炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用
阅读：262发布：2020-05-08
专利汇可以提供炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 生物 工程 领域的 炎症 性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，拟解决弥补 现有技术 中在IBD抗免疫 治疗 中的作用及机制下FGL2的评价方法及其作用，为了实现上述目的，本技术方案如下利用FGL2的 角 色缺失的实验背景，结合拮抗IBD过度激活的免疫反应，外源性输入FGL2以建立FGL2的免疫调节通路的研究方法。本技术属于开创性发明，提供了FGL2在IBD中的研究方法，便于深入剖析IBD中FGL2的作用，同时本技术方案中免疫调节通路的构建便于FGL2作用机制的阐明，并对FGL2研究提供全新的角度。，下面是炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用专利的具体信息内容。
1.炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：利用FGL2的角色缺失的实验背景，结合拮抗IBD过度激活的免疫反应，外源性输入FGL2以建立FGL2的免疫调节通路的研究方法。
2.根据权利要求1所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
包括以下步骤；
S1，构建IBD动物模型，并且以临床分期的特征构建初期、活动期和治疗缓解期的模型体；
S2，构建FGL2敲除的模型小鼠，在明确FGL2缺失的基因背景下Treg细胞的功能状态、CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞的活性改变；
S3，对于步骤2中的小鼠外源性补充FGL2生物制剂，判断FGL2所涉及的下游免疫活性调节的具体环节；
S4，在FGL2基因敲除小鼠的基础上，进一步诱导IBD模型，比较CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞免疫功能的改变；
S5，研究FGL2生物制剂对IBD免疫平衡的影响。
3.根据权利要求2所述的对于炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：所述步骤1中小鼠模型的诱导方法为三硝基苯磺酸法，随后对于小鼠临床分期的评价方法为对小鼠肠道组织常规活体取材，制成石蜡切片，利用HE染色镜下观察病理组织学变化，从而以炎症细胞浸润程度进行分组。
4.根据权利要求3所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
分组方式如下，按照炎症反应依次分为A1组、A2组和A3组；
A1组为炎症细胞浸润程度<50％的小鼠模型；
A2组为炎症细胞浸润程度>50％的小鼠模型；
A3组为将病理下炎症细胞浸润程度逆转<50％的小鼠模型。
5.根据权利要求4所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
基于A2组研究FGL2分子在IBD小鼠外周血及肠道组织中的表达,研究方法如下；
1)根据NCBI(the National Center for Biotechnology Information)上FGL2、FoxP3、RORγT编码序列，利用相关软件设计引物；
2)制备A2组小鼠外周血及肠道组织样本，试剂盒操作下提取cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增；
3)获取FGL2单克隆抗体，应用免疫组织化学法检测肠道组织中FGL2、FoxP3蛋白表达量；同时测定正常对照组小鼠外周血及肠道组织样本中FGL2、FoxP3、RORγT的mRNA表达及FGL2、FoxP3蛋白表达。
6.根据权利要求5所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
制备A1、A2和A3的IBD小鼠及正常对照小鼠的血浆样本，利用酶联免疫吸附试验分布测定sFGL2、IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的浓度，分析IBD不同状态下，上述细胞因子的变化方向并解释可能的机制,魏氏法检测ESR(血沉)的变化情况；利用免疫比浊法的CRP测定试剂盒测定CRP在不同分组中的数值。
7.根据权利要求6所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
i)获取A2组IBD小鼠组织和血浆，制备单细胞悬液，采用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+T百分比、CD4+IL-17+标记Th17占总CD4+T百分比；
ii)采用免疫磁珠两步法分离小鼠外周血单个核细胞中的CD4+CD25+Treg细胞，分离后的细胞经抗体染色后经流式细胞仪检测其分离纯度；
iii)应用Western blot及实时荧光定量PCR技术分别检测CD4+CD25+Treg细胞中FGL2蛋白及mRNA表达水平,同理获得纯化的Th17细胞，测定IL-17的mRNA表达；
iv)取正常健康小鼠为对照组，重复上述检测项目。
8.根据权利要求7所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
基于A2组研究FGL2对IBD中下游免疫活性改变影响的方法如下：分别制备A2组IBD小鼠的骨髓和脾脏样本，其中从小鼠股骨及肱骨中分离获得骨髓来源的DC，主要是BM-DC，经IL-4、GM-CSF刺激培养6天后，利用CD11c免疫磁珠分选试剂盒获取高纯度的DCs；
随后利用免疫荧光技术评价DC细胞内NF-κ-B-p65的活性，细胞核用DAPI进行复染以观察NF-κB的核转移现象，最后利用荧光显微镜进行定位定性分析；
流式细胞术检测DC细胞表面抗原分子CD80、CD86及MHC-II的表达情况；
无菌条件下切取小鼠脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞，计数后按比例加入适当的磁珠后孵育培养，其中CD19为B淋巴细胞磁珠分选标记，免疫磁珠负性分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD8+T细胞；酶联免疫斑点法检测B细胞的功能状态；TUNEL法评价B细胞的凋亡情况；
混合淋巴细胞的反应检测T细胞的增殖活性；
取正常健康小鼠为对照组，重复上述检测项目。
9.根据权利要求8所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
基因敲除小鼠模型FGL2的免疫作用途径的验证方法如下，
a)FGL2-/-小鼠造模，利用基因敲除实验动物平台，构建FGL2 knockout载体，将含该载体的细胞囊胚注射获得嵌合体小鼠，设置B0组，所述B0组由嵌合体小鼠繁殖出生殖细胞系FGL2-/-小鼠；随机获取G2代基因敲除小鼠的血液标本，测定FGL2 mRNA表达情况，若为阴性表达则说明造模成功；
b)评估FGL2-/-小鼠模型是否自发发生IBD；
c)FGL2-/-小鼠中Treg/Th17细胞免疫平衡及相关细胞因子的评估：
获取B0组FGL2-/-小鼠组织和血浆，制备单细胞悬液，采用流式细胞术分析CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+T百分比、CD4+IL-17+标记Th17占总CD4+T百分比；经免疫磁珠分选后测定纯化后的Th17中IL-17的mRNA表达；
制备B0组FGL2-/-，取小鼠外周血及肠道组织样本，利用实时荧光定量PCR，测定FoxP3、RORγT的mRNA表达以验证FCM中Treg/Th17的数量比例；
制备B0组FGL2-/-小鼠血浆样本，利用酶联免疫吸附试验分布测定IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度，同时测定CRP、ESR的改变情况；以A0组为对照；
d)FGL2缺失对下游免疫活性改变的影响：
同“方案1-步骤E”，分别检测FGL2缺失情况下，分析FGL2缺失对固有免疫中DC细胞成熟、体液免疫及细胞免疫的影响；取正常健康小鼠为对照组；
e)FGL2生物制剂逆转过度免疫激活的研究：
外源性导入FGL2生物制剂，分为注射给药组B1、口服给药组B2，重复步骤c和步骤d，以验证FGL2能够逆转FGL2-/-基因敲除小鼠过度免疫激活的状态。
10.根据权利要求9所述的炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，其特征在于：
推断FGL2缺失造成IBD炎症反应加重的影响环节包括以下步骤；
A)在FGL2-/-基因敲除小鼠的基础上继续诱导出IBD模型，取HE染色下“炎症细胞浸润超过50％”为造模成功组为C组，同时测定C组IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度、及CRP、ESR的改变情况；
B)重复步骤c和步骤d，取A2组为对照，测定DC细胞、B细胞、细胞毒性T细胞的功能活性，以验证FGL2的缺失是否会进一步强化IBD中上述免疫细胞的功能状态。
炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因尚不十分清楚的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’disease，CD)。该病在西方国家相当常见，欧洲和北美UC的发病率为10-20/105，患病率100-200/105；CD的发病率为5-10/105，患病率达50-100/105。世界胃肠病组织2010年的临床指南中提到，IBD发病率在全世界范围内，尤其东亚地区有持续上升趋势，目前该病已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要病因，IBD的发病机制研究目前主要涉及遗传学因素、肠道屏障破坏和肠道菌群、免疫调节异常等方面，其中免疫调节异常是最为活跃的研究领域，但其确切发病机制尚不明确，给临床诊治带来极大的困扰，给人类健康带来了极大的潜在威胁，引起了亚洲乃至全世界的高度重视。
[0003] 1998年Marazzi等第一次发现由T细胞分泌产生的FGL2，是一种可溶性FGL2，不具有凝血酶原酶活性，而具有调节获得性免疫的作用。后续越来越多的研究证据显示，sFGL2主要由T细胞亚群Treg细胞分泌产生，是Treg细胞免疫调节作用的效应分子。应用单克隆抗体阻断FGL2可以完全抑制Treg细胞功能；敲除FGL2基因后的小鼠Treg细胞功能损害。sFGL2发挥免疫调节活性的作用机制，目前主要认为是通过其羧基终末端的纤维蛋白原相关结构(Fibrinogen related domain，FRED)，与抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)表面的抑制性受体(FcγR)IIβ和FcγRIII结合，从而抑制骨髓来源的DC细胞成熟。其机制可能通过抑制核转录因子-κB(nuclear factor kappa beta，NF-κB)信号通路，从而导致DC细胞表面MHCII分子和共刺激分子CD80、CD86表达下调，从而抑制DC细胞成熟。而DC细胞成熟过程可诱导幼稚T细胞及记忆T细胞成熟和增殖，DC细胞表面的共刺激分子可诱导效应T细胞增殖及增强其免疫活性。
[0004] sFGL2通过抑制DC细胞成熟从而间接抑制T细胞增殖及免疫活性，另外sFGL2可直接通过诱导B细胞凋亡，来降低B细胞免疫反应。此外，sFGL2还可降低Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ水平，上调Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平，具有促进Th2细胞因子极化作用。故sFGL2是Treg细胞关键的效应分子，具有免疫调节活性。
[0005] 基于实际的预实验结果和文献基础，申请人及课题组推测前期试验中所观察到的UC和CD患者活动期外周血血浆及肠道组织中FGL2蛋白表达有显著上升(已发表SCI论文，Dig Dis Sci.)，可能揭示了FGL2在IBD中全新的免疫调节机制，即调节性T细胞分泌的FGL2通过抑制细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞的活性使IBD病情缓解。本项目为此将首次研究FGL2通过抑制下游免疫在IBD抗免疫治疗中的作用及机制。预期研究结果将从全新的角度阐明FGL2的作用机制，同时将有助于启发后续研究从全新的角度解决IBD的治疗难题，具有重要的临床、科研意义和巨大的社会经济效益。
[0006] 基于实际的预实验结果和文献基础，申请人及课题组推测前期试验中所观察到的UC和CD患者活动期外周血血浆及肠道组织中FGL2蛋白表达有显著上升(已发表SCI论文，Dig Dis Sci.)，可能揭示了FGL2在IBD中全新的免疫调节机制，即调节性T细胞分泌的FGL2通过抑制细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞的活性使IBD病情缓解。本项目为此将首次研究FGL2通过抑制下游免疫在IBD抗免疫治疗中的作用及机制。预期研究结果将从全新的角度阐明FGL2的作用机制，同时将有助于启发后续研究从全新的角度解决IBD的治疗难题，具有重要的临床、科研意义和巨大的社会经济效益。
发明内容
[0007] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种在IBD抗免疫治疗中的作用及机制下FGL2的研究方法。
[0008] 为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，利用FGL2的角色缺失的实验背景，结合拮抗IBD过度激活的免疫反应，外源性输入FGL2以建立FGL2的免疫调节通路的研究方法。
[0009] 采用上述方案后实现了以下有益效果：1、本技术属于开创性发明，提供了FGL2在IBD中的研究方法，便于深入剖析IBD中FGL2的作用。
[0010] 2、相对于论文Dig Dis Sci中揭露的效果，本技术方案中免疫调节通路的构建便于FGL2作用机制的阐明，并对FGL2研究提供全新的角度。
[0011] 3、相对于其他角度对FGL2的研究，本技术方案中以拮抗IBD过度激活的免疫反应挖掘sFGL2分子在调节Treg细胞及Th17细胞在IBD免疫平衡状态中的作用机制，并验证其在IBD临床病程进展中的意义。
[0012] 进一步，包括以下步骤；
[0013] S1，构建IBD动物模型，并且以临床分期的特征构建初期、活动期和治疗缓解期的模型体；
[0014] S2，构建FGL2敲除的模型小鼠，在明确FGL2缺失的基因背景下Treg细胞的功能状态、CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞的活性改变；
[0015] S3，对于步骤2中的小鼠外源性补充FGL2生物制剂，判断FGL2所涉及的下游免疫活性调节的具体环节；
[0016] S4，在FGL2基因敲除小鼠的基础上，进一步诱导IBD模型，比较CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞免疫功能的改变；
[0017] S5，研究FGL2生物制剂对IBD免疫平衡的影响。
[0018] 有益效果：1、通过FGL2基因敲除小鼠模型的实验验证，可以获得FGL2分子在炎症性肠病中具体的作用机制。
[0019] 2、调节性T细胞分泌的sFGL2分子可以作为炎症性肠病诊断的新标志物。
[0020] 3、调节性T细胞分泌的sFGL2分子可以作为炎症性肠病的新免疫调控分子靶标。
[0021] 4、构建炎症性肠病的小鼠动物模型，通过量化FGL2在IBD小鼠模型外周血及肠道组织中的表达模式及其对模型外周血及肠道组织中Treg/Th17细胞免疫失衡的影响程度，预测FGL2对IBD鼠模型中Treg/Th17细胞免疫失衡的作用及调节机制。
[0022] 5、构建FGL2基因敲除的小鼠模型，通过测定FGL2-/-小鼠模型外周血及肠道组织中Treg/Th17细胞的平衡状态，同时导入FGL2生物制剂，对比反证FGL2对IBD小鼠模型中Treg/Th17细胞免疫失衡的调节作用机制。
[0023] 6、在FGL2基因敲除小鼠的基础上，进一步诱导IBD模型，比较CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞免疫活性及相关细胞因子的改变。
[0024] 7、基于FGL2基因敲除小鼠，通过探讨FGL2分子缺失及重导入后，其对CD8+细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、DC细胞免疫活性及相关细胞因子的改变情况，在临床整体水平、实验动物水平、免疫细胞水平及免疫分子水平，挖掘sFGL2潜在的抗IBD免疫激活的作用机制。
[0025] 进一步，所述步骤1中小鼠模型的诱导方法为三硝基苯磺酸法，随后对于小鼠临床分期的评价方法为对小鼠肠道组织常规活体取材，制成石蜡切片，利用HE染色镜下观察病理组织学变化，从而以炎症细胞浸润程度进行分组。
[0026] 进一步，分组方式如下，按照炎症反应依次分为A1组、A2组和A3组；
[0027] A1组为炎症细胞浸润程度<50％的小鼠模型；
[0028] A2组为炎症细胞浸润程度>50％的小鼠模型；
[0029] A3组为将病理下炎症细胞浸润程度逆转<50％的小鼠模型。
[0030] 进一步，基于A2组研究FGL2分子在IBD小鼠外周血及肠道组织中的表达,研究方法如下；
[0033] 3)获取FGL2单克隆抗体，应用免疫组织化学法检测肠道组织中FGL2、FoxP3蛋白表达量；同时测定正常对照组小鼠外周血及肠道组织样本中FGL2、FoxP3、RORγT的mRNA表达及FGL2、FoxP3蛋白表达。
[0034] 进一步，制备A1、A2和A3的IBD小鼠及正常对照小鼠的血浆样本，利用酶联免疫吸附试验分布测定sFGL2、IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的浓度，分析IBD不同状态下上述细胞因子的变化方向并解释可能的机制,魏氏法检测ESR(血沉)的变化情况；利用免疫比浊法的CRP测定试剂盒测定CRP在不同分组中的数值。
[0035] 有益效果：IBD发病机制研究主要涉及遗传学因素、肠道屏障破坏和肠道菌群、免疫调节异常等方面，其中免疫调节异常是最为活跃的研究领域，但其确切发病机制尚不明确，从临床角度而言，FGL2作为Treg关键的免疫调节因子，与传统的评价IBD活动的炎症标记，如血沉、CRP等，进行进一步的应用评价。
[0036] 2、IBD背景中Treg细胞/Th17细胞免疫失衡的确切作用模式及机制，主要涉及sFGL2对Treg细胞/Th17细胞在数量上的影响及其通过DC，细胞的成熟抑制、B细胞的诱导凋亡及T细胞的增殖抑制等下游免疫通路的调节。
[0037] 进一步，i)获取A2组IBD小鼠组织和血浆，制备单细胞悬液，采用流式细胞术(FlowCytometry,FCM)分析CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+T百分比、CD4+IL-17+标记Th17占总CD4+T百分比；
[0039] iii)应用Western blot及实时荧光定量PCR技术分别检测CD4+CD25+Treg细胞中FGL2蛋白及mRNA表达水平,同理获得纯化的Th17细胞，测定IL-17的mRNA表达；
[0040] iv)取正常健康小鼠为对照组，重复上述检测项目。
[0041] 进一步，基于A2组研究FGL2对IBD中下游免疫活性改变影响的方法如下：分别制备A2组IBD小鼠的骨髓和脾脏样本，其中从小鼠股骨及肱骨中分离获得骨髓来源的DC，主要是BM-DC，经IL-4、GM-CSF刺激培养6天后，利用CD11c免疫磁珠分选试剂盒获取高纯度的DCs；
[0043] 流式细胞术检测DC细胞表面抗原分子CD80、CD86及MHC-II的表达情况；
[0044] 无菌条件下切取小鼠脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞，计数后按比例加入适当的磁珠后孵育培养，其中CD19为B淋巴细胞磁珠分选标记，免疫磁珠负性分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD8+T细胞；酶联免疫斑点法检测B细胞的功能状态；TUNEL法评价B细胞的凋亡情况。混合淋巴细胞的反应检测T细胞的增殖活性；
[0045] 取正常健康小鼠为对照组，重复上述检测项目。
[0046] 有益效果：sFGL2作为Treg细胞的效应分子，具有免疫调节活性，但是基于免疫调控的网络性，机制免疫异常的状态往往会整体上调或下调某些特定功能群的效应分子。这就需要靶向更高的方法学支撑，本课题组基于前期基因敲除的实验经验及基础，可以有效的建立FGL2基因敲除的实验动物模型，利用FGL2的角色缺失的实验背景，外源性输入FGL2，能够更直接的反应FGL2分子本身的免疫调节特征。
[0047] 进一步，基因敲除小鼠模型FGL2的免疫作用途径的验证方法如下，
[0048] 基因敲除小鼠模型FGL2的免疫作用途径的验证方法如下，
[0049] a)FGL2-/-小鼠造模，利用基因敲除实验动物平台，构建FGL2 knockout载体，将含该载体的细胞囊胚注射获得嵌合体小鼠，设置B0组，所述B0组由嵌合体小鼠繁殖出生殖细胞系FGL2-/-小鼠；随机获取G2代基因敲除小鼠的血液标本，测定FGL2 mRNA表达情况，若为阴性表达则说明造模成功；
[0050] b)评估FGL2-/-小鼠模型是否自发发生IBD；
[0051] c)FGL2-/-小鼠中Treg/Th17细胞免疫平衡及相关细胞因子的评估：
[0052] 获取B0组FGL2-/-小鼠组织和血浆，制备单细胞悬液，采用流式细胞术分析CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+T百分比、CD4+IL-17+标记Th17占总CD4+T百分比；经免疫磁珠分选后测定纯化后的Th17中IL-17的mRNA表达；
[0053] 制备B0组FGL2-/-，取小鼠外周血及肠道组织样本，利用实时荧光定量PCR，测定FoxP3、RORγT的mRNA表达以验证FCM中Treg/Th17的数量比例；
[0054] 制备B0组FGL2-/-小鼠血浆样本，利用酶联免疫吸附试验分布测定IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度，同时测定CRP、ESR的改变情况；以A0组为对照；
[0055] d)FGL2缺失对下游免疫活性改变的影响：
[0056] 同“方案1-步骤E”，分别检测FGL2缺失情况下，分析FGL2缺失对固有免疫中DC细胞成熟、体液免疫及细胞免疫的影响；取正常健康小鼠为对照组；
[0057] e)FGL2生物制剂逆转过度免疫激活的研究：
[0058] 外源性导入FGL2生物制剂，分为注射给药组B1、口服给药组B2，重复步骤c和步骤d，以验证FGL2能够逆转FGL2-/-基因敲除小鼠过度免疫激活的状态。
[0059] 进一步，推断FGL2缺失造成IBD炎症反应加重的影响环节包括以下步骤；
[0060] A)在FGL2-/-基因敲除小鼠的基础上继续诱导出IBD模型，取HE染色下“炎症细胞浸润超过50％”为造模成功组为C组，同时测定C组IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度、及CRP、ESR的改变情况；
[0061] B)重复步骤c和步骤d，取A2组为对照，测定DC细胞、B细胞、细胞毒性T细胞的功能活性，以验证FGL2的缺失是否会进一步强化IBD中上述免疫细胞的功能状态。
[0062] 有益效果：1、项目研究将本着实验研究与临床验证紧密结合的原则，综合FGL2在基础免疫的研究数据与临床应用的条件基础，充分利用现代先进分子生物学、分子免疫学的研究手段，通过FGL2基因敲除的实验动物模型，对比反证FGL2分子在IBD中的潜在免疫调节作用途径，根据实验结果总结、分析FGL2分子在IBD中的作用机制。
[0063] 2、本方法主要从两类动物模型入手：一是构建炎症性肠病的小鼠模型，利用IBD整体的疾病环境，评价其与健康小鼠体内的FGL2，Treg/Th17细胞免疫,平衡状态的偏倚程度，提供FGL2的宏观免疫调节特征。二是构建FGL2基因敲除的小鼠模型，深入挖掘在FGL2基因丢失的环境下，机体Treg/Th17细胞的免疫平衡及DC细胞、B细胞、细胞毒性T细胞免疫活性的改变。
[0064] 3、采用在ES细胞中进行同源重组已经成为一种研究特定基因甚至基因的特定结构域的常规技术，为此本研究选择利用FGL2基因敲除小鼠，构建稳定FGL2阴性表达的动物模型。通过选择性敲除FGL2基因，利用FGL2的角色缺失的实验背景，外源性输入FGL2，能够更直接的反应FGL2分子本身的免疫调节特征。
[0065] 4、IBD中机体的免疫内环境内各种免疫细胞的功能关系是极为错综复杂的。但是总体免疫状态的趋势是亢进的。结合FGL2既往的研究成果及已有的研究机制，纳入考量DC细胞、B细胞、细胞毒性T细胞的功能活性，通过设立IBD组、FGL2基因敲除组、IBD+FGL2基因敲除组及阴性对照组的分组策略，能够从多个角度验证FGL2分子本身对上述免疫细胞的影响，具有良好的参考价值。
[0066] 5、本申请项目的研究涉及实验小鼠的外周血、肠道粘膜组织、脾脏(外周免疫器官)三个层次，充分炎症各项指标之间的关联性，勾勒出更加完整的TregsFGL2在IBD中的免疫调节模式。结合体内和体外多种实验方法，结果具有说服力；并采用一些近年来新发展起来的研究手段，如Th17和Treg细胞的分离和检测技术、DC细胞培养技术、基因敲出小鼠模型的建立等，技术路线新，研究方法完备。
[0067] 6、本项目从FGL2基因敲除小鼠为基本出发点，研究的内容涵盖了Treg/Th17的免疫平衡，FGL2对DC、细胞毒性T细胞、B细胞、各项细胞因子的水平的影响，并分析其可能的作用机制，研究工作具有联系性，能够从更深的层次解释FGL2在IBD中的免疫调节机制。
[0069] 图1为现有技术中sFGL2发挥免疫调节作用的机制图；
[0070] 图2为现有技术中小鼠肝脏在不同时期的微血栓Masson染色阳性率的情况；
[0071] 图3为现有技术中不同时期FGL2基因及蛋白的表达；
[0072] 图4为实施例一的总体路线图；
[0073] 图5为IBD小鼠中FGL2分子表达模式的技术路线；
[0074] 图6为FGL2分子免疫干预的技术路线。
具体实施方式
[0075] 下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0076] 现有技术
[0077] 对于FGL2在炎症性肠病中作用机制的研究方法，具体实施过程如下：如图1所示，本技术方案的可行性基础来源于sFGL2是gTreg细胞关键的效应分子，具有免疫调节活性。文献来源于《Shalev I,2010Jul 2；1(1):e0004》。
[0078] 本技术方案有关的工作基础(前期工作)如下(已发表于World J Gastroenterol.2013Apr 28；19(16):2492-500；Hepato-gastroenterology.2012Jun；59(116):1225-9.)，请参考图2，FGL2作为前凝血酶原，具有“免疫凝血”的功能，且该免疫凝血活性与急性胰腺炎相关肝脏损伤的微血栓形成密切相关。小鼠肝脏在不同时期的微血栓Masson染色阳性率的情况，结果显示随着时间的延长，小鼠急性胰腺炎发作后肝内微血管血栓形成量明显增加，有统计学差异。
[0079] 请参考图3，通过实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学染色法验证FGL2在肝内静脉及肝窦内的基因表达强度。结果提示，急性胰腺炎发作的小鼠在各个时间点的FGL2表达量都有明显上升。
[0080] 实施例一
[0081] 炎症性肠病中FGL2基因敲除的建立方法和应用，附小鼠模型来源及构建：
[0082] 一、FGL2基因敲除小鼠购自于南京大学生物医药研究院，获得小鼠是完全性基因敲除鼠。
[0083] 二、构建IBD动物模型
[0085] 2.主要仪器：小鼠饲养笼、电子天平
[0086] 3.实验方法：
[0087] 3.1配制2.5％DSS溶液：用电子天平称取12.5g硫酸葡聚糖钠，与500ml的高压灭菌水混合，溶解至液体完全变清澈透明，4℃保存备用。
[0088] 3.2造模：给予小鼠2.5％DSS溶液喂养，连续7天，随后撤除并更换为高压灭菌水，再连续喂养2天。期间提供充分的全价配合饲料，密切观察小鼠的生长情况。
[0089] 3.3评估造模动物的临床症状：在造模前一天，称量小鼠的初始体重，观察大便情况。造模期间，每天监测小鼠的体重改变、腹泻程度和便血情况等三项指标，根据评分标准进行评分。体重下降严重程度评分标准：计算下降的体重量占初始体重量的百分比，无变化，0分；1-5％，1分；5-10％，2分；10-15％，3分；>15％，4分。腹泻严重程度评分标准：大便硬度正常，0分；松软稀便，2分；水样腹泻，4分。便血严重程度评分标准：隐血阴性，0分；隐血阳性，2分；肉眼血便，4分。最后算得三项指标相加后的平均值，即为疾病活动指数评分(DAI)。
[0090] 请参考图4，基于上述前期工作后，本技术方案主要通过IBD及FGL2基因敲除小鼠造模，FGL2分子的表达状态研究，FGL2分子对下游免疫的功能状态的影响和FGL2生物制剂对IBD免疫平衡的影响进行研究。
[0091] 请参考图5，首先，构建IBD动物模型与构建FGL2敲除的模型小鼠，利用三硝基苯磺酸(TNBS)法诱导制备IBD小鼠模型，评估小鼠肠道炎症反应程度。对小鼠肠道组织常规活体取材，制成石蜡切片，利用HE染色镜下观察病理组织学变化，从而以炎症细胞浸润程度进行分组。
[0092] 按照炎症反应依次分为A1组、A2组和A3组；A1组为炎症细胞浸润程度<50％的小鼠模型；A2组为炎症细胞浸润程度>50％的小鼠模型；A3组为将病理下炎症细胞浸润程度逆转<50％的小鼠模型。即A1组：初期；A2组：活动期；A3:治疗缓解期。注：本分期与临床分期大致一致，但为本课题的内部定义。
[0093] 其次，FGL2分子的表达状态研究,基于A2组研究FGL2分子在IBD小鼠外周血及肠道组织中的表达,研究方法如下；
[0094] 1)根据NCBI(the National Center for Biotechnology Information)上FGL2、FoxP3、RORγT编码序列，利用相关软件设计引物；
[0095] 2)制备A2组小鼠外周血及肠道组织样本，试剂盒操作下提取cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增；
[0096] 3)获取FGL2单克隆抗体，应用免疫组织化学法检测肠道组织中FGL2、FoxP3蛋白表达量；同时测定正常对照组小鼠外周血及肠道组织样本中FGL2、FoxP3、RORγT的mRNA表达及FGL2、FoxP3蛋白表达。
[0097] 制备A1、A2和A3的IBD小鼠及正常对照小鼠的血浆样本，利用酶联免疫吸附试验分布测定sFGL2、IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的浓度，分析IBD不同状态下上述细胞因子的变化方向并解释可能的机制,魏氏法检测ESR(血沉)的变化情况；利用免疫比浊法的CRP测定试剂盒测定CRP在不同分组中的数值。
[0098] i)获取A2组IBD小鼠组织和血浆，制备单细胞悬液，采用流式细胞术(FlowCytometry,FCM)分析CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+T百分比、CD4+IL-17+标记Th17占总CD4+T百分比；
[0099] 附流式细胞术检测Th17/Treg细胞的实验流程：
[0100] 1)材料与试剂：
[0101] 1.Cell stimulation cocktail(ebioscience，美国)
[0102] 2.胎牛血清(四季青)
[0103] 3.RPMI-1640(Hyclone，美国)
[0105] 5.庆大霉素(天津药业焦作有限公司)
[0106] 6.Anti-mouse CD16/CD32(ebioscience，美国)
[0107] 7.Anti-mouse CD4 FITC(ebioscience，美国)
[0108] 8.Anti-mouse IL-17A PE(ebioscience，美国)
[0109] 9.Anti-mouse CD25 APC(ebioscience，美国)
[0110] 10.Anti-mouse Foxp3 PE(ebioscience，美国)
[0111] 11.透膜液Permeabilization buffer(ebioscience，美国)
[0112] 12.Foxp3固定/破膜工作液(ebioscience，美国)
[0113] 13.流式专用1×PBS(北京索莱宝生物科技有限公司)
[0114] 14.双蒸水(实验室自备)
[0115] 15.1.5mlEP管(Axygen，美国)
[0116] 16.12孔细胞培养皿(Corning，美国)
[0117] 17.流式管(BD，美国)
[0118] 2)主要实验仪器:
[0119] 1.超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)
[0120] 2.台式低温离心机(Thermo Fisher Scientific))
[0121] 3.细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific)
[0122] 4.水平摇床(实验室自备)
[0123] 5.普通倒置显微镜(Nikon)
[0124] 6.流式细胞分析仪(Calibur BD)
[0125] 3)方法：
[0126] LPMCs、PBMCs、脾脏、MLN中Th17细胞的检测：
[0127] 1.分离得到小鼠LPMCs、PBMCs、脾脏、MLN细胞，细胞计数后用10％细胞培养基重悬，并按1×107个/ml密度进行铺12孔板，每个孔总体积为1ml，并加入cell stimulation cocktail(500×)2μl。为了减少样本之间加样的误差，首先计算好样本数，将细胞培养基和cell stimulation cocktail预混，后续的加样操作均采用该方法。将12孔板放置37℃，5％CO2细胞培养箱中刺激5-6小时。
[0128] 2.取出12孔板，轻轻吹打培养皿底部将细胞重悬，收获细胞并转移至1.5mlEP管中。提前将离心机冷却到4℃，以500g/min离心5min，弃掉上清。
[0129] 3.封闭：每管样本中加入50μl 3％细胞培养基，内含0.5μl Anti-mouse CD16/CD32封闭性抗体，然后置于冰上及水平摇床上慢速孵育15min。
[0130] 4.标记表面抗体:每管样本中加入50μl 3％细胞培养基，内含0.5μl Anti-mouse CD4 FITC,然后置于冰上及水平摇床上慢速避光孵育15min，期间可用手指轻轻吹弹EP管底部重悬细胞使得接触更充分。
[0131] 5.洗涤：每管样本中加入800μl RPMI-1640，混匀后以4℃，500g/min离心5min，弃掉上清。
[0133] 7.用双蒸水将10×透膜液稀释至1×，并取800μl直接加到上述样本中，混匀后在4℃下以500g/min离心5min，弃掉上清。
[0134] 8.标记胞内抗体：每100μl1×透膜液中加入1.25μl Anti-mouse IL-17A PE，混匀后室温下避光孵育15min，同样期间用手指轻轻吹弹EP管底部重悬细胞使得接触更充分。
[0135] 9.洗涤：每管样本中加入800μl 1×透膜液，混匀后以500g/min离心5min，弃掉上清。
[0136] 10.取350μl流式专用的1×PBS重悬细胞并转移至流式管中。
[0137] 11.上机检测并用FlowJo软件进行数据分析CD4+IL-17+双阳细胞占CD4+细胞的百分比。
[0138] LPMCs、PBMCs、脾脏、MLN中Treg细胞的检测：
[0139] 1.分离得到LPMCs、PBMCs、脾脏和MLN细胞，用10％细胞培养基重悬，细胞计数后按1×107个/ml密度取1ml细胞至1.5mlEP管中，无需刺激直接以4℃，500g/min离心5min，弃掉上清。
[0140] 2.后续的步骤同Th17，但不同的是表面抗体为Anti-mouse CD4 FITC和Anti-mouse CD25 APC，即每管样本中加入50μl 3％细胞培养基，内含0.5μl Anti-mouse CD4 FITC和1.5μl Anti-mouse CD25 APC。胞内抗体为Anti-mouse Foxp3 PE，即每管样本中加入100μl 1×透膜液，内含1.25μl Anti-mouse Foxp3 PE。
[0141] 3.最后上机检测并用FlowJo软件进行数据分析CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+细胞的百分比。
[0142] ii)采用免疫磁珠两步法分离小鼠外周血单个核细胞中的CD4+CD25+Treg细胞，分离后的细胞经抗体染色后经流式细胞仪检测其分离纯度；
[0143] 附免疫磁珠法提取小鼠骨髓来源DC、小鼠脾脏来源B细胞、CD8+T细胞的实验方案[0144] 免疫磁珠检测小鼠骨髓来源DC的分离纯化
[0145] 1.骨髓源成熟DC的分离及体外培养
[0146] ⑴将C57BL/6雄性小鼠颈椎脱位法处死后依次将小鼠放入75％乙醇、碘伏各2秒钟再浸没于75％乙醇中5分钟，然后取出小鼠在无菌状态下剪开股骨处皮肤，剥离出完整的下肢，粗略分离下肌肉及软组织，用无菌PBS溶液冲洗股骨及胫骨。
[0147] ⑵将小鼠下肢用RPMI-1640培养液充分冲洗后用无菌剪刀将股骨与胫骨分离，再用无菌纱布轻搓股骨及胫骨从而彻底把肌肉去除干净，然后浸泡于RPMI-1640培养液中。
[0148] ⑶用5ml注射器针头分别从骨头两端刺入骨髓腔使髓腔联通，再用lml注射器吸取lmlRPMI-1640培养液从长骨的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲入到一无菌培养皿中，每根长骨反复冲洗4-6次直至骨髓腔呈白色。
[0149] ⑷将冲洗下来的骨髓用吸管反复吹打均匀后经无菌200目滤网过滤以便去除杂质及组织碎片。将骨髓细胞悬液收集到离心管中以1500rpm的速度离心10分钟。
[0150] ⑸离心后弃上清液，加入5ml无菌红细胞裂解液吹打混匀室温静置2分钟以溶解红细胞后加入6ml无菌生理盐水终止裂解。1500rpm离心5分钟后弃去上清液，再用RPMI-1640培养液洗涤2遍。
[0151] ⑹涤后将细胞用RPMI.1640完全培养液(含10％胎牛血清、rmGM-CSF(10ng/m1)、rmIL-4(10ng/ml))悬浮，细胞计数，将细胞浓度调整至106/ml后分置于6孔细胞培养板中，每孔4ml。
[0152] ⑺把细胞培养板放于37℃、含5％C02的培养箱中培养48小时，轻轻晃动培养板，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。加入相同体积的RPMI-1640完全培养液(含10％胎牛血清、rmGM.CSF(10ng/m1)、rmIL-4(10ng/m1))，继续在相同条件下培养并隔天半量换液，尽量保留悬浮细胞。第6天加入肿瘤坏死因子Q(rmTNF-α)15ng/ml，继续培养24小时后收集到的所有细胞就是小鼠骨髓源性成熟树突状细胞。
[0153] 2.分离纯化DC
[0154] 1.确定细胞数量。
[0155] 2.以200g的速度离心细胞10分钟，弃去上清液。
[0156] 3.每108个细胞用400ul buffer缓冲液混悬。
[0157] 4.每108个细胞加入100ul CD11c+免疫磁珠。
[0158] 5.混合完全后将细胞置于冰箱内(2-8度)孵育15分钟。
[0159] 6.每107个细胞加1-2ml buffer缓冲液洗涤，200g离心10分钟，弃去上清液。
[0160] 7.每108个细胞用500ul buffer缓冲液混悬。
[0161] 8.将细胞分选柱放于免疫磁珠分选器上。
[0162] 9.用3ml缓冲液润洗分选柱。
[0163] 10.向分选柱内加入细胞悬浮液，收集流出来的未标记细胞。
[0164] 11.向分选柱内加入适量缓冲液冲洗，共3次，收集流出来的未标记细胞。收集10与11中的流出物，此为未标记的阴性细胞。
[0165] 12.把分选柱从分选器上移下，向分选柱中加入5ml缓冲液，迅速用与分选柱配套的活塞将细胞悬液推下来，收集到的细胞即为标记的阳性细胞。
[0166] 13.取一个新的分选柱重复8-12步骤再次筛选被洗脱的细胞悬液，以便提高细胞的纯度。
[0167] 3.细胞纯度计算获得的细胞使用流式抗体进行标记，使用流式细胞仪进行检测，然后使用软件对数据进行分析。
[0168] 免疫磁珠检测小鼠脾脏来源B细胞、CD8+T细胞的分离纯化
[0169] 小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备
[0170] 1.颈椎脱臼法处死小鼠，依次将小鼠放入75％乙醇、碘伏溶液中各2秒钟再浸没于75％乙醇中5分钟，然后取出小鼠在无菌状态下剪开腹部皮肤取出脾脏，用PBS溶液冲洗脾脏。
[0171] 2.去除脾脏表面脂肪及筋膜后将其放入磁珠专用缓冲液中，并将其分成细小碎块。
[0172] 3.将脾脏碎块置于200目滤网上用注射器活栓头部研磨，滤网下接一平皿以收集细胞，将收集到的细胞悬液放入离心管中，1500rpm离心10分钟，弃去上清液，加入8ml无菌红细胞裂解液吹打混匀室温静置2分钟以溶解红细胞后加入6ml免疫磁珠缓冲液终止裂解。
[0173] 4.1500rpm离心10分钟后弃去上清液，按此方法洗涤2次。
[0174] 5.将细胞悬液用预选滤器过滤后移到一个新的离心管中，计数细胞数量。
[0175] 2.分离纯化细胞B细胞和CD8+T细胞
[0176] 1)取4×107细胞，1200r/min离心10min，去上清液后用160μL缓冲液重悬，(CD8+T细胞需加40μL抗体Cocktail充分混匀),4℃孵育10min
[0177] 2)加160μL缓冲液，1200r/min离心10min，去上清液，再加入320μL缓冲液，加入80μL相应磁性微珠，充分混匀，4℃孵育15min
[0178] 3)用适量缓冲液冲洗，1200r/min离心10min；
[0179] 4)吸除上清液，用500μL缓冲液重悬细胞，200目筛网过滤成无气泡的单细胞悬液；
[0180] 5)将MS细胞分离柱置于MACS磁力架上，先用500μL缓冲液洗柱，再将细胞悬液通过MS柱,1500μL缓冲液洗涤,收集流出液体；离心收集细胞,计数。
[0181] 3.细胞纯度计算获得的细胞使用流式抗体进行标记，使用流式细胞仪进行检测，然后使用软件对数据进行分析。
[0182] iii)应用Western blot及实时荧光定量PCR技术分别检测CD4+CD25+Treg细胞中FGL2蛋白及mRNA表达水平,同理获得纯化的Th17细胞，测定IL-17的mRNA表达；
[0183] iv)取正常健康小鼠为对照组，重复上述检测项目。
[0184] 请参考图6，再次，基于A2组研究FGL2对IBD中下游免疫活性改变影响,分别制备A2组IBD小鼠的骨髓和脾脏样本，其中从小鼠股骨及肱骨中分离获得骨髓来源的DC，主要是BM-DC，经IL-4、GM-CSF刺激培养6天后，利用CD11c免疫磁珠分选试剂盒获取高纯度的DCs；
[0185] 随后利用免疫荧光技术评价DC细胞内NF-κ-B-p65的活性，细胞核用DAPI进行复染以观察NF-κB的核转移现象，最后利用荧光显微镜进行定位定性分析；
[0186] 流式细胞术检测DC细胞表面抗原分子CD80、CD86及MHC-II的表达情况；
[0187] 最后，无菌条件下切取小鼠脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞，计数后按比例加入适当的磁珠后孵育培养，其中CD19为B淋巴细胞磁珠分选标记，免疫磁珠负性分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD8+T细胞；酶联免疫斑点法检测B细胞的功能状态；TUNEL法评价B细胞的凋亡情况；混合淋巴细胞的反应检测T细胞的增殖活性；取正常健康小鼠为对照组，重复上述检测项目。
[0188] 实施例二
[0189] 本技术方案与实施例一的区别点在于主要研究基因敲除小鼠模型验证FGL2的免疫作用途径。
[0190] a)FGL2-/-小鼠造模，利用基因敲除实验动物平台，构建FGL2 knockout载体，将含该载体的细胞囊胚注射获得嵌合体小鼠，设置B0组，所述B0组由嵌合体小鼠繁殖出生殖细胞系FGL2-/-小鼠；随机获取G2代基因敲除小鼠的血液标本，测定FGL2 mRNA表达情况，若为阴性表达则说明造模成功；
[0191] b)评估FGL2-/-小鼠模型是否自发发生IBD；
[0192] c)FGL2-/-小鼠中Treg/Th17细胞免疫平衡及相关细胞因子的评估：
[0193] 获取B0组FGL2-/-小鼠组织和血浆，制备单细胞悬液，采用流式细胞术分析CD4+CD25+Treg细胞占总CD4+T百分比、CD4+IL-17+标记Th17占总CD4+T百分比；经免疫磁珠分选后测定纯化后的Th17中IL-17的mRNA表达；
[0194] 制备B0组FGL2-/-，取小鼠外周血及肠道组织样本，利用实时荧光定量PCR，测定FoxP3、RORγT的mRNA表达以验证FCM中Treg/Th17的数量比例；
[0195] 制备B0组FGL2-/-小鼠血浆样本，利用酶联免疫吸附试验分布测定IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度，同时测定CRP、ESR的改变情况；以A0组为对照；
[0196] d)FGL2缺失对下游免疫活性改变的影响：
[0197] 同“方案1-步骤E”，分别检测FGL2缺失情况下，分析FGL2缺失对固有免疫中DC细胞成熟、体液免疫及细胞免疫的影响；取正常健康小鼠为对照组；
[0198] e)FGL2生物制剂逆转过度免疫激活的研究：
[0199] 外源性导入FGL2生物制剂，分为注射给药组B1、口服给药组B2，重复步骤c和步骤d，以验证FGL2能够逆转FGL2-/-基因敲除小鼠过度免疫激活的状态。
[0200] 实施例三
[0201] 本实施例与上述实施例的区别在于推断FGL2缺失造成IBD炎症反应加重的影响环节包括以下步骤；
[0202] A)在FGL2-/-基因敲除小鼠的基础上继续诱导出IBD模型，取HE染色下“炎症细胞浸润超过50％”为造模成功组为C组，同时测定C组IL-17、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的浓度、及CRP、ESR的改变情况；
[0203] B)重复步骤c和步骤d，取A2组为对照，测定DC细胞、B细胞、细胞毒性T细胞的功能活性，以验证FGL2的缺失是否会进一步强化IBD中上述免疫细胞的功能状态。
[0204] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0205] 以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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