技术领域
[0001] 本
发明所属的技术领域为
植物生物技术，具体涉及到一种利用薏苡茎尖分生组织组培快繁方法。
背景技术
[0002] 薏苡(Coix lachryma-jobi L.)是一种药食同源植物，含有丰富的维生素、多糖、
氨基酸及酚类，具有很高的经济价值。贵州是我国薏苡生产最大的省份，占全国薏苡产量的1/3。但是，薏苡的繁殖方式属于异花
授粉，杂交后代不稳定，性状分离严重，同时，露天种植的薏苡易感染黑穗病、叶枯病、叶斑病等病害，导致薏苡的产量及品质下降，严重制约薏苡产业发展。
[0003] 利用薏苡茎尖分生组织为材料进行的组培快繁，不经过愈伤组织诱导过程，直接诱导丛生芽，具有繁殖系数高、不受季节影响、性状稳定、成本低等优点。目前，尚未见到利用薏苡茎尖分生组织组培快繁技术相关报道。
发明内容
[0004] 本发明提供了利用薏苡茎尖分生组织进行丛生芽及生根诱导的组培快繁方法，可以短期内获得大量遗传稳定的薏苡组培苗，为开发新的薏苡品种繁殖方式提供技术参考。
[0005] 一种利用薏苡茎尖分生组织组培快繁的方法，包括下列步骤：
[0006] (1)
种子及茎尖组培消毒：选取完整无虫眼、饱满的种子进行消毒处理，种子萌发后，切取茎尖，在超净
工作台中进行茎尖消毒处理，将茎尖分生组织及其上、下端0.3-0.5cm部分切掉后垂直接种于丛生芽诱导培养基中，所述垂直接种为茎尖分生组织形态学上端朝上接种；(2)茎尖顶端优势去除：当茎尖长至2-3cm后，将茎尖分生组织的上、下端0.3-0.5cm部分切掉，再次垂直接种于丛生芽诱导培养基中，此步骤重复2-3次。
[0007] (3)丛生芽生根诱导和组培苗移栽：待丛生芽长至3-5cm左右时，将丛生芽切下，接种于丛生芽生根培养基中，待根系粗壮，练苗移栽；
[0008] 所述丛生芽诱导培养基为：MS+9.0mg.L_16-BA+0.5mg.L-1NAA，pH＝5.80；丛生芽生根培养基为：MS+0.5mg.L-1NAA，pH＝5.80。
[0009] 所述MS基本培养基配方为4.4443g/L MS粉、30g/L
蔗糖和7g/L琼脂。
[0010] 所述步骤(1)种子消毒处理方法：选取完整无虫眼、饱满的种子，将其放入1％
洗涤剂溶液中搓洗发白，用自来
水将洗涤剂冲洗干净，沸水浴3-5s，立即放入50％多菌灵溶液中浸泡7-8h，取出后再用
自来水冲洗干净。
[0011] 所述步骤(1)茎尖消毒处理方法：将茎尖放入1％洗涤剂溶液中浸泡10min，自来水冲洗30min，在超净工作台中用75％酒精消毒30-40s，无菌水冲洗4次，再用0.2％升汞消毒7-8min，无菌水冲洗4次，最后用无菌吸水纸吸干表面水分，用于接种；
[0012] 所述步骤(3)中炼苗时间为2-3天，移栽所用基质为蛭石:营养土＝1:4均匀混合。
[0013] 所述种子萌发的条件为暗培养，
温度28℃，时间96h。
[0014] 所述步骤(2)、(3)的培养过程中，光照强度2000lx，每日光照12h，温度24-28℃。
[0015] 本发明以茎尖分生组织作为材料，在含有9.0mg.L-1 6-BA和0.5mg.L-1NAA的MS培养基中进行茎尖分生组织培养。采用多次
切除茎尖分生组织上端0.3-0.5cm部位，以去除茎尖顶端优势，促进侧芽生长；同时切除茎尖分生组织下端0.3-0.5cm部位，维持茎尖生理状态和发育年龄，从而在组培过程中，保证其具有较高的形态发生能
力，分化出大量的丛生芽，从而诱导丛生芽生根获得组培苗。通过此组培快繁方法获得的组培苗与露天栽培相比，组培苗遗传稳定，成苗期间不易感染黑穗病、叶枯病、叶斑病等病菌；与组培再生相比，具有不经过愈伤组织诱导，直接诱导产生丛生芽，成苗时间缩短30天左右，繁殖系数及移栽成活率高，不受季节限制等优点。使用本发明方法，其中种子萌发率、丛生芽诱导率、丛生芽生根率最高分别可达45.3％、76.9％、100％。
[0016] 本发明利用薏苡茎尖分生组织为材料进行的组培快繁，不经过愈伤组织诱导过程，直接诱导丛生芽，具有繁殖系数高、不受季节影响、性状稳定、成本低等优点。本发明成功建立了高效的茎尖分生组织组培快繁体系，可在生产上进行推广种植。
附图说明
[0017] 图1薏苡茎尖分生组织组培快繁过程图。
[0018] 其中，A：茎尖分生组织选取部位；B：第一次切掉茎尖分生组织部位上、下端各0.3-0.5cm的茎尖；C：第二次切掉茎尖分生组织部位上、下端0.3-0.5cm的茎尖；D：第三次切掉茎尖分生组织部位上、下端0.3-0.5cm的茎尖；E：去除茎尖顶端优势后，诱导60天的丛生芽；F：
丛生芽生根诱导20天的组培苗；G：移栽40天的
幼苗。
[0019] 图2薏苡1～6代继代组培苗。
[0020] 图3薏苡继代苗SSR分子标记遗传
稳定性检测。
[0021] 其中，A～D:四种引物(GBssrJT32、GBssrJT136、GBssrJT149、GBssrJT198)对继代苗PCR
电泳图验证；1～6为继代次数；a～c为重复次数。
具体实施方式
[0022] 下面结合
实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0023] 培养基及培养条件：丛生芽诱导培养基为：MS+9.0mg.L_16-BA+0.5mg.L-1NAA；丛生芽生根培养基为：MS+0.5mg.L-1NAA。所述培养的各个阶段，光照强度2000lx，每日光照12h，温度24-28℃。
[0024] 实施例1一种利用薏苡茎尖分生组织组培快繁体系的建立
[0025] 1.1种子消毒：选取完整无虫眼、饱满的种子，将其放入1％洗涤剂溶液中搓洗发白，用自来水将洗涤剂冲洗干净，沸水浴3-5s，立即将种子放入50％多菌灵溶液中浸泡6h，取出后，用自来水将多菌灵冲洗干净，放入育苗盘中28℃暗培养96h。
[0026] 由表1可看出薏苡种子经沸水浴处理效果较常温处理效果最佳，薏苡种子的
真菌污染随50％多菌灵处理时间增加呈降低趋势，在6h、9h未见真菌污染，成活率随50％多菌灵处理时间增加而降低，最佳组合为沸水浴处理3-5s，50％多菌灵处理6h，污染率0，存活率45.32％。
[0027] 表1不同消毒剂组合对薏苡种子处理结果
[0028]
[0029] 1.2茎尖组培消毒：将茎尖放入1％洗涤剂溶液中浸泡10min，自来水冲洗30min，在超净工作台中，用75％酒精消毒30-40s，无菌水冲洗4次，再用0.2％升汞消毒7-8min，无菌水冲洗4次，最后用无菌吸水纸吸干表面水分，用于后续实验。如图1中A所示。
[0030] 由表2可看出薏苡茎尖随75％酒精和0.2％升汞消毒时间增加，茎尖污染率逐渐降低，存活率升高。最佳消毒条件是3-3组，即75％酒精处理30s，0.2％升汞处理7min，污染率8％，存活率92％。
[0031] 表2不同消毒剂组合对薏苡茎尖处理结果
[0032]
[0033] 1.3丛生芽诱导：将茎尖分生组织及其上、下0.3-0.5cm部位切下，垂直(形态学上端朝上)接种于丛生芽诱导培养基中，当从生芽长至2-3cm时，再将茎尖分生组织上、下端0.3-0.5cm部位切下，垂直(形态学上端朝上)接种于丛生芽诱导培养基中。此步骤重复2-3次。丛生芽诱导培养基均为含9.0mg.L_1 6-BA和0.5mg.L-1NAA的MS培养基。如图1B、C、D、E所示。
[0034] 由表3可看出，薏苡茎尖分生组织上、下端0.3-0.5cm切取第4次时，处理后的茎尖分生组织繁殖系数随着6-BA浓度的升高上升，在2-3组最为明显，在加入0.5mg/L NAA和9mg/L6-BA时，茎尖繁殖系数达2.9个，从生芽诱导率76.9％，此组合最佳。
[0035] 表3不同
激素浓度组合对丛生芽诱导结果
[0036]
[0037] 1.4丛生芽继代培养和生根诱导：待丛生芽生长至3-5cm左右时，将诱导出的丛生芽切取，接种于0.5mg.L-1NAA的MS培养基中诱导生根以及0.5mg/LNAA+9mg/L 6-BA的MS培养基中进行继代培养。如图1F、图2所示。
[0038] 利用生长素对从生芽进行诱导生根，诱导结果由表4可知，从生芽在MS+NAA培养基的生根率、根毛
密度、根长和根粗比1/2MS、MS、MS+NAA长势好，而含0.5mg/L NAA的MS培养基生根数达到3.9个，生根率100％，此组合生根最佳。
[0039] 表4不同生长素浓度组合对丛生芽生根诱导结果
[0040]
[0041] 1.5组培苗移栽：将长成粗壮根系的组培苗开盖加水炼苗2-3天后移栽，移栽所用基质为蛭石:营养土(1：4)均匀混合，成活率95％。如图1中G所示。
[0042] 1.6继代苗遗传稳定性检测：所选检测材料为茎尖组织组培快繁产生的继代苗，下面用分子标记方法来检测继代6代的株系是否遗传稳定：
[0043] (1)DNA提取方法：取50mg用液氮
研磨的继代苗粉末，加入到20ul巯基
乙醇、1000uL2％CTAB的1.5mL离心管中，65℃水浴孵育1h，每个10min颠倒混匀，13200rpm离心
7min，转移上清液至新的离心管中，加入等体积的
苯酚-氯仿，并不断摇匀，13200rpm离心
10min，转移上清液至新的离心管中，加入等体积氯仿，并不断摇匀，13200rpm离心5min，转移上清液至新的离心管中，重复1次，加入0.6倍体积异丙醇，不断摇匀，-20℃
冰箱静置
20min，13200rpm离心10min,弃上清液，加入1ml75％乙醇，13200rpm离心3min,弃上清液，再加入1ml75％乙醇，13200rpm离心3min，弃上清液，将离心管放入37℃烘箱烘干，待乙醇挥发完全后取出，加入45-50uL含RNAase ddH2O，-20℃保存。
[0044] (2)SSR引物信息：
[0045]
[0046] PCR反应体系：10μL的PCR体系含100ng/uL DNA1.0μL，引物0.2μL，2.5mM dNTP 1μL，10×Taq buffer 1μL，5mM Mg2+0.8μL，5U/μL Taq酶0.05μL，ddH2O 5.75μL。
[0047] PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30S，56-60℃30S，72℃30S，循环35次，72℃7min，12℃∞，2.0％琼脂糖胶、90伏
电压电泳检测。
[0048] 利用多态性好、检测性强的GBssrJT32、GBssrJT136、GBssrJT149、GBssrJT198 4对SSR引物对继代6代的组培苗DNA进行PCR多态性检测，经凝胶电泳检测结果显示(图3)，继代苗株DNA扩出的谱带均在相同的
位置，说明继代6代的组培苗与亲代的多态性一致，同时表明本发明一种薏苡分生组织组培快繁方法可应用于生产。
