一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法
专利汇可以提供一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法，包括以下步骤：步骤一：模型制备；步骤二：药物制备；步骤三： 给药 ；步骤四：观察指标；步骤五：数据分析；模型组下丘脑中CGRP含量明显降低，NPY、5-HT含量明显升高，说明在寒凝血瘀型家兔ASO发展过程中CGRP分泌减少，NPY分泌增强，5-HT表达增强；三个给药组下丘脑CGRP含量明显升高，NPY含量均有所减低，5-HT含量均明显减低说明当归四逆汤能够上调下丘脑中CGRP的分泌，抑制NPY的分泌，减弱5-HT的表达，延缓动脉硬化闭塞症的发展 进程 。本发明的有益效果是，实用性强。，下面是一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法专利的具体信息内容。
1.一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：模型制备
选用雄性日本纯种大白兔20只，体重约2-2.5Kg,使用基础饲料基础上添加6%的脂肪+
1.5%的胆固醇构成的高脂高胆固醇饲料进行饲养，将二十只实验兔单笼饲养，适应性喂养一周后，按照随机数字表法将五十只雄性大耳白兔随机分成两组，即正常组十 只、模型大组四十只，参照用冰水冷冻的方法建立寒凝血瘀型动物模型，参照新型家兔动脉粥样硬化狭窄模型的建造方法，并在其基础上稍作改良复制 ASO疾病模型，将模型大组再随机分成四组，即模型组，当归四逆汤低剂量组、中剂量组和高剂量组；
步骤二：药物制备
当归四逆汤的制备：当归四逆汤由当归9g、桂枝 9g、芍药9g、细辛3g、甘草6g、通草6g、大枣5枚组成，经水煎、醇沉后制成提取液, 每毫升含中药生药为0.58g；
步骤三：给药
按人和动物体表面积折算的等效剂量比率表计算，用药组低中高剂量以1、2、4 倍于临床等效剂量给药，分别灌胃当归四逆汤提取液 0.95ml/（Kg.d）、1.9 ml/（Kg.d）、3.8 ml/（Kg.d）（三组均用生理盐水定容为10mL），正常组和模型组灌胃生理盐水 10ml，1次/d，连续给药2周；
步骤四：观察指标
1）、一般情况观察：观察造模过程中模型组家兔是否出现跛行、肢端营养障碍、破溃及坏死；冰水冷冻结束后观察模型组家兔是否出现寒凝血瘀证的表现；
2）、股动脉取材及病理形态学观察；
3）、BLOD-fMRI 技术对家兔脑功能的检测；
4）、家兔脑组织 5-HT、CGRP、YNPY 的含量检测；
步骤五：数据分析
实验数据应用SPSS17.0进行统计分析，数据以均数±标准差（χ±s）表示，各组下丘脑神经递质的含量变化采用单因素方差分析，各组比较用LSD（leastsignificant difference）法，以P＜0.05作为具有显著性差异的标准。
2.根据权利要求1所述的一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法，其特征在于，所述股动脉取材及病理形态学观察步骤为：
1）、取材：将多聚甲醛溶液中股动脉组织取出进行修块；
2）、冲洗：将修剪好的组织用蒸馏水冲洗，洗去固定液，以防染色时固定液残留于组织中，影响染色效果；
3）标记：取材后标记检验号，以防混乱造成差错；取材后将剩余组织保留，以便复检之用；
4）脱水：80%酒精（3-5h）→85%酒精（3-5h）→95%酒精Ⅰ（1h加温）→95%酒精Ⅱ（加温1h）→无水酒精Ⅰ（加温0.5h）→无水酒精Ⅱ（加温0.5h）；
5）透明：将脱水后的组织经二甲苯Ⅰ（15min）→二甲苯Ⅱ（15min）；
6）浸蜡：将盛有石蜡的蜡杯放入58℃的恒温箱熔化，然后把透明后的组织块放入蜡杯中0.5-1h；
7）包埋：将石蜡倒入包埋框，然后将蜡杯中的组织块放入其中，切面向下，完全凝固后，将蜡块推出；
8）切片与贴片;在冷冻台上修整蜡块，切去余蜡部分，将修好的蜡块安装在持蜡器上，安装好切片刀并调整厚度为4～5μm切片，用眼科镊轻轻夹起切下的蜡片平铺在40～45℃的水面上，将蜡片自然展平，然后放到载玻片的中段倾去余水，置于60～65℃的恒温箱内烤片
15～30min，熔化组织间隙的石蜡；
9）脱蜡：二甲苯Ⅰ（3min）→二甲苯Ⅱ（3min）→无水酒精Ⅰ（1min）
→无水酒精Ⅱ（1min）→95%酒精Ⅰ（1min）→95%酒精Ⅱ（1min）→85%酒精（1min）；
10）苏木素-伊红染色：苏木精液染色 3-6 min→流水洗去苏木精液 1-2min→1%盐酸酒精 1-3S→稍水洗 1-2S→促蓝液返蓝5-10S→流水冲洗15-30S→0.5%伊红液染色2-3min→蒸馏水稍洗1-2S；
11）脱水、透明、封片：85%酒精（1min）→95%酒精Ⅰ（1min）→95%酒精Ⅱ（1min）→无水酒精Ⅰ（1min）→无水酒精Ⅱ（1min）→二甲苯Ⅰ（1min）→二甲苯Ⅱ（1min）；最后用中性树胶封片；
12）高倍光学显微镜下观察各组织细胞结构，并拍照留存。
3.根据权利要求1所述的一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法，其特征在于，所述BLOD-fMRI 技术对家兔脑功能的检测方法为：随机每组抽取 2 个样本，按正常组、模型组、当归四逆汤高剂量组、当归四逆汤中剂量组、当归四逆汤低剂量组顺序，编成
1-10 个号，采用 BLOD-fMRI 技术探查其以边缘下丘脑为重点的相关脑区功能的变化；
第一步磁共振扫描采集图片：静息态 BOLD-fMRI—single-shot EPI，TR/TE（重复时间/回波时间）=2000ms/35ms,FA（激励角度） =900 ，FOV( 视野)=100mmX100mm，Matrix（矩阵）=64X64,THINK/GAP(层厚/间隔）=2mm/0，Slice（层数）=14，Time（扫描时长）=8min，扫描层面平行于丘脑且垂直于脑干覆盖头颅颅脑全部，过程中头颅全程制动；
第二步图像数据预处理：将磁共振扫描的原始数据通过 MRIConvet 软件将Dicom 格式数据转化成 Nifti 格式，再使用 SPM8 进行图像预处理，预处理经过以下步骤：（1）slice timing对图像进行时间层矫正，（2）realign对图像进行头动矫正，（3）filter对图像进行滤波处理图像经过预处理之后，进行 ALFF 值计算，按照 0.05 的阈值检查图像激活的脑区。
4.根据权利要求1所述的一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法，其特征在于，家兔脑组织5-HT、CGRP、YNPY的含量检测方法：用骨钳断开兔脑，用组织剪沿颅骨顶部正中剪开皮肤暴露骨性兔脑，用钝剪沿兔脑截断面上缘正中朝兔嘴方向剪开1cm，然后用止血钳沿剪开的口，逐渐将兔脑顶部骨片钳开，暴露兔脑，用眼科镊将兔脑轻轻夹出，置于冰盘上，吸去血迹，用眼科镊将脑组织上的血管和膜性组织剔除，小心分离下丘脑，分离出之后迅速将其放入冻存管内，然后将冻存管即可放入-80℃冰箱保存，采用酶联免疫法检测各组下丘脑相关脑组织中5-HT、CGRP、YNPY的含量。
一种基于心主血脉理论的动脉硬化闭塞症防止方法
技术领域
背景技术
发明内容
选用雄性日本纯种大白兔20只，体重约2-2.5Kg,使用基础饲料基础上添加6%的脂肪+
1.5%的胆固醇构成的高脂高胆固醇饲料进行饲养，将二十只实验兔单笼饲养，适应性喂养一周后，按照随机数字表法将五十只雄性大耳白兔随机分成两组，即正常组十只、模型大组四十只，参照用冰水冷冻的方法建立寒凝血瘀型动物模型，参照新型家兔动脉粥样硬化狭窄模型的建造方法，并在其基础上稍作改良复制 ASO疾病模型，将模型大组再随机分成四组，即模型组，当归四逆汤低剂量组、中剂量组和高剂量组；
步骤二：药物制备
当归四逆汤的制备：当归四逆汤由当归9g、桂枝 9g、芍药9g、细辛3g、甘草6g、通草6g、大枣5枚组成，经水煎、醇沉后制成提取液, 每毫升含中药生药为0.58g；
步骤三：给药
按人和动物体表面积折算的等效剂量比率表计算，用药组低中高剂量以1、2、4 倍于临床等效剂量给药，分别灌胃当归四逆汤提取液 0.95ml/（Kg.d）、1.9 ml/（Kg.d）、3.8 ml/（Kg.d）（三组均用生理盐水定容为10mL），正常组和模型组灌胃生理盐水 10ml，1次/d，连续给药2周；
步骤四：观察指标
1）、一般情况观察：观察造模过程中模型组家兔是否出现跛行、肢端营养障碍、破溃及坏死；冰水冷冻结束后观察模型组家兔是否出现寒凝血瘀证的表现；
2）、股动脉取材及病理形态学观察；
3）、BLOD-fMRI 技术对家兔脑功能的检测；
4）、家兔脑组织 5-HT、CGRP、YNPY 的含量检测；
步骤五：数据分析
实验数据应用SPSS17.0进行统计分析，数据以均数±标准差（χ±s）表示，各组下丘脑神经递质的含量变化采用单因素方差分析，各组比较用LSD法，以P＜0.05作为具有显著性差异的标准；
所述股动脉取材及病理形态学观察步骤为：
1）、取材：将多聚甲醛溶液中股动脉组织取出进行修块；
2）、冲洗：将修剪好的组织用蒸馏水冲洗，洗去固定液，以防染色时固定液残留于组织中，影响染色效果；
3）标记：取材后标记检验号，以防混乱造成差错；取材后将剩余组织保留，以便复检之用；
4）脱水：80%酒精（3-5h）→85%酒精（3-5h）→95%酒精Ⅰ（1h加温）→95%酒精Ⅱ（加温1h）→无水酒精Ⅰ（加温0.5h）→无水酒精Ⅱ（加温0.5h）；
5）透明：将脱水后的组织经二甲苯Ⅰ（15min）→二甲苯Ⅱ（15min）；
6）浸蜡：将盛有石蜡的蜡杯放入58℃的恒温箱熔化，然后把透明后的组织块放入蜡杯中0.5-1h；
7）包埋：将石蜡倒入包埋框，然后将蜡杯中的组织块放入其中，切面向下，完全凝固后，将蜡块推出；
8）切片与贴片;在冷冻台上修整蜡块，切去余蜡部分。将修好的蜡块安装在持蜡器上，安装好切片刀并调整厚度为4～5μm切片，用眼科镊轻轻夹起切下的蜡片平铺在40～45℃的水面上，将蜡片自然展平，然后放到载玻片的中段倾去余水，置于60～65℃的恒温箱内烤片
15～30min，熔化组织间隙的石蜡；
9）脱蜡：二甲苯Ⅰ（3min）→二甲苯Ⅱ（3min）→无水酒精Ⅰ（1min）
→无水酒精Ⅱ（1min）→95%酒精Ⅰ（1min）→95%酒精Ⅱ（1min）→85%酒精（1min）；
10）苏木素-伊红染色：苏木精液染色 3-6 min→流水洗去苏木精液 1-2min→1%盐酸酒精 1-3S→稍水洗 1-2S→促蓝液返蓝5-10S→流水冲洗15-30S→0.5%伊红液染色2-3min→蒸馏水稍洗1-2S；
11）脱水、透明、封片：85%酒精（1min）→95%酒精Ⅰ（1min）→95%酒精Ⅱ（1min）→无水酒精Ⅰ（1min）→无水酒精Ⅱ（1min）→二甲苯Ⅰ（1min）→二甲苯Ⅱ（1min）；最后用中性树胶封片；
12）高倍光学显微镜下观察各组织细胞结构，并拍照留存。
第一步磁共振扫描采集图片：静息态 BOLD-fMRI—single-shot EPI，TR/TE（重复时间/回波时间）=2000ms/35ms,FA（激励角度） =900 ，FOV(视野)=100mmX100mm，Matrix（矩阵）=64X64,THINK/GAP(层厚/间隔）=2mm/0，Slice（层数）=14，Time（扫描时长）=8min，扫描层面平行于丘脑且垂直于脑干覆盖头颅颅脑全部，过程中头颅全程制动；
第二步图像数据预处理：将磁共振扫描的原始数据通过 MRIConvet软件将Dicom格式数据转化成Nifti格式，再使用SPM8进行图像预处理，预处理经过以下步骤：1）slice timing对图像进行时间层矫正，2）realign对图像进行头动矫正，3）filter对图像进行滤波处理图像经过预处理之后，进行 ALFF值计算，按照0.05的阈值检查图像激活的脑区。
具体实施方式
一般情况观察结果：
实验过程中模型组麻醉时死亡1只，造模过程中正常组和模型组均有1只家兔大便成糊状，肛门周围粘连许多粪便，纳差，精神萎靡，少动，消瘦，给予庆大霉素及氟哌酸胶囊无效，
3天后相继死亡，死亡原因考虑肠炎；实验中所有动物未出现肢端的破溃、坏死；模型组家兔出现精神萎靡不振、肢端皮肤较暗、耸毛、毛色少泽、纳差、蜷缩少动，舌色较正常组暗，大便变软，小便多等寒凝血瘀证的表现；三个给药组与模型组比较，家兔精神状态有不同程度改善，耸毛次数减少，毛色恢复光泽，饲料消耗量有不同程度的增加，以中、高剂量组改善较为明显；造模结束后正常组家兔剩余9只，模型大组家兔38只；将模型组随机抽出2只作为备用，剩余36只，参照随机数字表法分成4组，每组9只，即模型组，当归四逆汤低剂量组、中剂量组和高剂量组。
模型组：血管中膜变厚，内皮细胞部分脱落，内皮下间隙变宽。中膜 VSMC增殖明显，排列紊乱，排列不规则，部分垂直于内膜生长，有大量泡沫细胞形成及炎性细胞浸润；
当归四逆汤高剂量组：血管内膜表面较模型组光滑，中膜层较模型组明显变薄，VSMC 增生较少,形态基本正常，排列较模型组整齐，泡沫细胞和炎性细胞明显减少；
当归四逆汤中剂量组：血管内膜和中膜较模型组变薄，中膜平滑肌增生紊乱降低，血管内膜表面基本光滑，细胞间隙基本正常；
当归四逆汤低剂量组：血管内膜和中膜较模型组略微变薄，内皮下间隙增宽，VSMC 增殖较模型组减弱，血管连续性破坏稍减轻。
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