一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法
阅读：1027发布：2020-06-01
专利汇可以提供一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，属于日用化工技术领域。方法如下：先将共轭亚油酸和蛋白酶在一定pH值和较低 钙 离子浓度下自组装成包埋蛋白酶的囊泡，再使得囊泡表层的共轭亚油酸发生部分交联，所得蛋白酶囊泡溶液经浓缩后可以直接用于洗衣液配方中、并能抵御洗衣液中 表面活性剂 的酶活抑制，在 洗涤剂 中保持酶活，而且能够在更高钙离子浓度下如洗涤用 水 的环境中崩解并释放出蛋白酶。本发明提供的方法对中性和 碱 性蛋白酶都能适用，所得的蛋白酶囊泡包埋体在洗衣液中的 稳定性 也高；所使用的壁材共轭亚油酸盐自身也有 去污 作用的表面活性剂，在洗衣液中与表面活性剂的相容性好，比果胶和海藻酸钠等大分子多糖壁材的包埋和释放效果好。，下面是一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：先在含有较低浓度钙盐的缓冲液中，将一定量的共轭亚油酸和蛋白酶自组装成包埋蛋白酶的囊泡，之后使此囊泡表层的共轭亚油酸发生部分交联，得到以部分交联的共轭亚油酸为壁材、蛋白酶为芯材的蛋白酶囊泡包埋体溶液；将此溶液冻干浓缩到10%-15%水含量后直接加入洗衣液配方中，即得到可以在洗衣液中酶活稳定、而在自来水中快速释放出蛋白酶的加酶洗衣液。
2.根据权利要求1所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于具体步骤如下：
室温下将一定量的共轭亚油酸和钙盐按一定比例溶解于一定缓冲液中混合均匀，加入蛋白酶溶液，混合均匀后于20-30℃下用摇床轻微振荡至包埋率不再上升后，得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液，摇床振荡速度不高于50rpm；将包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于配置磁力搅拌的反应器中，避光加入一定量的[3-(3,4-二甲基-9-氧代-9-氢-噻吨-2-氧基)-
2-羟丙基]三甲基氯化铵溶液，向反应器中通入氮气20-40分钟，将瓶口密封进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸的部分交联，到达一定交联度后停止辐照，得到以部分交联的共轭亚油酸为壁材、蛋白酶为芯材的蛋白酶囊泡包埋体溶液。
3.根据权利要求1所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述的钙盐为柠檬酸钙、四水柠檬酸钙和二柠檬酸三钙中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述含有较低浓度钙盐的缓冲液中钙盐的浓度为0.1-0.30 mmol L-1。
5.根据权利要求2所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述共轭亚油酸的部分交联，到达一定交联度后停止辐照，是指当交联度为35%-50%时停止辐照。
6.根据权利要求2所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述洗衣液指以表面活性剂为主体的浓缩洗衣液，表面活性剂活性物浓度在20wt%-50wt%之间。
7.根据权利要求2所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述将一定量的共轭亚油酸和钙盐按一定比例溶解于一定缓冲液中混合均匀，是指共轭亚油酸的最终浓度为200-600 mmol·L-1。
8.根据权利要求2所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述蛋白酶的加入量不超过600mg蛋白/g共轭亚油酸。
9.根据权利要求2所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述缓冲液的pH范围为7.0-10.0，缓冲液的阴离子为醋酸盐除外的酸根离子，优选柠檬酸-柠檬酸盐体系，缓冲液中的阳离子为钠离子、钾离子或铵离子中的一种。
10.根据权利要求2所述的用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，其特征在于：所述[3-(3,
4-二甲基-9-氧代-9-氢-噻吨-2-氧基)-2-羟丙基]三甲基氯化铵溶液的溶剂与共轭亚油酸溶液的溶剂相同，[3-(3,4-二甲基-9-氧代-9-氢-噻吨-2-氧基)-2-羟丙基]三甲基氯化铵的用量为共轭亚油酸的0.05 wt %-0.12wt %。
一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法
技术领域
[0001] 本发明属于日用化工技术领域，具体涉及一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法。
背景技术
[0002] 洗衣液富含阴离子表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂，其中阴离子表面活性剂是主要去污成分。为了改善洗衣液的洗涤性能，特别是为了有效去除血渍等含蛋白污渍，需要在洗衣液配方中加入蛋白酶。但是，蛋白酶容易受到外界环境如光、热和pH等影响，特别是在洗衣液中的阴离子表面活性剂水溶液这样既有大量水分又有大量表面活性剂的环境下，不能像洗衣粉中那样相对比较稳定地存在于包埋体中，而易与配方中的表面活性剂和漂白剂发生作用；在洗衣液中加入各种稳定剂能够在一段时间内减缓酶的失活。常见的洗衣液中稳定蛋白酶的方法有加入甘油、山梨醇、硅藻土等稳定剂或者其他合成稳定剂，目前较好的稳定剂也只能在8周内保持酶活为初始酶活的40%-50%，需要在洗衣液配方中多加很多蛋白酶。
[0003] 利用成膜材料将蛋白酶包覆起来，也可以提高蛋白酶在货架期的稳定性。例如用瓜尔胶或海藻酸（或其盐）等大分子多糖来包埋蛋白酶、或者固定化蛋白酶在载体的表面。这些方法都能够使蛋白酶在洗衣液中有一定的稳定性，但是仍然不够理想：比如固定化在载体表面的蛋白酶在浓缩液中仍然不敌水溶液中的表面活性剂，往往只能用于加酶洗衣粉中；此外，海藻酸盐等包埋或表面固载的蛋白酶体系通常会降低酶活而且需要半小时才能释放一半酶活，这远远超过了通常的家用洗涤时间。
[0004] 液体加酶洗涤剂中则常常需要用特殊的合成化学品来包埋蛋白酶。其关键问题在于，怎样能够形成稳定包埋物的体系，在洗涤环境中又不一定能够迅速崩解。因此，液体加酶洗涤剂中，理想的蛋白酶包埋体系除了要保障稳定的蛋白酶酶活，还要能够在洗涤剂产品的液体形态中稳定，更要在洗涤环境下迅速崩解。
发明内容
[0005] 本发明提供了一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法，具有包埋率高，包埋量大，蛋白酶稳定性好，包埋体在洗涤环境中能够迅速释放蛋白酶，对中性和碱性蛋白酶都能适用的特点。
[0006] 本发明以部分交联的共轭亚油酸为囊材来制备在洗衣液中稳定的加酶囊泡，而在洗涤环境下迅速解析出蛋白酶；其工作原理如下所述。
[0007] 本发明使用的共轭亚油酸盐属于脂肪酸盐，即皂，是良好的阴离子表面活性剂，和洗衣液中的两性、阴离子表面活性剂可以配伍。脂肪酸（盐）本身或在助表面活性剂存在下可以形成脂肪酸囊泡，因此有望是良好的囊材。而脂肪酸囊泡尤其是不饱和脂肪酸囊泡，是类脂质体胶体分散体系，是难得的安全且与人体相容的生物活性分子载体。
[0008] 国际上对不饱和酸如油酸的囊泡化行为以及生物作用的分子机理研究较多，而对稳定化囊泡的技术研究还在基础阶段。这是因为脂肪酸(盐)通常仅在其pKa附近自组装成囊泡，但即便在普通环境中都只能在短时间内并且无包埋物的前提下稳定存在，而且囊泡在不同应用环境的稳定化又是很大的挑战；更何况还有空腔容积大小的适应性问题。
[0009] 共轭亚油酸具有有益生理活性，因此目前共轭亚油酸作为芯材被微胶囊包埋的研究报道较多，常见的多以阿拉伯胶、明胶、交联蛋白等为壁材，用喷雾干燥制备微胶囊包埋共轭亚油酸；这些都是用于口服共轭亚油酸的保健品制备方法，不适合于洗衣液中保存蛋白酶。
[0010] 而另一方面，共轭亚油酸在一定条件下可以发生部分交联。交联的共轭亚油酸有可能兼具亚油酸和大分子的特征，有可能在一定条件下作为壁材形成囊泡，并且和洗衣液中的表面活性剂相容；但是要能够作为壁材而非芯材，形成可包埋蛋白酶并且在洗衣液产品形态中保持相对稳定、在洗涤环境下解体的载酶囊泡，依然是个棘手的限制性问题。
[0011] 我们在实验中发现，共轭亚油酸自组装成囊泡以后，通过将囊泡壁层的共轭亚油酸部分交联，可以获得比共轭亚油酸囊泡更大更稳定的囊泡，即部分交联的共轭亚油酸囊泡。这种部分交联的共轭亚油酸囊泡不仅比共轭亚油酸囊泡更稳定，也比混有油酸的交联共轭亚油酸囊泡稳定，而且所稳定的pH范围得以扩大。此外，低浓度钙离子环境下（例如低于50ppm以碳酸钙计算的硬度）可以制备空腔容积比无钙离子诱导时大一个数量级的囊泡；但最有意义的是，在一定范围交联度、一定范围酸碱环境和相对低浓度钙离子环境下所形成的特定囊泡，可以在此低浓度钙离子环境下稳定，但是在一定程度的高浓度钙离子存在下（例如高于90ppm以碳酸钙计算的硬度，也就是常规洗涤环境下即居民用自来水中）解体。
通常洗衣液配方中不含有刻意加入的钙离子，而洗涤环境下的自来水硬度一般在100-
250ppm (以碳酸钙计算)。这就提供了一种可能性，以开发满足上述要求的、以交联共轭亚油酸囊泡作为壁材包埋蛋白酶、并且在洗衣液的产品形态中保持相对稳定、继而又能在硬水洗涤环境下解体释放蛋白酶的载酶囊泡。
通常洗衣液配方中不含有刻意加入的钙离子，而洗涤环境下的自来水硬度一般在100-
250ppm (以碳酸钙计算)。这就提供了一种可能性，以开发满足上述要求的、以交联共轭亚油酸囊泡作为壁材包埋蛋白酶、并且在洗衣液的产品形态中保持相对稳定、继而又能在硬水洗涤环境下解体释放蛋白酶的载酶囊泡。
[0012] 本发明提供了一种用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法：先将共轭亚油酸和蛋白酶在一定pH值和较低钙离子浓度下自组装成包埋蛋白酶的囊泡，再将囊泡表层的共轭亚油酸部分交联,得到的蛋白酶囊泡包埋体经过浓缩后可以直接用于洗衣液配方中。如此获得的包埋体在洗衣液中能够抵御高浓度表面活性剂的酶活抑制，而且能够在更高钙离子浓度下如洗涤用水的环境中会解体，释放出蛋白酶；本发明提供的方法对中性和碱性蛋白酶都能适用。
[0013] 本发明采用的技术方案如下：本发明用于洗衣液中稳定蛋白酶的方法具体步骤为：室温下将一定量的共轭亚油酸和钙盐溶解于一定pH值的缓冲液中混合均匀后，加入蛋白酶溶液，混合均匀后于一定温度下用摇床轻微振荡一段时间至包埋率不再上升后，即得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液。
将100 mL上述溶液于配置磁力搅拌的250mL具塞圆柱体玻璃反应器（高径比为2：1）中，避光加入一定量的[3-(3,4-二甲基-9-氧代-9-氢-噻吨-2-氧基)-2-羟丙基]三甲基氯化铵(QTX)溶液，通氮20-40分钟以排出瓶中的氧气后，将瓶口密封。搅拌下，用紫外点光源于一定温度下辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，到达一定交联度后停止辐照；即得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。所得到的包埋体溶液经过浓缩后可以直接用于洗衣液中，被包埋的蛋白酶在洗涤环境下会直接释放出来，可以延长洗衣液中蛋白酶的货架时间。
将100 mL上述溶液于配置磁力搅拌的250mL具塞圆柱体玻璃反应器（高径比为2：1）中，避光加入一定量的[3-(3,4-二甲基-9-氧代-9-氢-噻吨-2-氧基)-2-羟丙基]三甲基氯化铵(QTX)溶液，通氮20-40分钟以排出瓶中的氧气后，将瓶口密封。搅拌下，用紫外点光源于一定温度下辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，到达一定交联度后停止辐照；即得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。所得到的包埋体溶液经过浓缩后可以直接用于洗衣液中，被包埋的蛋白酶在洗涤环境下会直接释放出来，可以延长洗衣液中蛋白酶的货架时间。
[0014] 所述的一定量的共轭亚油酸和钙盐，是指共轭亚油酸溶液的最终浓度为200-600 mmol·L-1(55.6-139 g·L-1)，钙盐的终浓度为0.1-0.30 mmol L-1，钙盐终浓度优选0.2 mmol L-1。
[0015] 所述的一定pH值的缓冲液，是指0.01mol·L-1、pH7.0-10.0的缓冲液；对缓冲液的阴离子没有特别要求（醋酸盐体系除外），优选含柠檬酸或柠檬酸盐的体系，但缓冲液中的阳离子不宜为钠、钾或铵以外的离子。
[0016] 所述的钙盐为柠檬酸钙、四水柠檬酸钙、二柠檬酸三钙中的一种或两种，优选四水柠檬酸钙；也可以使用氯化钙，但氯化钙的效果不如上述柠檬酸钙。
[0017] 所述的蛋白酶溶液为市售中性或碱性蛋白酶溶液，粉剂产品则需根据其产品说明用相应的最佳使用pH值的缓冲液溶解。由于各种商品酶制剂的酶活不一，浓度不一，但包埋量是依据蛋白质浓度的，加入量建议不超过600mg蛋白/g共轭亚油酸，技术人员可根据其所使用的蛋白酶在此基础上适当增减浓度。
[0018] 所述洗衣液指以表面活性剂为主体的浓缩洗衣液，表面活性剂中活性物浓度在20wt%-50wt%之间。
[0019] 所述的混合均匀后于一定温度下用摇床轻微振荡，是指20-30 0C。
[0020] 所述的轻微振荡，是指摇床振荡速度不高于50rpm。
[0021] 所述的一定量的[3-(3,4-二甲基-9-氧代-9-氢-噻吨-2-氧基)-2-羟丙基]三甲基氯化铵(QTX)溶液，是指溶剂为与共轭亚油酸溶液相同的缓冲液，QTX的用量为共轭亚油酸的0.05 wt %-0.12wt %，优选0.10 wt%。
[0022] 所述的用紫外点光源于一定温度下辐照，对紫外点光源没有特别要求，专业紫外点光源生产的产品均可使用（例如：POWER ARC UV 100型高强度点光源，350-450 nm，主波峰365 nm；功率200W；光照强度16 W/cm2；UV-LED点光源，波长365 nm；功率60W；光照强度8 W/cm2；LT-102型固化机，250-370 nm；功率1-2 KW，功率可调。）；紫外点光源反应器距点光源的距离可以由技术人员根据其所选的其它技术参数如光强、反应物量、光照时间自行调节，以交联度决定反应终点。
[0023] 所述的到达一定交联度后停止辐照，是指交联度为35%-50%；高于此交联度时，对水质碳酸钙硬度低于80ppm的少数地区，完全释放时间变慢到1.5min-2.5min，对使用效果影响不大；不适合于人为的、特定软水洗涤。
[0024] 包埋率可用常规方法测定：分别测定包埋中加入游离酶的总活性以及微胶囊化后上清液酶的活性，按下列公式计算蛋白酶的包埋率：包埋率=（初始加入酶的总活性-上清液的酶总活性）×100%/初始加入酶的总活性。酶活测定可以使用最方便和普遍的Fulin酪蛋白法，或者用供应商提供的酶活测定方法，可由技术人员自行选择。
[0025] 一定时间后的酶活释放率指一定时间后，(自来水洗涤体系中的测得的总酶活/初始加入自来水洗涤体系中酶的计算总活性)×100%。
[0026] 一定时间后的酶活保持率指一定时间后，(洗衣液中的测得的总酶活/初始加入洗衣液中的酶的计算总活性)×100%。
[0027] 酶的计算总活性指按照原测定的游离酶或固定化酶比活和重量计算的酶活。
[0028] 交联度可用以下方法测定和计算：将上述囊泡溶液用pH 8.6的缓冲液稀释至0.06mmol/L，用紫外可见分光光度计测其在234 nm处的吸光度A234。根据共轭亚油酸溶液的紫外吸收标准曲线判断测定时反应后溶液的共轭亚油酸浓度，并根据此残留共轭亚油酸浓度计算其交联度：
交联度=（反应前溶液的共轭亚油酸浓度-反应后溶液的共轭亚油酸浓度）×100%/反应前溶液的共轭亚油酸浓度。
交联度=（反应前溶液的共轭亚油酸浓度-反应后溶液的共轭亚油酸浓度）×100%/反应前溶液的共轭亚油酸浓度。
[0029] 本发明的有益效果：（1）利用包埋体在洗衣液产品中和洗衣液使用环境下的钙离子浓度的差异，分别达到稳定包埋体和迅速解体包埋体以释放蛋白酶的目的，产品使用简单易行；
（2）囊泡通过部分交联稳定，不需要加入其它非离子表面活性剂或助表面活性剂以稳定囊泡；
（3）适用对象宽，对中性和碱性蛋白酶都能适用；
（4）包埋率高，蛋白酶在高浓度洗衣液中的稳定性显著提高；
（5）包埋体在高浓度洗衣液产品形态中的稳定性也高，所使用的共轭亚油酸盐自身也是有去污作用的表面活性剂，在洗衣液中相容性好，比果胶和海藻酸钠等大分子多糖的包埋和释放效果好；
（6）制备方法也简单易行，所采用的设备和合成方法都是常用的手段。
（2）囊泡通过部分交联稳定，不需要加入其它非离子表面活性剂或助表面活性剂以稳定囊泡；
（3）适用对象宽，对中性和碱性蛋白酶都能适用；
（4）包埋率高，蛋白酶在高浓度洗衣液中的稳定性显著提高；
（5）包埋体在高浓度洗衣液产品形态中的稳定性也高，所使用的共轭亚油酸盐自身也是有去污作用的表面活性剂，在洗衣液中相容性好，比果胶和海藻酸钠等大分子多糖的包埋和释放效果好；
（6）制备方法也简单易行，所采用的设备和合成方法都是常用的手段。
具体实施方式
[0030] 实施例1-3中使用的洗衣液配方如下(所述配比为原料折干后重量百分比)：AES (脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠)，21.5%；AEO-7 (脂肪醇聚氧乙烯醚-7)，2.5%；AEO-9 (脂肪醇聚氧乙烯醚-9)，2.5%；柠檬酸三钠，3.5%；聚醚消泡剂，0.05%；柠檬酸，0.1%；NaCl，0.5%；荧光增白剂，0.14%；开松，0.05%；香精（柠檬香)，0.1%，余量为水，pH7.5。
[0031] 实施例4-6中使用的洗衣液配方如下(所述配比为原料折干后重量百分比)：AES，29%；椰子油聚氧乙烯醚-9，8%；AEO-9，5.5%；AEO-7，2.5%；柠檬酸三钠 3.5%；聚醚消泡剂
0.05%；柠檬酸 0.1%；NaCl 0.5%；荧光增白剂 0.14%；开松 0.05%；香精（柠檬香）0.1%，余量为水，pH7.4。
0.05%；柠檬酸 0.1%；NaCl 0.5%；荧光增白剂 0.14%；开松 0.05%；香精（柠檬香）0.1%，余量为水，pH7.4。
[0032] 上述洗衣液配方与大多数商品洗衣液类似，技术人员也可以自行开发，洗衣液配方对本发明提供的蛋白酶稳定方法的效果的影响不大。以下实施例所使用的蛋白酶均来自市售蛋白酶，有些经实验室浓缩处理。本发明方法不限于以下蛋白酶。
[0033] 实施例1制备包埋碱性蛋白酶2709 (909.1mg蛋白/g，邢台思倍特生物科技有限公司)的囊泡，具体步骤如下：
1）室温下将5.76g共轭亚油酸溶解于100mL含0.25mmol/L柠檬酸钙的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 8.6，0.01mol/L）中，共轭亚油酸的浓度为200mmol·L-1；混合均匀后，加入碱性蛋白酶2709溶液，蛋白酶的加入量为500mg蛋白/g共轭亚油酸 (550mg蛋白酶制剂/g共轭亚油酸)，混合均匀后于25 0C下用摇床避光振荡4h (摇床转速50rpm)，即得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液，包埋率为91.2%；
2）将100mL上述溶液于配置磁力搅拌的250mL具塞圆柱体玻璃反应器（高径比为2：1）中，避光加入共轭亚油酸的质量0.05%的QTX溶液，通氮约半小时以排出瓶中的氧气后，将瓶口密封。搅拌下，用紫外点光源于25 0C下辐照20min，停止辐照，交联度为36.2%，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。
1）室温下将5.76g共轭亚油酸溶解于100mL含0.25mmol/L柠檬酸钙的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 8.6，0.01mol/L）中，共轭亚油酸的浓度为200mmol·L-1；混合均匀后，加入碱性蛋白酶2709溶液，蛋白酶的加入量为500mg蛋白/g共轭亚油酸 (550mg蛋白酶制剂/g共轭亚油酸)，混合均匀后于25 0C下用摇床避光振荡4h (摇床转速50rpm)，即得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液，包埋率为91.2%；
2）将100mL上述溶液于配置磁力搅拌的250mL具塞圆柱体玻璃反应器（高径比为2：1）中，避光加入共轭亚油酸的质量0.05%的QTX溶液，通氮约半小时以排出瓶中的氧气后，将瓶口密封。搅拌下，用紫外点光源于25 0C下辐照20min，停止辐照，交联度为36.2%，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。
[0034] 将此溶液冻干浓缩到10%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以2wt%直接加入上述洗衣液中；25 0C下8周后，酶活保持率为85%；6个月后酶活保持率为55%。取1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中 (总硬度以碳酸钙计为98ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.01%。
[0035] 对照例1：直接将碱性蛋白酶2709加入洗衣液中0
将0.5克碱性蛋白酶2709加入100克洗衣液中，混合均匀；25 C下8周后，酶活保持率为
45%，6个月后酶活保持率为38%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，25 0C下，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.2%。
将0.5克碱性蛋白酶2709加入100克洗衣液中，混合均匀；25 C下8周后，酶活保持率为
45%，6个月后酶活保持率为38%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，25 0C下，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.2%。
[0036] 对照例2：用海藻酸钠和氯化钙固定化碱性蛋白酶2709取1.5克碱性蛋白酶2709 溶液加入到100mL 3%的海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀，用灭菌后的注射器吸入上述混合液缓慢滴入3%的氯化钙溶液中，得到凝胶微球；将此凝胶微球溶液于40C下静置过夜，使其进一步硬化，然后抽滤得到硬化的凝胶微球。用无菌生理盐水洗涤3次以洗去表面的氯化钙，晾干。将10g上述微球加入100g上述洗衣液中，混合均匀后
0
备用；25 C下8周后，酶活保持率为46.8%，6个月后酶活保持率为35%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，25 0C下，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为10.2%。
0
备用；25 C下8周后，酶活保持率为46.8%，6个月后酶活保持率为35%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，25 0C下，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为10.2%。
[0037] 实施例2制备包埋粘质赛氏碱性蛋白酶 (930.2mg蛋白/g，来自粘质赛氏菌)的囊泡，具体步骤如下：
1）室温下将共轭亚油酸和柠檬酸钙溶解于0.01mol/L的硼砂缓冲液（pH9.18）中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为240mmol/L，钙盐的浓度为0.15mmol/L；加入粘质赛氏碱性蛋白酶，蛋白酶的加入量为560mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于20℃下用摇床振荡7h，摇床的振荡速度为40rpm，自组装得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液，包埋率为92.3%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.06%，向反应器中通入氮气20分钟，将反应器瓶口密封；对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为45%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液，将此溶液冻干浓缩到10%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以2 wt%直接加入上述洗衣液中；
25 0C下8周后，酶活保持率为90.6%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为115ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为99.8%。
1）室温下将共轭亚油酸和柠檬酸钙溶解于0.01mol/L的硼砂缓冲液（pH9.18）中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为240mmol/L，钙盐的浓度为0.15mmol/L；加入粘质赛氏碱性蛋白酶，蛋白酶的加入量为560mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于20℃下用摇床振荡7h，摇床的振荡速度为40rpm，自组装得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液，包埋率为92.3%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.06%，向反应器中通入氮气20分钟，将反应器瓶口密封；对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为45%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液，将此溶液冻干浓缩到10%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以2 wt%直接加入上述洗衣液中；
25 0C下8周后，酶活保持率为90.6%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为115ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为99.8%。
[0038] 对照例：直接将粘质赛氏碱性蛋白酶加入洗衣液中0
将0.65g粘质赛氏碱性蛋白酶加入100克洗衣液中，混合均匀；25 C下8周后，酶活保持率为43.4%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，25 0C下，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.6%。
将0.65g粘质赛氏碱性蛋白酶加入100克洗衣液中，混合均匀；25 C下8周后，酶活保持率为43.4%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，25 0C下，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.6%。
[0039]实施例3
制备包埋中性蛋白酶1398 (905.7mg蛋白/g，邢台思倍特生物科技有限公司)的囊泡，具体步骤如下：
（1）室温下将共轭亚油酸和四水柠檬酸钙溶解于0.01mol/L的pH8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，共轭亚油酸的浓度为300 mmol/L，钙盐的浓度为0.25 mmol/L；加入中性蛋白酶1398溶液，蛋白酶的加入量为580 mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于25℃下用摇床振荡5h，摇床的振荡速度为50 rpm，自组装得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液,包埋率为
94.5%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.08 %，向反应器中通入氮气25分钟，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为50%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液，将此溶液冻干浓缩到10%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以5.5wt%直接加入上述洗衣液中。25 0C下8周后，酶活保持率为82%。
制备包埋中性蛋白酶1398 (905.7mg蛋白/g，邢台思倍特生物科技有限公司)的囊泡，具体步骤如下：
（1）室温下将共轭亚油酸和四水柠檬酸钙溶解于0.01mol/L的pH8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，共轭亚油酸的浓度为300 mmol/L，钙盐的浓度为0.25 mmol/L；加入中性蛋白酶1398溶液，蛋白酶的加入量为580 mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于25℃下用摇床振荡5h，摇床的振荡速度为50 rpm，自组装得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液,包埋率为
94.5%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.08 %，向反应器中通入氮气25分钟，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为50%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液，将此溶液冻干浓缩到10%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以5.5wt%直接加入上述洗衣液中。25 0C下8周后，酶活保持率为82%。
[0040] 将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为98ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.3%。
[0041] 对照例： 直接将中性蛋白酶1398加入洗衣液中将1.2g蛋白酶1398加入洗衣液中；25 0C下8周后，酶活保持率为45%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.8%。
[0042] 实施例4碱性蛋白酶2709的包埋，具体步骤如下：
（1）室温下将共轭亚油酸、等量的四水柠檬酸钙和二柠檬酸三钙溶解于0.01mol/L的pH
9.0的硼砂缓冲液中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为250 mmol/L，钙盐的浓度为0.28 mmol/L；加入碱性蛋白酶2709，蛋白酶的加入量为600mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于30℃下用摇床振荡8h，摇床的振荡速度50rpm，自组装得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液，包埋率为92.4%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.1 %，向反应器中通入氮气30分钟后，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为45%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。将此溶液冻干浓缩到15%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以3wt%直接加入加入上述洗衣液中；25 0C下8周后，酶活保持率为89.8%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为115ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.1%。
（1）室温下将共轭亚油酸、等量的四水柠檬酸钙和二柠檬酸三钙溶解于0.01mol/L的pH
9.0的硼砂缓冲液中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为250 mmol/L，钙盐的浓度为0.28 mmol/L；加入碱性蛋白酶2709，蛋白酶的加入量为600mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于30℃下用摇床振荡8h，摇床的振荡速度50rpm，自组装得到包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液，包埋率为92.4%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.1 %，向反应器中通入氮气30分钟后，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为45%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。将此溶液冻干浓缩到15%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以3wt%直接加入加入上述洗衣液中；25 0C下8周后，酶活保持率为89.8%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为115ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.1%。
[0043] 对照例： 直接将碱性蛋白酶2709加入洗衣液中将0.8克蛋白酶 2709加入洗衣液中；25 0C下8周后，酶活保持率为48%。将1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.8%。
[0044] 实施例5制备包埋中性蛋白酶1398的囊泡，具体步骤如下：
（1）室温下将共轭亚油酸和氯化钙溶解于0.01mol/L的pH7.0的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为300 mmol/L，钙盐的浓度为0.30 mmol/L；加入中性蛋白酶1398，蛋白酶的加入量为560mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于20℃下用摇床振荡
8h，摇床的振荡速度为50rpm，自组装得到包埋蛋白酶的共轭亚油酸囊泡溶液,包埋率为
91.6%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.12 %，向反应器中通入氮气40分钟，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为50%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。将此溶液冻干浓缩到10%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以6wt%直接加入洗衣液中；25
0C下8周后，酶活保持率为86.2%。取1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为98ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为94%。
（1）室温下将共轭亚油酸和氯化钙溶解于0.01mol/L的pH7.0的磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为300 mmol/L，钙盐的浓度为0.30 mmol/L；加入中性蛋白酶1398，蛋白酶的加入量为560mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于20℃下用摇床振荡
8h，摇床的振荡速度为50rpm，自组装得到包埋蛋白酶的共轭亚油酸囊泡溶液,包埋率为
91.6%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.12 %，向反应器中通入氮气40分钟，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为50%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。将此溶液冻干浓缩到10%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以6wt%直接加入洗衣液中；25
0C下8周后，酶活保持率为86.2%。取1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为98ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为94%。
[0045] 对照例： 直接将中性蛋白酶1398加入洗衣液中将1.3 g中性蛋白酶1398加入100克洗衣液中；25 0C下8周后，酶活保持率为47%。取1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为98ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.3%。
[0046] 实施例6制备包埋碱性蛋白酶2709的囊泡，具体步骤如下：
（1）室温下将共轭亚油酸和氯化钙溶解于0.01mol/L的pH10.0的硼砂-氢氧化钠缓冲液缓冲液中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为600 mmol/L，钙盐的浓度为0.10 mmol/L；加入碱性蛋白酶2709，蛋白酶的加入量为550mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于20℃下用摇床振荡8h，摇床的振荡速度为50rpm，自组装得到包埋蛋白酶的共轭亚油酸囊泡溶液,包埋率为
91.6%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.10 %，向反应器中通入氮气40分钟，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为35%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。将此溶液冻干浓缩到13%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以6wt%直接加入洗衣液中；25
0C下8周后，酶活保持率为85.4%。取1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为100ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为98%。
（1）室温下将共轭亚油酸和氯化钙溶解于0.01mol/L的pH10.0的硼砂-氢氧化钠缓冲液缓冲液中混合均匀，共轭亚油酸的浓度为600 mmol/L，钙盐的浓度为0.10 mmol/L；加入碱性蛋白酶2709，蛋白酶的加入量为550mg蛋白/g共轭亚油酸，混合均匀后于20℃下用摇床振荡8h，摇床的振荡速度为50rpm，自组装得到包埋蛋白酶的共轭亚油酸囊泡溶液,包埋率为
91.6%；
（2）将步骤（1）得到的自组装包埋蛋白酶共轭亚油酸囊泡溶液置于反应器中，避光加入QTX的用量为共轭亚油酸质量的0.10 %，向反应器中通入氮气40分钟，将反应器瓶口密封；
对反应器中混合溶液进行搅拌，搅拌的同时用紫外点光源辐照引发共轭亚油酸组装体的部分交联，交联度为35%时停止辐照，得到包埋蛋白酶的部分交联共轭亚油酸囊泡溶液。将此溶液冻干浓缩到13%水含量后，所得到的蛋白酶囊泡包埋体以6wt%直接加入洗衣液中；25
0C下8周后，酶活保持率为85.4%。取1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为100ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为98%。
[0047] 对照例： 直接将碱性蛋白酶2709加入洗衣液中将1.2 g碱性蛋白酶2709加入100克洗衣液中；25 0C下8周后，酶活保持率为45%。取1克此加酶洗衣液分散在1升自来水中(总硬度以碳酸钙计为100ppm)，1min后测得溶液中蛋白酶酶活释放率为100.1%。
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