、开心果、稻米、油葵、亚麻荠、亚麻、琉璃苣、红花、大麻、棉花、小麦胚芽、玉米、坚果、油罂粟、月见草、大麦、南瓜籽、葡萄籽、豌豆、芝麻、大豆、向日葵。
6.根据前述权利要求之一所述的组合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度为20至50g/L，并且所述表面活性剂是表面活性素，所述组合物中表面活性素的浓度为1至40g/L。
7.根据前述权利要求之一所述的组合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度为20至50g/L，并且所述表面活性剂是丰杆菌素，所述组合物中丰杆菌素的浓度为1至100g/L。
8.根据前述权利要求之一所述的组合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度为20至100g/L，并且所述表面活性剂是表面活性素和丰杆菌素，表面活性素的浓度为1至40g/L，并且丰杆菌素的浓度为1至100g/L。
9.根据前述权利要求之一所述的组合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度为20至100g/L，并且所述表面活性剂是植物油提取物、多糖苷衍生物和表面活性素。
10.根据前述权利要求之一所述的组合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度为20至100g/L，并且所述表面活性剂是甲基化植物籽油的提取物和椰子油聚甘油酯。
11.用于制备如前述权利要求之一中限定的组合物的方法，其包括制备具有高含量的伊枯草菌素脂肽的溶液以及添加表面活性剂的步骤。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其还包括脱水步骤。
13.根据权利要求1至10之一所述的组合物在农业食品、植物检疫或化妆品应用中的用途。
14.根据权利要求1至10之一所述的组合物，其用于医学或药学领域。
包含高浓度伊枯草菌素脂肽的组合物
[0001] 本发明涉及具有高浓度伊枯草菌素脂肽(lipopeptides ituriniques)的组合物。特别地，根据本发明的组合物具有浓度为5至200g/L的伊枯草菌素脂肽，并且由于表面活性剂和/或助水溶性分子(molécules hydrotropes)的存在而稳定且均匀。
[0002] 伊枯草菌素脂肽是由不同的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株并且更特别地是由以下的菌株产生的分子：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)、热阴沟芽孢杆菌(Bacillus thermocloacae)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velenzensis)、死谷芽孢杆菌(Bacillus valissmortis)。非穷举性实例包括枯草芽孢杆菌菌株ATCC6633、W23、ATCC19659、DSM23117、QST713或AQ713、FMBJ、3-10、RB14、BH072及其衍生物，解淀粉芽孢杆菌菌株FZB42、KB3、SYBC H47、GA1及其衍生物。
[0003] 该分子家族包含伊枯草菌素(iturine)A、AL和C，摩加夫素(mojavensine)，抗霉枯草菌素(mycosubtilline)以及杆菌霉素(bacillomycine)A、B、C、C、D、F、L和Lc。这些组分主要因其抗真菌特性而被知晓，但它们也具有抗细菌特性。这些特性来自其两亲性性质，这使得它们与不同的膜组分相互作用。
[0004] 可通过上述不同菌株在发酵液中的溶液中产生伊枯草菌素分子，然后可根据技术人员已知的方法对其进行回收以从培养物上清液提取、浓缩和纯化它们。尽管如此，它们在溶液中的行为取决于它们的浓度。事实上，已知高于临界胶束浓度(10至20mg/L)时，伊枯草菌素化合物会像其他脂肽分子一样形成或多或少的复杂胶束。另外，这些胶束的大小将随着其浓度提高演变为形成越来越复杂的结构，从浓度低于500mg/L的10nm的平均尺寸(Jauregi et al.，2013)，到高于1g/L的具有150nm的平均直径的泡状结构(Grau et al.，2001)，以及然后到浓度为10g/L时的层状双层超结构(Hamley et al.，2013)。正如这些对抗霉枯草菌素(Hamley et al.，2013)或伊枯草菌素A(Grau et al.，2001)的研究所公开的，这些超结构在例如表面活性素家族的其他脂肽分子中未发现。另外，伊枯草菌素化合物浓度的提高往往会提高其与培养基中包含的蛋白质的相互作用，并因此提高结构的大小，导致其不溶性(Jauregi et al.，2013)。
[0005] 因此，伊枯草菌素化合物的这些物理化学特性引起溶解性问题，导致不稳定的组合物，该组合物在组合物中伊枯草菌素脂肽的浓度提高时倾向于沉淀或凝胶化。
[0006] 接近本发明的现有技术。
[0007] 现有技术涉及很少的具有浓度高于5g/L的伊枯草菌素脂肽的组合物，以及甚至更少的具有浓度高于20g/L的伊枯草菌素脂肽的组合物，这主要是因为技术人员已知伊枯草菌素脂肽倾向于形成高浓度胶束，使得该组合物不稳定，因为伊枯草菌素胶束妨碍了其良好溶解性。
[0008] 然而，在现有技术中，已知专利JP2003128512(SHOWA DENKO)包含含有表面活性剂的化妆品组合物，向其添加伊枯草菌素和表面活性素用于其抗微生物特性，但是未提及这些组合物中伊枯草菌素的稳定性和均匀性，因为它们不是多种组合物的主要化合物。
[0009] 还已知的是美国专利2016/183537，其描述了来自解淀粉芽孢杆菌的组合物，该组合物包含伊枯草菌素、表面活性素和丰杆菌素(fengycine)以改善植物生长或保护植物。该文献没有提及该组合物中包含的分子的浓度。没有提及高的伊枯草菌素浓度。
[0010] 还已知Choukri HBID等的出版物，其描述了脂肽提取物对发酵过程中氧转移的影响。这些提取物对应于浓度高至4g/L的伊枯草菌素/表面活性素混合物。该文件中没有描述更高的伊枯草菌素浓度的可能性。
[0011] 因此，现有技术文献都没有鼓励技术人员制备具有高浓度的伊枯草菌素脂肽的组合物，因为该技术人员知晓其将不是稳定和均匀的并因此有很少的应用。
[0012] 本发明解决的问题
[0013] 本发明人已表明，可通过添加具有表面活性剂特性的分子来制备其中伊枯草菌素脂肽的浓度高于5g/L的稳定且均匀的组合物。事实上，本发明人已表明，表面活性剂改善了伊枯草菌素脂肽的溶解度使其超过5g/L，特别是在10g/L和20g/L以及高至50、100或甚至200g/L而无沉淀或凝胶出现。
[0015] 发明详述
[0016] 本发明的一般概念涉及稳定且均匀的液体组合物，其包含脂肽的混合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度高于5g/L。
[0017] 在这样的组合物中，脂肽与具有表面活性剂特性的分子组合，由此浓缩的伊枯草菌素脂肽组合物保持稳定和均匀。
[0018] 本发明的第一个目的涉及稳定且均匀的组合物，其包含浓度高于20g/L的伊枯草菌素脂肽以及选自阴离子表面活性剂家族、非离子表面活性剂家族或油家族的一种或更多种表面活性剂。
[0021] 术语均匀应理解为在搅拌后用肉眼不能区分其中的不同组分的混合物。均匀性可通过混合物中任意点的浓度的均匀性以及没有眼睛可见的结构或微结构(结块或沉淀)来评估。
[0022] 混合物的这种均匀性是有利的，因为这允许均一浓度的伊枯草菌素脂肽，然后可将其在水溶液中进行稀释。
[0023] 术语稳定应理解为组合物随时间保持均匀的事实。因此，稳定且均匀的混合物是具有随时间保持恒定的均一浓度的混合物。
[0024] 根据一个优选实施方案，根据本发明的组合物包含20至200g/L的伊枯草菌素脂肽。它可包含例如20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或200g/L的伊枯草菌素脂肽。优选地，组合物中伊枯草菌素脂肽的浓度为20至150g/L，或20至100g/L。甚至更优选地，组合物中伊枯草菌素脂肽的浓度高于50g/L，即50至150g/L，或50至100g/L或50至80g/L。
[0025] “伊枯草菌素家族的分子”意指伊枯草菌素A，摩加夫素，抗霉枯草菌素和杆菌霉素A、B、C、D、F和L。
[0026] 本发明的组合物包含具有表面活性剂特性的分子。
[0027] “具有表面活性剂特性的分子”，也称为“表面活性剂(agents tensioactif)”或简称为“表面活性剂(tensioactif)”，包括两亲性分子、表面活性剂、脂肽，例如表面活性素、丰杆菌素(或制磷脂菌素(plipastatine))、化学表面活性剂和生物表面活性剂例如鼠李糖脂、多糖等。这些分子可单独或组合用于本发明的组合物中。
[0028] 表面活性剂包括肝素、透明质酸、葡聚糖、直链淀粉、壳聚糖、来源于氨基酸的阴离子表面活性剂、来源于多糖苷(poly-glycosides)的非离子表面活性剂、助水溶物表面活性剂(tensio-actifs hydrotropes)、脂肽例如表面活性剂异构体和/或丰杆菌素异构体(或制磷脂菌素)、鼠李糖脂和植物油。
[0029] 更具体地，本发明涉及阴离子、非离子和油表面活性剂。
[0030] 阴离子表面活性剂家族的表面活性剂选自：表面活性素、丰杆菌素或氨基酸衍生物。
[0031] “表面活性素家族的分子”意指表面活性素A、B、C，地衣素(lichenysine)和帕米拉素(pumilacidine)。
[0032] “丰杆菌素家族的分子”意指丰杆菌素A和B，制磷脂菌素A和B以及阿瓜斯他汀(agrastatine)。
[0033] 非离子表面活性剂家族的表面活性剂选自：脂肪醇氧烷基化物(fatty alcohol axalkylate)、戊二醇及其衍生物、烷基多糖苷类型的助水溶性分子(烷基多糖苷和烷基乙氧基多糖苷)、结构改进的多糖苷分子(黄原胶、阿拉伯胶、西黄蓍胶、瓜尔胶、槐豆胶、罗望子胶、果胶、结冷胶、角菜酸类(carraghénates)、琼脂、藻酸类(alginates)。)[0034] 油家族的表面活性剂选自：油以及改性(酸化、甲基化、酯化)油的提取物，特别是来自：杏仁、落花生、摩洛哥坚果(argan)、鳄梨、油菜籽、罗伦佐(lorenzo)、印楝、榛子、腰果、澳洲坚果、橄榄、开心果、稻米、油葵(toumesol oléique)、亚麻荠、亚麻、琉璃苣、红花、大麻、棉花、小麦胚芽、玉米(mais)、坚果、香石竹(oeillette)、月见草、大麦、南瓜籽、葡萄籽、豌豆、芝麻、大豆、向日葵。
[0035] 伊枯草菌素脂肽将在这些油性化合物或脂肪中微乳化以获得改性油和油提取物的表面活性剂作用。
[0037] 根据第一方面，本发明涉及组合物，其包含5至50g/L的伊枯草菌素脂肽和1至40g/L的表面活性素。
[0038] 在一种特定组合物中，伊枯草菌素脂肽是抗霉枯草菌素。在另一种特定组合物中，伊枯草菌素脂肽的量优选地为10g/L至50g/L，优选20至50g/L，并且甚至更优选30至50g/L。
[0039] 根据第二方面，本发明涉及组合物，其包含5至100g/L的伊枯草菌素脂肽、1至40g/L的表面活性素和1至100g/L的丰杆菌素(或制磷脂菌素)。
[0040] 在一种特定组合物中，伊枯草菌素脂肽的量优选地为10至80g/L，优选20至80g/L，最优选30至80g/L。
[0041] 根据第三方面，本发明涉及组合物，其包含5至100g/L的伊枯草菌素脂肽、1至40g/L的表面活性素和1至30g/L的化学表面活性剂。
[0042] 在一种特定组合物中，伊枯草菌素脂肽的量优选地为10至80g/L，优选20至80g/L，优选30至80g/L。
[0043] 在一个特别的实施方案中，化学表面活性剂可以是多糖苷家族的非离子表面活性剂或来源于氨基酸的阴离子表面活性剂。优选地，化学表面活性剂由阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的混合物组成。
[0044] 根据第四方面，本发明涉及组合物，其包含5至100g/L的伊枯草菌素脂肽、1至40g/L的表面活性素、1至100g/L的丰杆菌素(或制磷脂菌素)和1至30g/L的化学表面活性剂。
[0045] 在一种特定组合物中，伊枯草菌素脂肽的量优选地为10至80g/L，优选20至80g/L，优选30至80g/L。
[0046] 根据第五方面，本发明涉及组合物，其包含5至100g/L的在油性或脂肪化合物(例如植物油)中的微乳化的伊枯草菌素脂肽。在这样的组合物中，油浓度为1％至100％，优选50％至100％，特别优选80％至100％。可使用的植物油包括玉米油，还有改性杏仁、花生、摩洛哥坚果、鳄梨、油菜籽、罗伦佐、印楝、榛子、腰果油和提取物、澳洲坚果、橄榄、开心果、稻米、油葵、亚麻荠、亚麻、琉璃苣、红花、大麻、棉花、小麦胚芽、玉米、坚果、香石竹、月见草、大麦、南瓜籽、葡萄籽、豌豆、芝麻、大豆和向日葵。
[0047] 优选地，所使用的油来自花生、橄榄、油葵、亚麻、玉米、坚果、大豆和向日葵。这样的油的优点是可大量且低成本地获得。甚至更优选地，所使用的油来自玉米或向日葵花生。
[0048] 在一个优选实施方案中，这样的组合物包含10至80g/L、优选20至80g/L的抗霉枯草菌素，优选30至80g/L并且非常优选50至80g/L的抗霉枯草菌素。
[0049] 因此，根据本发明的特定组合物包含：
[0050] -2％至8％伊枯草菌素脂肽
[0051] -3％化学表面活性剂，其由各自为1.5％的非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂的混合物组成
[0052] -2％至4％表面活性剂
[0053] -0至10％丰杆菌素或制磷脂菌素
[0054] 在一个特别的实施方案中，组合物包含约3％脂肽(1.25％抗霉枯草菌素和1.85％表面活性素)、1.5％的来源于多糖苷的非离子表面活性剂和1.5％的来源于氨基酸的阴离子表面活性剂。
[0055] 在另一个特别的实施方案中，组合物包含约5％脂肽(2.45％抗霉枯草菌素和2.65％表面活性素)和3％至8％丰杆菌素(或制磷脂菌素)。
[0056] 在另一个特别的实施方案中，组合物包含30至80g/L的抗霉枯草菌素和30至80g/L的丰杆菌素(或制磷脂菌素)。
[0057] 在一个特别的实施方案中，组合物包含浓度为20至100g/L的伊枯草菌素脂肽，并且表面活性剂是植物油的提取物、多糖苷衍生物和表面活性素。
[0058] 在另一个特别的实施方案中，组合物包含浓度为20至100g/L的伊枯草菌素脂肽，并且表面活性剂是甲基化植物籽油的提取物和聚甘油椰子油酯(Synergen OSTM)。
[0059] 在另一个特别的实施方案中，组合物包含浓度为20至100g/L的伊枯草菌素脂肽，并且表面活性剂是烷基聚葡糖苷(SimulsolTM)、氨基酸衍生物(ProtéolTM)和表面活性素的混合物。
[0060] 在另一个特别的实施方案中，组合物包含浓度为20至100g/L的伊枯草菌素脂肽，并且表面活性剂是脂肪醇氧烷基化物(fatty alcohol oxalkylate)(EmulsogenTM)与表面活性素的混合物。
[0061] 在另一个特别的实施方案中，组合物包含浓度为20至100g/L的伊枯草菌素脂肽，并且表面活性剂是植物油、黄原胶和表面活性剂的混合物。
[0062] 根据本发明的组合物可立即使用或可以为浓缩形式；可将浓缩溶液在使用之前进行稀释。
[0063] 根据本发明的第二个目的涉及脱水组合物，其包含脂肽的混合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度高于0.5％。在一个优选实施方案中，伊枯草菌素脂肽的浓度高于2％。
[0064] 这样的脱水组合物为粉末或冻干形式，并且是“即用型”；事实上，将它们在100mL溶液中再水化足以获得其伊枯草菌素脂肽浓度为至少5g/L的组合物。在一个优选实施方案中，这样的组合物具有浓度为至少20g/L的伊枯草菌素脂肽。
[0065] 这些固体组合物中的成分及其相对量与液体组合物的上述那些相同。事实上，这些脱水溶液的各种组分的干重浓度使得可获得其伊枯草菌素脂肽浓度高于5g/L的液体组合物，根据本发明，该液体组合物是稳定且均匀的。在一个优选实施方案中，伊枯草菌素脂肽的浓度高于20g/L。
[0066] 本发明的第三个目的涉及用于制备组合物的方法，所述组合物包含脂肽的混合物，其中伊枯草菌素脂肽的浓度高于5g/L。在一个优选实施方案中，混合物中伊枯草菌素脂肽的浓度为20g/L。
[0067] 组合物的伊枯草菌素脂肽可通过芽孢杆菌属菌株的发酵获得，并从培养物上清液中收获并浓缩。
[0068] 根据本发明的组合物可使用市售粉末形式的脂肽制剂来制备。这些原料粉末包含10％至多于80％(例如，15％或75％)的可变量的伊枯草菌素脂肽。这些粉末可以以30/70至
70/30或甚至95/5(例如，35/65、40/60、45/55或50/50)的比例包含抗霉枯草菌素与表面活性素的混合物。
70/30或甚至95/5(例如，35/65、40/60、45/55或50/50)的比例包含抗霉枯草菌素与表面活性素的混合物。
[0069] 为了制备根据本发明的组合物，必须将至少一种表面活性剂添加至包含高含量伊枯草菌素脂肽的溶液。
[0070] 用于制备这样的组合物的方法可包括另外的脱水步骤以提供粉末形式的“即用型”组合物，一旦再水化其特征就与本发明的组合物一致。
[0071] 因此，该方法使得可制备液体或固体溶液(为粉末或冻干形式)。这样的浓缩溶液特别适合于储存和分配。使用之前必须将其进行稀释。
[0072] 因此，根据本发明的组合物可通过溶解粉末而获得，该粉末允许如上限定的液体组合物重构。
[0073] 根据本发明的组合物在食品、植物保护和化妆品领域以及医学和药学领域中具有应用。
[0074] 通过以下实施例举例说明本发明。实施例
[0075] A.由芽孢杆菌菌株培养物的上清液制备包含脂肽的溶液
[0076] 1-获得培养物上清液
[0077] 脂肽如下获得：对于伊枯草菌素脂肽的产生，其获自来源于枯草芽孢杆菌菌株ATCC 6633的芽孢杆菌菌株的需氧发酵过程；且对于表面活性素和/或丰杆菌素(或制磷脂菌素)的产生，其获自来源于枯草芽孢杆菌菌株168的菌株的需氧发酵过程。培养在30℃下在包含碳源(葡萄糖、蔗糖、……)、氮源(硫酸铵、蛋白胨、……)和微量元素的经搅拌培养基中进行。将pH维持在值为7。在48至72小时之后收获培养物。然后将其离心或过滤以去除细胞。然后将培养物上清液浓缩。
[0078] 2-由培养物上清液制备具有高含量脂肽的组合物
[0079] 为了获得具有高含量的伊枯草菌素脂肽的组合物，可将培养物上清液浓缩。培养物上清液的浓度可通过技术人员已知的任何方法获得，特别是：
[0080] -通过使用截止阈值为1KDa至300KDa的膜的切向超滤。例如，通过透过所述膜将如上所述获得的1000L培养物上清液进行浓缩以获得体积为10至100L的渗余物。然后通过一个或更多个渗滤步骤去除小分子。如此获得的溶液可通过冻干、雾化干燥或者按原样使用。
[0081] -通过在酸性pH下沉淀：实现pH降低以便使脂肽选择性地沉淀。向所获得的上清液添加浓硫酸。在获得约1的最终pH之后，将溶液保持搅拌2至12小时。离心使得回收包含脂肽物质的沉淀(culot)。然后通过添加水和纯碱以获得7至8.5的pH值来将该沉淀溶解。如此获得的溶液可通过冻干、雾化干燥或者按原样使用。
[0083] 在这两个制备实例之一结束时脂肽的百分比为0.5％至20％(重量/体积)。
[0084] B-伊枯草菌素脂肽浓缩的组合物的制备
[0085] 1-不同表面活性剂对伊枯草菌素脂肽的溶解度和在高浓度组合物中的作用的研究
[0086] 将(在干物质上)纯度为45％至80％的伊枯草菌素脂肽(此处为抗霉枯草菌素)以不同浓度单独溶解在水中，并且将该对照组合物与如本申请中所述添加了不同表面活性剂化合物的不同组合物进行比较。在21℃下储存15天之后，仅选择具有流体类型的流变行为和均匀外观(无妨碍流动的结块和/或相移和/或沉淀)的组合物，通过搅拌进行混合，然后将这些组合物以10,000g离心10分钟，并且使用RP-HPLC参考方法分析上清液。该方法使得可检查随后在离心之后存在于上清液中的伊枯草菌素化合物的溶解度。
[0087] 图1中示出了单独的伊枯草菌素脂肽(此处为抗霉枯草菌素)在水溶液中随其浓度变化的溶解度。
[0088] 图2中示出了可溶于不同组合物中的伊枯草菌素脂肽的最大浓度。
[0089] 没有向仅包含伊枯草菌素脂肽的组合物1添加表面活性剂。
[0090] 在组合物2至13中添加的表面活性剂是：
[0091] -10％丰杆菌素(组合物2)
[0092] -烷基聚葡糖苷和氨基酸衍生物(SimulsolTM/ProtéolTM)，各自比例均为10％(组合物3)
[0093] -大豆卵磷脂(4％)和多糖苷衍生物(0.1％)(ElvisTM/黄原胶)(组合物4)
[0094] -甲基化植物籽油提取物和来自椰子油的聚甘油酯(0.2％)(Synergen OSTM)(组合物5)
[0095] -脂肪醇氧烷基化物类型的非离子表面活性剂(0.2％)(EmulsogenTM)(组合物6)[0096] -戊二醇类型的非离子表面活性剂(50％)(组合物7)
[0097] -0.4％多糖苷衍生物(烷基乙氧基糖苷＝AEG)(组合物8)
[0098] -4％表面活性素(组合物9)
[0099] -4％表面活性素和10％丰杆菌素(组合物10)
[0100] -植物油提取物(30％)和多糖苷衍生物(0.1％)以及表面活性素(4％)(玉米油/黄原胶/表面活性素)(组合物11)
[0101] -烷基聚葡糖苷和氨基酸衍生物(SimulsolTM/ProtéolTM)(各自比例均为10％)以及4％表面活性素(组合物12)
[0102] -0.2％脂肪醇氧烷基化物类型的非离子表面活性剂(EmulsogenTM)和4％表面活性素(组合物13)
[0103] 结果分析
[0104] 图1示出了在室温下伊枯草菌素脂肽(此处为抗霉枯草菌素)在水溶液中随其浓度变化的溶解度
[0105] 在图1中，可观察到，单独的抗霉枯草菌素以2g/L的最大浓度很好地溶解在水溶液中，但超过该浓度(例如，5至25g/L)时，可观察到沉降的沉淀物，并且仅一小部分保持可溶。
[0106] 图2示出了在室温下储存15天之后包含伊枯草菌素脂肽(此处为抗霉枯草菌素)和不同化合物的不同组合物的溶解度分析，以获得高且可溶性浓度的伊枯草菌素脂肽。测量是在离心步骤以消除不溶物质之后对上清液进行的。
[0107] 在图2中，可观察到，不同表面活性剂的添加显著提高了抗霉枯草菌素的溶解度，特别是添加有单独的或与非离子表面活性剂组合的阴离子化合物。丰杆菌素或表面活性素的存在允许获得接近30g/L的抗霉枯草菌素溶解度。出人意料地并且以原始方式，这两种阴离子脂肽化合物的组合使得可获得甚至更高的伊枯草菌素化合物溶解度。还应注意的是，尽管组合物均匀且稳定，但某些表面活性剂的使用并不能使得溶解度超过20g/L。大豆卵磷脂与黄原胶相结合(最大＝1.5g/L)的情况就是这样，非离子化合物EmulsogenTM(Clariant)(最大＝11.6g/L)以及非离子化合物SimulsolTM和阴离子ProtéolTM(Ceppic)(最大＝15.3g/L)的情况也是这样。注意到对于这些组合物，在离心步骤之后存在显著的沉淀物。另一方面，当这些组合物补充有另一种阴离子脂肽化合物(例如表面活性素)时，抗霉枯草菌素的溶解度提高到55至120g/L的值。另一些非离子化合物(例如戊二醇和烷基乙氧基糖苷)也提供高于30g/L的溶解度。允许伊枯草菌素化合物的最大溶解度(112g/L)的组合物是包含阴离子脂肽(表面活性素)和非离子表面活性剂(EmulsogenTM)的组合物。
[0108] 2-由脂肽粉末制备具有高伊枯草菌素脂肽含量的组合物
[0109] 可由脂肽粉末制备具有高含量伊枯草菌素脂肽的组合物，如以下两个组合物实例所示：
[0110] 组合物1：通过使脂肽粉末重新浆化获得包含约3.1％(m/v)脂肽(1.25％抗霉枯草菌素和1.85％表面活性素)的组合物，所述脂肽粉末包含40/60比例的抗霉枯草菌素/表面活性素混合物并且在水相(pH为7.5至8.5)中的纯度为约15％。
[0111] 组合物2：通过使脂肽粉末重新浆化获得包含约5.1％(m/v)脂肽(2.45％抗霉枯草菌素和2.65％表面活性素)的组合物，所述脂肽粉末包含45/55比例的抗霉枯草菌素/表面活性素混合物并且在水相(pH为7.5至8.5)中的纯度为约75％。
[0112] 3-包含表面活性剂的具有高含量伊枯草菌素脂肽的组合物的制备。
[0113] 已将表面活性剂添加至上述组合物1和2以评价此类分子对组合物特性的作用。
[0114] 组合物1A：将两种表面活性剂各自以10％(v/v)的比例添加至组合物1，即，来源于TM多糖苷的非离子助水溶性表面活性剂(商品名＝Simulsol SL 7C，由Seppic销售)和来源于氨基酸的阴离子表面活性剂(商品名＝ProteolTM APL，由Seppic销售)。
[0115] 组合物2A：将3％至8％(w/v)丰杆菌素(或制磷脂菌素)添加至组合物2。
[0116] 4-所获得组合物的表征：随时间的均匀性和稳定性。
[0117] a.室温下的稳定性测试
[0118] 在室温下(此处为约21℃下)研究了含有和不含有表面活性剂的组合物的外观。
[0119] 组合物1：两种表面活性剂的添加使得可获得均一的组合物(组合物1A)并且避免任何沉淀或沉降现象。包含表面活性剂的组合物1A具有浑浊但均匀的外观。
[0120] 组成2：丰杆菌素(或制磷脂菌素)的添加使得可获得均一的组合物并避免任何结块现象(该现象在不存在丰杆菌素或制磷脂菌素的情况下发生)。具有丰杆菌素(或制磷脂菌素)的组合物2A具有澄清且均匀的外观。
[0121] b.低温下的稳定性测试
[0122] 将经浓缩脂肽溶液(组合物1、2和1A、2A)在4℃下放置1至30天的时间。仅补充有表面活性剂或丰杆菌素(或制磷脂菌素)(即1A和2A)的溶液保持均匀并且未观察到沉积。在没有这些添加的情况下，经浓缩脂肽溶液有可能结块或引起显著的不溶性沉积物。
[0124] a.分析方法
[0125] 将上述2种组合物(1和2)以及包含添加剂的那些(1A和2A)在21℃下储存15天以及在54℃下储存15天(以模拟加速老化)。将组合物在高温(54℃)下储存是技术人员已知的方法，其使得可通过提高布朗运动从而加速组合物的失稳定来模拟组合物的加速老化。
[0126] 在这些时期结束时，使用紧凑型Anton PAAR MCR102模块化流变仪研究组合物的流变学。该方法由在剪切应力在1至100Pa之间逐渐提高(测试持续时间：500秒)时监测剪切速度组成。黏度(剪切应力/剪切速度的比值)也表示为剪切应力的函数。这使得可显现测试过程中的黏度演变。这些测试是对一式三份的样品进行的。
[0127] 在21℃或54℃下储存之后，对这些组合物的两个流变参数进行了研究，即：
[0128] 最小黏度(Pa.s)
[0129] 最大黏度下的剪切应力(Pa)
[0130] B.结果
[0131] 所有样品均表现出非牛顿流体行为(在测试过程中黏度不是恒定的)。随着剪切应力提高，黏度降低至接近最小黏度。搅拌下黏度的降低可通过随着剪切速度的提高结构单元(或分子)在流动方向上逐渐排列从而促进不同液体层的流动来解释。然后将这些流体称为剪切稀释剂并且可通过其最小黏度(在应用测试的情况下，这为测试结束时的黏度)以及通过在最大黏度下的剪切应力(Pa)来对其进行表征。
[0132] -最小黏度的研究
[0133] 图3示出了在21℃或54℃下储存之后，添加或未添加表面活性剂和其他添加剂A的不同的经浓缩伊枯草菌素组合物的最低黏度的分析。
[0134] 图3中所示的结果显示，在21℃下储存之后，组合物1A的最小黏度与未经配制的组合物1的最小黏度显著不同并且低于后者。在21℃下储存之后，未观察到组合物2与2A之间的显著差异。然而，在54℃下的老化测试中，组合物2的最小黏度非常显著地提高，而组合物2A的最小黏度保持接近于0。这表明向后者添加丰杆菌素(制磷脂菌素)对促进伊枯草菌素脂肽的溶解具有非常重要的作用。在54℃下储存之后可观察到组合物1与1A之间的类似作用，表明组合物1A的制剂的优点。
[0135] -最大黏度下的剪切应力的研究
[0136] 图4示出了在21℃或54℃下储存之后，添加或未添加表面活性剂和其他添加剂A的不同的经浓缩脂肽组合物在最大黏度下的剪切应力的分析。
[0137] 图4中所示的结果显示，组合物1A在21℃下储存15天之后在最大黏度下的剪切应力低于用未经配制的组合物1获得的剪切应力。未观察到组合物2与2A之间的显著差异。然而，当研究在54℃下加速老化对该参数的影响时，图4中的结果显示，未经配制的组合物1和2的剪切应力非常显著地提高，而经配制的组合物1A和2A的剪切应力几乎保持与在21℃下获得的那些相同。这些结果表明，根据本发明的制剂对促进高浓度的伊枯草菌素化合物随时间的溶解具有非常积极的影响。
[0138] 作为这些研究的结论，可确定：
[0139] -组合物1A使得可溶解伊枯草菌素化合物同时避免沉淀和/或凝胶形成，并且其特征在于在21℃下储存之后或者在其老化过程中，最小黏度和在最大黏度下的剪切应力均显著降低，在其老化过程中甚至更显著地降低。组合物1和1A与非牛顿卡森型(non newtoniens de type Casson)流体相关。
[0140] -组合物2A允许伊枯草菌素化合物溶解同时避免长时间储存之后形成沉淀和/或凝胶，并且其特征在于在54℃下储存之后最小黏度和在最大黏度下的剪切应力显著降低。组合物2和2A最初与剪切稀化型的非牛顿流体相关，但是未经配制的组合物2在其老化过程中变得非常稠。
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