适合用于移植的脐带血细胞部分的选择方法以及用途
阅读：495发布：2020-05-11
专利汇可以提供适合用于移植的脐带血细胞部分的选择方法以及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种选择用于离体扩增、分离CD133+/CD34+阳性部分以及未培养的CD133+/CD34+阴性部分的多个脐带血单位的方法、一种用于扩增所述选择的CD133+/CD34+部分的方法、一种用于选择用于移植入有需要的多个受试者的多个CD133+/CD34+脐带血细胞的多个扩增的群体的方法、以及一种将适当选择的离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分以及未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分于临床环境中的移植用于血液 恶性 肿瘤 治疗 的 治疗用途 。本发明还预想了包括所述扩增的以及未选择的脐带血部分的 试剂 盒 。，下面是适合用于移植的脐带血细胞部分的选择方法以及用途专利的具体信息内容。
1.一种选择用于离体扩增以及移植入一受试者的一解冻的脐带血单位的方法，其特征在于：所述方法包括：在将所述脐带血单位分离为CD133+/CD34+部分以及CD/133-/CD34-部分前，确定在所述解冻的脐带血单位中所述多个细胞的存活率百分比，以及选择具有约
40％至约85％存活率的多个单位，从而选择适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一解冻的脐带血单位。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括：选择具有约40％至约70％存活率的多个单位。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法更包括步骤：
(a)将适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的被选择的所述解冻的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；
(b)在所述第一选择的CD133+/CD34+部分中，确定以下多个分离后的参数：
(i)约20×105至约75×105个细胞总数；
(ii)约70％至约85％的存活率；
(iii)约70％至约85％的多个CD133+细胞；
(iv)约70％至约85％的多个CD34+细胞；
(v)在CD133+/CD34+选择后，约0.02％至约1％的产率；
(vi)每1000个细胞约15至约75个菌落形成单位；以及
(vii)低于3内毒素单位/毫升的内毒素；以及
(c)根据所述多个参数选择或排除所述第一选择的CD133+/CD34+部分，从而选择适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一CD133+/CD34+脐带血部分。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)的分离包括对CD133+的免疫磁珠选择。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分包括低于0.5％的多个CD133+/CD34+细胞。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分包括低于0.01％的多个CD133+/CD34+细胞。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分包括多个免疫细胞，所述多个免疫细胞包含多个T淋巴细胞、多个B淋巴细胞以及多个自然杀手(NK)细胞。
8.一种制备用于移植入一受试者的一脐带血单位的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)将适合用于移植入所述受试者的一单一的解冻的脐带血单位分离为：
(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；以及
(b)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清与多个细胞因子以及烟酰胺，所述多个细胞因子包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述第一选择的CD133+/CD34+血细胞部分(a)(i)是根据权利要求3或4中任一项所述的方法选择的适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一CD133+/CD34+脐带血部分。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述方法更包括：排除在所述离体扩增的第7天或第14天具有大于3.0内毒素单位/毫升的内毒素、及/或细菌、酵母菌或霉菌生长的多个单位。
11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其特征在于：适合用于移植的所述单一的脐带血单位的特征为以下多个冷冻保存前的参数：
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(i)约8×10至约15×10个CD34+细胞总数；
(ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；
(iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；以及
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(iv)每公斤受试者体重具有约1.5×10至约3.0×10个冷冻保存前的有核细胞总数。
12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其特征在于：所述血清包括10％胎牛血清。
13.如权利要求8至12中任一项所述的方法，其特征在于：所述多个细胞因子包括干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个，且分别为50奈克。
14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，其特征在于：所述烟酰胺以2.5毫摩尔提供。
15.如权利要求8至14中任一项所述的方法，其特征在于：所述离体培养进行18至25天。
16.如权利要求8至14中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法更包括：在培养19至
23天后，收获离体培养的所述第一选择的CD133+/CD34+部分。
17.如权利要求8至14中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法更包括：在培养21天后，收获离体培养的所述第一选择的CD133+/CD34+部分。
18.如权利要求8至17中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法更包括：分别地冷冻保存包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的离体培养的所述第一选择的血细胞部分以及包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分。
19.一种选择用于移植入一受试者的包括多个CD133+/CD34+选择的脐带血细胞的多个离体培养的脐带血细胞部分的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)在离体扩增后，在所述离体培养的脐带血部分确定以下多个参数：
(i)约8×108至约15×108个活细胞总数；
(ii)约70至85％的所述多个细胞的存活率；
(iii)约7至15％的多个CD34+细胞；
(iv)约5.6×107至约5×108个CD34+细胞总数；
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(v)约2.4×10至约2×10个CD133+细胞总数；
(vi)约8×105至约25×105个CD133+/CD38-细胞数；
(vii)约8×107至约15×108个CD14+细胞总数；
(viii)约2×108至约2×109个CD15+细胞总数；
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(ix)约8×10至约8×10个CD11b+细胞总数；
(x)约3.2×107至约3×108个CD1(a+c)+细胞总数；
(xi)没有培养的支原体、或细菌、酵母菌或霉菌生长；以及
(b)根据所述多个参数选择或排除所述离体培养的脐带血部分，从而选择适合用于移植入所述受试者的一离体培养的CD133+/CD34+脐带血部分。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：当参数(i)等于至少8×108个活细胞数时，选择所述离体培养的CD133+/CD34+脐带血部分。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述离体培养的脐带血部分是将来自选择用于离体扩增的一脐带血单位根据以下多个冷冻保存前的参数进行培养：
(i)约8×106至约15×106个CD34+细胞总数；
(ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；
(iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；以及
(iv)每公斤受试者体重具有约1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于：所述方法更包括：选择具有一淡黄色、混浊至不透明颜色且无白色团块与异物的多个离体培养的脐带血部分。
23.一种选择用于移植入一受试者的包括多个CD133/CD34阴性细胞的多个未选择的脐带血细胞部分的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)在对多个CD133/CD34阴性细胞选择后，在所述未培养的脐带血部分中确定以下多个参数：
(i)约4×108至约15×108个活细胞总数；
(ii)约70至85％的所述多个细胞的存活率；
(iii)约2.4×107至约8×107个CD3+细胞数；
(iv)没有细菌、酵母菌或霉菌生长；以及
(b)根据所述多个参数选择或排除所述未选择的脐带血细胞部分，从而选择适合用于移植入所述受试者的包括多个CD133/CD34阴性细胞的一未选择的脐带血细胞部分。
24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于：所述方法更包括：选择具有一红色、不透明颜色且无白色团块与异物的多个未选择的脐带血细胞部分。
适合用于移植的脐带血细胞部分的选择方法以及用途
[0001] 技术领域与背景技术
[0002] 本发明涉及一种选择用于离体扩增、分离CD133+/CD34+阳性部分以及未培养的CD133+/CD34+阴性部分的多个脐带血单位的方法、一种用于扩增所述选择的CD133+/CD34+部分的方法、一种用于选择用于移植入有需要的多个受试者的多个CD133+/CD34+脐带血细胞的多个扩增的群体的方法、以及一种将适当选择的离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分以及未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分于临床环境中的移植用于血液恶性肿瘤治疗的治疗用途。本发明还预想了包括所述扩增的以及未选择的脐带血部分的试剂盒。
[0003] 超过三分之二的等待造血干细胞移植的患者缺乏一合适的匹配相关供体，因此必须进行非相关的供体移植。脐带血、骨髓以及其他造血丰富的组织是干细胞的一宝贵来源，特别是在一合理时间内无法找到一匹配的非相关供体的情况下。使用脐带血的优点包含以下事实：脐带血易于获得、携带血源性传染病的风险较小，且与来自相关或非相关供体的外周血(peripheral blood)或骨髓的相似不匹配的干细胞相比，脐带血可以跨越HLA屏障进行移植，从而降低移植物抗宿主疾病的风险。脐带血的另一个重要优点是，一旦鉴定出是一可接受的脐带血单位，就可以迅速地获得。
[0004] 然而，与动员的外周血(PB)或骨髓相比，脐带血的一主要临床限制是可用于移植的干细胞剂量低。这种低干细胞剂量可能会损害移植的机会，并且造成中性粒细胞(neutrophil)与血小板恢复的动力学、以及其他移植结果的延迟，从而导致移植相关的并发症、发病率与死亡率、以及更长的住院时间。为了克服此缺点，已经开发了多种方法，包含双脐带血移植(dual umbilical cord blood transplantation，DCBT)以及脐带血干细胞的离体扩增(ex vivo expansion)。对于无法获得足够细胞剂量的一单一脐带血单位的接受者，DCBT已成为脐带血移植中的一标准做法。
[0005] 尽管如此，DCBT的移植动力学并不比单一单位移植更好。离体扩增仍然是一种实验方法。脐带血离体扩增的目的是为一移植物提供足够数量的细胞，这些细胞具有快速且强健的体内(in vivo)中性粒细胞与血小板生成潜能，从而能够成功进行移植。Delaney等人(2010，Nat Med 16：232-236)以及De Lima等人(2012，N Engl J Med，367：2305-2315)公开了两项临床研究的结果，该研究采用了在双脐带结构中离体扩增的脐带血移植物，即一个单位用于扩增，且一第二单位实施为未经操作的，报告说，虽然在移植后一周就观察到扩增的细胞，但它们大多在移植之前或之后丢失，而未经操作的细胞在所有接受者中则占主导地位。
[0006] 本发明人已经表明，在细胞因子(SCF、TPO、IL-6以及FLT-3配体)与烟酰胺(nicotinamide)的存在下培养CD133+脐带血细胞会导致晚期以及早期祖细胞(progenitor)二者更好且更持久的扩增(这对于短期的早期三系(trilineage)移植是重要的)、减少分化的单核细胞(myelomonocitic cell)(CD14+、CD11b+、CD11c+)的部分、以及增加分化程度较低的早期祖细胞(CD34+CD38-细胞)的部分。与仅用细胞因子培养的细胞或未培养的细胞相比，用NAM培养后获得的CD34+细胞显示出向SDF-1的迁移增加，且向骨髓(输注后24小时)归巢(home)的效力更高。此外，体外(in vitro)研究表明，这些培养条件不支持T细胞的扩增，且因此在扩增的脐带血部分中只能发现可忽略不计数量的显示T细胞表型的细胞(参见美国专利号7,955,852与8,846,393以及Peled等人(2012，Exp Hematol 40：
342-55))。
342-55))。
[0007] Horowitz等人(2014，J Clin Invest 124：3121-3128)使用双脐带血移植方法，证明从一整个脐带血单位且具有细胞因子以及烟酰胺离体扩增而来的同种异体(allogeneic)干细胞与祖细胞能够在竞争中胜出未经操作的脐带血移植，并提供快速移植以及稳健、长期的多系造血。
[0008] Wagner等人(Cell Stem Cell 2016 18：144-55)报告了在I/II期临床试验中，脐带血造血干细胞用一芳香烃受体拮抗剂作为一独立移植物进行扩增的阳性结果。
发明内容
[0009] 根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种选择用于离体扩增以及移植入一受试者的一解冻的脐带血单位的方法，所述方法包括：在将所述脐带血单位分离为CD133+/CD34+部分以及CD/133-/CD34-部分前，确定在所述解冻的脐带血单位中所述多个细胞的存活率百分比，以及选择具有约40％至约85％存活率的多个单位，从而选择适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一解冻的脐带血单位。
[0010] 根据本发明的一些实施例，所述方法包括：选择具有约40％至约70％存活率的多个单位。
[0011] 根据本发明的一些实施例，所述方法更包括步骤：
[0012] (a)将适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的被选择的所述解冻的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；
[0013] (b)在所述第一选择的CD133+/CD34+部分中，确定以下多个分离后的参数：
[0014] (i)约20×105至约75×105个细胞总数；
[0015] (ii)约70％至约85％的存活率；
[0016] (iii)约70％至约85％的多个CD133+细胞；
[0017] (iv)约70％至约85％的多个CD34+细胞；
[0018] (v)在CD133+/CD34+选择后，约0.02％至约1％的产率；
[0019] (vi)每1000个细胞约15至约75个菌落形成单位；以及
[0020] (vii)低于3内毒素单位/毫升的内毒素；以及
[0021] (c)根据所述多个参数选择或排除所述第一选择的CD133+/CD34+部分，
[0022] 从而选择适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一CD133+/CD34+脐带血部分。
[0023] 根据本发明的一些实施例，所述步骤(a)的分离包括对CD133+的免疫磁珠(immunomagnetic bead)选择。
[0024] 根据本发明的一些实施例，包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分包括低于0.5％的多个CD133+/CD34+细胞。
[0025] 根据本发明的一些实施例，包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分包括低于0.01％的多个CD133+/CD34+细胞。
[0026] 根据本发明的一些实施例，包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分包括多个免疫细胞，所述多个免疫细胞包含多个T淋巴细胞、多个B淋巴细胞以及多个自然杀手(natural killer，NK)细胞。
[0027] 根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种制备用于移植入一受试者的一脐带血单位的方法，所述方法包括：
[0028] (a)将适合用于移植入所述受试者的一单一的解冻的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；
[0029] (b)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清与多个细胞因子以及烟酰胺，所述多个细胞因子包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间。
[0030] 根据本发明的一些实施例，所述第一选择的CD133+/CD34+血细胞部分(a)(i)是根据权利要求3或4中任一项所述的方法选择的适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一CD133+/CD34+脐带血部分。
[0031] 根据本发明的一些实施例，所述方法更包括：排除在所述离体扩增的第7天或第14天具有大于3.0内毒素单位/毫升的内毒素、及/或细菌、酵母菌或霉菌生长的多个单位。
[0032] 根据本发明的一些实施例，适合用于移植的所述单一的脐带血单位的特征为以下多个冷冻保存前(pre-cryopreservation)的参数：
[0033] (i)约8×106至约15×106个CD34+细胞总数；
[0034] (ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；
[0035] (iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；以及
[0036] (iv)每公斤受试者体重具有约1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0037] 根据本发明的一些实施例，所述血清包括10％胎牛血清。
[0038] 根据本发明的一些实施例，所述多个细胞因子包括干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个，且分别为50奈克。
[0039] 根据本发明的一些实施例，所述烟酰胺以2.5毫摩尔(mM)提供。
[0040] 根据本发明的一些实施例，所述离体培养进行18至25天。
[0041] 根据本发明的一些实施例，所述方法更包括：在培养19至23天后，收获离体培养的所述第一选择的CD133+/CD34+部分。
[0042] 根据本发明的一些实施例，所述方法更包括：在培养21天后，收获离体培养的所述第一选择的CD133+/CD34+部分。
[0043] 根据本发明的一些实施例，所述方法更包括：分别地冷冻保存包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的离体培养的所述第一选择的血细胞部分以及包括多个CD133/CD34阴性细胞的所述第二未选择的血细胞部分。
[0044] 根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种选择用于移植入一受试者的包括多个CD133+/CD34+选择的脐带血细胞的多个离体培养的脐带血细胞部分的方法，所述方法包括：
[0045] (a)在离体扩增后，在所述离体培养的脐带血部分确定以下多个参数：
[0046] (i)约8×108至约15×108个活细胞总数；
[0047] (ii)约70至85％的所述多个细胞的存活率；
[0048] (iii)约7至15％的多个CD34+细胞；
[0049] (iv)约5.6×107至约5×108个CD34+细胞总数；
[0050] (v)约2.4×107至约2×108个CD133+细胞总数；
[0051] (vi)约8×105至约25×105个CD133+/CD38-细胞数；
[0052] (vii)约8×107至约15×108个CD14+细胞总数；
[0053] (viii)约2×108至约2×109个CD15+细胞总数；
[0054] (ix)约8×107至约8×109个CD11b+细胞总数；
[0055] (x)约3.2×107至约3×108个CD1(a+c)+细胞总数；
[0056] (xi)没有培养的支原体、或细菌、酵母菌或霉菌生长；以及
[0057] (b)根据所述多个参数选择或排除所述离体培养的脐带血部分，
[0058] 从而选择适合用于移植入所述受试者的一离体培养的CD133+/CD34+脐带血部分。
[0059] 根据本发明的一些实施例，当参数(i)等于至少8×108个活细胞数时，选择所述离体培养的CD133+/CD34+脐带血部分。
[0060] 根据本发明的一些实施例，所述离体培养的脐带血部分是将来自选择用于离体扩增的一脐带血单位根据以下多个冷冻保存前的参数进行培养：
[0061] (i)约8×106至约15×106个CD34+细胞总数；
[0062] (ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；
[0063] (iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；以及
[0064] (iv)每公斤受试者体重具有约1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0066] 根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种选择用于移植入一受试者的包括多个CD133/CD34阴性细胞的多个未选择的脐带血细胞部分的方法，所述方法包括：
[0067] (a)在对多个CD133/CD34阴性细胞选择后，在所述未培养的脐带血部分中确定以下多个参数：
[0068] (i)约4×108至约15×108个活细胞总数；
[0069] (ii)约70至85％的所述多个细胞的存活率；
[0070] (iii)约2.4×107至约8×107个CD3+细胞数；
[0071] (iv)没有细菌、酵母菌或霉菌生长；以及
[0072] (b)根据所述多个参数选择或排除所述未选择的脐带血细胞部分，
[0073] 从而选择适合用于移植入所述受试者的包括多个CD133/CD34阴性细胞的一未选择的脐带血细胞部分。
[0074] 根据本发明的一些实施例，所述方法更包括：选择具有一红色、不透明颜色且无白色团块与异物的多个未选择的脐带血细胞部分。
[0075] 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文中所描述的相似或等同的方法以及材料可以用于本发明的实施例的实践或测试，但以下所描述的示例性方法及/或材料，在有冲突的情况下，以专利说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法以及实例仅是说明性的，并非旨在一定是限制性的。
具体实施方式
[0076] 本发明涉及一种选择用于离体扩增、分离CD133+/CD34+阳性部分以及未培养的CD133+/CD34+阴性部分的多个脐带血单位的方法、一种用于扩增所述选择的CD133+/CD34+部分的方法、一种用于选择用于移植入有需要的多个受试者的多个CD133+/CD34+脐带血细胞的多个扩增的群体的方法、以及一种将适当选择的离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分以及未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分于临床环境中的移植用于血液恶性肿瘤治疗的治疗用途。本发明还预想了包括所述扩增的以及未选择的脐带血部分的试剂盒。
[0077] 本发明还涉及一种包括扩增的脐带血单位的试剂盒，以及其在血液恶性肿瘤治疗中的使用说明。
[0078] 在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应理解的是，本发明的应用并不一定限于以下描述中所述的细节。本发明能够以其他实施例或以各种方式实践或执行。
[0079] 同种异体造血干细胞移植是血液疾病患者的一种挽救生命的方法。然而，此方法的广泛应用受到适合的HLA匹配供体的限制。
[0080] 因此，脐带血移植是常规地且更成功地用于儿科移植环境中(根据所推荐的阈值细胞剂量，血库中仅20％的脐带血单位可满足一75公斤患者的需要)。接受脐带血移植的成年人由于延迟的移植以及较高的移植失败率，因此早期死亡率(第100天的死亡率高达30至60％)与感染的风险高。事实上，回顾脐带血与其他移植来源之间结果差异的发表一致地报告，脐带血移植后的非复发死亡率较高，通常归因于造血恢复不足，且延迟的移植已被视为成功进行脐带血移植的最大障碍，也是导致早期非复发死亡率的最重要因素。
[0081] 目前可用的多种移植物生产方法的一重大挑战是在不损害分化程度较低的祖细胞(CD34+CD38-或CD34+Lin-细胞)数量的前提下，产生多个定向(committed)造血祖细胞的一扩增的群体的能力。本发明提供了一种利用烟酰胺(NAM)的扩增技术，用于增加骨髓归巢以及移植效力。移植是一多步骤的过程，其涉及多个接种细胞(inoculated cell)的定向迁移、归巢至所述骨髓(BM)、在所述BM生态位(niche)内保留、然后进行自我更新以及分化。与新鲜的CD34+细胞相比，由于归巢至所述骨髓不良，或者由于培养中增强的分化而降低自我更新，扩增后的移植效力低是已知的。
[0082] 本文中提供的用于选择多个脐带血单位以及离体扩增多个造血祖细胞(HPC)的方法允许增加其数量，同时维持其自我更新的能力与其归巢至所述骨髓(BM)的能力，并有效地重建造血。烟酰胺的添加延迟分化以及提高脐带血来源的纯化的CD133+细胞的归巢与移植效力，所述纯化的CD133+细胞与4种细胞因子(FLT3、SCF、TPO以及IL6)的一组合培养21(+/-2)天(19至23天)。由于这些培养条件不支持多个T细胞的扩增(在所述多个培养的、扩增的细胞中只能发现可忽略不计数量的显示T细胞表型的细胞)，因此本发明提供了一种源自相同脐带血单位的未培养的、未经操作的部分，以提供多个T细胞。
[0083] 本发明提供了一种选择用于制备培养的离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分以及未培养的CD133/CD34阴性脐带血部分的多个脐带血单位的标准、一种所述CD133+/CD34+脐带血部分的培养以及离体扩增的方法、一种选择适合用于移植且有效移植的可能性高的扩增的CD133+/CD34+脐带血部分以及未培养的CD133/CD34阴性脐带血部分的标准、以及一种冷冻保存与制备所述培养的以及未培养的脐带血部分的方法。本发明还提供了使用扩增的CD133+/CD34+脐带血部分以及未培养的CD133/CD34阴性脐带血部分的方法，其在用于恶性血液疾病的治疗的临床环境中符合用于移植的选择标准。
[0084] 用于离体扩增脐带血单位的选择
[0085] 根据一些实施例，本发明提供了一种选择用于离体扩增以及移植入一受试者的一冷冻保存的脐带血单位的方法，其包括：在离体扩增前，在所述脐带血单位中确定以下多个冷冻保存前的参数：
[0086] (i)约8×106至约15×106个CD34+细胞总数；
[0087] (ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；
[0088] (iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；
[0089] (iv)每公斤受试者体重具有约1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数；以及
[0090] 根据所述多个参数选择或排除所述脐带血单位，从而选择适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一脐带血单位。
[0091] 所有脐带血单位均从符合国家适用法规的公共血库取得。捐赠者根据相关法规要求进行筛选以及测试。脐带血库通常采用用于有效存储新鲜收获的脐带血的方法，包含红细胞消耗以及血浆消耗，从而导致体积减少以及减少体积的脐带血单位的冷冻保存。在所述脐带血单位的冷冻保存之前，先分析所述单位的一样品以产生所述单位的一概况，包含但不限于细胞存活率、特定细胞群体的数量、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)分型(typing)、以及安全性标准(例如，细菌/病毒污染)、以及单位体积，其中包括提供所述整个单位的总数值、相对数值(例如，任何特定细胞类型占细胞总数的百分比)以及针对体积调整的数值(例如，一单位体积中任何特定细胞类型的浓度)。如本文中所使用，术语“冷冻保存”是指受到未调节的化学动力学损害的生物实体(例如，细胞、组织、细胞器)通过冷却至极低温度来保存的一过程，通常用固体二氧化碳冷却至-80℃或使用液氮冷却至-196℃。在一个实施例中，多个脐带血细胞用液氮冷冻保存。多个造血细胞群体的保存方法在本领域中是众所周知的(参见Watts等人在分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)中的冷冻保存以及冷冻干燥方案(Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols)，2007；368：237-259)。
[0092] 如本文中所使用，术语“冷冻保存前”是指在冷冻保存之前记录的多个参数、数值或特性，例如，在一储存的冷冻保存的脐带血单位的冷冻保存之前。在一些实施例中，可以参考这些“冷冻保存前”数据以选择用于本发明的所述多个方法中的多个候选脐带血单位。
[0093] 因此，根据本发明的一实施例，确定一脐带血单位的CD34+细胞总数、有核细胞总数、以及红细胞消耗与体积减少的多个冷冻保存前的参数，以便选择或排除用于离体扩增以及移植的所述脐带血单位。当已知用于移植的候选者(例如，所述“受试者”)的身份时，还可以确定例如HLA匹配(相容性)以及每公斤受试者体重具有的冷冻保存前的有核细胞总数的多个参数，并将其作为一选择标准。
[0094] 在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有冷冻保存前的CD34+总数值为约8×106至约15×106个CD34+细胞总数、约9×106至约13×106个CD34+细胞总数、约10×106至约12×106个CD34+细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少12×106个冷冻保存前的CD34+细胞总数。在一个实施例中，选择用于6
离体扩增的多个脐带血单位具有至少8×10个冷冻保存前的CD34+细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少10×106个冷冻保存前的CD34+细胞总数。
离体扩增的多个脐带血单位具有至少8×10个冷冻保存前的CD34+细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少10×106个冷冻保存前的CD34+细胞总数。
[0095] 在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有冷冻保存前的有9 9 9 9
核细胞总数值为约1.8×10至约3.0×10个有核细胞总数、约2×10至约2.7×10个有核细胞总数、或约2.2×109至约2.5×109个有核细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少2.5×109个冷冻保存前的有核细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少2.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数。在
9
一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少1.8×10个冷冻保存前的有核细胞总数。通常，多个有核细胞可以在血细胞计数器(haemocytometer)(例如，纽鲍尔(Neubauer))中手动计数或使用一自动计数器计数。
核细胞总数值为约1.8×10至约3.0×10个有核细胞总数、约2×10至约2.7×10个有核细胞总数、或约2.2×109至约2.5×109个有核细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少2.5×109个冷冻保存前的有核细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少2.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数。在
9
一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少1.8×10个冷冻保存前的有核细胞总数。通常，多个有核细胞可以在血细胞计数器(haemocytometer)(例如，纽鲍尔(Neubauer))中手动计数或使用一自动计数器计数。
[0096] 在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位的每公斤受试者体重具有冷冻保存前的有核细胞总数为每公斤受试者体重具有约1.5×107至约3.0×107个有核细胞总数、每公斤受试者体重具有约1.7×107至约2.8×107个有核细胞总数、每公斤受试者体重具有约1.9×107至约2.5×107个有核细胞总数、或每公斤受试者体重具有约2×107至约2.2×107个有核细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位的每公斤受试者体重具有至少3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位的每公斤受试者体重具有至少2.3×107个冷冻保存前的有核细胞总数。在一个实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位的每公斤受试者体重具有至少1.5×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0097] 在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配、在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少5个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配、或在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少6个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配。在一些实施例中，所述多个脐带单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配，至少一个有HLA-DRB1匹配。在一些实施例中，所述多个脐带单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少5个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配。在一些实施例中，所述多个脐带单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少5个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配，至少一个有HLA-DRB1匹配。通常，I类HLA(或主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC))抗原在所述多个脐带血细胞上是通过使用针对特异性HLAs的同种异体抗血清(alloantisera)、针对细胞毒性的补体、以及鉴定多个被杀死的细胞的一染剂的一微细胞毒性测定(microcytotoxicity assay)来确定。II类HLA通常是通过混合的淋巴细胞反应(lymphocyte reaction，MLR)来确定，其在多个混合的淋巴细胞群体培养后测量淋巴细胞增殖。多个HLA DR抗原可以在一微细胞毒性测定中用多个富集的B细胞通过B细胞抗血清来鉴定。抗血清可以通过特异性单克隆抗体替代。
[0098] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述多个脐带血单位的每公斤受试者体重6 7
具有至少8×10个冷冻保存前的CD34+细胞总数以及至少1.5×10个冷冻保存前的有核细胞总数。
具有至少8×10个冷冻保存前的CD34+细胞总数以及至少1.5×10个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0099] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述多个脐带血单位的每公斤受试者体重具有至少10×106个冷冻保存前的CD34+细胞总数以及至少2.5×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0100] 以下表I至IV中示出了选择用于离体扩增以及移植入一受试者的多个脐带血单位的示例性冷冻保存前的标准的多个实例。
[0101] 表I-CBU冷冻保存前选择标准
[0102]
[0103]
[0104] 表II-CBU冷冻保存前选择标准
[0105]
[0106] 表III-CBU冷冻保存前选择标准
[0107]
[0108] 表IV-CBU冷冻保存前选择标准
[0109]
[0110]
[0111] 如本文中所使用，术语“离体(ex-vivo)”是指将多个细胞从一活生物体中移出且在所述生物体外部增殖的一过程(例如，在一试管中、在一细胞培养袋中等)。
[0112] 如本文中所使用，术语“体外(in-vitro)”是指将源自实验室中维持的一或多个细胞株(cell line)(例如，胚胎细胞株等)在一生物体外部操作的一过程。这种细胞株通常是永生细胞。
[0113] 如本文中所使用，短语“干细胞”既是指致力于最早可再生细胞群体的谱系(lineage)，其负责在一组织或体内产生快速细胞团(rapid cell mass)，也是指分化程度较低的非常早期祖细胞(very early progenitor cell)，其尚未致力于一特定谱系且可以很容易地回复成为长期可再生细胞群体的一部分。造血干细胞是可以再生血液的多个细胞组分的干细胞，例如，红细胞、白细胞、血小板等。
[0114] 如本文中所使用，短语“非干细胞(non-stem)”、“非祖细胞(non-progenitor)”以及“定型细胞(committed cell)”是指处于分化的各个阶段的细胞，其通常不再保留回复成为可再生细胞群体的一部分的能力。离体培养干细胞、祖细胞以及非干细胞、非祖细胞的定型细胞的方法在细胞培养领域是众所周知的。为此，例如参见Freshney(纽约威利·利斯(Wiley-Liss)出版社，1994年，第三版)的教科书“动物细胞的培养-基本技术手册(Culture of Animal Cells–A Manual of Basic Technique)”，其内容在此通过引入作为参考。
[0115] 一旦鉴定出多个合适的冷冻保存的脐带血单位，可以将其运输以进行进一步处理(例如，解冻以及离体扩增)，或可以对其进行标记以及保持冷冻直到需要进行进一步处理以准备用于移植时为止。因此，可以建立适合用于离体扩增以及移植的多个冷冻冻存的脐带血单位的一“血库”，以及所述多个单位的一相应数据库，从而可以更快速地获得多个合适的脐带血单位。
[0116] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少1.8×109个冷冻保存前的有核细胞总数以及每公斤受试者体重具有至少1.5×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0117] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位具有至少2.5×109个冷冻7
保存前的有核细胞总数以及每公斤受试者体重具有至少2.0×10个冷冻保存前的有核细胞总数。
保存前的有核细胞总数以及每公斤受试者体重具有至少2.0×10个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0118] 选择适合用于离体扩增以及移植的多个脐带血单位的进一步处理包含：解冻所述选择的冷冻保存的单位，以及确定所述多个解冻的脐带血细胞是否适合进行进一步选择、从所述CD133-/CD34-脐带血细胞部分分离出一CD133+/CD34+脐带血细胞部分。
[0119] 因此，根据一些实施例，提供了一种选择用于离体扩增以及移植入一受试者的一解冻的脐带血单位的方法，所述方法包括：在将所述脐带血单位分离为CD133+/CD34+部分以及CD/133-/CD34-部分前，确定在所述解冻的脐带血单位中所述多个细胞的存活率百分比，以及选择具有约40％至约85％存活率的多个单位，从而选择适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一解冻的脐带血单位。
[0120] 在一些实施例中，选择具有约40％至约70％存活率的多个单位。在一些实施例中，选择具有约42％、约46％、约48％、约50％、约52％、约54％、约56％、约58％、约60％、约62％、约64％、约66％、约68％至约70％存活率的多个单位。
[0121] 应理解的是，所述多个解冻的脐带血单位通常是多个冷冻保存的脐带血单位，其已选择为适合用于使用本文中所述的标准以及方法进行进一步处理。
[0122] 根据一些实施例，根据所述脐带血库的程序将所述选择的冷冻脐带血单位转移至制造地点。在确认所述脐带血单位的身份后，将所述单位存储在液氮中央存储器中直到开始进行所述细胞选择以及扩增程序。
[0123] 在所述制造地点，使用无菌酒精湿巾仔细地擦拭脐带血袋，在37±1℃的一水浴中解冻，然后转移至一生产地点(例如，无菌室)进行进一步处理。
[0124] 在一些实施例中，制备用于细胞选择的多个解冻的脐带血单位如下：将所述解冻的血液转移至一175毫升离心管中。将冷冻袋用盐溶液中含10％w/v右旋糖酐(dextran-40)以及5％w/v HSA洗涤，然后添加至所述离心管。取出两个样品以确定细胞悬浮液的细胞存活率以及活细胞浓度、以及所述解冻的CBU的CD34+、CD133+含量。离心后，移除上清液，通过添加含有0.4％w/v柠檬酸钠以及1％v/v HSA的一PBS缓冲液使体积达到100毫升。添加IV Ig，在室温下培育10分钟后，将所述细胞悬浮液离心，并重新悬浮沉淀的细胞(pelleted cell)。
[0125] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配，且至少为8×106个冷冻保存前的CD34+细胞总数。
[0126] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配，且每公斤受试者体重具有至少2.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0127] 如本文中所使用，术语“存活率”是指活细胞以及非活(non-living)细胞之间的区别。细胞存活率可以通过形态变化或通过排除某些染料或吸收以及保留其他染液而推断出膜通透性及/或生理状态的变化来判断。细胞存活率测定是本领域众所周知的，包含但不限于，台盼蓝(trypan blue)或碘化丙锭(propidium iodide)排除以及罗丹明(rhodamine)代谢染色(Coder，D.，细胞计数法中的现行方案(Current Protocols in Cytometry)，1997，约翰威立出版社(John Wiley and Sons,Inc.)，单元9.2、9.2.1-9.2.14)。
[0128] 丢弃根据存活率标准排除的多个解冻的脐带血单位，且其无法继续进行用于可移植的脐带血单位的多个进一步的处理步骤。可以针对所述解冻的单位中存在的CD133+以及CD34+细胞的百分比，测定符合存活率标准的多个解冻的脐带血单位，并记录数据以供以后参考。
[0129] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配、每公斤受试者体重具有至少1.5×107个冷冻保存前的有核细胞总数、以及至少为8×106个冷冻保存前的CD34+细胞总数。
[0130] 多个解冻的脐带血单位通过存活率被认为是适合用于进一步离体扩增以及移植处理，然后通过根据干细胞标记CD133+的选择分离成两个脐带血部分。所述脐带血单位的所述CD133+/CD34+细胞部分代表一造血干细胞以及祖细胞群体，具有增殖、分化以及重建所有血细胞谱系的潜力，而所述未选择的CD133-/CD34-“阴性”细胞部分代表一富集多个成熟的免疫细胞的部分，例如，B细胞、T细胞以及自然杀手(NK)细胞。
[0131] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配，且至少为1.8×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0132] 可以使用多个干细胞标记(例如，CD34+、CD34+/CD38-、CD133+、CD34+/Lin-、以及本领域已知的其他干细胞标记)来鉴定以及富集多个干细胞。可以通过使用FACS、免疫磁分离或核酸方法(例如，PCR)的选择来进行所述多个解冻的脐带血细胞的所述CD133+/CD34+部分的鉴定以及分离，例如，Daniel R.Marshak(编辑)、Richard L.Gardner(编辑)在干细胞生物学(Stem Cell Biology)(出版商：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2001)以及Anthony D.Ho(编辑)、Richard Champlin(编辑)在造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation)(出版商：马塞尔·德克尔(Marcel Dekker)，2000)所述的分离或富集脐带血以及成年干细胞的方法。
[0133] 在一特定实施例中，使用多个抗CD133结合的(anti-CD133-conjugated)免疫磁珠(克林尼马克斯(CliniMacs)，米伦蒂生物技术公司(Milentyi Biotech)，德国)将选择适合用于离体扩增以及移植的所述解冻的脐带血单位分离为一CD133+/CD34+(阳性)部分以及一CD133-/CD34-(阴性)部分。
[0134] 在多个特定实施例中，所述CD133+部分的分离进行如下：将1.2毫升Miltenyi CliniMACS CD133试剂添加至所述脐带血细胞悬浮液中并在室温下培育5分钟。添加缓冲液，并将所述悬浮液在室温下以450×g离心10分钟。移除上清液，将细胞沉淀重新悬浮于含有0.4％w/v柠檬酸钠以及1％v/v HSA的PBS缓冲液中，并将所述细胞悬浮液转移到一转移袋中。按照制造商的说明组装CliniMACS系统(米伦蒂生物技术公司，德国)，将所述多个选择的CD133+细胞收集至一“收集”转移袋中，而将所述多个CD133-未选择的、未结合的细胞收集至阴性部分袋中。所述多个细胞从所述“收集”袋中无菌地转移至一175毫升离心管中。将所述选择的细胞悬浮液在室温下以450×g离心10分钟，移除上清液，并将所述多个细胞转移至一无菌试管中进行安全性测试。重新悬浮所述细胞沉淀，并测量以及记录准确的体积。
[0135] 取出所述细胞悬浮液的一样品，并测量所述细胞存活率以及所述活细胞浓度。计算从所述管柱获得的活细胞总数以及细胞产率。测量纯化的CD133+以及CD34+细胞的百分比。纯度是定义为在所述选择的细胞群体中CD133+细胞的百分比。
[0136] 一旦分离，所述CD133+/CD34+阳性部分可以离体扩增，但是首先必须进行筛选以适合于进一步处理。因此，在一些实施例中，选择用于离体扩增以及移植入一受试者的一解冻的脐带血单位的所述方法更包括步骤：
[0137] (a)将适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的被选择的所述解冻的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；以及
[0138] (b)在所述第一选择的CD133+/CD34+部分中，确定以下多个分离后的参数：
[0139] (i)约20×105至约75×105个细胞总数；
[0140] (ii)约70％至约85％的存活率；
[0141] (iii)约70％至约85％的多个CD133+细胞；
[0142] (iv)约70％至约85％的多个CD34+细胞；
[0143] (v)在CD133+/CD34+选择后，约0.02％至约1％的产率；
[0144] (vi)每1000个细胞约15至约50个菌落形成单位；以及
[0145] (vii)低于3内毒素单位/毫升的内毒素；以及
[0146] (c)根据所述多个参数选择或排除所述第一选择的CD133+/CD34+部分，
[0147] 从而选择适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一CD133+/CD34+脐带血部分。
[0148] 在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数约20×105至约75×105个细胞、约25×105至约65×105个细胞、约30×105至约5 5 5 5 5
60×10 个细胞、约36×10至约55×10个细胞、以及约40×10 至约50×10个细胞。在一个实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为
20×106个、至少为30×106个、至少为35×106个、至少为40×106个、至少为45×106个、至少为50×106个、至少为55×106个、至少为60×106个、以及至少为70×106个细胞总数。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为
25×106个细胞总数。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为20×106个细胞总数。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为45×106个细胞总数。
60×10 个细胞、约36×10至约55×10个细胞、以及约40×10 至约50×10个细胞。在一个实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为
20×106个、至少为30×106个、至少为35×106个、至少为40×106个、至少为45×106个、至少为50×106个、至少为55×106个、至少为60×106个、以及至少为70×106个细胞总数。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为
25×106个细胞总数。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为20×106个细胞总数。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数至少为45×106个细胞总数。
[0149] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配，且至少有1.8×109个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0150] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的多个脐带血单位在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有冷冻保存前的HLA匹配，且至少有2.5×109个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0151] 在一些实施例中，选择具有约70％至约85％存活率的多个CD133+/CD34+脐带血部分。在一些实施例中，选择具有约71％、约73％、约75％、约78％、约80％、约82％、约83％、约84％至约85％存活率的多个CD133+/CD34+脐带血部分。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分具有至少70％的活细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分具有至少77％的活细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分具有至少85％的活细胞。
[0152] 所述分离的脐带血部分的所述CD133+、CD34+以及CD133+/CD34+细胞含量对于所述移植的扩增的脐带血细胞的成功移植是至关重要的，因此是用于进行离体扩增的一重要标准。因此，在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数具有约70％至约85％的CD133+细胞、约73％至约82％的CD133+细胞、约75％至80％的CD133+细胞、以及约76至79％的CD133+细胞。在一个实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD133+细胞总数具有至少70％、至少
74％、至少78％、至少80％、至少83％、或至少85％的CD133+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD133+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少80％的CD133+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD133+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少70％的CD133+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD133+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少75％的CD133+细胞。
74％、至少78％、至少80％、至少83％、或至少85％的CD133+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD133+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少80％的CD133+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD133+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少70％的CD133+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD133+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少75％的CD133+细胞。
[0153] 因此，在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的细胞总数具有约70％至约85％的CD133+细胞、约73％至约82％的CD133+细胞、约75％至80％的CD133+细胞、以及约76至79％的CD34+细胞。在一个实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD34+细胞总数具有至少70％、至少74％、至少78％、至少80％、至少83％、或至少85％的CD34+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD34+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少82％的CD34+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD34+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少70％的CD133+细胞。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的分离后的CD34+细胞总数在针对CD133+分离后具有至少78％的CD133+细胞。
[0154] 在多个特定实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+分离后的所述选择后产率为约0.02％至约1.0％、约0.05％至约0.8％、约0.08％至约0.7％、约0.1％至约0.55％、约0.25％至约0.45％、以及约0.3至0.4％。在一个实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+选择后的所述选择后产率至少为0.01％、至少为0.05％、至少为0.1％、至少为0.3％、至少为0.5％、至少为0.65％、至少为0.75％、至少为0.9％、或至少为1.0％。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在分离后的所述选择后产率至少为0.02％。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在分离后的所述选择后产率至少为0.3％。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在分离后的所述选择后产率至少为0.5％。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在分离后的所述选择后产率至少为0.8％。
[0155] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在分离后的每1000个细胞具有约15至约75个菌落形成单位(CFU)、每1000个细胞具有约20至约60个CFU、每1000个细胞具有约25至约50个CFU、每1000个细胞具有约30至约40个CFU。在一个实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+选择后的每1000个细胞具有至少15个CFU、每1000个细胞具有至少22个CFU、每1000个细胞具有至少25个CFU、每1000个细胞具有至少30个CFU、每1000个细胞具有至少36个CFU、每1000个细胞具有至少40个CFU、每1000个细胞具有至少45个CFU、每1000个细胞具有至少52个CFU、每1000个细胞具有至少60个CFU、每1000个细胞具有至少68个CFU、或每1000个细胞具有至少75个CFU。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+选择后的每1000个细胞具有至少15个CFU。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+选择后的每1000个细胞具有至少25个CFU。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+选择后的每1000个细胞具有至少40个CFU。在另一实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+选择后的每1000个细胞具有至少45个CFU。
[0156] 以下表V至VIII中示出了选择适合用于离体扩增以及移植入一受试者的多个解冻的脐带血单位的示例性标准的多个实例。
[0157] 表V-用于扩增的脐带血选择标准
[0158]参数 数值
细胞总数 至少35×105个
存活率 至少85％
CD133+细胞部分 至少77％
CD34+细胞部分 至少83％
每1000个细胞的CFU 至少23个
选择后产率 至少0.5％
内毒素(endotoxin) 不超过3内毒素单位/毫升(Eu/ml)
细胞总数 至少35×105个
存活率 至少85％
CD133+细胞部分 至少77％
CD34+细胞部分 至少83％
每1000个细胞的CFU 至少23个
选择后产率 至少0.5％
内毒素(endotoxin) 不超过3内毒素单位/毫升(Eu/ml)
[0159] 表VI-用于扩增的脐带血选择标准
[0160]参数 数值
5
细胞总数 至少20×10个
存活率 至少70％
CD133+细胞部分 至少70％
CD34+细胞部分 至少70％
每1000个细胞的CFU 至少15个
选择后产率 至少0.02％
内毒素 不超过3Eu/ml
5
细胞总数 至少20×10个
存活率 至少70％
CD133+细胞部分 至少70％
CD34+细胞部分 至少70％
每1000个细胞的CFU 至少15个
选择后产率 至少0.02％
内毒素 不超过3Eu/ml
[0161] 表VII-用于扩增的脐带血选择标准
[0162]
[0163]
[0164] 表VIII-用于扩增的脐带血选择标准
[0165]参数 数值
细胞总数 至少55×105个
存活率 至少76％
CD133+细胞部分 至少85％
CD34+细胞部分 至少76％
每1000个细胞的CFU 至少35个
选择后产率 至少0.09％
内毒素 不超过3Eu/ml
细胞总数 至少55×105个
存活率 至少76％
CD133+细胞部分 至少85％
CD34+细胞部分 至少76％
每1000个细胞的CFU 至少35个
选择后产率 至少0.09％
内毒素 不超过3Eu/ml
[0166] 用于离体扩增以及移植的所述解冻的CD133+/CD34+脐带血单位的无菌性以及安全性是通过监测包括所述内毒素含量以及细菌、真菌、病毒以及支原体(mycoplasma)污染的存在来确保的。在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在所述扩增(细胞培养)过程期间的任何时间的一内毒素含量不超过3内毒素单位/毫升(Eu/ml)。在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+选择后且在任何测试日均不存在细菌、酵母菌、霉菌以及支原体。在一些实施例中，内毒素含量是在所述离体扩增的第0天以及第7天监测。在一些实施例中，细菌、酵母菌、霉菌以及支原体是在所述离体扩增的第0、7以及14天监测。
[0167] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的每1000个细胞具有至少15个CFU，且一选择后产率至少为0.02％。在其他实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+分离后的每1000个细胞具有至少15个CFU，一选择后产率至少为0.02％，且一分离后的CD133+细胞总数具有至少75％的CD133+细胞。在其他实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的每1000个细胞具有至少35个CFU，且一选择后产率至少为0.1％。
[0168] 在其他实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+分离后的每1000个细胞具有至少15个CFU，且一分离后的CD133+细胞总数具有至少70％的CD133+细胞。
[0169] 所述未选择的阴性CD133-部分包括多个免疫细胞的储备，包含但不限于，T淋巴细胞、B淋巴细胞以及自然杀手(NK)细胞。在针对CD133+细胞选择所述解冻的脐带血细胞后，通过洗涤以及悬浮在冷冻保存溶液中来制备未选择的阴性CD133-部分以用于冷冻保存。许多冷冻保存溶液是市售的。在一些实施例中，所述冷冻保存溶液是(BioLife Solutions公司)。冷冻保存之前，还监测所述未选择的CD133/CD34阴性脐带血细胞部分的多个参数，包含存活率、CD3+细胞(T细胞)含量、CD133+/CD34+含量以及无菌性。因此，在一些实施例中，本发明提供了一种选择用于移植入一受试者的包括多个CD133/CD34阴性细胞的多个未选择的脐带血细胞部分的方法，所述方法包括：
[0170] (a)在对多个CD133/CD34阴性细胞选择后，在所述未培养的脐带血部分中确定以下多个参数：
[0171] (i)约4×108至约15×108个活细胞总数；
[0172] (ii)约70至85％的所述多个细胞的存活率；
[0173] (iii)约2.4×107至约8×107个CD3+细胞数；
[0174] (iv)没有细菌、酵母菌或霉菌生长；以及
[0175] (b)根据所述多个参数选择或排除所述未选择的脐带血细胞部分，
[0176] 从而选择适合用于移植入所述受试者的包括多个CD133/CD34阴性细胞的一未选择的脐带血细胞部分。
[0177] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的一分离后6
的细胞总数至少为20×10个细胞总数，且至少70％的分离后活细胞。
的细胞总数至少为20×10个细胞总数，且至少70％的分离后活细胞。
[0178] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的一分离后的细胞总数至少为20×106个细胞总数，且至少80％的CD133+细胞。
[0179] 在其他实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+分离后的每1000个细胞具有至少15个CFU，一选择后产率至少为0.02％，且一分离后的CD34+细胞总数具有至少70％的CD34+细胞。
[0180] 在一些实施例中，选择用于移植的具有约70％至约85％存活率的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择具有约70％、约73％、约75％、约78％、约80％、约82％、约83％、约84％至约85％存活率的所述多个CD133/CD34阴性脐带血部分。在另一实施例中，用于移植的所述CD133/CD34阴性脐带血部分具有至少70％的活细胞。
[0181] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的一分离后的细胞总数至少为20×106个细胞总数，且至少70％的CD133+细胞。
[0182] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的一分离后的细胞总数至少为20×106个细胞总数，且至少70％的CD34+细胞。
[0183] 在其他实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+分离后的每1000个细胞具有至少15个CFU，一选择后产率至少为0.02％，且一分离后的CD34+细胞总数具有至少85％的CD133+细胞。
[0184] 在其他实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分在针对CD133+分离后的每1000个细胞具有至少15个CFU，一选择后产率至少为0.02％，且一分离后的CD133+细胞总数具有至少70％的CD133+细胞。
[0185] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分具有至少70％存活率以及至少70％的CD34+细胞。
[0186] 在一些实施例中，选择用于移植的具有约4×108至约15×108个活细胞总数的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性部分中的活细胞总数约6×108至约13×108个细胞、约7.5×108至约11×108个活细胞、或约9×108至约10×108个活细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性部分中的活细胞总数为至少4×108个、至少6×108个、至少7.5×108个、至少9×108个、至少10×108个、至少12×108个、至少14×108个、或至少15×108个活细胞总数。在一特定实施例
8
中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性部分中的活细胞总数为至少4×10 个活细胞总数。
8
中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性部分中的活细胞总数为至少4×10 个活细胞总数。
[0187] 在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分具有至少70％的活细胞、以及至少为0.02％的CD133+/CD34+细胞的一选择后产率。在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分具有至少80％的CD34+细胞、85％的活细胞、以及至少为0.1％的CD133+/CD34+细胞的一选择后产率。在一些实施例中，选择用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分具有至少70％的CD34+细胞、80％的活细胞、以及至少为0.02％的CD133+/CD34+细胞的一选择后产率。
[0188] 在一些实施例中，选择用于移植的具有约2.4×107至约8×107个CD3+细胞的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有约2.4×107至约8×107个CD3+细胞、约3.5×107至约7×107个CD3+细胞、约4.3×107至约6.2×107个CD3+细胞、或约4.8×107至约5×107个CD3+细胞的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在其他实施例中，选择用于移植的具有至少2.4×107个CD3+细胞、至少3.0×107个CD3+细胞、至少3.5×107个CD3+细胞、至少4.0×107个CD3+细胞、至少4.5×107个CD3+细胞、至少5×107个CD3+细胞、至少6×107个CD3+细胞、至少7×107个CD3+细胞、或至少8×107个CD3+细胞的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的所述多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分具有至少3.0×107个CD3+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分具有至少2.4×107个CD3+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分具有至少5×107个CD3+细胞。
[0189] 在其他实施例中，选择用于移植的具有至少5×107个CD3+细胞以及6×108个活细胞总数的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少2.4×107个CD3+细胞以及4×108个活细胞总数的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在其他实施例中，选择用于移植的具有至少6×107个CD3+细胞以及4×108个活细胞总数的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。
[0190] 在一些实施例中，选择用于移植的具有约0.01％至约0.5％的CD133+/CD34+细胞的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择具有不超过约0.03％、约0.05％、约0.08％、约0.1％、约0.25％、约3％、约4％、或约5％的CD133+/CD34+细胞的所述多个CD133/CD34阴性脐带血部分。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性脐带血部分具有不超过约0.01％的CD133+/CD34+细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性脐带血部分具有不超过约0.05％的CD133+/CD34+细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性脐带血部分具有不超过约0.1％的CD133+/CD34+细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性脐带血部分具有不超过约0.25％的CD133+/CD34+细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133/CD34阴性脐带血部分具有不超过约0.5％的CD133+/CD34+细胞。
[0191] 在一些实施例中，选择用于移植的具有至少4×108个活细胞总数以及85％存活率的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少70％存活率以及2.4×107个CD3+细胞的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。
[0192] 可以将选择适合用于移植的多个冷冻保存的CD133/CD34阴性脐带血部分存储以及维持冻结直至需要用于移植。在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个CD133/CD34阴性脐带血部分是存储在液氮中。
[0193] 在一些实施例中，选择用于移植的具有至少4×108个活细胞总数以及70％存活率的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少7
70％存活率以及2.4×10个CD3+细胞的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少4×108个活细胞总数、至少2.4×107个CD3+细胞、以及
70％存活率的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少6×108个活细胞总数、至少2.7×107个CD3+细胞、以及至少75％存活率的多个未
8
选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少4×10 个活细胞总数以及至少80％存活率的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。
70％存活率以及2.4×10个CD3+细胞的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少4×108个活细胞总数、至少2.4×107个CD3+细胞、以及
70％存活率的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少6×108个活细胞总数、至少2.7×107个CD3+细胞、以及至少75％存活率的多个未
8
选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有至少4×10 个活细胞总数以及至少80％存活率的多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分。
[0194] 所述多个未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分的分离以及处理可以包括监测所述多个培养的单位的安全性以及污染。因此，根据多个特定的实施例，将具有超过3.0Eu/ml内毒素及/或细菌、酵母菌或霉菌生长的多个脐带血部分或单位从冷冻保存中排除，或者，如果在所述制备过程期间的任何时候检测到，则终止进一步的处理，并丢弃所述多个污染的单位。
[0195] CD133+/CD34+选择的部分的培养(离体扩增)
[0196] 上文所述的选择用于离体扩增的多个脐带血单位的任何方法以及其单独或以各种组合方式采用的每个实施例可用于进行多个CD133+/CD34+选择的部分的培养(离体扩增)方法，如本节以及其后续各节中所述。
[0197] 烟酰胺(NAM)是维生素B的一水溶性衍生物，其生理活性形式为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+/NADH)以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+/NADPH)。NAM的所述生理活性形式在多种重要的代谢反应中作为辅酶。另外已知烟酰胺抑制CD38的酶活性，从而影响cADPR信号转导途径。
[0198] 选择适合用于本发明的扩增以及移植的所述CD133+CD34+部分的离体扩增方法可以通过向所述多个细胞提供烟酰胺本身或一烟酰胺类似物、一烟酰胺或一烟酰胺类似物衍生物、或一烟酰胺或一烟酰胺类似物代谢物来进行。
[0199] 如本文中所使用，短语“烟酰胺类似物”是指已知与烟酰胺具有相似作用的任何分子。烟酰胺类似物的代表性实例包含但不限于，苯甲酰胺(benzamide)、烟碱硫代酰胺(nicotinethioamide)(烟酰胺的硫醇(thiol)类似物)、烟酸以及α-氨基-3-吲哚丙酸(α-amino-3-indolepropionic acid)。短语“一烟酰胺或一烟酰胺类似物衍生物”是指烟酰胺本身或一烟酰胺类似物的任何结构衍生物。此类衍生物的实例包含但不限于，取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺与烟碱硫代酰胺、以及N-取代的烟酰胺与烟碱硫代酰胺。短语“一烟酰胺或一烟酰胺类似物代谢物”是指衍生自烟酰胺或衍生自其类似物的产物，例如NAD、NADH以及NADPH。在多个特定实施例中，选择适合用于扩增以及移植的所述CD133+CD34+部分与烟酰胺一起培养以用于离体扩增。
[0200] 所述烟酰胺、或其类似物、衍生物或代谢物的最终浓度(取决于特定应用)优选在毫摩尔范围内。例如，在约1毫摩尔(mM)至约10mM内、在约2.5mM至约8mM内、或在约2.5mM至约5mM内。
[0201] 根据本文中所述的本发明的多个优选实施例中的进一步特征，多个用于离体细胞增殖的条件包括为所述多个细胞提供血清、营养素以及细胞因子。
[0202] 所述细胞因子可以是早期作用的细胞因子。在一些实施例中，所述早期作用的细胞因子是选自包括干细胞因子、FLT3配体、白介素-1(interleukin-1)、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α)以及血小板生成素(thrombopoietin)的群组。在多个特定实施例中，所述细胞因子是包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个的多个细胞因子的一组合。
[0203] 根据本发明的所述方法，选择适合用于扩增以及移植的所述CD133+CD34+脐带血部分是通过在允许细胞增殖的多个条件下培养包括个CD133+CD34+选择的细胞的第一选择的血细胞部分来离体扩增，所述多个条件包括提供营养素、血清以及多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺在相同培养基中的量在1.0至10.0mM之间。
[0204] 因此，根据本发明，提供了一种制备用于移植入一受试者的一脐带血单位的方法，所述方法包括：
[0205] (a)将适合用于移植入所述受试者的一单一的解冻的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；以及
[0206] (b)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清与多个细胞因子以及烟酰胺，所述多个细胞因子包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间。
[0207] 在一些实施例中，适合用于移植入一受试者的所述单一的脐带血单位是根据本文中所述的用于选择冷冻保存的脐带血以用于扩增以及移植入一受试者的方法而选择的适合用于离体扩增以及移植入一受试者的一解冻的脐带血单位。例如，适合用于移植入一受试者的解冻的单一的脐带血单位的特征可以在于：(i)约8×106至约15×106个CD34+细胞总数；(ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；(iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；以及(iv)每公斤受试者体重具有约1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0208] 在一些实施例中，所述第一选择的CD133+/CD34+血细胞部分(a)(i)是根据本文中所述的用于选择适合用于离体扩增以及移植入一受试者的一CD133+/CD34+脐带血部分的方法而选择的适合用于离体扩增以及移植入所述受试者的一CD133+/CD34+脐带血部分。例如，适合用于离体扩增以及移植入一受试者的所述CD133+/CD34+脐带血部分的特征可以在于：(i)约8×106至约15×106个CD34+细胞总数；(ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；(iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；以及(iv)每公斤受试者体重具有约
1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0209] 在本发明的所述方法的其他实施例中，在所述离体扩增的第0天、第7天、或第14天将具有大于3.0Eu/ml的内毒素、及/或细菌、酵母菌或霉菌生长的多个脐带血部分或单位从培养(离体扩增)排除。
[0210] 在其他实施例中，适合用于离体扩增以及移植入一受试者的用于扩增所述CD133+/CD34+脐带血部分的所述培养基中的所述血清包括10％FBS以及干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个(分别为50奈克(ng))。在多个特定实施例中，用于扩增所述CD133+/CD34+脐带血部分的所述培养基包括2.5mM的烟酰胺。在其他实施例中，在允许细胞增殖的多个条件下培养所述多个细胞包括提供营养素、10％胎牛血清(FBS)以及多个细胞因子(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个，分别为50ng)、以及2.5mM的烟酰胺。在一些实施例中，所述烟酰胺以5.0mM提供。
[0211] 在一些实施例中，通过本文中所述的多个条件下培养18至25天来培养适合用于离体扩增以及移植入一受试者的所述CD133+/CD34+脐带血部分。在多个特定实施例中，将所述CD133+/CD34+脐带血部分培养18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、或25天。在一些实施例中，将用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分培养21天。
[0212] 如本文中所述，培养用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分包括监测所述多个培养的单位的安全性以及污染。因此，根据多个特定的实施例，在所述离体扩增的第7天或第14天将具有大于3.0Eu/ml内毒素及/或细菌、酵母菌或霉菌生长的多个脐带血部分或单位从培养(离体扩增)排除，或者，如果在所述培养过程期间检测到，则终止培养(扩增)，并丢弃所述多个污染的单位。
[0213] 用于移植的离体扩增的脐带血单位选择
[0214] 在选择适合用于离体扩增的所述CD133+/CD34+脐带血部分的所述培养(离体扩增)完成时，可以收获所述离体培养的第一选择的CD133+/CD34+以进行存储。
[0215] 上文中所述的用于离体扩增的选择多个脐带血单位的任何方法与上文中所述的用于扩增(离体培养)多个脐带血单位的的任何方法、以及其单独或以各种组合方式采用的每个实施例可用于进行多个培养的(离体扩增的)CD133+/CD34+选择的部分的选择方法，如本节以及其后续各节中所述。
[0216] 在存储之前，所述离体扩增的CD133+CD34+脐带血部分的特征在于适合用于冷冻保存并作为用于移植入一受试者的一扩增的CD133+CD34+脐带血部分。因此，根据本发明，提供了一种选择用于移植入一受试者的包括多个CD133+CD34+选择的脐带血细胞的多个离体培养的脐带血细胞部分的方法，所述方法包括：
[0217] (a)在离体扩增后，在所述离体培养的脐带血部分确定以下多个参数：
[0218] (i)约8×108至约15×108个活细胞总数；
[0219] (ii)约70至85％的所述多个细胞的存活率；
[0220] (iii)约7至15％的多个CD34+细胞；
[0221] (iv)约5.6×107至约5×108个CD34+细胞总数；
[0222] (v)约2.4×107至约2×108个CD133+细胞总数；
[0223] (vi)约8×105至约25×105个CD133+/CD38-细胞数；
[0224] (vii)约8×107至约15×109个CD14+细胞总数；
[0225] (viii)约2×108至约2×109个CD15+细胞总数；
[0226] (ix)约8×107至约8×109个CD11b+细胞总数；
[0227] (x)约3.2×107至约3×108个CD1(a+c)+细胞总数；
[0228] (xi)没有培养的支原体、或细菌、酵母菌或霉菌生长；以及
[0229] (b)根据所述多个参数选择或排除所述离体培养的脐带血部分，
[0230] 从而选择适合用于移植入所述受试者的一离体培养的CD133+/CD34+脐带血部分。
[0231] 在一些实施例中，选择具有约8×108至约15×108个活细胞总数的多个离体扩增的8 8
CD133+/CD34+脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有约9×10至约13×10 个活细胞总数、约10×108至约12×108个活细胞总数、或约10.5×108至约11×108个活细胞总数的多个离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分。在一个实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少8×108个、至少10×108个、至少11×108个、至
8 8 8 8
少12×10个、至少13×10个、至少14×10个、以及至少15×10 个活细胞总数。在一特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少8×108个活细胞总数。在一特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少11.5×108个活细胞总数。在一特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少15×108个活细胞总数。
CD133+/CD34+脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有约9×10至约13×10 个活细胞总数、约10×108至约12×108个活细胞总数、或约10.5×108至约11×108个活细胞总数的多个离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分。在一个实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少8×108个、至少10×108个、至少11×108个、至
8 8 8 8
少12×10个、至少13×10个、至少14×10个、以及至少15×10 个活细胞总数。在一特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少8×108个活细胞总数。在一特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少11.5×108个活细胞总数。在一特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少15×108个活细胞总数。
[0232] 在一些实施例中，选择具有约70％至约85％存活率的多个离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分。在一些实施例中，选择用于移植的具有约70％、约73％、约75％、约78％、约80％、约82％、约83％、约84％至约85％存活率的多个离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分。在一些实施例中，选择具有至少71％、至少73％、至少75％、至少78％、至少80％、至少82％、至少83％、至少84％、或至少85％存活率的多个离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分。在另一实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少
70％的活细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少78％的活细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少83％的活细胞。
70％的活细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少78％的活细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分具有至少83％的活细胞。
[0233] 所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的所述CD133+、CD34+与CD133+/CD34+、CD133+/CD38-、CD14+、CD15+、CD11b+以及CD1(a与c)+细胞含量对于所述移植的扩增的脐带血细胞的成功移植是至关重要的，因此是用于选择进行离体扩增的一重要标准。
[0234] 因此，在一特定实施例中，选择用于移植的一离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、或至少15％的CD34+细胞。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少7％。
在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少7.8％。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少9％。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少13％。
在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少7.8％。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少9％。在另一实施例中，选择用于移植的所述CD133+/CD34+脐带血部分的CD34+细胞的一总扩增后(培养后)部分为至少13％。
[0235] 因此，在多个特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD34+细胞总数为约5.6×107至约5×108个CD34+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD34+细胞总数为约6×107至约4×108个、约9×107至约3×108个、约1×108至约2.5×108个、约1.5×108至约2×108个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD34+细胞总数为至少5.6×107个、至少6×107
7 7 8 8 8 8
个、至少8×10个、至少9×10 个、至少1×10个、至少2×10 个、至少3×10个、至少4×10个、或至少5×108个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD34+细胞总数为至少2×108个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后
7
(培养后)CD34+细胞总数为至少8×10 个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD34+细胞总数为至少5.6×107个CD34+细胞总数。
7 7 8 8 8 8
个、至少8×10个、至少9×10 个、至少1×10个、至少2×10 个、至少3×10个、至少4×10个、或至少5×108个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD34+细胞总数为至少2×108个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后
7
(培养后)CD34+细胞总数为至少8×10 个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD34+细胞总数为至少5.6×107个CD34+细胞总数。
[0236] 在多个特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分7 8
的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为约2.4×10 至约2×10 个CD133+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为约3×107至约1×108个、约5×107至约8×107个、约6×107至约7×107个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少2.4×107个、至少3.5×107个、至少5×107个、至少7×
107个、至少8×107个、至少1×108个、至少1.5×108个、或至少2×108个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少2.4×107个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少4×
107个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少7.5×107个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少1.2×108个CD133+细胞总数。
的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为约2.4×10 至约2×10 个CD133+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为约3×107至约1×108个、约5×107至约8×107个、约6×107至约7×107个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少2.4×107个、至少3.5×107个、至少5×107个、至少7×
107个、至少8×107个、至少1×108个、至少1.5×108个、或至少2×108个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少2.4×107个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少4×
107个CD34+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少7.5×107个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+细胞总数为至少1.2×108个CD133+细胞总数。
[0237] 在多个特定实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为约8×105至约25×105个CD133+/CD38-细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为约10×105至约22×105个、约13×105至约20×105个、或约155 5
×10至约17×10个CD133+/CD38-细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少8×105个、至少10×105个、至少11.5×105个、至少13×105个、至少15×105个、至少18×105个、至少
20.0×105个、至少22×105个、或至少25×105个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少13×105个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少8×105个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少10×105个。
×10至约17×10个CD133+/CD38-细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少8×105个、至少10×105个、至少11.5×105个、至少13×105个、至少15×105个、至少18×105个、至少
20.0×105个、至少22×105个、或至少25×105个CD133+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少13×105个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少8×105个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD133+/CD38-细胞总数为至少10×105个。
[0238] 在其他实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为约8×107至约15×108个CD14+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为约10×107至约10×108个、约12×107至约8×108个、约15×107至约6×108个、约2×108至约5×108个、或约3×108至约4×108个CD14+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体
7
扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少8×10个、至少
10×107个、至少2×108个、至少4×108个、至少6×108个、至少8×108个、至少10.0×108个、至少12×108个、或至少15×108个CD14+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少8×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少2×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少7.5×108个。
7
扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少8×10个、至少
10×107个、至少2×108个、至少4×108个、至少6×108个、至少8×108个、至少10.0×108个、至少12×108个、或至少15×108个CD14+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少8×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少2×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD14+细胞总数为至少7.5×108个。
[0239] 在其他实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩8 9
增后(培养后)CD15+细胞总数为约2×10至约2×10个CD15+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为约
2.5×108至约1.5×109个、约4×108至约0.5×109个、约6×108至约9×108个、或约7×108至约8×108个CD15+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少2×108个、至少4×108个、至少6×108个、至少8×108个、至少1×109个、或至少2×109个CD15+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少2×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少6×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少8.5×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少1.1×109个。
增后(培养后)CD15+细胞总数为约2×10至约2×10个CD15+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为约
2.5×108至约1.5×109个、约4×108至约0.5×109个、约6×108至约9×108个、或约7×108至约8×108个CD15+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少2×108个、至少4×108个、至少6×108个、至少8×108个、至少1×109个、或至少2×109个CD15+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少2×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少6×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少8.5×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD15+细胞总数为至少1.1×109个。
[0240] 在其他实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为约8×107至约8×109个CD11b+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为约1×108至约5×109个、约4×108至约2×109个、约6×108至约1×109个、或约8×108至约9×108个CD11b+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐
7 8 8
带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少8×10个、至少1×10个、至少4×10个、至少6×108个、至少8×108个、至少1×109个、至少2×109个、至少4×109个、至少6×109个、或至少8×109个CD11b+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少8×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少10×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少2×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少5×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少3×109个。
7 8 8
带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少8×10个、至少1×10个、至少4×10个、至少6×108个、至少8×108个、至少1×109个、至少2×109个、至少4×109个、至少6×109个、或至少8×109个CD11b+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少8×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少10×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少2×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少5×108个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34脐带血部分的扩增后(培养后)CD11b+细胞总数为至少3×109个。
[0241] 在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为约3.2×107至约3×108个CD15+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为约4×107至约1×108个、约6×107至约9×107个、或约7×107至约8×107个CD1(a与c)+细胞。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为至少3.2×107个、至少4×107个、至少6×107个、至少8×107个、至少1×108个、或至少3×108个CD1(a与c)+细胞总数。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+7
细胞总数为至少3.2×10 个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为至少5×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为至少7.3×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133
8
+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为至少2.2×10个。
细胞总数为至少3.2×10 个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为至少5×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为至少7.3×107个。在一些实施例中，选择用于移植的所述离体扩增的CD133
8
+/CD34+脐带血部分的扩增后(培养后)CD1(a与c)+细胞总数为至少2.2×10个。
[0242] 以下表IX至XII中示出了选择用于离体移植入一受试者的多个脐带血单位的示例性扩增后标准的多个实例。
[0243] 表IX-用于移植的选择的、扩增的脐带血标准
[0244]
[0245]
[0246] 表X-用于移植的选择的、扩增的脐带血标准
[0247]参数 数值
活细胞总数 至少8×108个
存活率 至少70％
CD34+细胞部分 至少7％
CD34+细胞总数 至少5.6×107个
CD133+细胞总数 至少2.4×107个
CD133+/CD38-细胞数 至少8×105个
CD14+细胞总数 至少8×107个
CD15+细胞总数 至少2×108个
CD11b+细胞总数 至少8×107个
CD1(a与c)+细胞总数 至少3.2×107个
活细胞总数 至少8×108个
存活率 至少70％
CD34+细胞部分 至少7％
CD34+细胞总数 至少5.6×107个
CD133+细胞总数 至少2.4×107个
CD133+/CD38-细胞数 至少8×105个
CD14+细胞总数 至少8×107个
CD15+细胞总数 至少2×108个
CD11b+细胞总数 至少8×107个
CD1(a与c)+细胞总数 至少3.2×107个
[0248] 表XI-用于移植的选择的、扩增的脐带血标准
[0249]参数 数值
活细胞总数 至少8×108个
存活率 至少80％
CD34+细胞部分 至少11％
CD34+细胞总数 至少1×108个
CD133+细胞总数 至少4×107个
6
CD133+/CD38-细胞数 至少1.6×10个
CD14+细胞总数 至少2×108个
CD15+细胞总数 至少7×108个
CD11b+细胞总数 至少1.3×108个
CD1(a与c)+细胞总数 至少6×107个
活细胞总数 至少8×108个
存活率 至少80％
CD34+细胞部分 至少11％
CD34+细胞总数 至少1×108个
CD133+细胞总数 至少4×107个
6
CD133+/CD38-细胞数 至少1.6×10个
CD14+细胞总数 至少2×108个
CD15+细胞总数 至少7×108个
CD11b+细胞总数 至少1.3×108个
CD1(a与c)+细胞总数 至少6×107个
[0250] 表XII-用于移植的选择的、扩增的脐带血标准
[0251]
[0252]
[0253] 如上文中所述，监测安全性以及污染的多个参数以确保没有选择具有支原体、或细菌、酵母菌或霉菌生长的离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分用于移植。因此，在一些实施例中，选择用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分在扩增开始后、第7天、第14天以及扩增完成时不含细菌、酵母菌、霉菌以及支原体。
[0254] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少5.6×107个CD34+细胞总数、至少2.4×107个CD133+细胞总数、至少8×107个CD14+细胞总数、以及至少3.2×107个CD1(a与c)+细胞总数。在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少10×108个活细胞总数、至少9％的多个CD34+细胞、至少5.6×107个CD34+细胞总数、至少4×107个CD133+细胞总数、至少2×108个CD15+细胞总数、至少10×107个CD11b+细胞总数、以及至少5×107个CD1(a+c)+细胞总数。
[0255] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少70％的所述多个细胞的存活率、至少7％的多个CD34+细胞、至少8×105个CD133+/CD38-细胞、至少2×108个CD15+细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
[0256] 在其他实施例中，监测所述离体扩增的CD133+/CD34+脐带血部分的外观。所述扩增的CD133+/CD34+细胞部分的观察是针对所述部分的颜色以及纹理。在一些实施例中，选择呈现淡黄色、混浊至不透明且无白色团块与异物的多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞部分。
[0257] 在一些实施例中，将选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞洗涤并悬浮在一冷冻保存溶液中，例如， (BioLife Solutions公司)。将所述扩增的CD133+/CD34+部分细胞悬浮液转移至所述冷冻保存袋(CryoMACS冷冻袋，Miltenyi Biotech)中，标记并使用一控制速率冷冻器冷冻。储存在液氮(LN)中。
[0258] 在一些实施例中，将所述第一离体培养的CD133+/CD34+选择的脐带血部分以及所述第二未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分分别在液氮中冷冻保存。
[0259] 在一受试者中移植扩增的、离体培养的CD133+/CD34+选择的脐带血部分以及未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分
[0260] 已选择适合用于移植的扩增的选择的CD133+/CD34+脐带血部分以及未选择的CD133/CD34阴性部分可用于移植至有需要的受试者中。上文中所述的用于离体扩增的多个脐带血单位的选择、上文中所述的多个脐带血单位的扩增(离体培养)、及/或离体扩增后的移植、及/或所述多个脐带血部分的冷冻保存的任何方法、以及其单独或以各种组合方式采用的每个实施例可用于进行培养的(离体扩增的)CD133+/CD34+选择的部分以及未选择的CD133/CD34阴性部分的选择方法，如本节以及其后续各节中所述。应理解的是，可以根据至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个、或者根据本文中公开的所有选择参数来选择或排除所述离体扩增的CD133+/CD34+以及所述未培养的CD133/CD34阴性脐带血细胞部分。
[0261] 在一些实施例中，需要移植的所述受试者患有血液疾病。在一些实施例中，所述受试者患有血液恶性肿瘤。
[0262] 应理解的是，本发明的所述方法、组合物、试剂盒以及制造物品可以用于治疗或改善其他适应症的症状，包含但不限于，慢性骨髓性白血病(myeloid leukemia)、其他骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、再生障碍性贫血(aplastic anemia)、纯红细胞再生障碍、阵发性夜间血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)、范可尼(fanconi)贫血、重型地中海贫血(thalassemia major)、镰状细胞性贫血(sickle cell anemia)、重症综合性免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)、欧德里症候群(wiskott-aldrich syndrome)、噬血细胞淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis)、先天性代谢异常、表皮溶解水疱症(epidermolysis bullosa)、重型先天性中性粒细胞减少症(severe congenital neutropenia)、舒-戴二氏综合征(Shwachman-Diamond syndrome)、戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia)、白细胞粘附缺陷、自身免疫性疾病以及代谢性疾病。
[0263] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少2.4×107个CD133+细胞总数、至少2×108个CD15+细胞总数、以及至少3.2×107个CD1(a与c)+细胞总数。
[0264] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少83％的所述多个细胞的存活率、至少2×108个CD14+细胞8 7
总数、至少1×10个CD11b+细胞总数、以及至少6×10个CD1(a与c)+细胞总数。
总数、至少1×10个CD11b+细胞总数、以及至少6×10个CD1(a与c)+细胞总数。
[0265] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少83％的所述多个细胞的存活率、至少2×108个CD14+细胞总数、至少1×108个CD11b+细胞总数、以及至少6×107个CD1(a与c)+细胞总数。
[0266] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少70％的存活率、至少8×105个CD133+/CD38-细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
[0267] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具8 5
有至少8×10个活细胞总数、至少70％的存活率、至少8×10个CD133+/CD38-细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
有至少8×10个活细胞总数、至少70％的存活率、至少8×10个CD133+/CD38-细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
[0268] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有CD34+部分的总数为至少7％、至少8×107个CD14+细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
[0269] 受试者
[0271] 如本文中所使用，一“需要其的受试者”是指需要输液(transfusion)、输注(infusion)或植入本发明的所述多个脐带血部分以治疗或改善一疾病、病症或病状的一受试者。在一个实施例中，所述受试者患有(被诊断为)或正患有一血液疾病。在一些实施例中，所述血液疾病是一细胞增殖性疾病。在其他实施例中，所述血液疾病是一血液恶性肿瘤。
[0272] 如本文中所使用的，术语“的风险”或“的概率”是指发生的可能性。在一些实施例中，在一个体中发生的风险或概率(例如，一脐带血移植物的移植或不移植、非复发死亡率等)是指从接受治疗的群组与未接受相同治疗的群组之间的比较数据计算的一风险。在一些实施例中，风险或概率的增加或降低反映了在治疗组与对照组之间在考虑结果方面的差异。在一些实施例中，一特定事件或状况的风险或概率的增加或减少仅是相对的，而不是用数值来表示。
[0273] 如本文中所使用，术语“细胞增殖性疾病”是指其中细胞的失调或异常生长、或两者均可导致不希望的状态或疾病的发展的状况，其可能是或可能不是癌性的(cancerous)。本发明的示例性细胞增殖性疾病包括细胞分裂不受控制的多种状态。示例性细胞增殖性疾病包含但不限于，肿瘤、良性肿瘤、恶性肿瘤、癌前状态(pre-cancerous condition)、原位肿瘤(in situ tumor)、包膜肿瘤、转移性肿瘤(metastatic tumor)、液体肿瘤、实体肿瘤、免疫肿瘤、血液肿瘤、癌症(cancer)、癌(carcinomas)、白血病、淋巴瘤、肉瘤(sarcomas)、以及快速分裂的细胞(rapidly dividing cell)。如本文中所使用，术语“快速分裂的细胞”定义为以超过或大于在相同组织内的相邻或并置的细胞之间预期或观察到的速率分裂的任何细胞。一细胞增殖性疾病包含癌症前(precancer)或癌前(precancerous)状态。一细胞增殖性疾病包含癌症。在多个特定实施例中，本文中提供的方法用于治疗或改善癌症的症状。
术语“癌症(cancer)”包含实体肿瘤、以及血液肿瘤及/或恶性肿瘤。在优选的多个实施例中，所述受试者患有(被诊断为)或正患有一血液恶性肿瘤。所述血液恶性肿瘤可以是选自由急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome，MDS)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、或霍奇金病所组成的群组。
术语“癌症(cancer)”包含实体肿瘤、以及血液肿瘤及/或恶性肿瘤。在优选的多个实施例中，所述受试者患有(被诊断为)或正患有一血液恶性肿瘤。所述血液恶性肿瘤可以是选自由急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome，MDS)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、或霍奇金病所组成的群组。
[0274] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少75％的所述多个细胞的存活率、至少7％的CD34+细胞、至少8.1×107个CD34+细胞总数、至少6×107个CD133+细胞总数、至少3×108个CD15+细胞总数、至少8.7×107个CD11b+细胞总数、以及至少5×107个CD1(a与c)+细胞总数。
[0275] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少7％的CD34+细胞、至少8×105个CD133+/CD38-细胞、至少2×108个CD15+细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
[0276] 在一些实施例中，本发明的所述方法、组合物以及试剂盒可以用于治疗所有年龄组的受试者。在多个特定实施例中，所述受试者或患者的年龄在16至60岁之间。
[0277] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少2.4×107个CD133+细胞总数、以及至少5.6×107个CD34+细胞总数。
[0278] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少10×108个活细胞总数、至少83％的所述多个细胞的存活率、以及至少7×107个CD1(a与c)+细胞总数。
[0279] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少7％的CD34+细胞部分、至少8×105个CD133+/CD38-细胞总数、以及至少8×107个CD14+细胞总数。
[0280] 在一些实施例中，有需要的受试者可以在以下阶段之一中患有急性淋巴细胞性白血病(ALL)：(a)高风险第一次完全形态缓解(first complete morphologic remission，CR1)，定义为以下一种或多种：存在t(4；11)、t(9；22)、t(1；19)、或MLL重排t(11q23)；极端白细胞增多(WBC>30,000/微升(对于B-ALL)，或WBC>100,000/微升(对于T-ALL))；在首次诱导治疗后未能达到完全形态缓解；通过流式细胞术在筛查时的微小残留疾病(minimal residual disease，MRD)，或(b)第二次或后续缓解。
[0281] 有需要的受试者可以在以下阶段之一中患有急性骨髓性白血病(AML)：(a)第一次完全形态缓解(CR1)不被认为是一有利的风险，有利的风险定义为以下一种或多种以及在筛查时没有MRD：t(8,21)没有cKIT突变；inv(16)或t(16；6)没有cKIT突变，正常核型有突变的NPM1，且没有FLT-3内部串联重复(internal tandem duplication)；正常核型有双重突变的CEBPA；APL在固结(consolidation)结束时在第一次或第二次分子缓解中，或(b)第二次或后续缓解。
[0282] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少70％的所述多个细胞的存活率、至少8×107个CD14+细胞总数、以及至少3.2×107个CD1(a与c)+细胞总数。
[0283] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有CD34+部分的总数为至少7％、至少8×107个CD14+细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
[0284] 在其他实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少83％的所述多个细胞的存活率、至少2×108个CD14+细胞总数、至少1×108个CD11b+细胞总数、以及至少6×107个CD1(a与c)+细胞总数。
[0285] 有需要的受试者可以在以下阶段之一中患有慢性骨髓性白血病(CML)：(a)慢性期具有以下一个或多个特征：对尼洛替尼(nilotinib)或达沙替尼(dasatinib)无法达到一边缘血液的(rimaryhematological)或细胞发生的(cytogenic)反应(遵循欧洲白血病净时间表(European Leukemia Net timeline))。两种酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的不耐受/失效、以及任何T315I突变；(b)加速期具有以下一个或多个特征：新诊断的患者未达到欧洲白血病净时间表中概述的对多个TKI的最佳反应；TKI患者从慢性期进展，或(c)一先前急变期(blast crisis)(骨髓以及淋巴)目前处于完全形态缓解。
[0286] 有需要的受试者可以患有国际预后评分系统(International Prognostic Scoring System，IPSS)风险分类为INT-1或更高的骨髓增生异常综合症(MDS)。在筛查形态分析时，患者的骨髓中没有循环的成髓细胞(myeloblast)且≤10％的成髓细胞。原发表现(primary presentation)被分类为INT-1的MDS患者患有威胁生命的中性粒细胞减少症(ANC<0.5×109/升)或血小板减少症(血小板<30×109/升)。
[0287] 有需要的受试者可能患有非霍奇金淋巴瘤或霍奇金病，且具有以下至少一个特征：(a)进展或对前期化疗无反应，且已达到一部分缓解(部分缓解定义为与先前化疗相比疾病降低≥50％)至后续治疗，或(b)第二次或后续完全或部分缓解(部分缓解定义为与先前化疗相比疾病降低≥50％)，且不适合进行自体干细胞移植。
[0288] 在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少70％的所述多个细胞的存活率、至少7％的CD34+细胞、至少2.4×107个CD133+细胞总数、至少8×107个CD14+细胞总数、以及至少3.2×107个CD1(a与c)+细胞总数。在一些实施例中，选择适合用于移植的所述多个离体扩增的CD133+/CD34+细胞具有至少8×108个活细胞总数、至少2×108个CD15+细胞总数、以及至少8×107个CD11b+细胞总数。
[0289] 在一些实施例中，可以根据以下标准定义一有需要的受试者：通过卡诺夫斯基(Karnofsky)的一性能分数至少为70％，且足够的生理储备包含：a、心脏：通过超声心动图、放射性核素扫描、或心脏MRI，左心室射血部分(left ventricular ejection fraction，LVEF)≥40％；b、肺功能测试显示FVC以及FEV1大于预期年龄的50％，且cDLCO大于预期的50％；C、肾：肌酐(creatinine)清除测试(通过克罗夫特-高尔特方程(Cockcroft-Gault equation))≥60毫升/分钟，以及d、肝：血清胆红素(serum bilirubin)<2.0毫克/分升(dl)；肝转氨酶(hepatic transminase)(ALT以及AST)<3倍正常范围上限。
[0290] 在一些实施例中，可以将受试者从以下任何一个治疗的考虑中排除：
[0292] 2.CMMoL或MDS/CMMoL重叠；
[0293] 3.自所述患者最后一次化疗周期开始以及所述干细胞移植制备方案开始以来不到21天(鞘内药物(intrathecal agent)、羟基脲(hydroxyurea)、酪氨酸激酶抑制剂、低甲基化药物(hypomethylating agent)、利妥昔单抗(rituximab)以及来那度胺(lenalidomide)不视为化疗)；
[0294] 4.持续的临床显着毒性，使所述患者不适合移植；
[0295] 5.针对一候选脐带血单位概况的抗HLA抗体的证据(对HLA、A、B、C、或DRB1，MFI>3000)；
[0296] 6.HIV感染或HIV阳性血清学诊断(serology)的证据；
[0297] 7.通过血清学诊断或PCR确定的活性B型肝炎(hepatitis B)、C型肝炎、或EBV的证据；
[0298] 8.妊娠，如通过一阳性血清人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)测试、或泌乳(lactation)所表明；
[0299] 9.活性恶性肿瘤，除了在参加治疗计划的12个月内正在进行的UCB移植的活性恶性肿瘤。在参加的12个月内，允许原位完全切除的皮肤鳞状细胞(cutaneous squamous cell)或基底细胞癌(basal cell carcinoma)、或宫颈癌(cervical carcinoma)；
[0300] 10.不受控制的细菌、真菌或病毒感染、或严重伴发疾病的证据，其表明所述患者不能耐受移植；
[0301] 11.在中枢神经系统(CNS)中具有白血母细胞(leukemic blast)的体征以及症状的患者；
[0302] 12.具有一8/8等位基因(allele)水平HLA匹配的且易于获得的相关或不相关供体的患者(其干细胞可以及时收集而不会损害受体结果)；
[0303] 13.先前的异基因造血干细胞移植；
[0304] 14.对牛产品、庆大霉素(gentamicin)、或可能干扰治疗的任何其他产品过敏；
[0305] 15.心理上无法进行骨髓移植(BMT)并具有相关的严格隔离、或不遵守医疗规定、及/或心理疾病、及/或社会状况的历史记录，其会限制对治疗需求的依从性；以及[0306] 16.在批准的治疗日期前30天内参加一介入性(interventional)临床试验或接受一研究性治疗。
[0307] 在一些实施例中，有需要的受试者已经进行清髓疗法(myeloablative therapy)或调理方案(conditioning regime)。在多个特定实施例中，在移植或施用本发明的所述组合物之前，所述受试者已经进行清髓疗法或调理方案。可以在移植或施用本发明的所述组合物之前的11天(-11)至2天(-2)之间对所述受试者进行所述清髓疗法或调理方案，或者，在另一方案中，在移植或施用本发明的所述组合物之前的8天(-8)至1天(-1)之间，或在移植或施用本发明的所述组合物之前的7天(-7)至3天(-3)之间。所述清髓疗法或调理方案可以包含全身照射(total body irradiation，TBI)以及氟达拉滨(fludarabine)，也可以包含白消安(Busulfan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、或噻替派(Thiotepa)。在一个方案中，总辐射剂量为1350毫戈瑞(cGy)，将在5天内分8或9个部分。例如在11天方案的第-9天至第-5天，将在至少6小时的间隔给予在同一天的2个部分。在所述11天方案中，氟达拉滨(40mg/m2/天)将例如在第-5天至第-2天施行静脉注射(IV)。氟达拉滨将根据调整后的理想体重给药。在所述11天方案中，噻替派(5mg/kg)在第-11天以及第-10天施行IV。
[0308] 在一8天方案中，总辐射剂量为1350cGy，将在4天内分8个部分，在第-4天至第-1天，将在至少6小时的间隔给予在同一天的2个部分。氟达拉滨(25mg/m2/天)在第-8天至第-6天施行静脉输注(IV infusion)超过60分钟。氟达拉滨将根据调整后的理想体重给药。在一些实施例中，所述方案也可以包含环磷酰胺。环磷酰胺可以根据调整后的理想体重以
60mg/Kg/天施行，例如，在所述8天方案的第-8天以及第-7天。
60mg/Kg/天施行，例如，在所述8天方案的第-8天以及第-7天。
[0309] 一些调理方案不包含TBI。在一示例性7天方案中，噻替派(5mg/kg)在第-7天以及第-6天施行静脉注射，以及白消安(3.2mg/kg或调整为3天后白消安累积暴露量为75mg*h/L)在第-5天至第-4天施行静脉注射。在这一种方案中，氟达拉滨(50mg/m2/天)在第-5天至第-3天施行静脉输注超过60分钟。
[0310] 在一些实施例中，有需要的受试者已经进行移植物抗宿主疾病(graft-versus-host，GvHD)预防方案。在一个实施例中，在移植或施用本发明的所述组合物之前，所述受试者已经进行GvHD预防方案。可以在移植或施用本发明的所述组合物之前的9天(-9)至1天(-1)之间对所述受试者进行所述GvHD预防方案。在其他实施例中，所述受试者在移植或施用本发明的所述组合物之前的至少3天(-3)至至少第+150天具有所述GvHD预防方案。所述受试者可以单独地或组合地进行清髓疗法、或调理方案、或GvHD预防方案。所述GvHD预防方案可以包含霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)以及他克莫司(tacrolimus)。在一些实施例中，他克莫司从第-3天开始通过IV施行直至耐受口服药物，然后通过口服(PO)直到第+
150天达到5至15ng/ml的目标血液水平，且MMF通过IV或PO从第-3天开始至至少第+60天1天
3次(TID)施行1g(15mg/kg IV TID，如果患者体重<50kg)。
150天达到5至15ng/ml的目标血液水平，且MMF通过IV或PO从第-3天开始至至少第+60天1天
3次(TID)施行1g(15mg/kg IV TID，如果患者体重<50kg)。
[0311] 在一些实施例中，有需要的受试者将在所述调理方案之前放置一适当的长期中心静脉通路(venous access)。在一些实施例中，所述受试者将具有一三腔隧道导管(triple lumen tunneled catheter)。
[0312] 在一些实施例中，受试者可以接受以下任何或全部：输注支持物(infusion support)(例如，二苯醇胺(diphenylhydramine)、或右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、氢化可的松(hydrocortisone)以及对乙酰氨基酚(acetaminophen))、支持性细胞因子(例如，G-CSF)、所需的血液制品、抗病毒、抗菌、PCP及/或真菌预防、CMV、EBV以及HHV6监测、以及所需的IV免疫球蛋白。
[0313] 在一些实施例中，受试者接受所述血液疾病的任何或所有的其他治疗。所述治疗可以是选自由一免疫抑制治疗、化学疗法以及放射疗法所组成的群组的一治疗。
[0314] 因此，在一些实施例中，提供了一种在一有需要的受试者中治疗一血液疾病的方法，所述方法包括：
[0315] (a)将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；
[0316] (b)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；
[0317] (c)冷冻保存来自步骤(b)的所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；
[0318] (d)解冻所述离体培养的第一选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；以及
[0319] (e)将来自步骤(d)的所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，从而在所述受试者中治疗所述血液疾病。
[0320] 在一些实施例中，在一有需要的受试者中治疗一血液疾病的所述方法包括：
[0321] (a)将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；
[0322] (b)在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；
[0323] (c)冷冻保存来自步骤(b)的所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；
[0324] (d)解冻所述离体培养的第一选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；以及
[0325] (e)将来自步骤(d)的所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，从而在所述受试者中治疗所述血液疾病。
[0326] 在一些实施例中，适合用于移植的所述单一的脐带血单位的特征为以下多个冷冻保存前的参数：
[0327] (i)至少8×106个CD34+细胞总数；
[0328] (ii)在6个I类HLA(HLA-A以及HLA-B，低分辨率)以及II类HLA(HLA-DRB1，高分辨率)位点中至少4个与所述受试者有HLA匹配；
[0329] (iii)约1.8×109至约3.0×109个冷冻保存前的有核细胞总数；以及
[0330] (iv)每公斤受试者体重具有约1.5×107至约3.0×107个冷冻保存前的有核细胞总数。
[0331] 在一特定实施例中，在移植的同一天将所述第一冷冻保存的离体培养的选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分解冻。在一些实施例中，所述第一冷冻保存的离体培养的(扩增的)CD133+/CD34+部分保持冷冻直到移植当天。在移植当天，在临床现场，将第一冷冻保存的离体培养的(扩增的)CD133+/CD34+部分解冻，并在一封闭系统中用所述输注溶液(8％w/v人血清白蛋白(HSA)以及6.8％w/v右旋糖酐(Dextran-40))还原。
[0332] 在一些实施例中，相同脐带血单位的所述未选择的CD133/CD34阴性脐带血部分是在CD133+细胞的所述分离(例如，CliniMACS阳性分离)期间洗脱的细胞部分。此部分包含多个免疫细胞(例如，B、T以及NK细胞)的全部储备。从所述选择管柱(例如，CliniMACS管柱)洗脱后，将所述多个细胞洗涤并悬浮在冷冻保存溶液 (BioLife Solutions公司)中、标记、然后使用一控制速率冷冻器冷冻。储存在液氮中。所述未选择的CD133/CD34阴性部分保持冷冻直到移植入所述受试者当天。在移植当天，将所述未选择的CD133/CD34阴性部分解冻，并在一封闭系统中用所述输注溶液(8％w/v HSA以及6.8％w/v右旋糖酐(Dextran-40))还原。在一些实施例中，筛选所述输注溶液以适合与本发明的所述方法以及组合物一起使用。选择合适的输注溶液的示例性标准包含安全性测试，其表明无细菌、酵母菌、或霉菌生长、内毒素含量低于0.5Eu/ml，且一清晰、无异物的外观。
[0333] 在一些实施例中，将所述输注溶液储存在袋中直至在2至8℃下使用(例如，移植)。
[0334] 在一些特定实施例中，在多个脐带血部分的移植之前，在移植当天对所述有需要的受试者进行安全性评估，通常包含一体格检查、CBC、血液化学(例如，至少血清肌酐、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT以及镁)、生命体征：体重、体温、血压、脉搏以及呼吸频率，且伴随药物的施用，包含RBC以及血小板输注。
[0335] 取决于个体部位实践的限制，通常通过所述患者的中心静脉导管的输注将所述选择的、扩增的CD133+CD34+以及所述未选择的CD133CD34阴性脐带血部分输注至有需要的受试者中。在一些实施例中，首先输注所述选择的、扩增的CD133+/CD34+脐带血部数，然后立即输注所述未选择的CD133/CD34阴性(未经操作的)脐带血部分。在其他实施例中，首先输注所述未选择的CD133/CD34阴性(未经操作的)脐带血部分，然后立即输注所述选择的、扩增的CD133+/CD34+脐带血部分。
[0336] 因此，在本发明的一些实施例中，通过在所述患者中输注一输注溶液来进行移植，其中所述离体培养的第一选择的血细胞部分在所述未培养的第二未选择的血细胞部分之前输注，而在其他实施例中，未培养的所述第二未选择的血细胞部分在所述离体培养的第一选择的血细胞部分之前输注。
[0337] 如上文中所详述，筛选选择适合用于移植的所述选择的、扩增的CD133+/CD34+脐带血部分以及所述未选择的CD133/CD34阴性(未经操作的)脐带血部分，其中包含活细胞总含量。在一些实施例中，用于输注至所述受试者中的所述第一离体培养的CD133+CD34+血细胞部分包括至少8×108个活细胞总数。在一些实施例中，用于输注至所述受试者中的所述第二未培养的CD133/CD34阴性血细胞部分包括至少4×108个活细胞总数。
[0338] 本发明的血液疾病的治疗方法可用于治疗血液恶性肿瘤，包括但不限于，慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、以及骨髓增生异常综合症(MDS)。还考虑了霍奇金病以及非霍奇金淋巴瘤的治疗。如本文中所使用，术语“治疗一血液疾病”或“治疗一血液恶性肿瘤”是指减轻所述血液疾病的症状或体征。在一些实施例中，根据(但不限于)随时间推移的症状减轻，临床参数(例如，中性粒细胞以及血小板计数)的改善、住院治疗减少、以及复发或死亡的风险减少来评估治疗血液疾病或一血液恶性肿瘤。
[0339] 因此，根据本发明方法的一些实施例，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，减少了从移植到中性粒细胞移植入所述受试者中的时间。
[0340] 如本文中所使用，术语“未经操作的脐带血”是指未经历如本文中所述的选择及/或扩增的脐带血。在一些实施例中，未经操作的脐带血是来自所述脐带血库的一新鲜单位或一冷冻保存的脐带血单位。
[0341] 在一些实施例中，当与一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血液的移植将中性粒细胞移植的时间减少了5至14天。
[0342] 如本文中所使用，术语“中性粒细胞移植”是指在移植后42天或之前(以及在输注任何其他干细胞产品之前)，后续的供体嵌合(donor chimerism)(通过外周血嵌合而≤10％的宿主细胞)在不同天的3次连续测量达到一绝对中性粒细胞计数(ANC)≥0.5×109个/L。在一些实施例中，减少中性粒细胞移植的时间是指在移植后16天或之前，后续的供体嵌合(通过外周血嵌合而≤10％的宿主细胞)在不同天的3次连续测量达到一绝对中性粒细胞计数(ANC)≥0.5×109个/L。
[0343] 根据本发明方法的一些实施例，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，减少了从移植到血小板植入所述受试者中的时间。
[0344] 在其他实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，移植所述第一离体培养的CD133+/CD34+造血干/祖血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分，在移植后42天增加了在所述受试者中血小板移植的可能性。
[0345] 在多个特定实施例中，术语“血小板移植”是指在不同天进行至少3次连续测量的第一天，以使所述患者在前7天(移植日计算为前7天之一)在没有血小板输注下达到一血小板计数>20×109/L。所述3个测量的所述第一天将被指定为血小板移植日，且发生在一第二干细胞产品的任何输注之前。
[0346] 根据本发明方法的一些实施例，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，降低了在所述受试者中移植后第42天非移植的可能性。在多个特定实施例中，术语“原发性移植失败(primary graft failure)”或“非移植(non-engraftment)”是指如上文中所述在第42天之前未能达到中性粒细胞移植。在移植后第42天或之前向所述受试者输注一第二干细胞产物的要求也视是原发性移植失败。然而，即使在移植后第42天或之前发生，在有记录的中性粒细胞移植后需要输注一另外的干细胞产物也可以视为继发性移植失败(secondary graft failure)。原发性移植失败的日期将指定为移植后第43天。
[0347] 在其他实施例中，将所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分根据本发明的所述方法移植入一有需要的受试者中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，降低了继发性次移植失败或继发性非移植的可能性。在多个特定实施例中，术语“继发性移植失败”或“非移植”是指有记录的中性粒细胞移植，随后是骨髓细胞<5％的严重中性粒细胞减少症(在不同天进行三次或三次以上连续实验数值为<0.5×109/L)，没有自发或生长因子治疗后发生的后续改善。在有记录的中性粒细胞移植后输注一另外的干细胞产物视为继发性移植失败。如上文所定义，严重中性粒细胞减少症的第一天的较早时间，或另外的干细胞输注的日期将指定为继发性移植失败的日期。
[0348] 根据本发明方法的一些实施例，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，降低了在所述受试者中移植后非复发死亡率的可能性。如本文中所使用，术语“非复发死亡率”是指未在受试者的一种或多种血液疾病复发之前发生的任何死亡。
[0349] 在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分的移植降低了移植后180至210天的非复发死亡率的可能性。
[0350] 在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分的移植降低了1年时的非复发死亡率的风险。在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，根据本发明的所述方法移植所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分降低了移植后15个月的非复发死亡率的风险。
[0351] 根据本发明方法的一些实施例，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，降低了移植后的第一个100天内所述受试者的住院时间(hospitalization)。如本文中所使用，术语“住院时间”是指从移植到首次出院的总天数。
[0352] 在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分的移植降低了5至30天的手术后住院时间。在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分的移植增加了移植后存活天数以及出院率。如本文中所使用，存活天数以及出院率定义为所述患者存活且没有住院的完整天数(日历天)。
[0353] 根据本发明方法的一些实施例，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，降低了在所述受试者中移植后2/3级细菌性或侵入性真菌感染的风险。细菌性及/或侵入性真菌感染的分级是本领域众所周知的。3级细菌感染的迹象包含但不限于，细菌血症伴有深部器官病变(例如，伴有新的或恶化的肺部浸润(pulmonary infiltrate)；心内膜炎(endocarditis))、严重败血症伴有细菌血症、需要清创的筋膜炎(fasciitis)、需要插管的肺炎、无细菌血症的脑脓肿(abscess)或脑膜炎(meningitis)、以及困难毒素阳性粪便(difficile toxin positive stool)伴有毒性扩张术(dilatation)、或肾功能不全伴有/没有伴有腹泻。3级真菌感染的迹象包含但不限于，真菌病(包含念珠菌病(candidemia)、已证实或可能的侵入性真菌感染(例如，曲霉菌(aspergillus)、毛霉菌(mucor)、镰刀菌(fusarium)、孢子菌(Scedosporium))、散播性(disseminated)感染(定义为多灶性肺炎、尿液或血液抗原的存在、及/或CNS病变)伴有荚膜组织浆菌病(histoplasmosis)、芽生菌病(blastomycosis)、球孢子菌(coccidiomycosis)、或隐球菌(cryptococcus)以及耶氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis jiroveci pneumonia)(无论PaO2水平)。
[0354] 在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，根据本发明的所述方法移植所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分降低了在所述受试者中移植后2/3级细菌性或侵入性真菌感染的风险、降低了在所述受试者中移植后100天2/3级细菌性或侵入性真菌感染的风险。
[0355] 根据本发明方法的一些实施例，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，降低了在所述受试者中移植后100天急性移植物抗宿主疾病III-IV级的风险。在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，根据本发明的所述方法移植所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分降低了在所述受试者中移植后100天急性移植物抗宿主疾病III-IV级的风险。
[0356] 在一些实施例中，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，根据本发明的所述方法移植所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分降低了在所述受试者中移植后180天或1年慢性移植物抗宿主疾病(轻度/中度/重度)在所述受试者中的风险。
[0357] 如本文中所使用，术语“急性GvHD”是指在移植后较早发生的急性移植物抗宿主疾病，而慢性或cGvHD是指在移植后急性GvHD的分界点之后较晚出现的慢性移植物抗宿主疾病。在一些实施例中，急性GvHD是根据关于急性GvHD分级的共识会议(参见Przepiorka等人，骨髓移植(Bone Marrow Transplant)，1995，15：825-828)进行分类，以及cGvHD是根据对cGvHD分级的NIH共识标准(参见Jagasia等人，血液以及骨髓移植的生物学(Biol.Blood Marrow Transplant)，2015，21：389-401)进行分类。
[0358] 在本发明的所述方法的一些实施例中，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，增加了移植后15个月无疾病的存活率、增加了移植后210天及/或15个月的总存活率、提升了移植后例如28天、70天、100天、180天以及365天在所述受试者中的免疫重建(不同淋巴细胞亚群的数量以及比例)。
[0359] 在本发明的所述方法的一些实施例中，将适合用于移植入所述受试者的一单一的脐带血单位分离为：(i)一第一选择的血细胞部分，包括多个CD133+/CD34+选择的细胞，以及(ii)一第二未选择的血细胞部分，包括多个CD133/CD34阴性细胞；在允许细胞增殖的多个条件下，离体培养包括多个CD133+/CD34+选择的细胞的所述第一血细胞部分，所述多个条件包括提供营养素、血清、多个细胞因子的一组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0毫摩尔至10毫摩尔之间；冷冻保存所述离体培养的第一CD133+/CD34+选择的血细胞部分以及所述未培养的第二未选择的血细胞部分；解冻所述离体培养的CD133+/CD34+第一选择的血细胞部分以及所述未培养的CD133/CD34阴性第二未选择的血细胞部分；以及将所述解冻的离体培养的第一选择的血细胞部分以及未培养的第二未选择的血细胞部分移植入一有需要的受试者，当与移植一单个或两个单位的未经操作的脐带血相比，降低了在所述受试者中移植后疾病复发以及复发死亡率的可能性。
[0360] 在一些实施例中，根据以下标准定义疾病复发：
[0361] 恶性肿瘤复发-复发是由与移植前特征一致的AML、ALL、CML、或MDS的形态学或细胞遗传学证据定义。
[0362] 微小残留疾病-微小残留疾病(MRD)是在血液或骨髓中没有疾病的形态学或细胞遗传学证据的情况下，通过流式细胞仪、荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)、或南方墨点法或西方墨点法、或聚合酶链反应(PCR)、或其他技术的恶性细胞的唯一证据来定义。仅有微小残留疾病的证据不足以符合复发的定义，然而，进展的微小残留疾病可视为复发。
[0363] 急性白血病-复发可定义为以下任何一种：
[0364] >5％的母细胞在骨髓中，非归因于其他原因(例如，骨髓再生)。
[0365] 骨髓内出现新的增生异常变化，非归因于其他原因。
[0366] 在外周血中再次出现白血病母细胞。
[0367] 移植前再次出现疾病的先前细胞遗传学或分子标记。
[0368] 脑脊髓液中髓外白血病或白血病细胞的发展。
[0370] 慢性骨髓性白血病(CML)
[0371] 在以下情况下可以诊断血液学复发：
[0372] 1.在外周血中持续地记录未成熟的造血细胞；或
[0373] 2.在存在细胞遗传学复发的情况下，在骨髓中有骨髓增生。
[0374] 在以下情况下可以诊断细胞遗传学复发：
[0375] 1.50％的中期表现特征性(9；22)易位(translocation)，至少分析了10个中期；或[0376] 2.无论分析的中期数量，至少间隔一个月，在两个分开的连续检查中的每一个至少有一个中期显示(9；22)易位。最早测试的日期将视为复发的日期。
[0377] MDS
[0378] 复发可定义为以下任何一种：
[0379] 满足上述对急性白血病演变的标准；或
[0380] 至少间隔一个月，在两个连续骨髓样本中检测到再次出现的移植前形态异常(最早测试的日期将视为复发的日期)；或
[0381] 无论分析的中期数量，至少间隔一个月，在两个分开的连续检查中的每一个至少有一个中期再次出现移植前细胞遗传学异常。
[0382] 无论是否符合上述标准，对MRD检测做出反应的任何疗法的设立(包含撤回免疫抑制疗法或用低甲基化药剂的治疗)视为复发的证据，。
[0384] (i)包括在允许细胞增殖的条件下离体培养的多个CD133+/CD34+选择的脐带血细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的一第一血细胞部分，所述条件包括提供营养素、血清与多个细胞因子的组合(包含干细胞因子、血小板生成素、FLt3配体以及IL-6中的每一个)、以及烟酰胺，所述烟酰胺的量在1.0mM至10mM之间；(ii)包括多个CD133/CD34阴性细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的一第二未培养的、未选择的血细胞部分，其中所述包装材料包括一标签或包装插页，其表明所述第一以及第二脐带血细胞群体是用于治疗一有需要的受试者中的一血液疾病。
[0385] 在一些实施例中，本发明的所述制品、组合物或试剂盒更包括用于施用所述(i)包括多个CD133+/CD34+选择的脐带血细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第一血细胞部分，以及(ii)包括多个CD133/CD34阴性细胞至一有需要的受试者的适合用于移植入一有需要的受试者的所述第二未培养的、未选择的血细胞部分的指示。
[0386] 在本发明的所述制品、组合物或试剂盒的一些实施例中，所述(i)包括多个CD133+/CD34+选择的脐带血细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第一血细胞部分包括至8
少8×10个活细胞总数。在一些实施例中，所述第一CD133+/CD34+选择的脐带血细胞部分包括至少10×108个活细胞总数、至少15×108个活细胞总数、至少20×108个活细胞总数、或至少25×108个活细胞总数。在本发明的所述制品、组合物或试剂盒的一些实施例中，所述(ii)包括多个CD133/CD34阴性细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第二未培养的、未选择的血细胞部分包括4×108个活细胞总数。在一些实施例中，包括多个CD133/CD34阴性细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第二未培养的、未选择的血细胞部分包括至少6×108个活细胞总数、至少8×108个活细胞总数、至少10×108个活细胞总数、或至少15×
108个活细胞总数。
少8×10个活细胞总数。在一些实施例中，所述第一CD133+/CD34+选择的脐带血细胞部分包括至少10×108个活细胞总数、至少15×108个活细胞总数、至少20×108个活细胞总数、或至少25×108个活细胞总数。在本发明的所述制品、组合物或试剂盒的一些实施例中，所述(ii)包括多个CD133/CD34阴性细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第二未培养的、未选择的血细胞部分包括4×108个活细胞总数。在一些实施例中，包括多个CD133/CD34阴性细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第二未培养的、未选择的血细胞部分包括至少6×108个活细胞总数、至少8×108个活细胞总数、至少10×108个活细胞总数、或至少15×
108个活细胞总数。
[0387] 在本发明的所述制品、组合物或试剂盒的一些实施例中，所述(i)包括多个CD133+/CD34+选择的脐带血细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第一血细胞部分，以及(ii)包括多个CD133/CD34阴性细胞的适合用于移植入一有需要的受试者的第二未培养的、未选择的血细胞部分是作为冷冻保存的脐带血细胞部分。
[0388] 本发明选择的细胞群体本身可以与培养基(含有与从所述培养基分离出来的相同物质)一起提供，且与一药学上可接受的载体以及可以促进细胞移植及/或器官功能的其他试剂组合(例如，免疫抑制剂、抗生素、生长因子)。因此，本发明的细胞群体可以在一药学上可接受的载体或稀释剂(例如，无菌生理食盐水以及水性缓冲溶液)中施用。这种载体以及稀释剂的使用是本领域众所周知的。
[0389] 如果需要，本发明的组合物可以存在于一包装或分配器装置中(例如，一FDA批准的试剂盒或制品)，其可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型(例如，细胞)。所述包装可以例如包括金属或塑料箔，例如，一泡罩(blister)包装。所述包装或分配器装置可以随附给药说明。所述包装或分配器装置还可以附有由政府机构规定的管理药物的制备、使用、或贩卖的形式通知，所述通知反映所述机构对人类或兽医管理的组合物形式的认可。这类通知例如可能包含美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)批准的处方药标签或一批准的产品插页。如上文中进一步详述的，还可以制备包括在一药学上可接受的载体中配制的本发明制剂的组合物，将其放置在一适当的容器中、并贴上标签以用于治疗一指定的病症。
[0390] 根据本发明的所述方法制备的所述多个细胞可以本身、或在与合适的载体或赋形剂(excipient)混合的一药物组合物中施用于所述受试者。
[0391] 如本文中所使用，一“药物组合物”是指本文中所述的一种或多种活性成分与其他化学组分(例如，生理上合适的载体以及赋形剂)的制备。一药物组合物的目的是促进一化合物对一生物体的给药。
[0392] 在下文中，可以互换使用的短语“生理上可接受的载体”以及“药学上可接受的载体”是指不会对一生物体造成显着刺激，且不会消除所述施用的化合物的生物活性以及特性的一载体或一稀释剂。这些短语中包含一佐剂(adjuvant)。
[0393] 在本文中，术语“赋形剂”是指添加至一药物组合物中以进一步促进一活性成分给药的一惰性物质。药物的配制以及给药技术可以在宾夕法尼亚州伊斯顿市麦克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA)的“雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)”的最新版本中找到，在此全文通过引用作为参考。
[0394] 因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用包括赋形剂以及辅助剂(auxiliary)的一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制，所述赋形剂以及辅助剂有助于将所述活性成分加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选的给药途径。
[0395] 对于注射，可以将所述药物组合物的所述活性成分配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，例如，汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、或生理盐缓冲液中。
[0396] 适合用于本发明上下文中的药物组合物包含其中所述有效成分的一有效含量达到预期目的的组合物。更具体地说，一“治疗有效量”是指有效预防、减轻、或改善一疾病(例如，白血病)的症状、或延长所述被治疗的受试者的存活率的一活性成分(例如，扩增的CD133+/CD34+细胞)的量。
[0397] 一治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文中所提供的详细公开内容。
[0398] 本文中所述的活性成分的毒性以及治疗功效可以通过体外、在细胞培养或实验动物中的标准药学方法来确定。从这些体外、以及细胞培养测定法与动物研究中获得的数据可以用于制定一系列用于人类的剂量。所述剂量可以根据所采用的剂型以及所使用的给药途径而变化。确切的配方、给药途径、以及剂量可以由个别医师根据患者的状况进行选择(参见，例如，Fingl,E等人，1975，治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第1章，第1页)。
[0399] 取决于待治疗病症的严重性以及反应性，剂量可以是单次或多次给药。当然，一组合物给药的量将取决于所治疗的受试者、患病的严重性、给药方式、开药医师的判断等。
[0400] 移植的临床经验
[0401] 根据本发明的所述方法，对接受所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分移植的人类患者进行血小板移植的评估，表明成功的血小板移植，且在较短的天数可观察到(与移植单个或两个单位的未经操作的脐带血相比)。
[0402] 在一临床试验中，包含36个血液恶性肿瘤患者接受了根据本发明的所述方法的所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分的移植，确定血小板移植时间是指移植与在不同天进行至少三次连续测量的第一天之间的间隔，所述患者在前7天(移植日计算为前7天之一)在没有血小板输注下达到一血小板计数>20×109/L。然后将所述三次测量的第一天指定为血小板移植日，发生在一第二干细胞产品的任何输注之前。根据本发明的所述方法，在成功移植血小板的所述患者中(在监测时)，接受移植的患者的血小板移植的中值时间为34天(95％CI：32至42天)(p<0.001)。在对照组(从文献来看)中的血小板移植的时间为46天(95％CI：42至50天)。
[0403] 当根据多个移植前参数对单个患者的血小板计数进行分析时，观察到在输注的活细胞总数与所述移植时间之间在统计学上高度相关。表XIII表示在具有不同活细胞总数值的患者之间在任何时间完成移植的概率比例(“比例亚分布危险模型(proportional subdistribution hazards model)”)。低“p值”(pr>ChiSq)的总计算以及温赛化(Winsorized)计算皆支持以下假设：使用所主张的移植方法，增加的活细胞总数导致更快的血小板移植。
[0404] 表XIII：血小板移植的比例亚分布危险模型的总活细胞总数
[0405]
[0406] *温赛化数据是极限值被限制以消除虚假无关值(outlieing value)的数据。
[0407] 当使用一特定原因(cause-specific)危险模型分析所述血小板移植数据时，所述温赛化数据集的所述p值略低于95％的概率(表XIV)：
[0408] 表XIV：血小板移植的特定原因危险模型的总活细胞总数
[0409]
[0410] 当分析接受根据本发明的所述方法的所述第一离体培养的CD133+/CD34+血细胞部分以及所述第二未培养的CD133-/CD34-血细胞部分移植的患者的血小板移植数据时间时，其他参数为：每公斤患者体重输注的活细胞总数(TVC)、当血小板移植作为一连续变量时，在输注的活细胞总数/公斤与所述移植时间之间在统计学上高度显着(TVC/kg以及TVC/kg温赛化)(表XV)。当将数据分为3组时，相关性仍然高度显着，且将最高四分位数值与最低四分位数值进行比较(参见表XV的“>Q3”)。
[0411] 表XV：血小板移植的比例亚分布危险模型的总活细胞总数/公斤
[0412]
[0413] *“3类”(>Q3)：将数据分为3类(category)(“类”(class))-上四分位数、中间两个四分位数、以及下四分位数，将上四分位数与下四分位数进行比较。
[0414] 当使用一特定原因危险模型分析所述TVC/Kg与血小板移植时间的关系时，TVC/Kg、TVC/Kg温赛化、以及>Q3的TVC/Kg的所有三个之间的相关性仍然高度显着(最高与最低四分位数之间)(表XVI)：
[0415] 表XVI：血小板移植的特定原因危险模型的总活细胞总数/kg
[0416]
[0417]
[0418] 移植后血小板移植时间是至关重要，因为延长的血小板减少症(thrombocytopaenia)代表移植受体存活的一风险因素。综上所述，本文分析的令人鼓舞的结果反映了接受根据本发明的所述方法的移植在血液恶性肿瘤患者中的有效血小板移植，与使用单个或两个单位的未经操作的血单位移植的患者报告的血小板恢复典型时间相比，显着地减少完成所述移植时间(中位数为34天(95％CI：32至42天)(例如参见Barker等人，
2015，Brit J Hemat168：405：中位数为49天(95％CI：31至320天至使用两个单位的脐带血移植的血小板移植))。
2015，Brit J Hemat168：405：中位数为49天(95％CI：31至320天至使用两个单位的脐带血移植的血小板移植))。
[0419] 如本文中所使用，术语“大约”是指±10％。
[0420] 术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包含(include)、“包含(including)”、“具有”以及它们的变化形式意味着“包含但不限于”的意思。
[0421] 术语“由……组成(consisting of)”意味着“包含且限于”的意思。
[0422] 术语“基本由……组成”意味着所述组成、方法或结构可以包含另外的成分、步骤及/或部件，但只有在所述另外的成分、步骤及/或部件本质上不改变所主张的组成、方法或结构的基本特性和新特性时。
[0423] 在本文中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述”包括复数参考，除非上下文另外明确地指出。例如，术语“一化合物”或“至少一个化合物”可以包含多个化合物，包含其混合物。
[0424] 贯穿本申请全文，可以以范围格式表示本发明的各种实施例。应理解的是，范围格式的描述仅出于便捷以及简明，而不应该构造为本发明的范围的一不可变的限制。相应地，一范围的描述应该被认为具有具体公开的所有可能子范围以及该范围内的单独的数字值。例如，一范围的描述例如从1至6应该被认为具有具体公开的子范围，例如，从1至3、从1至4、从1至5,从2至4、从2至6、从3至6等、以及该范围内的单独数字，例如1、2、3、4、5以及6。无论范围的宽度如何，这都可以适用。
[0425] 在本文中无论何时指示范围，都意指包含在指示的范围内的任何引用数值(分数或整数)。短语在一第一指示数字以及一第二指示数字“之间的范围/范围(ranging/ranges between)”、以及“从”一第一指示数字“到”一第二指示数字“的范围/范围”在本文中可以互换使用，且意在包含所述第一以及第二指示数字与它们之间的所有小数以及整数。
[0426] 在本文中所使用的术语“方法”是指用于完成一给定任务的方法、装置、技术以及程序，包含但不限于，公知的或通过化学、药理学、生物学、生物化学以及医学领域的从业人员根据公知方法、装置、技术以及程序容易获知的那些方法、装置、技术以及程序。
[0427] 应理解的是，虽然出于简明目的，在不同的实施例中描述了本发明的某些特征，但所述本发明的某些特征可以在一个实施例进行组合。反过来，虽然出于简洁目的，在单个实施例的上下文中描述了本发明的各种特征，但也可以分别提供本发明的各种特征，或以任何适当的子组合提供本发明的各种特征，或在本发明的任何其它所述实施例中适当地提供本发明的各种特征。在各种实施例的上下文中所述的某些特征，不应被视为这些实施例的必要特征，除非所述实施例没有这些元件不能工作。
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