技术领域
[0001] 本
发明属于检测技术领域，具体为一种通过解决由于分子与基质共结晶不均匀以及咖啡环效应导致的待测物分子在传统靶板上分布不均匀的问题(即甜点效应)，进而提高检测
信号的重复性，以改进质谱检测的方法。
背景技术
[0002] 基质辅助激光
解吸飞行时间质谱仪是鉴定多肽、
蛋白质、脂质、以及多种
聚合物强有
力的工具，应用范围较广泛。其原理是当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶
薄膜，基质从激光中吸取
能量，基质-样品之间发生能量转移从而使得样品发生解吸电离，电离的样品在
电场的作用下
加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。实际检测过程是随机选择样品的被测点，从中可以看出被检测信号的均匀性是衡量检测方法准确的前提。传统的基质辅助激光解吸电离质谱制备样品的方法是(从下往上)：分子-基质，基质-分子-基质，分子基质混合，然后再对样品进行晾干。由于基质-分子的共结晶不均匀，以及样品溶液晾干时的咖啡环效应，分子在基底上分布极其不均匀，而由于分子聚集导致信号很强的区域被称作是“甜点”。这种分子的分布不均匀使得检测时点与点之间信号差异特别大，最终导致选点时存在偶然性以及主观性，不能对实验结果进行准确的分析。因此，也有很多研究者做过许多相关工作，为了减弱咖啡环效应，
电润湿法，快速
蒸发法，增加混合样品的
粘度以及
真空沉积等方法被提出，但是，由于不能控制不同分子间的相互作用，这些工作依然无法实现基质和待测物分子的均匀共结晶。此外，也有一部分研究工作者设计制备特定的基质来解决共结晶的问题，但是这些基质和分子之间的相互作用一般都是基于官能团之间的相互作用，他们对于待测物分子的检测不具有普适性。另外，他们在利用这些基质进行辅助检测的时候，几乎都没有考虑混合溶液晾干过程中存在的咖啡环效应，这也会导致分子分布不均匀。无论是从解决咖啡环效应还是从解决基质和待测物分子不均匀共结晶的问题方面出发，虽然都得到了比较好的检测重复性，有的甚至得到低于
10％的相对标准偏差，但是基于技术方法的
缺陷，导致他们选的点数比较少，一般都少于十个点，这对判定解决方法的好坏不具有很大的说服力。
[0003] 因此，目前对于甜点效应的改善方法，存在解决不彻底的问题，从而导致只有在选取少量测试点的前提下才可以有好的重复性，具有一定的偶然性。
发明内容
[0004] 本发明的目的是利用聚甲基
丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏
水硅纳米柱阵列来解决基质辅助激光解吸电离质谱分析中存在的检测信号重复性不好的问题。由于弱疏水作用，聚甲基丙烯酸甲酯可以
吸附疏水性的蛋白和多肽，而聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列能够提供均匀的待测物吸附位点，因此我们将其作为基质辅助激光解吸电离质谱的基底。首先将基底置于待测物溶液的液面上，同时对溶液进行搅拌，将分子吸附到基底表面。由于该基底的疏水作用，将其从溶液中取出时表面没有溶液残留，因此待测分子不会生成咖啡环，从而去除了咖啡环效应。同时，纳米柱阵列及均匀分布在柱上的聚甲基丙烯酸甲酯使得待测分子均匀分布在基底上，然后以极易挥发的乙腈和三氟乙酸为
溶剂配制基质溶液并将其滴加到基底上，由于溶剂挥发速度大于分子向边缘迁移的速度，因此基质在溶剂挥发后不会生成咖啡环，而是均匀分布在吸附了待测分子的基底上，保证了分子和基质的均匀分布。我们这种方法有效地去除了甜点效应，提高了基质辅助激光解吸电离质谱的检测重复性。
[0005] 本发明所述的一种通过消除甜点效应提高质谱检测重复性的方法，具体步骤如下：
[0006] (1)在提球
硅片基底上
旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；
[0007] (2)在
覆盖聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底上组装聚苯乙烯微球；
[0008] (3)利用反应离子
刻蚀技术，以聚苯乙烯微球作为掩膜对硅进行刻蚀；
[0009] (4)利用
有机溶剂除去残留的聚苯乙烯微球，从而得到有序硅纳米柱阵列；
[0010] (5)在得到的有序硅纳米柱阵列上通过组装氟硅烷
单层分子膜进行表面修饰，得到疏水有序硅纳米柱阵列；
[0011] (6)在氟修饰的疏水有序硅纳米柱阵列上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；
[0012] (7)对聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列进行加热，得到聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；
[0013] (8)用聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列吸附待测分子；
[0014] (9)滴加基质分子溶液到吸附有待测分子的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；
[0015] (10)晾干步骤(9)中制备的样品，进行质谱检测。
[0016] 上述方法中，步骤(1)所述的在提球硅片基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜，包括如下几个步骤：
[0017] ①清洗硅片：将多片硅片依次用丙
酮、氯仿、
乙醇和去离子水在40～100W下超声清洗3～10min，再用NH3·H2O：H2O2：H2O体积比为1～3：1～3：5～7的混合溶液在80～100℃下加热清洗50～70min，最后用去离子水冲洗并用氮气吹干，分别得到提球硅片和排球硅片；
[0018] ②旋涂聚甲基丙烯酸甲酯：将用二
甲苯配制的
质量分数为5％～7.5％的聚甲基丙烯酸甲酯(分子量为97000～350000)溶液滴加到步骤①清洗好的提球硅片上，以2000rpm～7000rpm的速度进行旋涂，得到旋涂有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底，聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的厚度范围是100～300nm。
[0019] 步骤(2)所述的在有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的提球硅片基底上组装聚苯乙烯微球，包括如下几个步骤：
[0020] ①配制聚苯乙烯微球(直径为100～4000nm)的乙醇和去离子水的混合溶液：将直径100～4000nm的聚苯乙烯粉末0.1～1g加入到1～20mL、体积比1：1的去离子水和乙醇的混合溶液中，超声1～6h，使其混匀；
[0021] ②聚苯乙烯微球单层膜的组装及转移：在干净表面皿中加入去离子水，并加入20～100μL质量分数为0.5％～2％的
表面活性剂十二烷基
硫酸钠水溶液；然后用微量进样器将步骤①得到的聚苯乙烯微球的乙醇和去离子水混合溶液缓慢滴加到排球硅片上，并沿着排球硅片滑入水中，使其形成六方紧密堆积的聚苯乙烯微球单层膜，再加入5～25μL上述十二烷基硫酸钠水溶液使单层膜稳定；然后用具有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的提球硅片基底将聚苯乙烯微球提起，并倾斜放置直至水分完全挥发。
[0022] 步骤(3)所述的利用反应离子刻蚀技术，以聚苯乙烯微球作为掩膜进行硅的刻蚀，包括如下步骤：
[0023] ①减小聚苯乙烯微球的粒径：将表面带有聚苯乙烯微球单层膜的提球硅片在5×10-5～8×10-5Pa真空度下开始反应离子刻蚀，刻蚀的参数为：O2流量为10～50sccm，腔体压力为10～50mtorr，射频功率为15～200W，电感耦合
等离子体功率为50～150W；刻蚀时间为1～15min，刻蚀后聚苯乙烯微球的粒径减小为80～3500nm.
[0024] ②硅的刻蚀：将减小了聚苯乙烯微球粒径的提球硅片在5×10-5～8×10-5Pa真空度下开始反应离子刻蚀，刻蚀的参数为：SF6流量为5～15sccm，CHF3流量为30～60sccm，腔体压力为10～50mtorr，射频功率为15～50W，电感耦合等离子体功率为50～150W，刻蚀时间为1～9min。
[0025] 步骤(4)所述的利用有机溶剂除去剩余的聚苯乙烯微球，从而得到有序硅纳米柱阵列，具体步骤如下：
[0026] 将步骤(3)刻蚀完的提球硅片依次放在丙酮、氯仿、乙醇和去离子水中以40～100W功率超声清洗3～10min，直至将剩余的聚苯乙烯微球除掉为止，从而得到有序硅纳米柱阵列,硅纳米柱的直径为50～3000nm，高度为400～800nm。
[0027] 步骤(5)所述的在制备得到的有序硅纳米柱阵列上进行氟修饰，得到疏水有序硅纳米柱阵列，具体步骤如下：
[0028] ①羟基化处理：将得到的有序硅纳米柱阵列用NH3·H2O：H2O2：H2O体积比为1～3：1～3：5～7的混合溶液在80～100℃下加热清洗50～70min，最后用去离子水冲洗并用氮气吹干；
[0029] ②氟修饰：将羟基化处理得到的有序硅纳米柱阵列放在玻璃培养皿中，滴加2～10μL全氟硅烷到玻璃培养皿中，在60～300℃下加热0.5～6h，然后依次用丙酮、氯仿、乙醇、去离子水在40～100W下超声清洗3～10min，从而在有序硅纳米柱阵列上通过自组装全氟硅烷单层膜的形式进行氟修饰。
[0030] 步骤(6)所述的在氟修饰的疏水有序硅纳米柱阵列上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜，具体步骤如下：
[0031] 将用二甲苯配制的质量分数为1％～5％的聚甲基丙烯酸甲酯(分子量为97000～350000)溶液滴加到氟修饰的硅纳米柱阵列上，旋涂速度为1000～7000rpm，使氟修饰的有序硅纳米柱阵列上有一层聚甲基丙烯酸甲酯薄膜，薄膜的厚度范围是2～200nm。
[0032] 步骤(7)所述的对聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列进行加热，得到聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列，具体步骤如下：
[0033] 将旋涂有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜的氟修饰的硅纳米柱阵列放在热台上，在200～400℃条件下加热5～60min，得到聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列。
[0034] 步骤(8)所述的用聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列吸附待测分子，具体步骤如下：
[0035] 首先将1～20mL的疏水性蛋白(
马心肌红蛋白、辣根过
氧化物酶、
牛血清
白蛋白、细胞色素C、溶菌酶)或者多肽(血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅲ、血管舒缓激肽)待测分子溶液置于小烧杯中，然后将具有聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列的基底置于待测分子溶液表面吸附待测分子，同时对溶液进行搅拌，吸附时间为5～45min。
[0036] 步骤(9)所述的滴加基质分子溶液到吸附有待测分子的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列，具体步骤如下：
[0037] 吸取0.5～10μL的基质分子(α-氰基-4-羟基
肉桂酸、芥子酸、2,5-二羟基苯
甲酸)溶液滴加到吸附有待测分子的聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列上。
[0038] 步骤(10)所述的晾干步骤(9)中制备的样品，进行质谱检测，具体步骤如下：
[0039] 在空气中晾干步骤(9)制得的样品，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮
激光器发出的
波长为355nm的激光，加速
电压为20kV。每张质谱图都是经过100～1000次激光照射后累加得到的。
[0040] 总之，这种聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列有以下几个特点：(1)很强的疏水性，将其从溶液中取出后没有溶液残留在表面，因此待测分子不能形成咖啡环。同时，没有溶液残留可以除去其它干扰物(如一些盐类)，可以进一步提高检测灵敏度、降低
检测限；(2)纳米柱阵列及聚甲基丙烯酸甲酯在在柱上的均匀分布使得待测分子均匀分布在基底表面，而以极易挥发的乙腈和三氟乙酸为溶剂配制基质溶液，当基质滴加到基底后，由于溶剂的挥发速度大于基质分子向边缘迁移的速度，因此溶剂挥发后，基质不会形成咖啡环，而是与待测分子均匀分布。因此以这种聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列作为质谱检测基底，并采用先吸附待测分子，再滴加基质分子的方法消除了甜点效应，得到非常理想的检测重复性，这在基质辅助激光解吸电离质谱测试方面是一个重大突破。
附图说明
[0041] 图1：聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列的构筑及样品制备示意图；
[0042] 图2：具有不同表面修饰的倾斜
角为45°的硅纳米柱阵列的SEM图片，所有图中的插图为相应图片的局部放大图。图2A是硅纳米柱阵列；图2B是表面修饰了氟硅烷单层分子膜的硅纳米柱阵列；图2C是聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列；图2D是聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列；
[0043] 图3：在下列不同表面上的水
接触角图片。图3A为硅纳米柱阵列表面；图3B为表面有氟硅烷修饰的硅纳米柱阵列表面；图3C为聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列表面；图3D为聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列表面；
[0044] 图4：以氟修饰的硅纳米柱阵列为基底测得的血管紧张素Ⅲ的质谱图，血管紧张素Ⅲ分子浓度为1pmol/μL，分子量为931.10；
[0045] 图5：分别将聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰和薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列为基底，从含有1pmol/μL血管紧张素Ⅲ的尿素(1mol/L)或盐(1mol/L)溶液中取出后的光学照片。图A中的①和②是将具有聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列的基底，分别从含有1mol/L尿素和1mol/L盐溶液中取出时的光学图片，标尺是5mm；③和④是将具有聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列的基底，分别从含有1mol/L尿素和1mol/L盐溶液中取出时的光学图片；图B和图C是图A中的样品①和②在空气中放置半小时后的光学图片；图D和图E是图A中样品③和④在空气中放置半小时后的光学图片,图B-E的标尺是500μm；
[0046] 图6：以聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列为基底测得的血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL)的质谱图，基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。图A和图B分别在图5A中的样品①和样品②上获得；
[0047] 图7：以聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列为基底，测得的血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL)质谱图，基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。图A和图B分别在图5A中的样品③和样品④上获得；
[0048] 图8：以聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列为基底，测得的血管紧张素Ⅲ(10fmol/μL)质谱图，基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸；
[0049] 图9：是以聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列为基底，分别吸附了血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL)和溶菌酶(10pmol/μL，分子量是14000左右)，并滴加α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，晾干后的光学照片(图A和图C)和对应的质谱图(图B和图D)。图A和图C中的插图是分别使刚刚从两种待测溶液中取出时的光学照片；图B和图D分别是在图A和图C样品上随机测试的30个点的质谱图。图9A和图9C中标尺为1mm，其插图中的标尺为2mm；
[0050] 图10：以聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列为基底，吸附了血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL)并滴加α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，晾干后的光学照片(图A)和对应的质谱图(图B)。图A的插图基底刚刚从溶液取出时的光学照片；图B是对图10A中的样品随机测试的30个点的质谱图。图A及其插图的标尺分别是1mm和2mm；
[0051] 如图1所示，我们首先将全氟硅烷组装到硅纳米柱阵列上，然后旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜，并通过加热使聚甲基丙烯酸甲酯在纳米柱顶面形成点状结构。将具有聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列置于待测分子溶液表面，吸附待测分子，同时不断搅拌，一段时间后取出样品，滴加基质，在空气中晾干，将待测样品制备好。
[0052] 如图2所示，得到的硅纳米柱阵列是均匀的六方堆积排列，组装全氟硅烷单分子膜及旋涂聚甲基丙烯酸甲酯薄膜并未对结构形貌有明显改变，加热后，聚甲基丙烯酸甲酯在纳米柱的顶端形成均匀的点状结构。
[0053] 如图3所示，接触角显示制备的硅纳米柱阵列是亲水的，当组装了氟硅烷单层膜后，接触角明显增加，但在旋涂完聚甲基丙烯酸甲酯薄膜后，接触角变小，当通过加热使聚甲基丙烯酸甲酯薄膜变成点状结构时，其接触角几乎回到只有氟修饰的状态。
[0054] 如图4所示，没有血管紧张素Ⅲ的质谱峰出现，也说明氟硅烷分子没有吸附待测分子的作用。
[0055] 如图5所示，由于聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列没有强疏水作用，因此基底从含有尿素和
氯化钠的血管紧张素Ⅲ的溶液中取出后有溶液残留，样品晾干后，表面有盐的结晶，它会影响分析物的检测，降低检测信号的
信噪比。而聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列很疏水，从这两种盐溶液配制的血管紧张素Ⅲ中的溶液中取出时没有溶液残留在表面，因此没有盐的结晶。
[0056] 如图6所示，以聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列为基底，分析尿素和氯化钠溶液中的血管紧张素Ⅲ分子时，信噪比分别为271.8和256.6，这充分证明所用的基底在检测分子时具有良好的
耐盐性。
[0057] 如图7所示，以聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列为基底，分析尿素和氯化钠溶液中的血管紧张素Ⅲ分子时，信噪比分别为9.0和6.1,再一次证明了聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列作为基底的优越性。
[0058] 如图8所示，以聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列为基底，血管紧张素Ⅲ分子检测限很低。
[0059] 如图9所示，以聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列为基底，吸附待测的血管紧张素Ⅲ分子后，从溶液中取出时，表面没有溶液残留，从而不会有咖啡环生成，然后滴加用乙腈和三氟乙酸为溶剂配制的基质溶液，由于溶剂的挥发速度大于分子向边缘迁移的速度，因此基质不会生成咖啡环，从而与待测物分子均匀分布在基底表面，检测信号的相对标准偏差达到了3.8％。当以聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列为基底分析溶菌酶分子(10pmol/μL)时，同样没有溶液残留，而且滴加基质后，也没有咖啡环形成，从而使待测物分子和基质都分布均匀，检测信号的相对标准偏差达到了5.7％。
[0060] 如图10所示，以聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列为基底，从血管紧张素Ⅲ分子溶液中取出时，表面溶液残留，晾干生成了咖啡环，尽管所滴加的基质不会生成咖啡环。但是由于待测物分子分布不均匀，因此检测信号的相对标准偏差达到了26.0％。
具体实施方式
[0061] 下面通过
实施例来进一步阐明本发明方法及其在质谱检测中的应用，而不是要用这些实施例来限制本发明。本发明的目的是利用一种聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列使待测分子和基质均匀分布,从而去除甜点效应，在保证高灵敏度前提上，提高质谱检测的重现性，具有很好的应用前景。
[0062] 实施例1
[0063] 先将硅片切成10片，其中9片的尺寸是1.5cm×1.5cm，一片的尺寸是4cm×6cm，然后依次用丙酮、氯仿、乙醇、去离子水在70W下各超声清洗5min。配制NH3·H2O：H2O2：H2O＝1：1：5(体积比)的混合溶液，将其加热至90℃，再将清洗过的两个硅片浸入该溶液中煮40min。
最后用去离子水冲洗并用氮气吹干，分别得到提球硅片(1.5cm×1.5cm)和排球硅片(4cm×
6cm)。
[0064] 用台式匀胶仪在提球硅片上以7000rpm的速度旋涂用二甲苯配制的质量分数为7.5％聚甲基丙烯酸甲酯(相对分子质量为97000)溶液，聚甲基丙烯酸甲酯的厚度是220nm。
[0065] 将直径为600nm的聚苯乙烯粉末0.1g加入到2mL、体积比1：1的去离子水和乙醇的混合溶液中，超声6h，使其混匀，得到聚苯乙烯微球的乙醇和去离子水混合溶液。在干净表面皿中加入去离子水，并加入质量分数为2％的表面活性剂十二烷基硫酸钠的水溶液60μL；然后用微量进样器将聚苯乙烯微球的乙醇和去离子水混合溶液缓慢滴加到排球硅片上，并沿着排球硅片滑入水中，使其形成六方紧密堆积的聚苯乙烯微球单层膜，再加入10μL十二烷基硫酸钠水溶液使单层膜稳定；然后用具有聚甲基丙烯酸甲酯的提球硅片基底将聚苯乙烯微球提起，并倾斜放置直至水分完全挥发。将表面带有聚苯乙烯微球单层膜的提球硅片在7.29×10-5Pa真空度下开始刻蚀，刻蚀的参数为：O2流量为50sccm，腔体压力为30mtorr,射频功率为30W，电感耦合等离子体功率为100W，刻蚀时间为2.5min。
[0066] 然后将表面带有粒径减小为480nm的聚苯乙烯微球的硅片在7.29×10-5Pa真空度下开始刻蚀，刻蚀的参数为：SF6流量为6sccm，CHF3流量为45sccm，腔体压力为8mtorr，射频功率为25W，电感耦合等离子体功率为100W，刻蚀时间为8min。
[0067] 将制备的结构硅片浸入甲苯中以洗去剩余的聚苯乙烯微球，再依次用丙酮、氯仿、乙醇、蒸馏水在70W下各超声5min，得到直径为380nm,高度为630nm的有序硅纳米柱阵列。
[0068] 配制NH3·H2O：H2O2：H2O＝1：1：5(体积比)的混合溶液，将其加热至90℃，将清洗过的有序硅纳米柱阵列浸入该溶液中煮40min最后用去离子水冲洗并用氮气吹干。将上述处理得到的有序硅纳米柱阵列放在玻璃培养皿中，滴加5μL的全氟硅烷到玻璃培养皿中，在250℃下加热4h，然后依次用丙酮、氯仿、乙醇、去离子水在70W下超声清洗5min，从而通过自组装全氟硅烷单层膜的形式对有序硅纳米柱阵列进行氟修饰。
[0069] 将得到的氟修饰的硅纳米柱阵列以7000rpm的速度旋涂二甲苯配制的质量分数1％的聚甲基丙烯酸甲酯溶液(相对分子质量为350000)，得到聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列，其中柱顶端覆盖的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜厚度是3nm，底端沟槽里面覆盖的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜厚度是45nm。把得到的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列放置在设置为300℃的热台上加热30min，就得到聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列。
[0070] 实施例2
[0071] 分别向实施例1不同步骤得到的硅纳米柱阵列、氟修饰的硅纳米柱阵列、聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列、聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列滴加5μL水测试接触角。
[0072] 实施例3
[0073] 将氟修饰的硅纳米柱阵列倒置于血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL，3mL，溶剂为去离子水，容器为小烧杯)溶液表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出上述结构基底，滴加1μLα-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0074] 实施例4
[0075] 为了检测这种基底在基质辅助激光解吸电离测试中的自除盐性能，以尿素分子作为干扰物，将聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列基底倒置于血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL，3mL，溶剂为1mol/L的尿素溶液，容器为小烧杯)溶液表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出后滴加1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0076] 实施例5
[0077] 为了检测这种基底在基质辅助激光解吸电离测试中的自除盐性能，以氯化钠分子作为干扰物，将聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列基底倒置于血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL，3mL，溶剂为1mol/L氯化钠溶液，容器为小烧杯)溶液表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出后滴加1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0078] 实施例6
[0079] 为了对比验证这种基底在基质辅助激光解吸电离测试中自除盐的优越性，以尿素分子作为干扰物，将聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列基底倒置于血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL，3mL，溶剂为1mol/L的尿素溶液，容器为小烧杯)溶液表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出后滴加1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0080] 实施例7
[0081] 为了对比验证这种基底在基质辅助激光解吸电离测试中自除盐的优越性，以氯化钠分子作为干扰物，将聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列基底倒置于血管紧张素Ⅲ(1pmol/μL，3mL，溶剂为1mol/L的氯化钠溶液，容器为小烧杯)溶液表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出后滴加1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0082] 实施例8
[0083] 将聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列倒置于血管紧张素Ⅲ(10fmol/μL，3mL，溶剂为去离子水，容器为小烧杯)溶液表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出上述结构基底，滴加1μLα-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0084] 实施例9
[0085] 为了检测通过利用这种基底消除基质辅助激光解吸电离测试中甜点效应，从而提高样品检测重复性的可行性，以血管紧张素Ⅲ作为待测分子，将聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列基底倒置于血管紧张素Ⅲ溶液(1pmol/μL，3mL，溶剂为去离子水，容器为小烧杯)表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出后滴加1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0086] 实施例10
[0087] 为了检测这种基底消除基质辅助激光解吸电离测试中的甜点效应，从而提高样品检测重复性的可行性，以溶菌酶作为待测物分子，将聚甲基丙烯酸甲酯点状结构修饰的疏水硅纳米柱阵列底倒置于溶菌酶溶液(10pmol/μL，3mL，溶剂为去离子水，容器为小烧杯)表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出后滴加1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
[0088] 实施例11
[0089] 为了验证这种基底在消除基质辅助激光解吸电离测试中的甜点效应，从而提高样品检测重复性的优越性，以血管紧张素Ⅲ作为待测分子，将聚甲基丙烯酸甲酯薄膜覆盖的疏水硅纳米柱阵列基底倒置于血管紧张素Ⅲ溶液(1pmol/μL，3mL，溶剂为去离子水，容器为小烧杯)表面，以吸附待测分子，在不断搅拌的条件下吸附30min，取出后滴加1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质，将晾干的样品粘贴到靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在Kratos Axima CFRplus spectrometer(Shimadzu Biotech,Manchester,UK)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
