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一种利用多种 角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法

阅读：513发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法，含以下步骤：(一)角膜上皮细胞刺激性预测；(二)角膜基质成纤维细胞刺激性预测；(2.1)中性红释放(NRR)测试；(2.2)炎性因子测试；(三)角膜内皮细胞刺激性预测；(四)基于多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性模型的建立。该方法可全面体现受试物(如刺激物或腐蚀物)对角膜结构细胞的毒性作用，非动物测试，可以对眼刺激性物质进行刺激程度预测，数据信息丰富，能广泛应用。，下面是一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法，其特征是含以下步骤：
(一)角膜上皮细胞刺激性预测
(1.1)最高试验浓度确定：选取角膜上皮细胞，采用MTT法确定细胞活性＞80％的受试物浓度作为最高试验浓度；
(1.2)屏障功能测试：采用步骤(1.1)中的最高试验浓度进行荧光素漏出测试，获得荧光素钠漏出百分比，计算接触受试物后引起20％荧光素钠漏出的实验物质浓度FL20(g/
100mL)，并根据4h、20％荧光素钠漏出的实验物质浓度FL20H4进行刺激性预测：FL20H4＞10g/
100mL为无刺激性或轻度刺激性，2～10g/100mL为中度刺激性，＜2g/100mL为重度刺激性；
(二)角膜基质成纤维细胞刺激性预测
(2.1)中性红释放(NRR)测试：选取角基质成纤维细胞，将受试物按照梯度浓度配制，加入中性红染料，进行吸光度测试，计算细胞活性率，并根据剂量-细胞活性率曲线计算出使角基质成纤维细胞的中性红染料释放50％的受试物浓度，即NRR50，并根据剂量-细胞死亡率曲线计算受试物浓度为50％时的细胞死亡率，即PM值，根据NRR50和PM值建立角膜基质成纤维细胞毒性和刺激性预测模型如下表1：
表1细胞毒性判定和眼刺激性预测模型
NRR50(％) PM 细胞毒性分类角膜基质刺激性预测分类
NRR50>50 PM≤20 无细胞毒性无刺激性
NRR50>50 2025≤NRR50≤50 -- 中度细胞毒性中度刺激性
NRR50<25 -- 严重细胞毒性重度刺激性
；
(2.2)炎性因子测试：当步骤(2.1)中预测分类为无刺激性时，通过酶联免疫吸附分析炎性细胞因子的表达，如在设定浓度下不引起任何一种炎性因子释放的增加，则判定为无刺激性，如在设定浓度下引起至少一种炎性因子释放的增加，则判定为轻度刺激性，其它任何条件下，不管有没有炎性因子释放的增加，均判定为刺激性；
(三)角膜内皮细胞刺激性预测
同步骤(二)中角膜基质成纤维细胞刺激性预测中的中性红释放(NRR)测试以及炎性因子测试，不同的是采用的是角膜内皮细胞，建立的眼刺激性预测模型以及炎性因子测试刺激性模型相同；
(四)基于多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性模型的建立
根据上述步骤(一)～步骤(三)中的结果，建立基于多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性模型如下：
2.根据权利要求1所述利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的评估方法，其特征是：步骤(1.1)中所述受试物包括个人护理产品、家用洗涤产品、药品、植物提取物、医疗器械及其浸提物、生物材料、环境污染物以及其它眼部接触产品；其中所述个人护理产品包括洗发香波、护发素、染发剂、护肤类、防晒类、眼影、沐浴乳或身体乳，所述家用洗涤产品包括洗衣液、洗衣粉、肥皂、洗洁精、漂白剂、消毒液或柔顺剂，所述植物提取物包括植物粗提取物、植物精提取物及二者的混合物；所述其它眼部接触产品包括纺织品浸提物衣服或内衣。
3.根据权利要求1所述利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的评估方法，其特征是：步骤(1.2)中采用以下公式计算荧光素钠漏出百分比：
m表示各受试物各浓度荧光素漏出量均值，y表示无受试物对照组荧光素漏出量均值，z表示无细胞培养对照组荧光素漏出量均值。
4.根据权利要求1所述利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的评估方法，其特征是：步骤(2.2)中所述炎性因子包括TGF-β、TGF-α、IL-1、IL-2、IL-8、FGF-2、EGF-8和血小板衍生生长因子中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的评估方法，其特征是：步骤(2.1)中将受试物按照以下百分比逐渐稀释的梯度浓度配制：50％、35％、25％、
15％、5％。
6.根据权利要求1所述利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的评估方法，其特征是：步骤(2.2)中所述设定浓度为根据步骤(2.1)中中性红释放(NRR)测试的剂量-细胞活性率曲线确选择细胞活性＞80％的受试物浓度作为炎性因子测试的最高试验浓度。

说明书全文

一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法

技术领域

[0001] 本发明属于非动物测试方法技术领域，具体涉及一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法。

背景技术

[0002] 日常生活中，人的眼睛可能主动接触或意外暴露于药品、日化产品、农药等外源性物质，以原样或稀释的形式进入眼睛，产生局部刺激作用，甚至腐蚀作用，可能影响人的健康。因此，评估外源物质可能具的眼刺激性具有重要意义。

[0003] 眼刺激性属于健康毒理学的范畴，传统方法是1944年由Draize等提出的兔眼试验，简单过程就是直接把受试样品滴入兔子的眼睛内，观察造成的损伤反应。目前该方法仍然在国际范围内广泛使用。但Draize试验的科学性和合理性一直备受质疑。随着动物福利意识和动物实验3R原则(减少Reduction，优化Refinement，替代Replacement)的不断深入人心，加上新技术的发展，一些毒性测试与评价的体外替代方法被开发出来，并陆续被验证和认可。2003年，欧盟在化妆品指令(76/768/EEC)第7次修正案(2003/15/EC)中首次提出禁止化妆品动物实验的要求，2013年3月11日起，欧盟全面实施了化妆品及成分的动物试验禁令和经动物实验化妆品的销售禁令。2007年6月正式试验REACH法规要求所有化学品的安全性评估必须采用最少的实验动物。欧盟联合参考实验室(EURL ECVAM)和美国替代方法部门间协调验证中心(ICCVAM)提出了一系列化学品的非动物测试方法等。全球至少48个国家已提出了全面禁止化妆品动物实验的法规要求。

[0004] 角膜损伤从机制分析常累及三层结构，损伤的程度与累及的深度有关。现有的体外实验方法可分为化学反应、细胞方法、器官型方法和重组人组织模型等。化学反应是根据刺激物通常具有蛋白变性的作用，在体外设计一组特殊蛋白质，将受试物与蛋白质反应，定量测定蛋白变性的程度，进而推测可能具有的眼刺激性。

[0005] 器官型方法包括离体角膜和鸡胚绒毛尿囊膜方法，这些离体组织可以在短期内维持正常生理活性。离体角膜是将化学受试物暴露于分离的牛、猪、鸡或兔的眼球或角膜，通过观察离体组织的生物学效应，从而测试受试物是否具有眼刺激性。其中，牛角膜浑浊度和渗透性实验(BCOP)，是通过验证并得到法规认可的眼腐蚀性和刺激性的替代方法标准之一，列入经济合作和发展组织(OECD)化学品测试指南(TG)编号437的方法，适用于鉴别严重刺激性/腐蚀性物质和鉴别有无刺激性，实际中可测试化妆品、药品、日用和工业用品等。但对于轻微到中度眼刺激性不太敏感，需要结合其他测试方法综合评估。

[0006] 细胞方法主要基于细胞毒性和功能性的试验。研究发现，某些损伤眼睛的受试物也能引起不同各类型细胞的细胞毒性作用，包括眼球的各种上皮、基质和内皮组织。因此，可以通过基于细胞毒性和功能性的试验来检测眼刺激作用。如中性红摄取(NRU)试验是一种应用广泛的细胞毒性试验方法，通过检测受试物抑制活性细胞摄取中性红染料的能力反应细胞的活性，该方法较好的应用于轻度眼刺激物评价和分类，但实验没有反应眼刺激的特征性。还有红细胞溶血实验，是根据化学物质能损伤细胞膜的原理设计，可应用于区分极轻度和非轻度的表面活性剂，但红细胞非角膜结构细胞，其观察指标与真实的眼刺激存有差距。基于细胞功能的试验有荧光素漏出试验(FL试验)，是基于角膜上皮具有防止有害化学物质渗透的屏障功能的原理设计的，屏障功能损伤导致眼刺激反应出现，FL试验可用于测试表面活性剂的严重刺激性，但对于轻度刺激不够敏感。细胞学方法的局限是细胞不够特异性，无法直接测定角膜损伤深度。

[0007] 重组人组织模型包括EpiOcular、SkinEthicTMHCE模型和HCE-TEP，正常人的角膜上皮组织由5～6层分化的外胚层细胞组成，保护角膜并构成他的视觉特性。重组人组织模型TM是模拟角膜上皮组织，如SkinEthic HCE模型是由法国SkinEthic实验室开发的人角膜上皮模型，该方法适用于化妆品，个人护理、日化和化工企业等研究实验，覆盖了各种不同的理化性质以及包含了富有挑战性的原料物质，HCE模型已商品化，但无法判断角膜内皮层的损伤，且实验研究成本较高。

[0008] 眼刺激试验是替代方法研究中最为活跃的领域之一，多数方法试图通过验证研究证明其可靠性和相关性，但目前为止，还没有单一的体外试验可完全替代体内Draize试验，为了解决只用单一体外试验方法不能覆盖体内试验所有检测的损伤范围的现状，许多机构(如OECD、ICCVAM和ECVAM)推荐使用成套试验程序。当然，仍有必要进一步研发新的体外方法，新方法的重点不仅限于眼刺激性的分类，还包括功能性的损伤深度等研究。另外，目前的体外眼刺激方法组合评测存在实验耗时长、费用高、操作有一定难度、实验室间变异高等问题，也需要加以优化，进一步提高方法的检测通量。

发明内容

[0009] 本发明目的是提供一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法，该方法可全面体现受试物(如刺激物或腐蚀物)对角膜结构细胞的毒性作用，非动物测试，可以对眼刺激性物质进行刺激程度预测，数据信息丰富，能广泛应用。

[0010] 本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种利用多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性的方法，含以下步骤：

[0011] (一)角膜上皮细胞刺激性预测

[0012] (1.1)最高试验浓度确定：选取角膜上皮细胞，采用MTT法确定细胞活性＞80％的受试物浓度作为最高试验浓度；

[0013] (1.2)屏障功能测试：采用步骤(1.1)中的最高试验浓度进行荧光素漏出测试，获得荧光素钠漏出百分比，计算接触受试物后引起20％荧光素钠漏出的实验物质浓度FL20(g/100mL)，并根据4h、20％荧光素钠漏出的实验物质浓度FL20H4进行刺激性预测：FL20H4＞10g/
100mL为无刺激性或轻度刺激性，2～10g/100mL为中度刺激性，＜2g/100mL为重度刺激性；

[0014] (二)角膜基质成纤维细胞刺激性预测

[0015] (2.1)中性红释放(NRR)测试：选取角基质成纤维细胞，将受试物按照梯度浓度配制，加入中性红染料，进行吸光度测试，计算细胞活性率，并根据剂量-细胞活性率曲线计算出使角基质成纤维细胞的中性红染料释放50％的受试物浓度，即NRR50，并根据剂量-细胞死亡率曲线计算受试物浓度为50％时的细胞死亡率，即PM值，根据NRR50和PM值建立角膜基质成纤维细胞毒性和刺激性预测模型如下表1：

[0016] 表1细胞毒性判定和眼刺激性预测模型

[0017] NRR50(％) PM 细胞毒性分类角膜基质刺激性预测分类NRR50>50 PM≤20 无细胞毒性无刺激性
NRR50>50 2025≤NRR50≤50 -- 中度细胞毒性中度刺激性
NRR50<25 -- 严重细胞毒性重度刺激性
；

[0018] (2.2)炎性因子测试：当步骤(2.1)中预测分类为无刺激性时，通过酶联免疫吸附分析炎性细胞因子的表达，如在设定浓度下不引起任何一种炎性因子释放的增加，则判定为无刺激性，如在设定浓度下引起至少一种炎性因子释放的增加，则判定为轻度刺激性，其它任何条件下，不管有没有炎性因子释放的增加，均判定为刺激性；

[0019] (三)角膜内皮细胞刺激性预测

[0020] 同步骤(二)中角膜基质成纤维细胞刺激性预测中的中性红释放(NRR)测试以及炎性因子测试，不同的是采用的是角膜内皮细胞，建立的眼刺激性预测模型以及炎性因子测试刺激性模型相同；

[0021] (四)基于多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性模型的建立

[0022] 根据上述步骤(一)～步骤(三)中的结果，建立基于多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性模型如下：

[0023]

[0024] 可选地，步骤(1.1)中所述受试物包括个人护理产品、家用洗涤产品、药品、植物提取物、医疗器械及其浸提物、生物材料、环境污染物以及其它眼部接触产品。

[0025] 可选地，所述个人护理产品包括洗发香波、护发素、染发剂、护肤类、防晒类、眼影、沐浴乳或身体乳，所述家用洗涤产品包括洗衣液、洗衣粉、肥皂、洗洁精、漂白剂、消毒液或柔顺剂，所述植物提取物包括植物粗提取物、植物精提取物及二者的混合物；所述其它眼部接触产品包括纺织品浸提物衣服或内衣。

[0026] 可选地，步骤(1.2)中采用以下公式计算荧光素钠漏出百分比：

[0027]

[0028] m表示各受试物各浓度荧光素漏出量均值，y表示无受试物对照组荧光素漏出量均值，z表示无细胞培养对照组荧光素漏出量均值。

[0029] 可选地，步骤(2.2)中所述炎性因子包括TGF-β、TGF-α、IL-1、IL-2、IL-8和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)中的一种或几种。

[0030] 可选地，步骤(2.1)中将受试物按照以下百分比逐渐稀释的梯度浓度配制：50％、35％、25％、15％、5％。

[0031] 可选地，步骤(2.2)中所述设定浓度为根据步骤(2.1)中中性红释放(NRR)测试的剂量-细胞活性率曲线确选择细胞活性＞80％的受试物浓度作为炎性因子测试的最高试验浓度。

[0032] 可选地，步骤(1.1)中的角膜上皮细胞，包括商定购买的细胞系(兔角膜上皮SIRC细胞、人角膜HCE-T细胞)的单层或多层培养物，类角膜上皮细胞系(如犬的肾小管上皮MDCK细胞)；也可以分离自兔、牛、人角膜上皮细胞的原代培养。

[0033] 可选地，本发明步骤(1.1)中最高试验浓度确定时，具体可以包括如下步骤：

[0034] 将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，当细胞(常规培养的角膜上皮细胞)的细胞密度长至80％～90％时，分别加入上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组(0.2g/mL二乙基二硫代氨基甲酸锌聚氨酯)、阴性对照组(0.2g/mL高密度聚乙烯)和空白对照组(含10％FBS的DMEM培养基)，在各组中分别加入MTT和DMSO溶液，用酶标法分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算细胞死亡率，细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，根据细胞死亡率曲线，计算受试物的80％抑制浓度(IC80)。选取细胞活性＞80％的受试物浓度为最高试验浓度。

[0035] 可选地，MTT英文全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，MTT比色法是一种常用检测细胞存活和生长的方法。

[0036] 可选地，本发明步骤(1.2)中屏障功能测试时，具体可以包括如下步骤：

[0037] 荧光素漏出(FL)测试：细胞生长于嵌入培养皿，当融合时培养的上皮细胞形成紧密连接和细胞桥粒。细胞层将培养基分隔成两部分，细胞在上层接触一定量的不同浓度受试物，设3个平行孔，15min±1min后用Hank’s液轻柔冲洗细胞表面以清除受试物，放入另一块含Hank’s液的培养皿中，10μg/mL的荧光素钠溶液加到上层细胞，在37℃±1℃孵育30min±5min后，通过荧光分光光度计检测(激发波长485nm，发射光波长530nm)渗入培养板，即细胞下层中荧光素量，作为细胞屏障损伤程度的指标。因为，大部分细胞仍存活，清洗细胞，置于另一个含新鲜培养液的培养皿上，于37℃±1℃继续培养4h后，再次加入荧光素钠溶液，同时检测以了解受试物对细胞紧密连接的影响。依次检测24h和72h受试物对细胞的影响，按一下公式计算引起荧光素钠漏出百分比：

[0038]

[0039] m表示各受试物各浓度荧光素漏出量均值，y表示无受试物对照组荧光素漏出量均值(阴性对照)，z表示无细胞培养对照组荧光素漏出量均值(阳性对照)。

[0040] 其中培养基为含10％FBS的DMEM。DMEM培养基为商业化购买，如GIBCO公司。

[0041] 嵌入式细胞培养皿为商业化购买，如MILLIPORE公司的Millcell或corning公司的Transwell。

[0042] 可选地，步骤(1.3)中所述酶联免疫吸附采用酶联免疫吸附分析法，Enzyme-linked immunosorbentanalyses，ELISA。

[0043] 可选地，步骤(1.3)中测试炎性因子的ELISA 试剂盒为商业化购买，参考ELISA试剂盒说明进行加样，清洗，染色，用酶标仪测试OD值，下同。

[0044] 可选地，步骤(2.1)中所述角基质成纤维细胞包括细胞系(如HECE-12)、转染细胞和原代细胞(可分离兔、牛、人的等角膜基质成纤维细胞原代培养)。

[0045] 可选地，步骤(2.1)中所述中性红释放(NRR)测试，具体可以包括如下步骤：

[0046] 将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，当培养的细胞密度长至80％～90％，接种至24孔培养皿，常规培养18-24h，镜检24孔培养皿每孔细胞汇合情况，接近融合或者已达到融合的单层细胞，加入中性红染料，37℃±1℃，孵育3h±30min，随后去除中性红染料，加入培养液终止30min±10min。更换培养液后，用约2mL缓冲液溶液冲洗2～3次，加入500μL上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组(0.01％、0.05％、0.2％十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS))、阴性对照组(0.9％氯化钠溶液)和空白对照组(含10％FBS的DMEM培养基)，受试物和对照组与细胞直接接触1～5min，暴露结束后，然后合适的溶剂洗去受试(参比波长405nm)出测定终溶液的吸光度。

[0047] 根据下述公式，计算细胞活性率和抑制率，细胞活性率＝(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)×100％；细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％。

[0048] 通过剂量-细胞活性率细胞活性率曲线计算使预载细胞(角膜基质成纤维细胞)中性红染料释放50％的受试物浓度，即为NRR50。

[0049] 计算细胞死亡率，通过剂量-细胞死亡率曲线，计算受试物浓度50％下细胞死亡率，即为PM值(Percentage of cell mortality observed at the 50％dilution)。

[0050] 其中培养基是含10％FBS的DMEM，4mmol/L L-谷氨酰胺，100IU青霉素和100μg/mL 链霉素。

[0051] FBS(Fetal bovine serum)为胎牛血清，可以商业化购买，如GIBCO公司。

[0052] DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。

[0053] 清洗细胞的缓冲液溶液为DPBS(Dulbecco’s 磷酸盐缓冲溶液)：均含有氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠和磷酸氢二钠。DPBS有利于维持稳定的pH值，是细胞的等渗溶液，无细胞毒性。

[0054] 可选地，步骤(3.1)中所述角膜内皮细胞包括细胞系(如HECE-12)、转染细胞和原代细胞(可分离兔、牛、人的等内皮细胞原代培养)。

[0055] 可选地，步骤(四)基于多种角膜结构细胞组合预测眼刺激性模型的建立中，通常情况下角膜三层结构的毒性中，权重从高到低依次为：内皮>上皮>基质；损伤参数权重从高到低依次为，炎性因子>屏障功能>细胞毒性。

[0056] 本发明具有如下有益效果：

[0057] (1)本发明利用多种角膜结构细胞毒性组合预测眼刺激性的评估方法，可全面体现受试物(刺激物或腐蚀物)对角膜结构细胞的毒性作用；

[0058] (2)本发明通过对眼刺激性物质进行机制性研究和刺激程度预测，应用广泛；

[0059] (3)本发明通过定性检测细胞因子，具有灵敏度高，通量高，检测参数全面，特异性高等，提供眼刺激性预测更多检测数据进行评估，适用于不同受试物的精准比较；

[0060] (4)本发明建立的方法可替代动物，提供定量和定性的检测数据，直接用于化学品、药品、化妆品等产品的眼刺激性毒性预测和功能性损伤深度。

具体实施方式

[0061] 实施例1基于多种角膜结构细胞毒性方法评估某品牌氨基酸泡沫洗面奶眼刺激性[0062] 1.角膜上皮刺激性预测

[0063] 1.1角膜上皮细胞常规培养：所用细胞为兔角膜上皮SIRC细胞。

[0064] 1.2细胞毒性测试

[0065] (1)受试物浓度的确定及配制：用分析天平称取200mg洗面奶，用无血清培养基为溶剂制备储备液，配制成100mg/mL的母液，待用。

[0066] (2)铺板：待角膜上皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0067] (3)受试物的添加：洗面奶终浓度为100mg/mL，稀释成31.6mg/mL，10mg/mL，3.2mg/mL，1mg/mL，0.32mg/mL。将稀释的洗面奶添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。使用多通道移液器以减少孔间差异。置于培养箱中孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液(噻唑蓝)，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO(二甲基亚砜)，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min后。

[0068] (4)酶标仪测量及细胞活性计算：用酶标仪在570nm处测量步骤(3)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC50(半数抑制浓度，即50％细胞活性时受试物浓度)：

[0069] 细胞活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％

[0070] (5)细胞毒性分析：得到试验结果为：100mg/L时细胞存活率为51.89％，31.6mg/L时为64.89％，10.01mg/L为78.91％，3.16mg/L时为87.63％，1.00mg/L时为88.46％、0.32mg/L时为87.26％。经统计得到洗面奶的，IC80为14.98mg/mL，选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为荧光素漏出测试的最高试验浓度。

[0071] 1.3荧光素漏出(FL)测试：

[0072] (1)细胞以2×105/孔接种于嵌入培养皿，待细胞密度长至80％时，上皮细胞形成紧密连接和细胞桥粒。细胞层将培养基分隔成两部分，设置受试物浓度为14mg/mL(选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为荧光素漏出测试的最高试验浓度，只要大于80％就可以选择)，7mg/mL，3mg/mL，设3个平行孔，在细胞表面加入0.4mL，15min±1min后用Hank’s液轻柔冲洗细胞表面以清除受试物，放入另一块含Hank’s液的培养皿中，10μg/mL的荧光素钠溶液加到上层细胞，在37℃±1℃孵育30min±5min后，通过荧光分光光度计检测(激发波长485nm，发射光波长530nm)渗入培养板，即细胞下层中荧光素量，作为细胞屏障损伤程度的指标。因为，大部分细胞仍存活，清洗细胞，置于另一个含新鲜培养液的培养皿上，于37℃±
1℃继续培养4h后，再次加入荧光素钠溶液，同时检测以了解受试物对细胞紧密连接的影响。依次检测24h和72h受试物对细胞的影响，按一下公式计算引起荧光素钠漏出百分比：

[0073]

[0074] (2)荧光素漏出(FL)测试结果分析：

[0075]

[0076]

[0077] 剂量-FL20曲线为：y＝0.0725x+0.0126，当y＝20％，x＝2.55g/100ml，即为FL20H4[0078] FL20H4在2～10g/100mL为中度刺激性。

[0079] 2.角膜基质成纤维细胞刺激性预测

[0080] 2.1角膜基质成纤维细胞常规培养，所用细胞为人原代角膜基质成纤维细胞(HCS)。

[0081] 2.2样品配置：洗面奶加入0.9％NaCl溶液终浓度50％，稀释成35％，25％，15％，5％；阳性对照为SDS，配制0.01％，0.05％，0.2％；阴性对照为0.9％NaCl溶液。

[0082] 2.3铺板：待角膜基质成纤维细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以2×105/孔将细胞铺于24孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0083] 2.4中性红释放(NRR)测试：24孔板内加入0.05mg/mL中性红染料1mL/孔，37℃±1℃，孵育3h±30min，随后去除中性红染料，加入培养液终止30min±10min。更换培养液后，用约2mL缓冲液溶液冲洗2～3次，加入500μL上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，2个复孔，受试物和对照组与细胞直接接触1min，暴露结束后，PBS清洗2-3次，每孔加入1mL解析液(醋酸：50％乙醇＝1：99)，搅拌15min后，每孔取200μL转移至96孔板，4个复孔，在参比波长405nm测定终溶液的吸光度。

[0084] 2.5根据下述公式，计算细胞活性率和抑制率，细胞活性率＝(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)×100％；细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，通过剂量-细胞活性率曲线计算使预载细胞中性红染料释放50％的受试物浓度。毒性终点通常用NRR50表达；PM值计算公式为细胞死亡率＝(1-细胞活性率)×100％，通过剂量-细胞死亡率曲线计算50％浓度下细胞死亡率。

[0085] 2.6结果：

[0086]

[0087]

[0088] 剂量-细胞活性率曲线为：y＝-0.7006x+0.9472当y＝50％时，x＝63.86％，即为NRR50。

[0089] 剂量-细胞死亡率曲线为：y＝0.7006x+0.0528，当x＝50％时，y＝40.31％，即为PM。

[0090] 样品NRR50为63.86％(大于50％)，PM值为40.31％(大于20％，小于50％)，该样品对于角膜基质成纤维细胞具有轻度细胞毒性，轻度刺激性。

[0091] 3.角膜内皮细胞刺激性预测

[0092] 3.1角膜内皮细胞常规培养：人原代角膜内皮细胞HCEC细胞。

[0093] (1)样品配置：洗面奶加入0.9％NaCl溶液终浓度50％，稀释成35％，25％，15％，5％；阳性对照为SDS，配制0.01％，0.05％，0.2％；阴性对照为0.9％NaCl溶液。

[0094] (2)铺板：待角膜内皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以2×105/孔将细胞铺于24孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0095] (3)中性红释放(NRR)测试：24孔板加入0.05mg/mL中性红染料1mL/孔，37℃±1℃，孵育3h±30min，随后去除中性红染料，加入培养液终止30min±10min。更换培养液后，用约2mL缓冲液溶液冲洗2～3次，加入500μL上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，2个复孔，受试物和对照组与细胞直接接触1min，暴露结束后，PBS清洗2—3次，每孔加入1mL解析液(醋酸：50％乙醇＝1：99)，搅拌15min后，每孔取200uL转移至96孔板，4个复孔，在参比波长405nm测定终溶液的吸光度。

[0096] (4)根据下述公式，计算细胞活性率和抑制率，细胞活性率＝(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)×100％；细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，通过剂量-细胞活性率曲线计算使预载细胞中性红染料释放50％的受试物浓度。毒性终点通常用NRR50表达；PM值计算公式为细胞死亡率＝(1-细胞活性率)×100％，通过剂量-细胞死亡率曲线计50％浓度下细胞死亡率。

[0097] (5)NRR测试结果：

[0098]组别 OD值细胞活性
空白对照 0.0379 --
阴性对照 0.6351 100.00％
阳性对照0.01％ 0.6052 95.00％
阳性对照0.05％ 0.6216 97.75％
阳性对照0.2％ 0.2470 35.03％
5％dilution 0.7458 103.52％
15％dilution 0.7181 99.47％
25％dilution 0.6803 93.95％
35％dilution 0.6594 90.89％
50％dilution 0.6245 85.79％

[0099] 剂量-细胞活性率曲线为：y＝-0.3976x+1.0506当y＝50％时，x＝138.48％，即为NRR50。

[0100] 剂量-细胞死亡率曲线为：y＝0.7006x+0.0528，当x＝50％时，y＝14.82％，即为PM。

[0101] 样品NRR50为138.48％(大于50％)，PM值为14.82％(小于20％)，该样品对于角膜内皮细胞无细胞毒性，无刺激性。

[0102] 选择做炎性因子测试，根据NRR试验剂量-细胞活性率曲线，当样品浓度为63.02％时，细胞活性大于80％，选取细胞活性＞80％受试物浓度的作为细胞因子测试的最高试验浓度。

[0103] 2.3炎性因子测试

[0104] (1)样品配置：洗面奶加入0.9％NaCl溶液稀释成终浓度50％，继续稀释成25％，12.5％，空白对照为0.9％NaCl溶液。

[0105] (2)铺板：待角膜内皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以2.0～3.0×105个/孔将细胞铺于12孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0106] (3)取出培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1mL含不同浓度的测试样品，空白对照，培养24±1h。

[0107] (4)去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h。

[0108] (5)收集上清液，检测炎性因子TGF-β，以及生长因子PDGF、FGF-2和EGF8，采用ELISA试剂盒进行测定。

[0109] (6)炎性因子测试结果

[0110] 收集上清液，检测炎性因子EGF8，结果见下表2。

[0111] 表2.不同组别EGF-8差异比较

[0112]

[0113] *：与对照组相比，差异具有统计学意义。

[0114] 样品组受试物浓度50％，25％，12.5％与空白对照组相比，培养液中炎性因子的释放均无统计学意义，该样品在50％，25％，12.5％浓度下，未引起角膜内皮细胞释放EGF-8炎性因子。

[0115] 该样品对于角膜内皮细胞无细胞毒性，无刺激性，且未引起炎性因子释放，结果为无刺激性。

[0116] 4.眼刺激性预测模型

[0117]

[0118] 实施例2基于多种角膜结构细胞毒性方法评估某品牌眼药水眼刺激性[0119] 1.角膜上皮刺激性预测

[0120] 1.1角膜上皮细胞：所用细胞为人角膜细胞系THCE细胞。

[0121] 1.2细胞毒性测试

[0122] (1)受试物浓度的确定及配制：用分析天平称取200mg眼药水，用无血清培养基为溶剂制备储备液，配制成100mg/mL的母液，待用。

[0123] (2)铺板：待角膜上皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0124] (3)受试物的添加：眼药水终浓度为100mg/mL，稀释成31.6mg/mL，10mg/mL，3.2mg/mL，1mg/mL，0.32mg/mL。将稀释的洗面奶添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。使用多通道移液器以减少孔间差异。置于培养箱中孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min后。

[0125] (4)酶标仪测量及细胞活性计算：用酶标仪在570nm处测量步骤(3)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC50(半数抑制浓度，即50％细胞活性时受试物浓度)：

[0126] 细胞活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％

[0127] (5)细胞毒性分析：得到试验结果为：100mg/L时细胞存活率为68.02％，31.6mg/L时为81.13％，10.01mg/L为85.53％，3.16mg/L时为91.68％，1.00mg/L时为96.22％，0.32mg/L时为96.38％。经统计得到洗面奶的IC80为49.73mg/mL，选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为荧光素漏出测试的最高试验浓度。

[0128] 1.3荧光素漏出(FL)测试：

[0129] (1)细胞以2×105/孔接种于嵌入培养皿，待细胞密度长至80％时，上皮细胞形成紧密连接和细胞桥粒。细胞层将培养基分隔成两部分，设置受试物浓度为40mg/mL(选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为荧光素漏出测试的最高试验浓度，只要大于80％就可以选择)，20mg/mL，10mg/mL，设3个平行孔，在细胞表面加入0.4mL，15min±1min后用Hank’s液轻柔冲洗细胞表面以清除受试物，放入另一块含Hank’s液的培养皿中，10μg/mL的荧光素钠溶液加到上层细胞，在37℃±1℃孵育30min±5min后，通过荧光分光光度计检测(激发波长485nm，发射光波长530nm)渗入培养板，即细胞下层中荧光素量，作为细胞屏障损伤程度的指标。因为，大部分细胞仍存活，清洗细胞，置于另一个含新鲜培养液的培养皿上，于37℃±
1℃继续培养4h后，再次加入荧光素钠溶液，同事检测以了解受试物对细胞紧密连接的影响。依次检测24h和72h受试物对细胞的影响，按一下公式计算引起荧光素钠漏出百分比：

[0130]

[0131] (2)荧光素漏出(FL)测试结果分析：

[0132]

[0133] 剂量-FL20曲线为：y＝y＝0.0152x+0.0237，当y＝20％，x＝11.60g/100ml，即为FL20H4。

[0134] FL20H4＞10g/100mL为无/轻微刺激性。

[0135] 2.角膜基质成纤维细胞刺激性预测

[0136] 2.1角膜基质成纤维细胞常规培养：兔角膜前基质层成纤维细胞RCFBF。

[0137] 2.2中性红释放(NRR)测试：

[0138] (1)样品配置:眼药水加入0.9％NaCl溶液稀释成终浓度50％，继续稀释成35％，25％，15％，5％；阳性对照为SDS，配制0.01％，0.05％，0.2％；阴性对照为0.9％NaCl溶液。

[0139] (2)铺板：待角膜基质成纤维细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调
5
整浓度，以2×10/孔将细胞铺于24孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0140] (3)24孔板内加入0.05mg/mL中性红染料1mL/孔，37℃±1℃，孵育3h±30min，随后去除中性红染料，加入培养液终止30min±10min。更换培养液后，用约2mL缓冲液溶液冲洗2～3次，加入500μL上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，2个复孔，受试物和对照组与细胞直接接触1min，暴露结束后，PBS清洗2—3次，每孔加入1mL解析液(醋酸：50％乙醇＝1：99)，搅拌15min后，每孔取200uL转移至96孔板，4个复孔，在参比波长405nm测定终溶液的吸光度。

[0141] (4)根据下述公式，计算细胞活性率和抑制率，细胞活性率＝(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)×100％；细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，通过剂量-细胞活性率曲线计算使预载细胞中性红染料释放50％NRU的受试物浓度。毒性终点通常用NRR50表达；PM值计算公式为细胞死亡率＝(1-细胞活性率)×100％，通过剂量-细胞死亡率曲线计50％浓度下细胞死亡率。

[0142] (5)NRR测试结果：

[0143]组别 OD值细胞活性
空白对照 0.0363 --
阴性对照 0.8794 100.00％
阳性对照0.01％ 0.7164 80.67％
阳性对照0.05％ 0.3492 37.11％
阳性对照0.2％ 0.1768 16.66％
5％dilution 0.5936 93.06％
15％dilution 0.5561 86.78％
25％dilution 0.5908 92.58％
35％dilution 0.5294 82.30％
50％dilution 0.5241 81.42％

[0144] 剂量-细胞活性率曲线为：y＝-0.2514x+0.9376当y＝50％时，x＝174.07％，即为NRR50。

[0145] 剂量-细胞死亡率曲线为：y＝0.2514x+0.0624，当x＝50％时，y＝18.81％，即为PM。

[0146] 样品NRR50为174.07％(大于50％)，PM值为18.81％(小于20％)，该样品对于角膜基质成纤维细胞无细胞毒性，无刺激性。

[0147] 选择做炎性因子测试，根据NRR试验剂量-细胞活性率曲线，样品浓度为54.73％时，细胞活性大于80％，选取细胞活性＞80％受试物浓度的作为炎性因子测试的最高试验浓度。

[0148] 2.3炎性因子测试

[0149] (1)样品配置:眼药水加入0.9％NaCl溶液稀释成终浓度50％，继续稀释成25％，12.5％，空白对照为0.9％NaCl溶液。

[0150] (2)铺板：待角膜基质成纤维细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调
5
整浓度，以2.0～3.0×10个/孔将细胞铺于12孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0151] (3)取出培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1mL含不同浓度的测试样品，空白对照，培养24±1h。

[0152] (4)去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h

[0153] (5)收集上清液，检测炎性因子TGF-β，以及生长因子PDGF、FGF-2和EGF8，采用ELISA试剂盒进行测定。

[0154] (6)炎性因子测试结果

[0155] 收集上清液，检测炎性因子TGF-β，结果见下表3。

[0156] 表3.不同组别TGF-β差异比较

[0157]

[0158] *：与对照组相比，差异具有统计学意义。

[0159] 样品组受试物浓度50％，25％与空白对照组相比，培养液中炎性因子的释放具有统计学意义(P<0.05)，该样品在50％，25％，浓度下，引起角膜基质成纤维细胞释放TGF-β炎性因子。

[0160] 该样品对于角膜基质成纤维细胞无细胞毒性，无刺激性，但引起角膜基质成纤维细胞释放一种炎性因子，结果为轻度刺激性。

[0161] 3.角膜内皮细胞刺激性预测

[0162] 3.1角膜内皮细胞常规培养：兔角膜原代内皮细胞。

[0163] (1)样品配置:眼药水加入0.9％NaCl溶液稀释成终浓度50％，继续稀释成35％，25％，15％，5％；阳性对照为SDS，配制0.01％，0.05％，0.2％；阴性对照为0.9％NaCl溶液。

[0164] (2)铺板：待角膜内皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以2×105/孔将细胞铺于24孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0165] (3)中性红释放(NRR)测试：24孔板加入0.05mg/mL中性红染料1mL/孔，37℃±1℃，孵育3h±30min，随后去除中性红染料，加入培养液终止30min±10min。更换培养液后，用约2mL缓冲液溶液冲洗2～3次，加入500μL上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，2个复孔，受试物和对照组与细胞直接接触1min，暴露结束后，PBS清洗2-3次，每孔加入1mL解析液(醋酸：50％乙醇＝1：99)，搅拌15min后，每孔取200uL转移至96孔板，4个复孔，在参比波长405nm测定终溶液的吸光度。

[0166] (4)根据下述公式，计算细胞活性率和抑制率，细胞活性率＝(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)×100％；细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，通过剂量-细胞活性率曲线计算使预载细胞中性红染料释放50％的受试物浓度。毒性终点通常用NRR50表达；PM值计算公式为细胞死亡率＝(1-细胞活性率)×100％，通过剂量-细胞死亡率曲线计50％浓度下细胞死亡率。

[0167] (5)结果：

[0168]组别 OD值细胞活性
空白对照 0.0379 --
阴性对照 0.7195 100.00％
阳性对照0.01％ 0.4555 61.27％
阳性对照0.05％ 0.2781 35.24％
阳性对照0.2％ 0.2168 26.25％
5％dilution 0.8187 114.19％
15％dilution 0.7014 97.03％
25％dilution 0.6455 88.85％
35％dilution 0.6276 86.24％
50％dilution 0.6342 87.20％

[0169] 剂量-细胞活性率曲线为：y＝-0.5616x+1.093当y＝50％时，x＝105.59％，即为NRR50。

[0170] 剂量-细胞死亡率曲线为：y＝0.5616x-0.093，当x＝50％时，y＝18.78％，即为PM。

[0171] 样品NRR50为105.59％(大于50％)，PM值为18.78％(小于20％)，该样品对于角膜内皮细胞无细胞毒性，无刺激性。

[0172] 选择做炎性因子测试，根据NRR试验剂量-细胞活性率曲线，当样品浓度为52.17％时，细胞活性大于80％，选取细胞活性＞80％受试物浓度的作为炎性因子测试的最高试验浓度。

[0173] 3.2细胞因子测试

[0174] (1)样品配置:眼药水加入0.9％NaCl溶液稀释成终浓度50％，继续稀释成25％，12.5％，空白对照为0.9％NaCl溶液。

[0175] (2)铺板：待角膜内皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以2.0～3.0×105个/孔将细胞铺于12孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0176] (3)取出培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1mL含不同浓度的测试样品，空白对照，培养24±1h。

[0177] (4)去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h

[0178] (5)收集上清液，检测炎性因子IL-1，采用ELISA试剂盒进行测定。

[0179] (6)炎性因子测试结果

[0180] 收集上清液，检测炎性因子IL-1，结果见下表3。

[0181] 表3.不同组别IL-1差异比较

[0182]

[0183] *：与对照组相比，差异具有统计学意义。

[0184] 样品组受试物浓度50％，25％，12.5％与空白对照组相比，培养液中炎性因子的释放无统计学意义，该样品在50％，25％，12.5％浓度下，未引起角膜内皮细胞释放IL-1炎性因子。

[0185] 该样品对于角膜基质成纤维细胞无细胞毒性，无刺激性，也不但引起不会引起角膜内皮细胞释放炎性因子，结果为无刺激性。

[0186] 4.眼刺激性预测模型

[0187]

[0188] 实施例3基于多种角膜结构细胞毒性方法评估某品牌洗发水眼刺激性[0189] 1.角膜上皮刺激性预测

[0190] 1.1角膜上皮细胞常规培养：人角膜原代上皮细胞。

[0191] 1.2细胞毒性测试

[0192] (1)受试物浓度的确定及配制：用分析天平称取200mg洗发水，用无血清培养基为溶剂制备储备液，配制成100mg/mL的母液，待用。

[0193] (2)铺板：待角膜上皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0194] (3)受试物的添加：洗发水终浓度为100mg/mL，稀释成31.6mg/mL，10mg/mL，3.2mg/mL，1mg/mL，0.32mg/mL。将稀释的洗发水添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。使用多通道移液器以减少孔间差异。置于培养箱中孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min后。

[0195] (4)酶标仪测量及细胞活性计算：用酶标仪在570nm处测量步骤(3)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC50(半数抑制浓度，即50％细胞活性时受试物浓度)：

[0196] 细胞活性＝[(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％

[0197] (5)细胞毒性分析：得到试验结果为：100mg/L时细胞存活率为50.17％，31.6mg/L时为65.47％，10.01mg/L为74.91％，3.16mg/L时为81.41％，1.00mg/L时为85.54％，0.32mg/L时为87.65％。经统计得到洗面奶IC80为7.66mg/mL。选择细胞毒性＞80％受试物浓度为荧光素漏出(FL)测试最高测试浓度。

[0198] 1.3荧光素漏出(FL)测试：

[0199] (1)细胞以2×105/孔接种于嵌入培养皿，待细胞密度长至80％时，上皮细胞形成紧密连接和细胞桥粒。细胞层将培养基分隔成两部分，设置受试物浓度为6mg/mL(选取细胞活性＞80％的受试物浓度作为荧光素漏出测试的最高试验浓度，只要大于80％就可以选择)，3mg/mL，2mg/mL，设3个平行孔，在细胞表面加入0.4mL，15min±1min后用Hank’s液轻柔冲洗细胞表面以清除受试物，放入另一块含Hank’s液的培养皿中，10μg/mL的荧光素钠溶液加到上层细胞，在37℃±1℃孵育30min±5min后，通过荧光分光光度计检测(激发波长485nm，发射光波长530nm)渗入培养板，即细胞下层中荧光素量，作为细胞屏障损伤程度的指标。因为，大部分细胞仍存活，清洗细胞，置于另一个含新鲜培养液的培养皿上，于37℃±
1℃继续培养4h后，再次加入荧光素钠溶液，同事检测以了解受试物对细胞紧密连接的影响。依次检测24h和72h受试物对细胞的影响，按一下公式计算引起荧光素钠漏出百分比：

[0200]

[0201] (2)荧光素漏出(FL)测试结果分析：

[0202]

[0203]

[0204] 剂量-FL20曲线为：y＝0.0771x+0.0042，当y＝20％，x＝2.54g/100ml，即为FL20H4[0205] FL20H4在2～10g/100mL为中度刺激性。

[0206] 2.角膜基质成纤维细胞刺激性预测

[0207] 2.1角膜基质成纤维细胞常规培养：兔角膜后基质层成纤维细胞RCBBF。

[0208] 2.2样品配置:洗发水加入0.9％NaCl溶液终浓度50％，稀释成35％，25％，15％，5％；阳性对照为SDS，配制0.01％，0.05％，0.2％；阴性对照为0.9％NaCl溶液。

[0209] 2.3铺板：待角膜基质成纤维细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调
5
整浓度，以2×10/孔将细胞铺于24孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0210] 2.4中性红释放(NRR)测试：24孔板内加入0.05mg/mL中性红染料1mL/孔，37℃±1℃，孵育3h±30min，随后去除中性红染料，加入培养液终止30min±10min。更换培养液后，用约2mL缓冲液溶液冲洗2～3次，加入500μL上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，2个复孔，受试物和对照组与细胞直接接触1min，暴露结束后，PBS清洗2-3次，每孔加入1mL解析液(醋酸：50％乙醇＝1：99)，搅拌15min后，每孔取200uL转移至96孔板，4个复孔，在参比波长405nm测定终溶液的吸光度。

[0211] 2.5根据下述公式，计算细胞活性率和抑制率，细胞活性率＝(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)×100％；细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，通过剂量-细胞活性率曲线计算使预载细胞中性红染料释放50％NRU的受试物浓度。毒性终点通常用NRR50表达；PM值计算公式为细胞死亡率＝(1-细胞活性率)×100％，通过剂量-细胞死亡率曲线计50％浓度下细胞死亡率。

[0212] 2.6结果：

[0213] 组别 OD值细胞活性空白对照 0.0325 --
阴性对照 0.9962 100.00％
阳性对照0.01％ 0.6052 59.43％
阳性对照0.05％ 0.6216 61.13％
阳性对照0.2％ 0.2470 22.26％
5％dilution 0.9344 93.58％
15％dilution 0.8231 82.04％
25％dilution 0.7755 77.10％
35％dilution 0.7503 74.48％
50％dilution 0.7404 73.45％

[0214] 剂量-细胞活性率曲线为：y＝-0.4193x+0.9103，当y＝50％时，x＝97.85％，即为NRR50。

[0215] 剂量-细胞死亡率曲线为：y＝0.4193x+0.0897，当x＝50％时，y＝29.94％，即为PM。

[0216] 样品NRR50为97.85％(大于50％)，PM值为29.94％(大于20％，小于50％)，该样品对于角膜基质成纤维细胞有轻度细胞毒性，轻度刺激性。

[0217] 3.角膜内皮细胞刺激性预测

[0218] 3.1角膜内皮细胞常规培养：人脐静脉血管内皮细胞系(HUVEC)

[0219] 3.2中性红释放(NRR)测试：

[0220] (1)样品配置:洗发水加入0.9％NaCl溶液稀释成终浓度50％，继续稀释成35％，25％，15％，5％；阳性对照为SDS，配制0.01％，0.05％，0.2％；阴性对照为0.9％NaCl溶液。

[0221] (2)铺板：待角膜内皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以2×105/孔将细胞铺于24孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0222] (3)24孔板内加入0.05mg/mL中性红染料1mL/孔，37℃±1℃，孵育3h±30min，随后去除中性红染料，加入培养液终止30min±10min。更换培养液后，用约2mL缓冲液溶液冲洗2～3次，加入500μL上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，2个复孔，受试物和对照组与细胞直接接触1min，暴露结束后，PBS清洗2-3次，每孔加入1mL解析液(醋酸：50％乙醇＝1：99)，搅拌15min后，每孔取200uL转移至96孔板，4个复孔，在参比波长405nm测定终溶液的吸光度。

[0223] (4)根据下述公式，计算细胞活性率和抑制率，细胞活性率＝(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)×100％；细胞死亡率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，通过剂量-细胞活性率曲线计算使预载细胞中性红染料释放50％NRU的受试物浓度。毒性终点通常用NRR50表达；PM值计算公式为细胞死亡率＝(1-细胞活性率)×100％，通过剂量-细胞死亡率曲线计50％浓度下细胞死亡率。

[0224] (5)NRR测试结果

[0225] 组别 OD值细胞活性空白对照 0.0335 --
阴性对照 0.9888 100.00％
阳性对照0.01％ 0.6052 59.85％
阳性对照0.05％ 0.6216 61.57％
阳性对照0.2％ 0.2470 22.35％
5％dilution 0.8821 88.16％
15％dilution 0.9244 92.55％
25％dilution 0.8767 87.60％
35％dilution 0.8116 80.85％
50％dilution 0.8185 81.56％

[0226] 剂量-细胞活性率曲线为：y＝-0.2229x+0.9194，当y＝50％时，x＝94.95％，即为NRR50。

[0227] 剂量-细胞死亡率曲线为：y＝0.2229x+0.0806，当x＝50％时，y＝19.21％，即为PM。

[0228] 样品NRR50为188.12％(大于50％)，PM值为19.21％(小于20％)，该样品对角膜内皮细胞无细胞毒性，无刺激性。

[0229] 选择做炎性因子测试，根据NRR试验剂量-细胞活性率曲线，当样品浓度为53.57％时，细胞活性大于80％，选取细胞活性＞80％受试物浓度的作为炎性因子测试的最高试验浓度。

[0230] 3.3炎性因子测试

[0231] (1)样品配置:眼药水加入0.9％NaCl溶液稀释成终浓度50％，继续稀释成25％，12.5％，空白对照为0.9％NaCl溶液。

[0232] (2)铺板：待角膜内皮细胞在细胞瓶中密度长至80％时，加入0.25％胰酶/0.02％EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以2.0～3.0×105个/孔将细胞铺于12孔板中，放入培养箱中孵育24小时。

[0233] (3)取出培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1mL含不同浓度的测试样品，空白对照，培养24±1h。

[0234] (4)去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h

[0235] (5)收集上清液，TGF-β细胞因子采用ELISA试剂盒进行测定。

[0236] (6)炎性因子测试结果

[0237] 收集上清液，检测炎性因子TGF-β，结果见下表4。

[0238] 表4.不同组别TGF-β差异比较

[0239]

[0240] *：与对照组相比，差异具有统计学意义。

[0241] 样品组受试物浓度50％，25％与空白对照组相比，培养液中炎性因子的释放具有统计学意义(P<0.05)，该样品在50％，25％浓度下，引起角膜内皮细胞释放TGF-β炎性因子。

[0242] 该样品对于角膜内皮细胞无细胞毒性，无刺激性，但会引起角膜内皮细胞释放炎性因子，最终结果为轻度刺激性。

[0243] 4眼刺激性预测模型

[0244]

[0245] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。本发明虽然仅列举了部分化妆品原料及产品、眼部用药品。但本发明中提到的其他非单一成分体系，如可能接触眼部的个人护理产品(洗发香波、护发素、染发剂、护肤类、防晒类、眼影、沐浴乳、身体乳等)、家用洗涤产品(洗衣液、洗衣粉、肥皂、洗洁精、漂白剂、消毒液、柔顺剂等)、药品、植物提取物(粗提取物、精提取物及其混合物)、医疗器械及其浸提物、生物材料、环境污染物，以及其它眼部接触产品(衣服、内衣等纺织品浸提物)等也可以用本发明所述方法进行皮肤致敏检测。此处不再一一列举。

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